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Transfus Clin Biol 2000 ; 7 : 513-518

0 2000 kditions scientifiques et medicales Elsevier SAS. Tous droits r&erv&

ImmunohCmatologie
Mise au point

Aide 6 la ckision en immunohBmatologie :


recherche c/es unticorps anti-Crythrocytuires
WI)
F. Roubinet ‘, L. Mannessier 2, J. Chiaroni 3, I? Lauroua 4

’ EFS Pyrh&-MkditerranCe, site de Toulouse.avenue de Grande-Bretagne, BP 32 IO, 3 IO2 7 Toulouse cedex 3 ;


’ ES Nord de France, site de M/e ; 3 EFS Alpes-MCditerranCe, site de Marseille ; ’ EFS Aqoitaine-Limousin, site de
Bordeaux, France

recherche d’anticorps antikythrocytaires / rCsolution de probli?mes

Summa y
Problem-solving strategies in immunohematology: detection of irregular red cell antibodies
Detection and identification of irregular red-cell antibody in the serum or plasma of a patient is of
prime importance for the prevention of hemolytic transfusion reactions and the biological supervi-
sion of the hemolytic disease of the fatus or the newborn. Practice in these tests is replete with com-
plex biological problems. Using problem solving strategies, we discuss the recognition and resolu-
tion of the most frequent dificulties encountered in red cell antibody identification. 0 2000
Editions scientifiques et mkdicales Elsevier SAS

problem solving strategies / irregular red cell antibodies

La recherche des anticorps anti-krythrocytaires (RAI) dkcisionnels adapt& aux situations les plus couran-
est un examen fondamental pour la prkvention et le tes rencontrkes lors de la RAI.
diagnostic des accidents immunoh6molytiques de la
transfusion sanguine, ainsi que pour la surveillance Rappels des modalit6s techniques
des incompatibilit& fcetomaternelles [l-3]. de la RAI
La RAI est un examen biologique de rkalisation
technique relativement simple mais d’interprktation La RAI comporte une premiere &ape de dkpistage.
souvent complexe [4]. L’identification du ou des an- Si le dkpistage est positif, une identification du ou
ticorps anti-krythrocytaires eventuellement prksents des anticorps doit impkrativement @tre effect&e.
dans le &rum ou le plasma d’un patient nkcessite Chaque &ape doit @tre pratiqube par deux techni-
d’adapter la dkmarche technique aux multiples si- ques obligatoires A ce jour : le test indirect 2 l’antiglo-
tuations biologiques rencontrGes, en tenant compte buline polyvalente et un test enzymatique B + 37 “C
des antkckdents transfusionnels ou obstktricaux. PI-
Dans un but de perfectionnement, nous proposons Une gamme de dkpistage comporte au minimum
au lecteur, sous forme de logigrammes, des arbres deux 21quatre hbmaties-tests [5]. L’utilisation d’une
514 F. Roubinet et al.

gamme de deux hematies-tests est nettement insuf-


fisante, car elle ne permet pas d’avoir une represen-
tativite satisfaisante des differents antigenes, ni une
expression homozygote des antigenes les plus im-
portants.
En cas de depistage positif, l’identification est rea-
lisle avec une gamme d’hematies-tests d’identifica-
tion comportant au minimum dix hematies de com-
binaison phenotypique egalement reglementee [5].
Le nombre d’hematies-tests utilisees devra toutefois
@tresouvent augment6 pour permettre une identifi-
cation dans de bonnes conditions de securite.
L’identification de la specificite du ou des anticorps
necessite en effet de trouver une relation statistique-
ment significative entre les reactions positives ou ne-
gatives observees et la presence ou l’absence d’un
antigene sur les hematies testees.
Comme pour toute analyse de biologie medicale, il
est imperatif de valider la RAI a l’aide de contrbles
de qualite internes (CQI) (arbre de’cisionnelno 1). C’est
une demarche qualite de type preventif qui permet,
en verifiant le fonctionnement du processus analyti-
que interactif (materiel-technique-reactif) dans son
ensemble, la detection de toute anomalie, erreur ou
alteration des resultats [6-81. Arbre dkisionnel no I. Prockdure de validation de la RAI P I’aide de
L’obtention de resultats conformes a ceux atten- contrBles de qualit internes.
dus permet au personnel technique, sous la respon-
sabilite du biologiste, d’effectuer la validation analy- est Gfaible B et ne reconnait pas toutes les hematies
tique. En cas de resultats non-conformes, des possedant l’antigene correspondant ou agglutine
procedures doivent preciser les mesures a prendre. seulement les hematies d’expression phenotypique
Le responsable du laboratoire doit etre immediate- homozygote, l’interpretation sera plus difficile. 11
ment inform6 de toute anomalie des resultats des sera alors necessairede tester le prelevement avec un
CQI pour analyser les causesdu dysfonctionnement nombre plus important d’hematies d’expression
et y apporter une mesure corrective adaptee et rapi- homozygote pour l’antigene correspondant 21l’anti-
de. L’ensemble des resultats obtenus avec les CQI et corps suspect&
les eventuelles mesures correctives prises en cas Dans certains cas rares, une seule hematie peut
d’anomalie doivent @treconsign& et archives. @treagglutinee. C’est le cas des anticorps reconnais-
sant un antigene de faible frequence, voire un anti-
Arbres dkisionnels prive. 11est alors necessaire de tester un grand nom-
bre d’hematies-tests afin de prouver le caractere
Plusieurs situations biologiques schematiques peu- <cprive jk de l’antigene reconnu. L’identification pre-
vent Gtre rencontrees. cise de la cible antigenique qui necessite de recourir
a un laboratoire de reference, n’a qu’un interet fon-
Prksence dons le s&urn d’un anticorps unique
damental. En effet, si le patient doit etre transfuse, la
(arbre dkisionnel no 2)
quasi-totalite des unites de sang sera compatible.
L’identification est simple si l’anticorps est puissant
Pr6sence d’un mhlange d’anticorps
et agglutine toutes les hematies possedant l’antigene
correspondant qu’elles soient d’expression phenoty- Un melange d’anticorps est suspect& lorsque les
pique homozygote ou heterozygote. Si l’anticorps intensites des reactions d’agglutination H varient B
Inteqhtation de la FM

Arbre dkisionnel no 2. RAI en cas de presence d’un anticorps unique. Arbre dkisionnel no 3. lnterpkation de la MI quand toutes les
h6maties tesdes sent agglutin6es.

d’une hematie a une autre ou quand on observe des


distorsions de reactivite entre le test indirect a l’anti- enzymatique. Un anti-H est suspect6 lorsque le
globuline et le test enzymatique. Chacune des speci- patient est de phenotype A,. 11 convient done de
ficites suspectee doit etre confirmee de facon separee determiner le groupe sanguin ABO du patient s’il
en utilisant plusieurs gammes d’hematies-tests n’est pas connu. La RAI sera effect&e avec des gam-
d’identification ou en adsorbant l’un des anticorps mes d’hematies-tests A, et AZ. Une autre possibilite
sur des hematies informatives. est <cd’eliminer Ml’anti-H en incubant le serum avec
de la salive de sujet 0 secreteur de substance ABH.
Toutes /es hCmaties testkes sent agglutinkes
(arbres dkisionnels no 3 et 4) MBlange complexe d’anticorps ou anti-public
11 peut s’agir d’un auto-anticorps, d’un anticorps Toutes les hematies testees sont agglutinees, le
dir@ contre un antigene de t&s grande frequence temoin autologue et le test direct a l’antiglobuline
ou encore d’un melange complexe d’anticorps. Un sont negatifs. 11faut suspecter un melange complexe
test direct a l’antiglobuline et un temoin autologue d’anticorps ou un anticorps dirige contre un anti-
doivent @tre realises. Le temoin autologue est effec- gene de t&s grande frequence. L’identification de ces
tue dans les memes conditions techniques que celles anticorps implique de disposer de multiples gam-
oti ont et6 observees les reactions d’agglutination mes d’hematies-tests, de recourir eventuellement a
des hematies-tests. des hematies informatives de phenotypes rares con-
servees par congelation a - 80 “C ou dans l’azote
Le test direct 6 l’antiglobuline et le tkmoin outologue
liquide et des serums-test permettant de determiner
sont nCgatifYs
le statut phenotypique du patient vis-a-vis d’antige-
Anti-H nes particuliers. Ce travail doit @trecelui d’un labo-
Toutes les hematies sont agglutinees dans les deux ratoire referent regional de l’etablissement francais
techniques et les reactions sont plus nettes en technique
516 F. Roubinet et al.

(Rg) dont l’activitk est neutraliske apres incubation


du s&urn dans un mblange de plasmas (qui contien-
nent les antiggnes Ch et Rg).
Le test direct 6 I’ontiglobuline est nkgatif et le tkmoin
autologue est positif
C’est le cas des c(auto-enzyme )) mis en evidence
aprPs traitement des hematies par une enzyme, et en
particulier par la papdine. Ces reactions parasites,
sans intQ@t transfusionnel, nfkessitent neanmoins
d’&re kliminkes par adsorption comme cela est
dkcrit dans le paragraphe suivant, pour rechercher
un &entuel allo-anticorps masque. Plus rarement,
les reactions sont positives dans les deux techniques,
correspondant en g&-&al B des auto-anticorps
n’ayant pas ou trop peu c(sensibilise )) les hbmaties
du patient in vivo ou 2 un mklange complexe
d’auto-anticorps et d’autres anticorps actifs en tech-
nique 2tl’antiglobuline.
Le test direct b I’ontiglobuline et le tCmoin autologue
sent positifs
Les auto-anticorps peuvent entrainer des difficult&
d’identification trPs longues B rksoudre. Certains de
ces auto-anticorps ont une spkificitk ktroite (par
exemple anti-RH5) mais le plus souvent les auto-
anticorps ont une spkificitk (( publique F>non identi-
fiable, B moins de disposer d’hkmaties rares en d&!-
tion partielle ou totale. 11 est done difficile, voire
Arbre dkisionnel no 4.
impossible, de dktecter un allo-anticorps masque
sans avoir recours & des techniques complkmentai-
res. Dans certains cas peu nombreux, le temoin auto-
logue peut @trenegatif (par exemple lorsque la tech-
du sang qui fera kventuellement appel au Centre
nique utilisee pour traiter les hkmaties du patient est
national de reference pour les groupes sanguins.
diffkrente de celle utilisee par le producteur d’hema-
Anticorps high titer low avidity (anti-HTM) ties-tests).
Les reactions sont positives uniquement en test indi- Si le test direct 2 l’antiglobuline est positif de type
rect 2 l’antiglobuline en basse force ionique et de fai- complement, les &actions positives observkes dans
ble intensitk Les antigknes correspondants aux anti- les deux techniques avec une intensitb supkieure
HTLA sont des antigenes de grande frequence et lorsque les hkmaties sont traitkes par les enzymes,
possedent des rkactivit& trPs variables d’un indi- ou seulement en technique enzymatique avec le plus
vidu & un autre [9]. souvent une variation d’intensitk d’une hkmatie a
Pour confirmer la presence d’un anti-HTLA, il est une autre : il s’agit probablement d’auto-anticorps
possible, compte tenu de leur faible avidit& d’aug- froids. Un moyen simple et efficace de d&ecter un
menter le rapport s&um/hkmaties et d’incuber plus allo-anticorps masqub est de traiter le s&urn par un
longtemps B + 37 “C. Une autre approche est le titra- agent reducteur comme le dithiotreitol [lo] ou le
ge de l’anticorps qui s’av&e elev4. Le groupe des mercapto-ethanol. Ce traitement rgduit les pentam&
anti-HTLA inclus de nombreux anticorps. Les plus res d’IgM au niveau des ponts disulfures et dkruit
frequents sont les anti-Chid0 (Ch) et anti-Rodgers leur activitk. En cas d’inefficacite d’un tel traitement,
Interprbtation de la RAI 517

le recours aux adsorptions avec des hematies humai- bution des reactions observees ne soit pas due au ha-
nes s’avere necessaire. sard, le nombre d’hematies testees et donnant une
Si le test direct a l’antiglobuline est positif de reaction positive doit @tre suffisant (trois ou quatre).
type IgG ou mixte, il est egalement necessaire 11en est de m@me pour celles dormant une reaction
d’adsorber les auto-anticorps pour detecter et iden- negative, afin de pouvoir eliminer toutes les autres
tifier un eventuel allo-anticorps masque. specificites d’anticorps. Pour chaque specificite
Les modal&% d’adsorption dependent des antece- d’anticorps, deux a trois hematies porteuses de l’an-
dents transfusionnels ou obstetricaux : adsorption tigene specifique correspondant et d/expression ho-
homologue avec des hematies de phenotype RH mozygote doivent etre testees.
<<antigeno-compatible B avec celui du patient et de- Force est de constater que pour la majorite des an-
pourvues des principaux antigenes immunogenes, ticorps, une seule gamme d’hematies-tests d’identi-
ou des adsorptions croisees. Chaque fois que cela fication est insuffisante pour rendre le resultat dans
sera possible (patient non-transfuse dans les des conditions de securite satisfaisantes.
trois mois), la methode d’adsorption autologue sera L’identification d’un anticorps anti-erythrocytaire
privilegiee. Pour rendre possible ou permettre une implique egalement :
efficacite maximale de l’adsorption autologue, les - une etape de validation consistant a verifier
immunoglobulines fixees sur les hematies du patient l’absence ou au contraire la presence de l’antigene
doivent @tre eludes selon divers procedes comme le correspondant a l’anticorps suspecte; lorsque la
chauffage a + 56 “C [ll], l’utilisation de solvants or- validation est (< incorrecte b), c’est-a-dire lorsque le
ganiques [12], le ZZAP [13]. patient possede l’antigene correspondant a l’anti-
Dans tous les cas, si le patient a des antecedents corps identifie, plusieurs hypotheses doivent @tre
transfusionnels &cents (depuis moins de trois mois), envisagees chez un patient non-transfuse dans les
il est egalement indispensable d’effectuer une elu- trois mois precedents : il s’agit d’un auto-anticorps
tion a partir de ses hematies et de realiser une RAI dont la preuve doit Gtre faite apres adsorption; il
sur l’eluat afin de deceler un eventuel allo-anticorps s’agit d’un anti-RH produit par un sujet RH partiel
fixe sur les globules rouges. (urbre d&sionneZ no 2), dont le plus frequent est un
anti-RHl. Dans ce dernier cas, une etude comple-
Validation analytique mentaire du phenotype RH des hematies du patient
sera realisee avec une batterie d’anti-RHl ;
Le raisonnement necessaire pour realiser l’identifi- - la determination au minimum du phenotype
cation d’un ou plusieurs anticorps anti-erythrocytai- RH-KEL du patient, puisque tout patient allo-immu-
res fait appel aux connaissances des frequences des nise doit @tre transfuse avec du sang phenotype apres
differents phenotypes dans tous les systemes de une epreuve directe de compatibilite au laboratoire
groupes sanguins, des anticorps les plus frequem- 1141.
ment rencontres en raison de l’immunogenicite des La validation analytique de la FM1 implique de
antigenes correspondants, des variations de s’etre assure que l’ensemble des resultats des CQI
l’expression antigenique d’un donneur d’hematies- sont conformes a ceux attendus. Toute anomalie
tests a un autre, des differents types de reactions constatee dans ces resultats interdit la validation de
d’agglutination en fonction des systemes concern&, l’ensemble des identifications de la meme serie.
des effets de dose de certains anticorps, des techni- Enfin, il est imperatif de tenir compte des antece-
ques preferentielles de mise en evidence des anti- dents transfusionnels ou obstetricaux, non seule-
corps en fonction des procedes utilises. Cela expli- ment sur le plan technique (pour decider d’effectuer
que que cet acte soit essentiellement realise par des une auto-adsorption ou une adsorption homologue,
laboratoires specialises en immunohematologie. par exemple), mais egalement pour l’interpretation
L’identification de la specificite necessite de trou- et le compte rendu du resultat. C’est le cas en parti-
ver une relation entre les reactions positives et nega- culier des RAI effect&es dans le cadre du suivi des
tives observees avec la presence ou l’absence d’un grossesses ou apres un accouchement. En cas de de-
antigene sur les hematies testees. Pour que la distri- couverte d’tm anticorps anti-erythrocytaire, celui-ci
518 F. Roubinet et al.

sera tit& dans des conditions techniques rigoureu- 2 Circulaire DGS/3B/552 du I7 mai 1985 relative a la prevention
des accidents transfusionnels et des accidents d’allo-immunisa-
ses (non d&rites ici) et sa concentration mesuree par
tion.
dosage pond&al [15]. La decouverte d’un anti-RHl 3 D&ret no 92- I43 du I4 fevrier I992 relatif aux examens obliga-
chez une femme enceinte ou recemment accouchee, toires prenuptial, pre- et post-natals. JO du I8 fevrier 1992.
ou encore chez un patient recemment transfuse avec 4 Rouger P, Salmon C. La pratique de I’agglutination des erythrocy-
tes et du test de Coombs. Paris : Masson ; I98 I.
des concentres plaquettaires implique, avant de ren-
5 Art&C du 8 fevrier I984 precisant les caracteristiques et normes
dre le resultat, d’interroger le prescripteur sur la no- des reactifs en immunohemarologie erythrocytaire. JO du
tion d/injection ou non d’immunoglobulines anti-D I7 mars 1984.
chez le patient. 6 Arrete du 26 novembre 1999 relatif a la bonne execution des
analyses de biologie medicale. JO du I I decembre 1999.
7 Mannessier L. Immune-hematologie erythrocytaire et securite
Conclusion transfusionnelle. Option Bio 1999 ; supplement au no 241/242.
8 Mannessier L, Lejealle A, Raba M, le groupe Immuno-hematologie
de la Societe francaise de transfusion sanguine. Etude de la reacti-
L’identification d’un anticorps anti-erythrocytaire vite des antigenes des hematies-tests en solution de conserva-
dans le serum ou le plasma d’un patient est relative- tion. Transfus Clin Biol I994 ; 4 : 905-6.
ment simple sur le plan technique. Elle necessite 9 Widmann FK. Technical manual. 9th ed. Arlington VA: AABB;
1985.
cependant une adaptation permanente de la techni-
IO Olson PR, Weiblenc BJ, O’Leary JJ, Moscovia AJ, MC Cullough ]A.
que aux differentes situations biologiques rencon- Simple method for the inactivation of IgM antibodies using dithio-
trees et une solide connaissance de l’immunohema- treitol. VOX Sang I976 ; 30 : 149-59.
tologie. L’identification d’un anticorps necessite de II Morel PA, Bergren MO, Franck BA. A simple method for the
detection of alloantibody in the presence of warm antibody [abs-
tenir compte de tout un ensemble de parametres bio-
tract]. Transfusion I978 ; I8 : 388.
logiques et medicaux. Le risque d’erreur existe tou- I2 Edwards JM, Moulds JJ. Judd WJ. Chloroquine dissociation of anti-
jours. 11 convient toutefois de le minimiser le plus gen-antibody complexes: a new technic for typing red cells with a
possible en appliquant une demarche rigoureuse et positive direct antiglobulin test. Transfusion 1982 ; 22 : 59.
I3 Branch DR. Petz LD. Anex reagent (ZZAP) having multiple appli-
comprise par les techniciens et les biologistes.
cations in immunohematology. Am J Clin Pathol I982 ; 78 : I6 I.
I4 Arrete du 4 aoQt 1994 portant homologation du reglement de
I’Agence francaise du sang relatif aux bonnes pratiques de distri-
bution et pris en application de I’article L 668-3 du Code de la
Rkfbrences Sante publique. JO du 26 aoSt 1994.
I5 Mannessier L, Valat AS, Codaccioni X, Puech E Huart JJ. La sur-
I Arret6 du I9 avril I985 relatif aux examens m6dicaux pre- et veillance immuno-hematologique des femmes enceintes. Rev
post-natals. JO du 30 mai 1985. Gynecol I994 ; 2 : 425-30.