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Garabet Ani Hématologie normale BIME 2018-2019

CHAP 2 : Cellules souches


Le rôle des cellules souches
Durant le développement embryonnaire (cellules souches embryonnaires)
• Augmenter la masse de cellules différenciées
• Création d’organes
Durant le développement adulte (cellules souches somatiques)
• Maintien constant du nombre de cellules fonctionnelles
• Remplacement de cellules mortes
• Remplacement de cellules perdues suite à des lésions

Potentiel de régénération des tissus (à l’état normal)


Tissus peu prolifératifs (peu de divisions cellulaires) :
• Tissus nerveux.
• Tissus osseux (squelette).
Tissus à haut potentiel de régénération :
• Muqueuse gastro-intestinale.
• Peau.
• Gonades.
• Tissu hématopoïétique

Durée de vie des éléments figurés du sang :


Érythrocyte 120 jours
Plaquettes 7-8 jours
Monocyte 3 jours
Neutrophile 7 heures

Potentiel de régénération du tissu hématopoïétique


• Remplacement des cellules ayant une demi-vie très courte.
• 1010 cellules différenciées du sang sont remplacées toutes les heures.
• Sur une vie d’environ 60 ans, 2.500 Kg de matières ont été produites.
• Cellule souche hématopoïétique est à l’origine de toute cette production
o Faible nombre.
o Très haut potentiel de régénération.
o Auto-renouvellement

Le sang est un tissu très hétérogène. Une seule cellule progénitrice est à l’origine du tissu hématopoïétique dont la
capacité d’auto-renouvellement est quasi illimitée (le pool ne s’épuise pas durant une vie adulte normale).
Ce concept résulte des observations suivantes :
• Maladies du sang atteignent parfois plus d’une lignée cellulaire (LMC, maladie de Vaquez ...).
• Analyses cytogénétiques

Cellules sanguines mûres (cellules terminales fonctionnelles)


Elles ont perdu leurs capacité de prolifération et leur durée de vie est limitée mais on acquit des fonctions
physiologiques propres :
• Transport de l’oxygène (GR)
• Défense contre les agents infectieux
o Bactéries (neutrophiles et monocytes)
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o Champignons (neutrophiles et monocytes)


o Virus (lymphocytes)
• Empêcher les hémorragies (plaquettes)

Types de cellules souches


• Cellule souche pluripotente
o Commune à toutes les lignées.
• Cellule souche engagée multipotente
o Myéloïdes-érythroïdes.
o Myéloïdes-érythroïdes-mégacaryocytes.
• Cellule souche engagée monopotente
o Myéloïdes.
o Erythroïdes.
o Lymphoïdes.
o Mégacaryocytes

Mise en évidence des CFU-s


Des souris sont totalement irradiées corporellement par des radiations ionisantes (10 Gray) et on remarque une
destruction irréversible du tissu hématopoïétique. Si on injecte à ces souris irradiées des cellules médullaires saines
(extraites chez des autres souris non irradiées de la même race), elles vont survivre. Cette expérience démontre
qu’il existe dans la moelle osseuse des cellules capables de recoloniser les organes hématopoïétiques détruits lors de
l’irradiation. Après l’étude des organes hématopoïétiques de souris greffées, nous observons la présence de nodules
à la surface de la rate. Ces nodules comportent des cellules érythroïdes et myéloïdes mûres ainsi que leurs
précurseurs.
Ces expériences démontrent l’existence de cellules souches pluripotentes murines appelées CFU-s (Colony Forming
Units - spleen).

Cellule souche pluripotente murines (CFU-s)


→ Commune à toutes les lignées.
Elle est capable d’auto-renouvellement et sa différenciation est irréversible. Elle est utilisée pour dénombrer les
cellules souches hématopoïétique chez la souris. Cette cellule souche ,injectée à des souris irradiées, forment des
nodules spléniques contenant des :
Cellules érythroïdes
Cellules myéloïdes
Cellules lymphoïdes (n’a jms été démontrée)
Cellules souches

Monoclonalité des CFU-s :


L’origine unicellulaire des CFU-s a été établie après une expérience consistant à irradier des cellules médullaires de
souris en suspension, ce qui a induit des anomalies cytogénétiques aléatoires dans des cellules médullaires. Suite à la
greffe de ces cellules à des souris irradiées (avec des doses létales de plus de 10 Gray), l’examen cytogénétique
montre que dans chaque colonie les anomalies cytogénétiques sont identiques. Les anomalies cytogénétiques sont
différentes d’une colonie à l’autre.

Existence de cellule souche pluripotente chez l’homme :


Elle a été confirmée par la présence dans certaines affections hématologiques d’anomalies atteignant toutes les
lignées (leucémie myéloïde chronique et maladie de Vaquez) mais aussi par :
▪ La mise en évidence du chromosome de Philadelphie (Ph 1) dans plusieurs lignées cellulaires
▪ Aplasie médullaire (l'insuffisance de production par la moelle osseuse des différentes lignées sanguines)
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▪ Analyse de la G6PD dans les colonies mixtes (myéloïdes - érythroïdes).


▪ Greffe de la moelle osseuse après traitement myéloablatif létal.

Caractéristiques des CFU-s murines :


Majoritairement localisés dans la moelle osseuse mais aussi en moindre quantité dans le sang et la rate. Leurs
capacité de prolifération est liée à la concentration locale en CFU-s (voir expérience des souris irradiées).
Les CFU-s sont en phase G0 du cycle cellulaire. Celles qui sont dans le cycle de division ont un temps de doublement
très long ce qui protège le patrimoine génomique d’éventuels accidents lors de la division cellulaire.
Elles prolifèrent activement après une altération du pool en deux temps :
1. Auto-renouvellement
2. Différenciation des cellules souches
Elles n’expriment pas d’antigènes de différenciation (ce qui confirme le caractère ancestral de cette cellule souche
puisque les antigènes ne sont exprimés que sur les cellules + différenciées). Elle possèdent des récepteurs pour les
agglutines du blé et expriment l’antigène Thy-1 et SCA (Stem Cell Antigen 1)

Localisation médullaire des CFU-s


La moelle osseuse n’a pas une structure organisée contrairement à un épithélium ou un tissu glandulaire. Les cellules
souches CFU-s (et les CFU-GM) sont localisées près de la paroi osseuse (niches) tandis que les cellules différenciées
se trouvent dans la cavité osseuse.

Le modèle murin (CFU-s) : cinétique d’apparition


▪ Jour 6 : petites colonies érythroïdes :
o Appartenant à une « classe de progéniteurs des érythrocytes caractéristiques de l’hématopoïèse
prénatale
o Pas d’auto-renouvellement
o Survie 1 à 2 jours
o Cellule souche engagée vers une voie de différenciation
▪ Jour 9 - 10 : larges colonies érythroïdes et myéloïdes :
o Survie 2 - 3 jours
o Cellule souche multipotente est le progéniteur qui a donné naissance à cette colonie
o Pas d’auto-renouvellement
▪ Jour 12 - 14 : larges colonies mixtes
o Contenant cellules souches capables d’auto-renouvellement

Cette succession de colonies spléniques chez la souris irradiée et transplantée illustre les 3 principales étapes du
développement de la myélopoïèse/hématopoïèse :
➢ La cellule souche pluripotente et persistante
➢ La cellule souche pluripotente non persistante
➢ La cellule souche engagée et transitoire

Différenciation de la CFU-s (rôle du microenvironnement)


• Surface de la rate : colonies composées de cellules érythroïdes ou mixtes (érythroïdes et myéloïdes)
• Trabécules : cellules myéloïdes (granulocytes)
• Sous la capsule splénique : cellules mégacaryocytes

Hétérogénéité des CFU-s

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Les cellules souches engagées


Cellule souches engagée multipotente
o Myéloïdes-érythroïdes.
o Myéloïdes-érythroïdes-mégacaryocytes.

Cellule souche engagée monopotente


o Myéloïdes.
o Erythroïdes.
o Lymphoïdes.
o Mégacaryocytes

Les cellules souches engagées n’ont pas de caractéristiques morphologiques propres et ne sont donc pas
identifiables au microscope. Elles forment, en culture (dans un milieu semi solide et en présence d’agents
stimulants), des colonies constituées de cellules précurseurs et mûres après 7-21j d’incubation.
Les cellules souches engagées sont en fait les précurseurs des myéloblastes, des monoblastes, des lymphoblastes,
des proérythroblastes et des mégacaryoblastes.
Monoclonalité des cellules engagées (hématopoïétique)
Plusieurs méthodes confirment la monoclonalité.
Il existe une relation linéaire entre le nombre de colonies formées et le nombre de cellules mises en culture.
L’analyse du caryotype des colonies.
L’analyse des iso-enzymes de la G6PD chez des femmes hétérozygotes. Cet iso-enzyme existe sous deux isoformes
différentes, A et B (A migre plus vite que B par électrophorèse). Le gène se trouve sur le chromosome X. Chez la
femme hétérozygote, A et B coexistent mais durant l’embryogenèse un des chromosome X est inactivé → chaque
cellule ne contient donc qu’une seule isoforme de l’iso-enzyme et si cette cellule est une cellule souche, toute sa
descendance contiendra la même isoforme de l’enzyme.

Modèle de différenciation des cellules souches


La cellule souche peut produire une nouvelle cellule souche soit une cellule plus engagée. Il existe deux manière de
représenter la division cellulaire :
-Symétrique : une cellule souche donne soit 2 cellules souches (auto-renouvellement) soit 2 cellules engagées
(différenciation)
-Asymétrique : une cellule souche donne une cellule souche (auto-renouvellement) et une cellule engagée
(différenciation)

a. Modèle de déterminisme des cellules souches


Deux modèles de déterminisme de la cellule souche peuvent
être envisagés :
1. Existence d'une cellule souche pluripotente commune
aux lignées myéloïdes et lymphoïdes dont la
différenciation conduit à la formation des 5 classes
différentes de cellules souches engagées

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2. Existence d'une cellule souche pluripotente qui sera capable


de se différencier dans un premier temps soit en une cellule
souche myéloïde soit en une cellule souche lymphoïde, ces
deux dernières ayant un potentiel d'auto-renouvellement très
limité

b. Déclin
C’est une forme particulière de différenciation au cours de laquelle la
cellule souche perd ses capacités de prolifération et son potentiel
d’auto-renouvellement mais elle conserve sa capacité de
différenciation et elle acquiert des antigènes de différenciations et
des fonctions physiologiques.

c. Modèles de différenciation des cellules souches


i. Modèle stochastique
La décision de la cellule souche de s'autorenouveler ou de se différencier est gouverne par le hasard. Une fois que le
choix est fait, la hiérarchie des cellules souches est dichotomique (divisée en 2). la cellule souche pluripotente
s'oriente soit vers la lignée myéloïde (érythropoïèse, granulopoïèse et mégacaryopoïèse) soit vers la lignée
lymphoïde. Durant le processus de différenciation, la cellule souche pluripotente donnera naissance à des cellules
souches engagées multipotentes (granulocytes et érythrocytes et mégacaryocytes) qui se différencieront ensuite en
cellules souches engagées monopotentes (granulocytes ou érythrocytes ou mégacaryocytes).
ii. Modèle linéaire
La différenciation de la cellule souche
pluripotente se ferait de manière linéaire c'est à
dire que la cellule souche acquérait au cours de
sa maturation la potentialité de s'engager vers
une voie donnée si un signal adéquat est
présent, sinon la maturation continue vers une
autre voie et ainsi de suite.
iii. Modèle local
Le micro-environnement dans lequel se trouve
la cellule souche va jouer un rôle.
iv. Modèle par compétition
Les facteurs de croissances (agents stimulants, tels que l’érythropoïétine ou molécules stimulants la granulopoïèse)
sont en compétition. Il y a une acquisition ou une perte de récepteurs à certains facteurs de croissance.

Classification des progéniteurs


Classement par rang d’âge des progéniteurs hématopoïétiques et étude de leur dépendance vis-à-vis des facteurs de
croissance grâce à des observations de cultures

a. LTC-IC (Long Term Culture – Initiating Cell)


• CD34+ : cellules souches pouvant être identifiées par la présence d’un marqueur antigénique glycoprotéique
(CD34)
• Incapables de former des colonies en systèmes semi solides
• Génèrent des progéniteurs primitifs et plus tardifs en milieu liquide (+ cytokines adéquates) pendant plusieurs
semaines.

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b. HPP-CFU (High Proliferating Potential - Colony Forming Unit)


• CD34+
• Génèrent de très grosses colonies à aspect blastique en milieu semi-solide en 2-3 semaines
• Après repiquage, capable de former des colonies secondaires (auto-renouvellement) maturant plus
rapidement et dont les progéniteurs sont plus engagés.

Cellules souches multipotente (CFU-GEMM) chez l’homme


CFU-GEMM = Colony Forming Unit Granulocytic, Erythrocytic, Monocytic, Megakaryocytic
Ce sont des cellules souches très ancestrales formant des colonies érythroïdes (BFU-e et CFU-e) associées à un autre
type de colonie (CFUGM, CFU-M, CFU-G, CFU-Meg ...). Les conditions de culture permettent la croissance des CFU-
GEMM mais également des CFU-e, BFU-e et CFU-GM.
Seulement 5 % des colonies sont de type mixte.

Les CFU-GEMM peuvent se différencier en :


• Erythroblastes.
• Monocytes/Macrophages.
• Granulocytes neutrophiles et éosinophiles.
• Mégacaryocytes.
• Lymphocytes T/B.

Clonalité des CFU-GEMM (origine des lymphocytes T)


Une cellule souche multipotente se multiplie et se différencie en lymphocyte T (loin de l’environnement thymique).
Une multiplication a lieu sous l’effet des agents stimulants de lymphocytes T mûrs.

Monoclonalité
Preuve de l’origine monoclonale de la cellule souche pluripotente :
• Vitesse de sédimentation différente pour les cellules souches érythroïdes, myéloïdes et les CFU-GEMM
• Relation linéaire entre le nombre de cellules mises en culture et le nombre de colonie
• La coculture de CFU-GEMM provenant de cellules médullaires mâles et femelles ne montre que des colonies
composées exclusivement de cellules mâles ou femelles
• Etude des isoformes de la G6PD chez les femmes noires hétérozygotes

Propriétés des CFU-GEMM


Elles sont présentes dans le sang et la moelle. Leur vitesse de sédimentation est de 4 à 4,5 mm/h.
0 à 25% des CFU-GEMM sont dans la phase S. Ces cellules expriment les antigènes d'histocompatibilité HLA A, B et
Dr.

Identité des CFU-GEMM


La composition des colonies est variable :
Granulocytes + Erythrocytes 100 %
Granulocytes + Monocytes + Erythrocytes 30 - 60 %
Granulocytes + Erythrocytes + Mégacaryocytes 19 - 20 %
Granulocytes éosinophiles + Erythrocytes 5%

Le reclonage des colonies de 1ère génération montre que 1 cellule reclonée sur 4 est capable d’auto-renouvellement
(formation d’une colonie de seconde génération). Cela suggère que la cellule souche CFU-GEMM est proche de la
CFU-s décrite chez la souris car lorsqu’on injecte du CFU-GEMM à des souris irradiées, il y a une formation de
colonies spléniques.

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Facteurs de croissance de CFU-GEMM


• Erythropoïétine (2,5 unités/ml)
➢ Assure l’hémoglobinisation des CFU-e/BFU-e
➢ N’est pas requise durant toute la culture
• IL-3 – Stem Cell Factor
➢ Nécessaire dès le début de la culture
➢ Exerce son action stimulante sur les cellules accessoires qui, secondairement, stimulent la
croissance des CFU-GEMM

Culture des cellules souches en milieu liquide


Cette technique permet la culture à long terme des précurseurs
myéloïdes et érythroïdes. Comme la culture des cellules souches
myéloïdes primitives, elle requiert la présence des cellules du
stroma médullaire. Dans ces conditions, la culture en milieu
liquide assure la prolifération et la différenciation de cellules
souches multipotentes et unipotentes pendant plusieurs
semaines.

Cinétique de croissance
• Fraction non-adhérente
o Se divisent rapidement
o Se situent dans la cavité osseuse
o Cellules souches engagées et cellules différenciées
Composition de la fraction non-adhérente (CFU-GM [granulocytes-macrophages] → 20 semaines) :
➢ Granulocytes – macrophages 80%
➢ Macrophages 10%
➢ Eosinophiles 10-15%

Les polynucléaires produits ont plusieurs fonctions : génération de superoxydes, phagocytose, bactéricidie et
dégranulation.

• Fraction adhérente
o Alternance entre repos et division en fonction des apports nutritifs exogènes
o Cellules souches primitives

Interaction entre stroma et cellule souche


Le stroma médullaire est composé de cellules du
stroma, d’une MEC et de facteurs stimulants.
La composition cellulaire du stroma médullaire :
➢ Fibroblastes 50-70%
➢ Cellules endothéliales 10-20%
➢ Monocytes-macrophages 3-5%
➢ Adipocytes 5%

Protéines du stroma médullaire


• Fibronectine
o Précurseurs érythroïdes
• Haemopoïétine
o Précurseurs myéloïdes
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• Glycosaminoglycanes (fixation des facteurs de croissance)


• Haemonectine
• Laminine
• Actine
• Collagène

Les agents stimulants


Les agents stimulant la formation des colonies myéloïdes, érythroïdes, lymphoïdes normales et leucémiques se
répartissent dans deux groupes de molécules : les CSF (Colony Stimulating Factors) et les interleukines.

Caractéristiques (des CSF)


Ce sont des protéines et des glycoprotéines qui régulent la différenciation et la prolifération.
Elle sont présentes dans l’environnement médullaire des cellules hématopoïétiques et peuvent être produites
• à distance de la moelle hématopoïétique (transport humoral)
• localement par des cellules de l’environnement (système paracrine)
• par les cellules hématopoïétiques elles-mêmes (système autocrine)

Fonctions des CSF


Survie, auto-renouvellement, prolifération, différenciation, effets multiples (réactions immunitaire et
inflammatoire).

Production des CSF


Auparavant, pour préparer ces stimulants, ils incubaient des cellules ayant la capacité de produire des CSF tels que
des monocytes, lymphocytes stimulés (lectine), cellules placentaires et endothéliales dans du milieu de culture.
Après plusieurs, le milieu surnageant (milieu conditionné) était récolté et utilisé comme source de CSF.
De nos jours, on utilise le génie génétique en insérant du cDNA (codant pour un CSF) dans un oocyte.

Cibles des CSF


Ils ont une activité très large, agissant sur plusieurs types cellulaires et interagissant les uns avec les autres (effets
additifs et synergiques). Ils stimulent également la prolifération des tissus tumoraux (cellules leucémiques,
lymphomateuses, carcinomateuses pulmonaires et coliques).
L'IL-1, l'IL-6 et le Stem Cell Factor (SCF) agissent sur les progéniteurs primitifs.
L'IL-3 et le GM-CSF agissent sur les progéniteurs de rang intermédiaire.
L'érythropoïétine (EPO), le G-CSF ou le M-CSF agissent sur les progéniteurs tardifs.

Les IL-3
Cette molécule assure la liaison entre le système hématopoïétique et immunitaire. Elle augmente le nombre de
cellules souches (pluripotentes et engagées), basophiles, éosinophiles, monocytes et polynucléaires. Elle stimule la
formation de :
• neutrophiles et éosinophiles.
• macrophages.
• mastocytes.
• lymphocytes NK.
• CFU-GEMM et BFU-e.

Les GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor)


Les sources de GM-CSF sont les lymphocytes T activés, macrophages, fibroblastes et cellules endothéliales. Elles
stimulent la prolifération des CFU-GM, CFU-Meg et des BFU-e ainsi que des promyélocytes et myélocytes.

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Les IL-1
Induit la fièvre et la neutrophilie.
Les IL-4 et 6
Stimule les lymphocytes B.
Les IL-5
Stimule éosinophiles.
Les IL-7
Stimule la formation de plaquettes en stimulant la
mégacaryocinèse

effet des facteurs de croissance

CHAP 3 : Erythropoïèse
I. Définition
L'érythropoïèse est le processus qui conduit à la production de globules rouges (GR) à partir d'une cellule souche
pluripotente.
L'érythropoïèse résulte en fait de deux événements distincts :
– L'engagement, dans lequel le potentiel de développement vers plusieurs lignées de la cellule souche
pluripotente se restreint vers la lignée érythroblastique.
– La maturation du progéniteur érythroblastique par exécution du programme de différenciation
érythroblastique.

II. Embryologie
➢ Dès la 3ème semaine de la vie intra-utérine, les premiers
érythroblastes apparaissent dans le mésoblaste
embryonnaire : les mégaloblastes.
➢ Dès la fin du 2ème mois, l'érythropoïèse a lieu dans le foie
et la rate.
➢ À partir du 5ème mois débute l'hématopoïèse médullaire. Il
y a colonisation progressive de la moelle jusqu'au 9ème
mois
➢ À la naissance, l'érythropoïèse hépatosplénique disparaît et seule persiste l'érythropoïèse médullaire.

III. Progéniteurs érythroïdes


Non identifiables au microscope • BFU-e
• CFU-e
Identifiables au microscope • Proérythroblaste
• Erythroblastes
• Réticulocytes
• Erythrocytes

a) Culture des Progéniteurs Engagés chez l’Homme


– Impossibilité d’utiliser les colonies spléniques pour étudier l’hématopoïèse chez l’homme.
– Utilisation de la culture en milieu semi-solide.
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– Chaque colonie provient de la multiplication et de la différenciation d’une cellule souche engagée.


– La taille de la colonie est directement proportionnelle à la capacité de prolifération de la cellule souche.
– Phénotype des cellules souches engagées :
o CD34 +
o CD38
o HLA-DR

b) Les cellules souches érythroïdes (BFU-e et CFU-e)


Deux types de cellules souches érythroïdes sont actuellement connus : les BFU-e (Burst Forming Unit-erythroid) et
les CFU-e (Colony Forming Unit-erythroid).

BFU-e CFU-e

✓ Cellule souche érythroïde la plus primitive ✓ Cellule souche érythroïde plus différenciée
✓ Nécessite 15 jours de culture ✓ Assure la transition entre la BFU-e et le
✓ Formation d’agglomérats de petits clusters (>50 proérythroblaste
cellules) ✓ Nécessite 3 - 5 jours de culture
✓ 3 - 5 colonies hémoglobinisées ✓ Colonies hémoglobinisées contenant de 8 - 60
✓ Localisées dans la moelle et le sang érythroblastes
✓ Localisées dans la moelle
FACTEURS DE CROISSANCE :
– IL-3
o Assure la croissance et la prolifération des BFU- FACTEURS DE CROISSANCE :
e – EPO : Indispensable pour assurer la maturation des
o Présente dans les surnageants de splénocytes érythroblastes et l’hémoglobinisation.
stimulés par des lectines (activité BPA)
o Augmente dans le sérum de patients atteints
d’anémie aplastique
– Erythropoïétine (EPO) : pas nécessaire pour la
survie et la différenciation des BFU-e
– Stem Cell Factor.
– GM-CSF.
– IL-9.
– IL-11.

Monoclonalité des cellules souches engagées


Le fait qu'il existe une relation linéaire entre le nombre de BFU-e et
de CFU-e et le nombre de cellules médullaires ou sanguines mises
en culture suggère que chaque colonie résulte bien de la
prolifération d'une seule BFU-e ou CFU-e.
→ Analyse du caryotype des colonies + des isoenzymes de la G6PD.

Méthode de culture
– Prélever 2-3ml de moelle osseuse.
– Séparation des cellules mononucléées sur Ficoll (sépare les cellules en fonction de leur nb de noyau).
– Mise en culture de 2.10^5 cellules.
– Incubation 7-14 jours à 37 °C (5 % CO2 - 100 % H2O)

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c) Régulation de la prolifération des BFU-e et des CFU-e


Les principaux stimulants de l’érythropoïèse sont l’IL3 et l’EPO mais les hormones peuvent également réguler la
production des GR !
Stimulants Inhibiteurs
- IL3, EPO - Hormones :
- Hormones : o Œstrogènes
o Stimuli neuro-hormonaux. - Suppression immunologique
o Androgènes (taux Hb plus élevé chez o Aplasie pure de la lignée rouge.
l’homme que chez la femme). o Syndrome de Diamond-Blackfan.
o Hormones thyroïdiennes. - Interférons α, β et γ.
o Hormones vasoactives : diminuent le - Facteur nécrosant des tumeurs (TNF-
flux rénal α).
Erythropoïétine (EPO)

Caractéristiques ✓ Glycoprotéine globulaire PM : 46.000.


✓ Taux sérique : 6 - 7 U/ml.
✓ Excrétion urinaire quotidienne :
o Homme . 2.8 U.
o Femme . 0.9 U → la femme en excrète moins car elle en a + besoin !
✓ Glycosylation est indispensable à l’activité in-vivo.
✓ Partie protéique interagit avec le récepteur.
✓ Demi-vie : 4 - 7 h.
✓ Codé par le chromosome 7.
✓ Catabolisée par le foie et le rein.
✓ Peut-être produite par génie génétique.
Métabolisme ✓ Chez l’adulte : produite par les cellules interstitielles intertubulaires rénales (90 %).
✓ Ces cellules productrices sont sensibles à l’hypoxie.
✓ L’augmentation de la production d’EPO se fait par augmentation du nombre de cellules
productrices.
✓ Une production hépatique, par les cellules du foie :
o 10 % chez l’adulte.
o 100 % chez le fœtus
Régulation de la ✓ Effet stimulant de l’hypoxie rénale par l'intermédiaire de récepteurs sensibles à l'hypoxie :
synthèse d’EPO o Diminution de la PO2 déclenche la sécrétion.
o Diminution du pH favorise la sécrétion .
✓ Augmentation de la masse des précurseurs érythroblastiques
o Régulation par consommation de l’EPO.
Récepteurs à l’EPO ✓ 2 types de récepteurs ayant des constantes de dissociation de 0.1 nM et 1 nM.
✓ 300 - 3000 récepteurs/CFU-e.
✓ 2 sous-unités glycosylées de 85 et 100 kD.
✓ Le récepteur est composé à parts égales des 2 sous-unités.
✓ Permet à l’érythropoïétine d’être internalisée dans la cellule
o Induit la prolifération
o Induit le différenciation
✓ Est ensuite rapidement dégradée.
Mécanisme d’action ✓ Agit sur les précurseurs médullaires (CFU-e).
o Active diverses RNA-polymérases : augmentation de la transcription du mRNA codant
pour les globines.
✓ Agit sur les érythroblastes
o Raccourcissent de la durée du cycle cellulaire (temps de doublement).
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o Diminution du nombre de mitoses.


o Dénucléation plus rapide.
o Libération plus rapide des réticulocytes médullaires.

Régulation de ✓ La diminution du taux des hématies diminue l’oxygénation (hypoxie !)


l’érythropoïèse ✓ Suite à l’hypoxie, le rein produit de l’EPO
✓ L’EPO stimule l’érythropoïèse par la stimulation des divisions cellulaires et de la synthèse
de l’HB.

Sensibilité des BFU-e et CFU-e à l’EPO

En absence d'érythropoïétine, les CFU-e disparaissent très


rapidement.

Survie des CFU-e et BFU-e en absence d’EPO

L'érythropoïétine n'est nécessaire ni pour la survie ni pour la


prolifération des BFU-e.
En absence d'érythropoïétine, les CFU-e disparaissent très rapidement.

d) Rôle des cellules accessoires


Lymphocyte T Monocytes - Macrophages
➢ Augmente la croissance des BFU-e mais ➢ Participent à l’hémoglobinisation des BFU-e et des
l’élimination des lymphocytes T n’empêche pas la CFU-e.
croissance. ➢ Action stimulante potentialisant l’effet de l’EPO
➢ l’IL-3 est responsable de cet effet stimulant ! sur CFU-e et BFU-e.
➢ L’IL-1 et le fer sont responsable de cet effet
stimulant !

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e) Cinétique de croissance des BFU-e et CFU-e


La cinétique de croissance des BFU-e et des CFU-e est différente. Les CFU-e,
étant très sensibles à l'EPO, se multiplient très rapidement pour former des
petites colonies bien hémoglobinisées après 6 jours de culture. Ces colonies
une fois formées dégénèrent assez rapidement et disparaissent après environ
15 jours de culture.
La cinétique des BFU-e est plus lente, étant peu sensibles à l'EPO, elles se
multiplient plus lentement et ne forment des colonies hémoglobinisées
qu'après + 12 jours de culture. Ces colonies survivent environ 1 semaine in
vitro puis disparaissent après 25 jours de culture.

f) Caractéristiques des CFU-e et BFU-e

IV. Structure et régulation du compartiment érythroïde


Répartition des CFU-e et BFU-e
La répartition des différents progéniteurs érythroïdes dans le
tissu médullaire n'est pas homogène.
Les BFU-e ont une distribution bimodale : elles se situent (1) tout
près de la surface de l'os sans cependant être en contact avec lui,
(2) dans un espace intermédiaire entre l'os et le centre de la
cavité osseuse.
Les CFU-e quant à elles se distribuent de manière plus
hétérogène avec cependant une incidence plus grande au
centre de la cavité osseuse.

Evolution des précurseurs érythroïdes


Les progéniteurs se différencient ensuite en précurseurs de la lignée rouge : les érythroblastes.
- La taille des érythroblastes diminue au cours de la maturation.
- Le rapport nucléocytoplasmique diminue également avec la maturation.
- La chromatine nucléaire est fine et devient de plus en plus grossière au cours de la maturation, pour devenir
pycnotique.
- Le nucléole (lieu de production d’ARN messager et ribosomial) apparent dans le proérythroblaste, disparaît
progressivement du noyau au cours de la maturation.
- Au stade de l’érythroblaste basophile :
o Diminution de la synthèse d'ARN
o Diminution progressive de la basophilie
- La synthèse d'hémoglobine augmente.

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Caractéristiques des érythroblastes


- Les érythroblastes en surface portent des récepteurs de la transferrine (CD71).
- Le fer nécessaire à la synthèse de l’hémoglobine est apporté par la transferrine laquelle se fixe au récepteur de
la transferrine à la surface de l'érythroblaste (l'ensemble est internalisé).
- Le fer sera libéré dans la cellule pour se fixer à l'apoferritine et forme la ferritine.
- Certains érythroblastes contiennent des agrégats de ferritine ou sidérosomes dans le cytoplasme : ce sont les
sidéroblastes. Les précurseurs des hématies contiennent des molécules de ferritine et montrent de la
rhophéocytose. Le réticulum endoplasmique, les microtubules et les microfilaments y sont peu développés.

V. Les précurseurs érythroblastiques médullaires


Dynamique de l’érythropoïèse : synthèse d’ADN
Quatre mitoses séparent le proérythroblaste de l'érythroblaste orthochromatophile. Le nombre de mitoses peut
varier entre 3 et 5.
Environ 10 % des érythroblastes meurent au stade
orthochromatophile (mort médullaire) : c'est
l'érythropoïèse inefficace physiologique. La carence
en fer ou en vitamine B12 peut augmenter ce %.
L'érythroblaste orthochromatophile ne se divise pas
et, après ce stade, le noyau, devenu pycnotique et
inutile, est expulsé, donnant naissance au
réticulocyte.
La maturation dure 5 jours. Les réticulocytes
séjournent :
- 1 - 2 jours dans la moelle.
- 1 - 2 jours dans la circulation.
- Achèvent leur maturation dans la rate
(élimination des résidus cytoplasmiques dans les
corps de Howell-Jolly).

Proérythroblaste (0.2 - ➢ Premier précurseur érythroïde médullaire reconnaissable au


1.3 %) microscope.
➢ Cellule de grande taille 20 - 25 μm.
➢ Rapport nucléo-cytoplasmique élevé.
➢ Chromatine fine (euchromatine).
➢ 1 à 2 nucléoles : synthèse de RNA.
➢ Zone claire périnucléaire représente l’appareil de Golgi.
➢ Nombreux polyribosomes.

Erythroblaste basophile ➢ Plus petit que le proérythroblaste (16 - 18 μm).


(0.5 - 2.4 %) ➢ Taille du noyau diminue.
➢ Plus de nucléole.
➢ Chromatine condensée (15 - 20 chromocentres).
➢ Cytoplasme très basophile.
➢ Nombreux polyribosomes.
➢ Présence de lysosomes contenant de la ferritine.

Erythroblaste ➢ Précurseur érythroïde le plus fréquent.


polychromatophile (18 - ➢ La taille de la cellule diminue (12 - 15 μm).
29 %) ➢ La taille du noyau diminue et occupe une position excentrique.
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➢ Chromatine condensée.
➢ Pas de nucléole.
➢ Grand chromocentre.
➢ Basophilie du cytoplasme diminue.
➢ Présence de sidérosomes.

Erythroblaste ➢ Le plus petit des érythroblastes (10 - 15 μm).


orthochromatophile ➢ Noyau pycnotique en voie d’expulsion.
(0.4 - 4.6 %) ➢ Cytoplasme acidophile (rose).
➢ Présence de sidérosomes.

Réticulocyte ➢ Globule rouge jeune.


➢ Taille 10 µm.
➢ Quelques polyribosomes.
➢ Vacuole et rhophéocytose
o Sidérosomes.
o Ferritine.
➢ Perte du RE.
➢ Disparition des ribosomes (24 - 48 h).

Erythrocyte ➢ Disque aplati biconcave (discocyte).


➢ Très déformable dans la microcirculation.
➢ Conservation de la forme :
o Protéines du cytosquelette membranaire.
o Mécanismes consommant de l’énergie.

Ilot érythroblastique
C’est l'unité anatomique de l'érythropoïèse dans la moelle : il est
constitué d’un ou deux macrophages entourés d'érythroblastes à
divers degrés de maturation. Des projections cytoplasmiques du
macrophage sont en contact intime avec les érythroblastes. Plus la
cellule érythroblastique est différenciée, plus elle s'éloigne du centre
de l'îlot.
L'érythroblaste orthochromatophile finit par se détacher d'une
extrémité du macrophage. Ce contact dure environ 85 heures en
moyenne. Pendant ce temps, l'érythroblaste ferait en moyenne 4
divisions et synthétiserait 80% de l'hémoglobine des globules rouges
qui sera produite.
Le macrophage médullaire
Il joue un rôle majeur dans :
- La récupération
- Le stockage
- La redistribution du fer des globules rouges.
Le macrophage est une cellule médullaire de très grande taille. Son noyau est
excentrique et son contour cytoplasmique est flou.

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Les érythrocytes âgés ou endommagés sont phagocytés. Après 1 heure déjà, la membrane dégénère (apparition de
structures lipidiques lamellaires) et l'hémoglobine dégradée (apparition de particules de ferritine dans le cytoplasme
du macrophage).
La ferritine
La ferritine est un complexe (soluble dans l'eau) d'hydroxyde de fer et d'apoferritine. La ferritine se retrouve :
- En particules dispersées libres dans le cytoplasme
- En particules agrégées libres dans le cytoplasme ou dans une vésicule de pinocytose
- En particules agrégées en amas entourés d'une membrane : les sidérosomes.
L'hémosidérine
L'hémosidérine représente une forme de ferritine partiellement dénaturée, déprotéinée. Elle se présente sous forme
de dépôts amorphes colorés en brun au May-Grünwald Giemsa. La réaction de Perls (ferrocyanure de potassium) fait
apparaître en bleu vif la ferritine et l'hémosidérine.
Cette hémosidérine résultant de la digestion de l’érythrocyte par le macrophage, constitue la principale forme de
stockage du fer chez l'homme (1 gr soit + 25% du fer total de l'organisme).

VI. Globule Rouge et hémoglobine


Les GR sont des cellules dépourvues de noyau et d'organites intracellulaires. Ils sont
incapables de synthétiser les protéines membranaires. Il contient l'Hb et les
enzymes nécessaires au métabolisme intracellulaire, indispensables pour exercer
leur rôle principal : délivrer l'O2 des poumons aux tissus, transporter en sens
inverse le CO2 et les protons produits par le métabolisme tissulaire. Le GR est tout
de même capable de produire l'énergie nécessaire au maintien de l'équilibre
ionique et de l'eau, entre l'intérieur et l'extérieur de la cellule.
Le GR est un exemple parfait des relations étroites qui existent entre une structure
protéique et une fonction biologique. Sa structure est relativement simple : une
membrane entourant une solution d'Hb. Sa forme en disque biconcave augmente le
rapport entre la surface et le volume, ce qui facilite les échanges gazeux.

a. Forme
Echinocyte
Le terme échinocyte s'applique à une hématie qui acquiert des spicules à sa surface et à
l'extrême finit par prendre l'aspect d'une sphère crénelée (sphéroéchinocyte). Ce
phénomène survient lorsque la face externe de la membrane s'agrandit plus que la face
interne. Il peut être provoqué in vitro par l'action de plusieurs agents "échinocytogènes"
(lysolécithine, pH alcalin, détergents anioniques...).
Stomatocyte
D'autre part, on appelle stomatocyte une hématie en forme de coupe (l'une face étant convexe)
et qui, à l'extrême, prend l'aspect d'une sphère avec une petite dépression localisée
(sphérostomatocyte). Ce phénomène survient lorsque la face interne de la membrane s'agrandit
plus que la face externe. Il peut être provoqué in vitro par divers agents "stomatocytogénes"
(pH acide, détergents cationiques, phénothiazines...).
L'échinocytose et la stomatocytose sont donc des mécanismes opposés. L'hématie déformée de
cette manière tend à reprendre sa forme normale, grâce à des mécanismes qui consomment de
l'énergie.

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Equilibre

b. Membrane érythrocytaire
Structure
La membrane du GR est constituée d'une double couche lipidique et de protéines, périphériques ou insérées dans la
bicouche lipidique. Le squelette membranaire constitue un filet dont les mailles correspondent à des interactions
protéine-protéine. Ce filet est relié par des liaisons verticales de haute affinité à la bicouche lipidique par
l'intermédiaire des protéines intramembranaires.
Protéines membranaires
Méthode d’étude
Etude des protéines par électrophorèse en gel de polyacrylamide (PAGE) après solubilisation dans du SDS
(dodécylsulfate sodique) :
➔ 8 bandes majeures sont détectées accompagnées de sous-fractions.
➔ 4 bandes majeures contenant des glycoprotéines peuvent également être détectées après coloration au PAS.

Cytosquelette
Spectrine (bandes 1 et 2) : la plus abondante, forme les mailles du réseau.
Actine (bande 5).
Bande 4.1 : protéine globulaire phosphorylée qui stabilise la spectrine et l’actine.
Bande 4.9.
Ankyrine (bande 2.1) : fixation du cytosquelette à la bicouche lipidique.

Spectrine ➢ Tétramère comportant :


o 2 chaînes α (bande 1) PM : 240.000
o 2 chaînes β (bande 2) PM : 220.000
➢ Deux dimères β en forme de double hélice s’associent par une extrémité pour former un
tétramère.

Actine ➢ Bande 5 à l’électrophorèse.


➢ Fixation de l’actine à une extrémité du tétramère de spectrine.
➢ Assure la cohésion du cytosquelette.
➢ Formées de filaments composés 5 - 30 monomères de PM 42.000.
➢ Par filament d’actine se fixent de 2 - 12 dimères de spectrine

Bande 4.1 ➢ Protéine globulaire phosphorylée.


➢ Stabilise la liaison spectrine - actine.
➢ Fixation d’une molécule de la bande 4.1 à chaque dimère de spectrine.
➢ Assure l’élasticité de la membrane de l’érythrocyte.

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Bande 4.9 ➢ Phosphoprotéine.


➢ Une molécule de la bande 4.9 s’insère entre 2 dimères de spectrine dans le complexe
spectrine -actine - bande 4.1.

Ankyrine ➢ Bande 2.1.


➢ Rattache le cytosquelette à la bicouche lipidique.
➢ Protéine globulaire de PM : 200.000.
➢ Assure la liaison entre une protéine intégrale de la membrane (bande 3) et la spectrine.
➢ Chaque protéine de bande 3 fixe une molécule d’ankyrine.
➢ Fixe la spectrine au niveau des extrémités αβ qui forment le tétramère.

Glycophorine A ➢ Glycoprotéine PM 55.000


➢ Bandes PAS 1, 2, 4 en SDS PAGE.
➢ 40 % protéique.
➢ 60 % carboné (acide sialique, hexoses, hexosamines, mannose, fucose)
➢ Les composés hydrocarbonés font protrusion à l’extérieur de la membrane.
o Support des groupes sanguins (ABO et MN).
o Autres récepteurs membranaires.

Bande 3 ➢ Glycoprotéine PM 95.000


➢ Possède :
o Segment transmembranaire.
o Segment hydrocarboné extra-cytoplasmique.
o Segment intramembranaire (fixe l’ankyrine).
➢ Constitue le canal qui assure le passage des anions aux travers de la membrane.

Bande 4.5 ➢ Transporteur de glucose.

Enzymes ➢ ATPase.
exclusivement ➢ Acétylcholinestérase.
membranaires
Enzymes ➢ Protéines kinases.
membranaires et ➢ ATPases.
cytoplasmiques

Lipides membranaires
Phospholipides. Le rapport entre les différents composants lipidiques
o Phosphatidylcholine est capital pour assurer l’élasticité de la membrane.
o Phosphatidyléthanolamine
o Phosphatidylsérine Pas de synthèse de novo des lipides membranaires mais
o Sphingomyéline échanges passifs avec les lipoprotéines plasmatiques.
o Phosphatidylinositol
o Acide phosphatique
Cholestérol non estérifié.
Céramidesglycolipides (globoside)
o Céramides.
o Glucose.
o Galactose.
o N-acétylgalactosamine.

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c. Hémoglobine
L'Hb, pigment coloré qui donne sa couleur rouge aux hématies, représente 95 % des protéines intracellulaires. Sa
fonction essentielle est celle de transporteur d'O2 et de CO2.
Structure de l’Hb
➔ Tétramère PM 64.500.
➔ C'est une structure cyclique organique complexe comportant un groupement prosthétique, l'hème, et une partie
protéique, la globine. L'hème est formé par la protoporphyrine IX, à laquelle est liée un atome de fer à l'état
ferreux.
➔ Les 4 chaînes polypeptidiques forment un tétraèdre.
➔ Les groupements polaires sont orientés vers l’extérieur : molécule hydrosoluble.
➔ Les groupements non polaires sont orientés vers l’intérieur : cavité où se loge l’hème.
➔ Dans la cavité, l’atome de Fe se lie à une histidine proximale.
➔ La molécule d’oxygène se fixe à l’atome de Fer.

Structure de l’hème
La protoporphyrine est constituée par quatre noyaux pyrroles unis par des
ponts méthényles.
Le fer de l'hème se lie aux quatre atomes d'azote au centre du noyau
protoporphyrinique.
L'O2 ne peut se lier à l'hème que s'il est à l'état ferreux (Fe++). Lorsque le fer
est à l'état ferrique, la méthémoglobine ainsi produite est incapable de fixer
l'O2.
Un hème est lié à une chaîne polypeptidique de globine et forme une sous-
unité. Les quatre sous-unités s'adaptent les unes aux autres pour former un tétraèdre : la molécule d'Hb. Chaque
hème est enfoui profondément dans une poche tapissée par de nombreux résidus d'acides aminés (AA)
hydrophobes. Une des deux liaisons de coordinence de l'atome de fer se lie au groupement R terminal de l'histidine,
l'autre reste libre pour fixer O2.

Sortes d’hémoglobine :
Hémoglobine A1 ➢ Constituant principal le l’Hb adulte
➢ La plus abondante.
➢ 2 chaînes α et 2 chaînes β (α2β2).

Hémoglobine glycosylées :
+- 5 % de l’Hb A1 peut-être glycosylée par l’adjonction d’hydrate de carbone sur l’extrémité N-
terminale des chaînes β.
- A1c addition de glucose.
- A1a1 addition de fructose 1.6 diphosphate.
- A1a2 addition de glucose-6-phosphate.

Hémoglobine A2 ➢ 2 - 3.5 % du total.


➢ 2 chaînes α et 2 chaînes δ (α2δ2).

Hémoglobine F ➢ Hémoglobine fœtale. !


➢ +- 1 % du total.
➢ 2 chaînes α et 2 chaînes γ (α2γ2).

La réactivation de l'expression de l'HbF peut survenir dans certaines conditions physiologiques


ou pathologiques :
- stress hématopoïétique
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- Erythroblastopénies transitoires de l'enfant


- Greffe de moelle osseuse
- Deuxième trimestre de la grossesse
- Hémoglobinopathies et thalassémies,
- Certaines substances chimiques agissant soit sur la structure des gènes, soit sur
l'érythropoïèse : AZT, hydroxyurée, EPO et dérivés de l'acide butyrique.

Identification des hémoglobines


➔ Séparation par électrophorèse A1,A2 et F.
o Chaîne α 141 acides aminés.
o Chaîne β, γ, δ 146 acides aminés.
➔ Hb F résistante à la dénaturation en milieu alcalin ou acide.
➔ Mise en évidence par cytochimie de l’Hb F !Résistance des érythrocytes à l’élution acide (test de Kleihauer).

d. Synthèse de l’Hb
L’hème est produit dans les mitochondries.
La globine produite dans les mitochondries et le RE.
L’hème stimule la synthèse de la globine.

e. Propriétés de l’Hb
➔ Allostérie : modification de son activité en fonction du ligand.
o Etat tendu (T) : forme déoxygénée
▪ Proximité des dimères α1β1 et α2β2 maintenus par des ponts salins.
o Etat relâché (R) : forme oxygénée
▪ Ecartement des dimères α1β1 et α2β2 par rupture des ponts salins.
➔ L'affinité de la déoxyhémoglobine pour l'oxygène est faible, mais elle croît au fur et à mesure que l'hémoglobine
capte de l'oxygène : ceci explique que la courbe de dissociation de l'hémoglobine a la forme d'une sigmoïde.

f. Affinité de l’Hb
➔ Courbe de dissociation identique pour O2 et CO2 (voir explication p12)
➔ Fixation du CO : ses taux sont physiologiquement très, faibles mais peuvent s'élever en pathologie et
compromettent alors sérieusement l'oxygénation tissulaire pour deux raisons :
o Le CO se combine avec l'hème au même site que l'oxygène (formant de la carboxyhémoglobine) mais avec
une affinité 150 fois plus grande pour l'oxygène, qu'il déplace.
o La fixation de CO sur un hème entraîne, par interaction des hèmes, une augmentation de l'affinité pour
l'oxygène (diminution de la P50) ce qui diminue l'oxygène libérable vers les tissus.

VII. Métabolisme des érythrocytes


L'hématie tire essentiellement son énergie du métabolisme du glucose. Ce métabolisme est simplifié par rapport à
celui des autres cellules de l'organisme, car les hématies mûres n'ont pas de mitochondries et donc pas de cycle de
Krebs.
Normalement, 90% du glucose érythrocytaire est métabolisé par la voie anaérobie d'Embden-Meyerhoff et 10% par
la voie aérobie ou voie des pentoses-phosphates.
Les sources d'énergie autres que le glucose ne jouent guère de rôle in vivo, mais peuvent être sollicitées dans
certaines circonstances, notamment lors de la conservation du sang dans les banques de sang. Ces sources sont
l'adénosine, le fructose, le mannose, le galactose, le dihydroxyacétone et le glycéraldéhyde.

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VIII. Métabolisme des réticulocytes


a. Synthèse protéique
On peut détecter dans les réticulocytes des activités métaboliques résiduelles rappelant celles des érythroblastes,
mais qui disparaissent dès leur transformation en hématies mûres : synthèse des lipides, de l'hème et des protéines,
cycle de Krebs, et phosphorylations oxydatives.
Cependant, le métabolisme énergétique et de nombreuses activités enzymatiques sont bien plus élevés dans les
réticulocytes que dans les hématies mûres.
b. Catabolisme
Les réticulocytes possèdent des mécanismes cataboliques, en particulier des protéases permettant la digestion de
protéines diverses et de polypeptides, et des enzymes permettant la dégradation de l'ARN ribosomial. L'étape
terminale de cette dégradation est la déphosphorylation des nucléotides en nucléosides grâce à des nucléotidases,
notamment la pyrimidine-5'-nucléotidase (PNP).
Les produits qui ne peuvent être complètement dégradés par voie enzymatique forment des résidus insolubles, qui
sont expulsés spontanément par exocytose ou par phagocytose durant le transit splénique; il en va ainsi pour
certains résidus nucléaires, constituant les corps de Howell-Jolly.

IX. Destruction des érythrocytes


Introduction
Les hématies sont dépourvues des mécanismes métaboliques, de réparation qui leur permettraient de réparer les
dommages qu'elles subissent. Il n’y a plus la possibilité de synthétiser des protéines ou de métaboliser des lipides.
La durée de vie des hématies est limitée à 120 jours environ et 200.10^9 hématies sont remplacées par jour. Durant
leur parcours sanguin, les érythrocytes parcourent 300 - 400 km.

Sénescence des hématies


- Diminution de leur taille
- Diminution de l’activité des enzymes de la glycolyse
- Diminution de leur déformabilité
- Diminution des taux de divers constituants membranaires (lipides, protéines, acide sialique)
- Augmentation de leur densité
- Augmentation de la formation de peroxydes

Mécanisme de destruction
La fragmentation Lors du passage dans la microcirculation, libération de fragments qui sont
phagocytés par les macrophages.
Causes :
- Diminution de la déformabilité
- Diminution de l’ATP.

La lyse osmotique Une diminution de l'activité de la pompe à cations monovalents entraîne la


pénétration d'eau dans la cellule. Le gonflement des hématies peut entraîner
l'apparition de "trous", par lesquels peut s'écouler l'hémoglobine.
Lors de leur passage dans la rate, les hématies rencontrent des conditions
métaboliques peu favorables (acidose, hypoglycémie), pouvant entraîner une
diminution de l'activité glycolytique et favoriser la lyse osmotique.

L’érythrophagocytose Il s'agit de la phagocytose d'hématies entières par des macrophages, des monocytes
ou des granulocytes neutrophiles.
Ce mécanisme intervient en pathologie : érythroleucémie.

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La cytolyse induite par Le complément a la propriété de se fixer sur les hématies et peut entraîner leur lyse.
le complément La fixation cellulaire du complément peut être induite par la réaction entre un
antigène cellulaire et d'un anticorps "fixateur du complément", mais aussi par
certaines anomalies cellulaires n'impliquant pas de réaction antigène-anticorps.
La fixation des complexes terminaux du complément entraîne une lésion
membranaire qui, si elle est petite augmente la perméabilité à l'eau et entraîne la
lyse osmotique ou, si elle est plus grande, entraîne la fuite directe d'hémoglobine.
Ce mécanisme intervient principalement lors d’anémies hémolytiques. Il est peu
probable qu’il participe à la destruction physiologique des hématies.

Dénaturation oxydative Il est possible, mais non démontré, que la formation de corps de Heinz soit un
de l’Hb phénomène "préterminal" survenant juste avant la mort des hématies normales.

Site de destruction
Hémolyse extravasculaire (80 - 90 %) Hémolyse intravasculaire
- Principalement au niveau de la rate - Libération d’Hb dans le plasma
- Aussi au niveau du foie et de la moelle osseuse. o Fixation à l’haptoglobine (α2 glycoprotéine)
- A l’intérieur de ces organes, ▪ Concentration : 50 - 150 mg/dl.
o Les macrophages phagocytent des débris ▪ Fixation de 200 - 400 mg/dl d’Hb.
cellulaires. ▪ Fixation de 2 dimères αβ par molécule
o Hb y est phagocyté d’haptoglobine.
o Le fer est recyclé. ▪ Liaison entre la chaîne α de l’haptoglobine
et la chaîne β de l’Hb.
- Complexes Haptoglobine - Hémoglobine ne
traversent pas le filtre rénal et sont captés par le
foie
o Dégradation de l’hème par les hépatocytes.

Catabolisme de l’hémoglobine
- L’hémoglobine est capturé par les macrophages et est clivé en globine. La globine est ensuite dégradée en acides
aminés et en hème.
o L’hème oxygénase transforme la protoporphyrine IX en biliverdine IXa qui est ensuite transformée en
bilirubine IXa par la bilirubine réductase.
- Le fer est libéré dans le plasma et est capturé par la transferrine.

Catabolisme hépatique de le bilirubine


- La bilirubine passe dans le plasma. Le taux de bilirubine dans le plasma varie de 0,5 à 1,0 mg/dl.
- Etant très insoluble dans l'eau, la bilirubine s'y fixe sur l'albumine; chaque molécule d'albumine peut fixer deux
molécules de bilirubine.
- Le métabolisme de la bilirubine dans les hépatocytes comporte trois étapes :
o La captation paraît impliquer la dissociation de la bilirubine et de l'albumine, suivi de la pénétration de la
bilirubine dans l’hépatocyte.
o La conjugaison à l'acide glycuronique (intervention de l’enzyme glycuronyltransférase).
o L'excrétion de la forme conjuguée de la bilirubine avec la bile.
Transportée dans la bile et déversée dans l'intestin, où elle ne peut pas être réabsorbée, la bilirubine conjuguée sera
éliminée dans les selles.

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X. Fer
Le fer intervient dans la composition de nombreux constituants corporels, dont le principal est l'hémoglobine. Chez
un homme normal, les teneurs en fer sont les suivantes :
- Hémoglobine : 2670 mg
- Myoglobine : 140 mg –
- Enzymes contenant de l'hème (cytochromes, catalase, peroxydase) : 8 mg
- Transferrine : 3 mg
- Ferritine et hémosidérine : 1200 à 1500 mg
Soit un total voisin de 4 g, dont les 2/3 sous forme d'hémoglobine.

Incorporation du fer dans l’hémoglobine


- Fourni principalement par la transferrine
o Fixation à un récepteur membranaire (CD71)
▪ Présent sur les érythroblastes et réticulocytes.
▪ Absent sur les hématies mûres.
o Internalisation du complexe transferrine-récepteur.
o Vacuoles d’endocytose.
o Relargage du Fe dans le cytosol à pH acide (5.5).
o Relargage du complexe apotransferrine-récepteur au contact de la membrane plasmique.
o Libération de l’apotransferrine du récepteur (pH neutre).
- Rhophéocytose de la ferritine joue un rôle mineur.
- Le cycle de transport dure . 5 - 15 minutes

Homéostasie du fer
Pertes Les pertes sont faibles (+ 1 mg/jour chez l’homme)
- Desquamation des cellules intestinales.
- Desquamation des cellules des voies urinaires.
- Pertes de sang lors des menstruations (femme).
- Saignements accidentels

Apports - Absorption de + 10 % du fer alimentaire ingéré.


- Absorption par l’intestin :
o Sous forme d’ions ferreux
o Sous forme d’hème.
- Absorption dépend du régime alimentaire:
o Diminué par les céréales.
o Augmenté par les viandes.
o Plus l’activité érythropoïétique est importante, plus l’absorption est élevée.
o Augmenté lorsque le stock en Fe est abaissé

Variations du taux de fer macrophagique


L’absence de fer dans les macrophages signale dès lors généralement une carence → anémie ferriprive.
L’excès de fer dans les macrophages peut résulter de:
Hémosidérose (transfusions)
o 1 ml de sang = 500 mg de fer.
Non utilisation de fer par les érythroblastes : absence d’érythropoïèse (anémie aplastique).
Réduction de la restitution du fer aux érythroblastes par les macrophages.
o Infections.
o Etats inflammatoires.
o Cancers.
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Métabolisme du fer intracytoplasmique


- Transfert du Fe cytoplasmique sur la ferritine (stockage du Fe en excès).
- D’autres protéines à forte affinité peuvent également chélater le Fe (lactoferrine).
- Passage du Fe++ dans les mitochondries et conjugaison à la protoporphyrine IX en présence de ferrochélase ou
hème-synthétase pour former l’hème.

Sidéroblastes
Ce sont des érythroblastes contenant du fer. Ils peuvent être colorés par la réaction au bleu de Prusse (Perls).
Normalement, de 20 à 50% des érythroblastes sont identifiables comme étant des sidéroblastes.
Les granules qu'ils présentent résultent de l'agrégation de la ferritine intracytoplasmique.
Dans des circonstances pathologiques caractérisés par une altération de la synthèse de l'hème ou de la globine, du
fer s'accumule dans les mitochondries; on observe alors des
granules présentant une disposition périnucléaire
caractéristique (sidéroblastes en anneaux).

XI. Oxygène
a. Apport périnatal en O2
L'approvisionnement prénatal en oxygène est essentiellement
optimisé par trois facteurs:
- une affinité élevée de l'HbF pour l'oxygène
- un hématocrite embryonnaire élevé
- le pH (effet Bohr)
Les concentrations en O2 en rapport avec la pression partielle
d'oxygène (PO2) sont représentées sur les deux courbes
correspondant aux sangs maternel et fœtal au moment de la naissance. Lors des échanges gazeux dans le placenta la
concentration en O2 dans le sang maternel s'abaisse de 9 % vol alors que dans le sang fœtal elle augmente de 7 %
vol. On remarque donc qu'à pression partielle identique (ex. 50 mm Hg) le sang fœtal peut lier nettement plus d'02
(22 %) que celui de la mère (12 %).

b. PO2 tissulaire
La concentration en oxygène tissulaire dépend de:
- L’activité métabolique.
- L’apport en oxygène : concentration en Hb.
L’apport en oxygène dépend :
- Du débit sanguin fonction du débit cardiaque.
- De la PO2 sanguine qui dépend de la PO2 atmosphérique et de la fonction pulmonaire.
- De l’affinité de l’Hb pour l’oxygène.

c. Contrôle de l’apport en O2
En cas de diminution de l’Hb :
o Augmentation de la ventilation pulmonaire.
o Augmentation du débit cardiaque.
o Augmentation de la saturation de l’Hb en O2 (P50).
La concentration en Hb est aussi fonction du rapport entre le volume érythrocytaire et le volume plasmatique,
c’est-à-dire l’hématocrite .
o Diminution du rapport → diminution de la viscosité sanguine.
o Augmentation du rapport → augmentation viscosité sanguine → diminution de l’apport en O2 aux
tissus.
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XII. Besoins fondamentaux de l’érythropoïèse


Acides aminés Les AA sont nécessaires à la synthèse protéique.
Si l’apport en acides aminés diminue, la synthèse de l’Hb diminue et cela peut induire des
anémies.

Vitamines ➢ B12 & acide folique (synthèse ADN)


o Aliments d’origine animale.
o Vit B12 est absorbé par l’iléon après conjugaison dans l’estomac avec un “R-binder”
et le facteur intrinsèque.
o Transportée aux cellules par des transcobalamines.
➢ B6 coenzyme intervenant dans de nombreuses réactions métaboliques.
➢ B2 (riboflavine).
➢ Acide nicotinique : synthèse des pyridines.
➢ Acide ascorbique (Vit C) prévient l’oxydation des folates.
➢ Vitamine E, anti-oxydant protégeant les lipides membranaires (acides gras
polyinsaturés).

Minéraux Les minéraux interviennent dans la composition des enzymes suivantes :


➢ Cuivre
o Céruloplasmine.
o Superoxyde-dismutase.
o Cytochrome-oxydase (capture du Fe par les mitochondries)
➢ Cobalt
o Composant de la vitamine B12.
➢ Sélénium
o Glutathion-peroxydase.
➢ Zinc
o Anhydrase carbonique.
o Superoxyde-dismutase.

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Chap 4 : Granulopoïèse
I. La cellule souche myéloïde primitive BI-CFC
La BI-CFC est une cellule souche myéloïde plus ancestrale que la CFU-GM qui a la propriété d'adhérer aux cellules du
stroma médullaire (macrophages, fibroblastes, cellules endothéliales et adipocytes).

Mise en évidence des BI-CFC


La culture de cette cellule souche requiert la préparation in vitro d'un stroma médullaire.
➢ Préparation du stroma durant 6 à 8 semaines dans un milieu α-MEM (Modified Eagle Medium) en présence de
méthylprednisolone 1,7 10^-6 M : après quelques semaines, formation de fibroblastes, de macrophages et
d'adipocytes.
➢ On dépose (sur le stroma) des cellules médullaires allogéniques (d'un autre individu) dont on a au préalable
enlevé les cellules adhérentes (monocytes, macrophages et certains lymphocytes). Les cellules médullaires non-
adhérentes sont incubées pendant 2 heures avec les cellules du stroma.
➢ Après 5j d’incubation (à 37°C et 7,5% de CO2), on observe au sein même du stroma médullaire des colonies de
cellules souches primitives
Composition du stroma médullaire :

Influence des conditions de culture :


MEM α + 15 % FCS Fibroblastes
MEM α + 15 % FCS + méthylprednisolone 10-^6 Fibroblastes + Adipocytes
M
MEM α + 15 % FCS + phytohemagglutinine Macrophages
(PHA)
FCS : sérum de veau fœtal

Caractéristiques des BI-CFC


➔ Adhèrent au stroma médullaire.
➔ Capables d'auto-renouvellement (pour le type 1 seulement).
➔ Expriment l'antigène HLA-DR

Nombre de BI-CFC
Nombre/ 10^5 cellules % en phase S
Moelle 81 +- 11 0
Sang 1,5 +- 0.5 0
Types de BI-CFC
Description Fréquence (%)
Type I Cellules homogènes immatures sans granulations. 66
Type II Cellules homogènes plus mûres contenant des 32
granulations
Type III Cellules mûres identiques aux colonies de CFU-GM. 2

Le développement des cellules souches myéloïdes primitives ne nécessite pas de facteurs de croissance exogène.

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Molécules d’adhésion
ELAM-1 endothelial leucocyte adhésion molecule-1
ICAM-1intercellular adhesion molecule-1
ICAM-2intercellular adhesion molecule-2
VCAM vascular cell adhesion molecule
GMP-140 granule membrane protein-140 (CD62)
PECAM platelet endothelial cell adhesion molecule (CD31

Cinétique d’adhérence au stroma :


La cinétique de fixation des cellules souches primitives aux sites récepteurs du
stroma obéit à une relation linéaire pour des temps compris entre 30 minutes
et 2 heures. Après un contact de 2 heures, toutes les cellules souches
primitives ont adhéré au stroma.

II. Progéniteurs myéloïdes


Non-identifiables au microscope Identifiable au microscope
➔ CFU-GM ➔ Myéloblaste
➔ CFU-G ➔ Promyélocyte
➔ CFU-M ➔ Myélocyte
➔ Métamyélocyte
➔ Polynucléaire non-segmenté

La cellule souche myéloïde CFU-GM (Colony Forming Unit-Granulocyte Macrophage)


Les progéniteurs myéloïdes ont été baptisés CFU-GM (Colony Forming Unit Granulocytes - Macrophages). Ce sont
des cellules souches engagées capables de se différencier en granulocytes neutrophiles, éosinophiles et basophiles
ou en monocytes macrophages. Ce sont les précurseurs de la lignée myéloïde. Cette cellule souche est
essentiellement présente dans la moelle osseuse; on en trouve très peu dans le sang et la rate chez l'individu
normal.
➔ Différenciation des CFU-GM en :
o Polynucléaires neutrophiles.
o Polynucléaires éosinophiles.
o Polynucléaires basophiles.
o Monocytes-Macrophages.
➔ Morphologie des colonies :
o Clusters de 3 - 40 cellules.
o Colonies > 40 cellules.
Caractéristiques des CFU-GM
Hétérogénéité - Plusieurs sous-populations :
des colonies o Maturité après 7 jours de culture.
o Maturité après 15 jours de culture.
o Expression d’antigènes de surface différents.
- CFU-Eo : colonies d’éosinophiles.
- CFU-M : colonies de monocytes-macrophages.
CFU-G : colonies de granulocytes.

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Nombre de CFU-
GM

Nombre de - Moelle : 30 - 40 %
cellules en phase - Sang : 3 - 13 %
S
Différenciation
des CFU-GM

Vitesse de
sédimentation

Facteurs de croissance
Colony Stimulating Factor (CSF) est indispensable à la prolifération des CFU-GM. Les CSF sont produits par
différentes cellules :
➔ Monocytes-Macrophages.
➔ Cellules placentaires.
➔ Leucocytes stimulés par la PHA.
➔ Cellules pulmonaires.
➔ Les CSF doivent être présents durant toute la durée de la culture. Fonctions :
➔ Stimulent la synthèse du mRNA.
➔ Stimulent la synthèse des protéines
Le CSF est un nom sous lequel sont regroupées plusieurs glycoprotéines ayant une activité stimulante comme le GM-
CSF (Granulocyte-macrophage colony stimulating factor), le G-CSF (Granulocyte colony stimulating factor) et IL-3.

G-CSF ➢ Stimule la prolifération des CFU-G.


➢ Induit la différenciation de lignées leucémiques.
➢ Provoque la libération des granulocytes et des cellules souches de la
moelle.
M-CSF ➢ Stimule in vitro, la prolifération des CFU-M.
➢ Assure la survie et la différenciation des macrophages.

Inhibiteurs des CFU-GM


Effet direct sur la ➢ Lipoprotéines sériques.
prolifération des ➢ Prostaglandines E2
CFU-GM o Exogènes
o Produites par les monocytes (10-10 M)
➢ Isoferritine acide.
➢ Interférons α, β et γ.
➢ Facteur nécrosant des tumeurs (formes α et β) :
o Agissent en synergie avec interféron γ.
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o Augmentation de l’expression des récepteurs au TNF par l’interféron


γ.
o Induisent également la différenciation des CFU-GM.
➢ Suppression immunologique.
o Anémie aplastique.
o Syndrome de Diamond-Blackfan (anémie arégénérative).
➢ Toxicité médicamenteuse.
Effet indirect sur ➢ Polynucléaires mûrs inhibent la croissance des CFU-GM.
la production de o Effet de la Lactoferrine (glycoprotéine de 80.000100.000 kDa).
CSF ▪ Agit directement sur la production de CSF par les monocytes.
▪ Agit indirectement sur la production de CSF par inhibition de la
production d’IL-1.
➢ Chez la souris :
o Inhibition de la fraction de CFU-GM en phase S.
o Pas de diminution de la leucocytose.

III. Différenciation de la lignée myéloïde


➔ Lignée neutrophile
➔ Lignée éosinophile
➔ Lignée basophile

Les trois séries granulocytaires (neutrophile, éosinophile, basophile) ont une évolution parallèle.
Les lignées granulocytaires neutrophiles, éosinophiles et basophiles ne s'individualisent morphologiquement qu'à
partir du stade myélocytaire.

Myéloblaste ✓ Taille : 10 - 18 μm.


✓ Rapport nucléocytoplasmique important
o Grand noyau.
o Peu de cytoplasme.
✓ Chromatine fine.
✓ Présence de nucléoles.
✓ Pas de granulations spécifiques.
Vu le peu de caractéristiques morphologiques, le myéloblaste
est difficile à distinguer des autres types de blastes :
monoblaste, lymphoblaste...

Promyélocyte ✓ Taille : 12 - 20 μm.


✓ Plus grand que le myéloblaste.
✓ Chromatine fine.
✓ Présence de nucléoles.
✓ Apparition des granulations primaires azurophiles.
o Granulations de 1 μm contenant des enzymes
lysosomiaux

Myélocyte ✓ Taille : 10 - 18 μm.


✓ Noyau excentrique.
✓ Chromatine plus condensée (masses chromatiniennes).
✓ Plus de nucléoles.
✓ Basophilie du cytoplasme diminue (perte des ribosomes).
✓ Disparition progressive des granulations primaires : granulations secondaires.
o Granulations de 0.5 μm contenant des enzymes lysosomiaux et des protéines.

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Myélocyte neutrophile Myélocyte éosinophile Myélocyte basophile

Métamyélocyte ✓ Taille : 10 - 18 μm.


✓ Noyau réniforme excentré.
✓ Plus de nucléoles.
✓ Nombreuses granulations secondaires au niveau du cytoplasme.
✓ Perte des capacités de prolifération.

Métamyélocyte neutrophile Métamyélocyte éosinophile Métamyélocyte basophile


Polynucléaire ✓ Apparaissent dans la circulation sanguine.
non segmenté ✓ Représentent entre 3 - 5 % des cellules sanguines.
✓ Stade intermédiaire entre le métamyélocyte et le polynucléaire
segmenté.
✓ Noyau segmenté en 2 lobes.

Caractéristiques biochimiques des granulations


Granulations Contiennent des hydrolases, des protéines cationiques, des bactéricides, des
azurophiles mucopolysaccharides, des lysozymes.
(1aires)
Granulations Contiennent des lysozymes, lactoferrine, collagénase, protéine fixant la vit
neutrophiles B12, enzyme clivant le C5a, Tissue Plasminogen Activator (t-PA), cytochrome
(2aires) b558.
Granulations Contiennent des gélatinases.
3aires
Phagosomes Contiennent de la phosphatase alcaline.

a. Polynucléaire neutrophile (PMN)


Noyau - Chromatine nucléaire est très dense.
- Apparition de plusieurs lobes nucléaires reliés par de fines
structures de DNA.
- Le noyau contient entre 2 à 5 lobes selon l’âge de la cellule.
- Présence d’appendice nucléaire chez les femmes (corpuscule de
Barr).

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Cytoplasme - Taille : 12 - 14 μm.


- Présence de 80 - 90 % de granulations secondaires spécifiques.
- Persistance de 20 - 10 % de granulations primaires.
- Pauvre en ribosomes, en RE et en mitochondries.
- L’appareil de Golgi est peu développé.
- Présence de vacuoles.
- Particules de glycogène.

Durée de vie - Moins de 24 heures dans le sang périphérique.


- Mort par apoptose.
- Le noyau devient pycnotique puis se fragmente en corps apoptotiques.

Fonctions des PMN


La fonction essentielle des PMN est de tuer les micro-organismes.
Adhérence ➢ Le Rolling des PMN qui s’attachent à l’endothélium d'une manière faible.
➢ Il résulte de l'action des cytokines inflammatoires sur :
o les cellules endothéliales (qui expriment alors les sélectines P et E)
o les polynucléaires (qui expriment alors la sélectine L).
➢ Une adhésion plus forte est alors permise par les intégrines interagissant entre elles
➢ Le granulocyte change alors de forme et migre à travers l'endothélium.

Chimiotactisme Le chimiotactisme est un mouvement de la cellule dans une direction donnée, en réponse à un
gradient de concentration d'un médiateur chemo-attractant.

Les agents cytotaxigènes ne sont pas directement chimiotactiques mais interagissent avec :
- Le plasma, le complément, les mastocytes et les lymphocytes sensibilisés.
Ils génèrent des facteurs chimiotactiques :
- Complexe Ag-Ac.
- Endotoxines.
- Zymosan.
- Bactéries.
- Enzymes réagissant avec le complément.

Les cytotaxines ont une action directe sur les phagocytes produits par des micro-organismes :
- Oligopeptides possédant une extrémité N-formyl, apparentés au produit synthétique N-formyl-
met-leuc-phe (FMLP)
- Lipides

Produits de l'interaction entre des micro-organismes et des protéines sériques :


- C5a
- Endotoxines
- Protéases
- Plasmine, fibrinopeptides
- Kinines, kallikréine
- Leucoégressine (dérivé des IgG)

Produits dérivés des leucocytes et/ou des plaquettes :


- Dérivés de l'oxydation de l'acide arachidonique
- Leucotriènes
- Lactoferrine
- Protéases, collagénases

31
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- Lymphokines produite par les macrophages

Locomotion des PMN :


➢ Sans stimulant chimiotactique : migration et émission de pseudopodes dans toutes les
directions.
➢ En présence d’agents chimiotactiques : migration et émission de pseudopodes dans la
direction du gradient de l’agent chimiotactique.

Méthodes d’évaluation :
➢ Technique de la chambre de Boyden : Il s'agit d'une chambre comportant deux
compartiments séparés par un filtre dont les pores sont suffisamment petits pour empêcher
le passage passif des polynucléaires, mais suffisamment grands pour permettre leur
migration active. La suspension leucocytaire est introduite dans le compartiment supérieur
et le chémoattractant dans le compartiment inférieur. Après un temps déterminé, on
compte les leucocytes adhérant à la face inférieure du filtre.

➢ Technique de migration en agarose : La suspension leucocytaire est déposée dans un puits


creusé dans un gel d'agarose. Les cellules tendent à migrer dans l'agarose environnant le
puits. Si un agent chémoattractant a été introduit dans un autre puits, la migration s'oriente
en direction de ce puits

Phagocytose Lorsque le polynucléaire arrive au contact des micro-organismes, il s’y fixe via des opsonines.
Ceux-ci peuvent alors être ingérés.

Les immunoglobulines sont des anticorps spécifiques, qui se fixent sur les micro-organismes via
leur fragment (F(ab')2), et dont le fragment Fc peut s'attacher à des récepteurs Fc présents à la
surface des polynucléaires neutrophiles. Ce sont essentiellement des IgG, principalement des
IgG1 et des IgG3.
Des composants du complément : la principale opsonine générée à partir du complément est le
C3b, qui se fixe sur des récepteurs spécifiques pour le C3b et le C3bi (CR1 et CR3), présents à la
surface des polynucléaires neutrophiles.

La particule adhère au polynucléaire et est progressivement entourée par des pseudopodes, qui
finissent par se réunir en l'encerclant complètement.
L'ingestion est également influencée par des modifications de l'environnement local. Les
facteurs suivants jouent un rôle important :
➢ Les taux des cations bivalents (Ca++, Mg++), qui sont indispensables à la phagocytose.
➢ ↓ si la T° ↓
➢ ↓ à pH acide (urine)
➢ ↓ si la pression osmotique ↑
➢ La tuftsine : cette substance (1-thréonyl-L-lysyl-L-propylL-arginine) stimule la phagocytose
d'une manière différente des opsonines; en effet, elle se fixe sur le phagocyte et non sur la
particule. La tuftsine est libérée à partir des IgG.

Mesure de la phagocytose :
Dans un premier temps, le micro-organisme (bactérie donnée ou levure) est incubé en présence
d'une source d'opsonines (du sérum normal de référence, soit le matériel dont les propriétés
opsonisantes sont à tester).
Dans un second temps, les particules opsonisées sont incubées en présence de PMN à tester.
Afin d'évaluer le nombre de micro-organismes ingérés, plusieurs méthodes peuvent être
utilisées.
- les méthodes microscopiques consistent à dénombrer au microscope le nombre de
particules. ingérées;
32
Garabet Ani Hématologie normale BIME 2018-2019

- les méthodes isotopiques, on utilise des micro-organismes préalablement marqués par


un isotope radioactif et l'on compte finalement la radioactivité des leucocytes;
- cytométrie de flux à l’aide de bactéries conjuguées à un fluorochrome.

Dégranulation La dégranulation consiste en la vidange du contenu des granulations à l'intérieur du phagosome.


Ce mécanisme peut être décrit de la manière suivante :
- Les granulations se déplacent vers le phagosome.
- La membrane des granulations fusionne avec celle du phagosome.
- La membrane devenue commune se lyse, permettant la vidange du contenu granulaire
dans le phagosome.

Explosion La phagocytose s'accompagne d'une activation importante du métabolisme des polynucléaires


respiratoire neutrophiles.

Mécanisme :
L'explosion respiratoire implique l'activation d'un système oxydasique "dormant" dans les
polynucléaires neutrophiles non stimulés et situé au niveau de la membrane plasmatique.
Phosphorylation par une protéine kinase de protéines du système oxydasique.
Le système oxydasique permet la réduction de l'oxygène moléculaire en anions superoxydes
(formation de H2O2 à partie de O2-).
L’H2O2 est catabolisé par :
- Catalase.
- Système glutathion réductase glutathion peroxydase.

Evaluation :
➢ Chimiluminescence des PMN : durant l'explosion respiratoire, les PMN émettent de la
lumière. Cette chimiluminescence résulte de l'action des dérivés de l'oxygène produits au
cours de l'explosion respiratoire sur certains composants des PMN ou sur les agents
stimulants. La lumière émise peut être mesurée en mettant la suspension de polynucléaires
neutrophiles dans une fiole introduite dans un compteur à scintillation liquide. Certaines
variantes de cette technique ont été décrites; l'une d'entre elles consiste à amplifier la
lumière émise en ajoutant du luminol à la suspension de polynucléaires neutrophiles;
➢ Le NBT est une substance soluble et incolore qui est réduite par le superoxyde en formazan,
substance insoluble qui précipite en présence ce O2- :
NBT + O2- → formazan + O2

« Killing » Le "killing" des micro-organismes ingérés peut résulter de l'intervention de systèmes "oxygène-
dépendants" c'est-à-dire requérant la participation des dérivés de l'oxygène qui sont produits
au cours de l'explosion respiratoire, et de systèmes "oxygène-indépendants". Lorsque le micro-
organisme présent dans le phagosome est une bactérie, le "killing" s'appelle aussi "bactéricidie".

Mécanisme :
➢ Mécanismes O2 -dépendant-MPO indépendant
o L’OH- et ¹O2 oxydent les composants bactériens.
➢ Mécanismes O2-dépendant-MPO dépendant
o Génération d’hypochlorite ClO- qui oxyde différents composés bactériens.
➢ Mécanismes O2 - indépendant
o pH acide des phagolysosomes.
o Lysozyme.
o Défensines et protéines cationiques. !Lactoferrine
▪ Privation du Fe nécessaire à certains micro-organismes.
▪ Potentialise l’action du lysozyme.

33
Garabet Ani Hématologie normale BIME 2018-2019

Evaluation :
➢ Incubation des PMN en présence de bactéries opsonisées.
➢ Après l'ingestion d'une partie des bactéries, on lave les PMN afin de se débarrasser des
bactéries non ingérées.
➢ Incubation des PMN pendant des périodes déterminées (0,50 et 120 minutes).
➢ Lyse des PMN
➢ Pourcentage des bactéries survivantes est déterminé.

Digestion des La digestion des micro-organismes tués résulte surtout de l'action des hydrolases acides, mais
germes tués d'autres enzymes (protéases neutres, élastase) peuvent aussi intervenir. La digestion ne requiert
pas l'intervention du métabolisme énergétique des leucocytes. Sa rapidité diffère d'un micro-
organisme à l'autre, et d'un composant à l'autre (protéines, lipides, ARN, ADN).

Cinétique des PMN


Le cycle de vie des polynucléaires neutrophiles peut être divisé en plusieurs compartiments : médullaires, sanguin et
tissulaire. Les compartiments médullaires sont eux-mêmes au nombre de trois :
Compartiments :
Médullaire Compartiment des précurseurs non-identifiables : incluant des cellules souches pluri et unipotentes.

Compartiment mitotique : incluant les myéloblastes, les promyélocytes et les myélocytes.

Compartiment de maturation et de stockage : incluant les métamyélocytes, les polynucléaires non


segmentés et les polynucléaires neutrophiles segmentés.

Sanguin ➢ Pool des polynucléaires circulants.


➢ Pool des polynucléaires marginalisés : adhèrent à la paroi des vaisseaux (veinules
postcapillaires).

Tissulaire Migration des polynucléaires vers les tissus où ils vont exercer leurs actions physiologiques.

Les facteurs qui contrôlent le relargage de ces cellules dans le sang comportent entre autres :
- Diamètre des pores des sinusoïdes médullaires.
- Maturité des cellules (les polynucléaires neutrophiles pénètrent plus facilement dans la lumière des
sinusoïdes que les métamyélocytes, et ces derniers plus facilement que les myélocytes).
- Facteurs stimulants.
- Perte de molécules d’adhésion
La cinétique des PMN dans le sang
Cela a été étudié grâce à un traceur radioactif. On constate :
- La radioactivité disparaît du sang de façon exponentielle. ( Temps de demi-vie ~ 7 heures).
- Echanges entre le compartiment sanguin et tissulaire se fait au hasard.
- Pas de retour des PMN tissulaires vers le sang.
Destruction des PMN
Une partie d'entre eux est éliminée dans la salive, dans le tractus digestif et dans les urines et une partie s'accumule
dans les poumons, le foie et la rate, où ils peuvent être détruits.
Modulation de la cinétique des PMN
Démarginalisation L'épinéphrine entraîne en quelques minutes une augmentation du pool de granulocytes
circulants de l'ordre de 50%, sans modifier le pool total de granulocytes; cette hormone agit
en "démarginant" les cellules.
Marginalisation L'injection d'endotoxines bactériennes entraîne après 90 minutes une neutropénie
transitoire, due à la marginalisation accrue des polynucléaires neutrophiles sanguins.
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Garabet Ani Hématologie normale BIME 2018-2019

Utilisation du - Endotoxine bactérienne (5 heures).


pool médullaire - Etiocholanolone.
- Facteurs de croissance (G-CSF, GM-CSF).
- LIF (leukocytosis inducing factor).
- C3 du complément.

b. Polynucléaire éosinophile
➔ Les facteurs stimulants sont :
o GM-CSF, IL3 et IL5.
➔ Noyau généralement bilobé.
➔ Granulations de grandes tailles de couleur orange-vert.
➔ Numération absolue plus fiable (50 - 500 µl) que la formule leucocytaire (0 - 3 %).
Les causes d'hyperéosinophilie sont nombreuses :
o Allergie (asthme, eczéma, rhume des foins)
o Affections auto-immune (polyarthrite noueuse...)
o Affections parasitaires (parenchymateuse > intestinale)
o Médicaments (sels d'or, Zyloric, Pénicilline...)
o Lésions cutanées
o Certains cancers :
▪ Maladie de Hodgkin - Lymphome non-Hodgkinien - Leucémie myéloïde chronique - Cancers
métastatiques.
Structure - Noyau bilobé.
- Ribosomes, RER, Golgi + développé : capacités de synthèse + importante.
- Granulations éosinophiles
o Corps elliptoïdaux
▪ Noyau cristalloïde.
▪ Matrice moins dense.
o Granulations plus fines.
Contenu Peroxydase, β-glucuronidase, Phosphatases acides, Arylsulfatase, Histaminase,
enzymatique Phospholipase D., Lysophospholipase, Major Basic Protein (MBP) (éosinophilie), Eosinophil
semblable au Cationic Protein (ECP).
PMN
Fonctions - Attirés par les agents chimiotactiques des bactéries ou composants du complément.
- Ingèrent micro-organismes.
- Déverser le contenu de leurs granulations dans les phagosomes.
- Tuent les micro-organismes ingérés.
- Moins efficaces que les polynucléaires neutrophiles.
- Contrôle de la réaction d’hypersensibilité immédiate.

Contrôle de la réaction d’hypersensibilité immédiate


Lorsque les polynucléaires éosinophiles sont arrivés dans un site de réaction d'hypersensibilité, ils sont capables
d'inactiver les mastocytes de diverses manières :
- Elaborent l’Eosinophil Derived Inhibitor qui inhibe ainsi la dégranulation des mastocytes.
- Phagocytent les granules libérés par les mastocytes.
- Relarguent la MBP qui inactive l'héparine libérée par les mastocytes.
- Relarguent leurs enzymes qui dégradent divers médiateurs provenant des mastocytes (histaminase).
Médiateurs des mastocytes :
L'histaminase dégrade l'histamine.
L'arylsulfatase B inactive le SRS-A ("Slow Reacting Substance of Anaphylaxis").

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La phospholipase D inactive le PAF ("Platelet Activating Factor").


La lysophospholipase détruit les lysophospholipides (LPL) relargués par les mastocytes.

Destruction des helminthes :


Les polynucléaires éosinophiles ont la propriété d'induire la destruction anticorps-dépendante ou
complément-dépendante des stades larvaires de certains parasites (les helminthes) lorsque ceux-ci infestent
l'organisme.
Les polynucléaires éosinophiles possèdent à leur surface des récepteurs pour les fragments Fc des Ig et pour
les fragments C3 du complément; ces récepteurs leur permettent d'adhérer aux larves recouvertes d'anticorps IgG
et de C3b.
L'adhérence des polynucléaires éosinophiles est suivie de leur dégranulation. Les lésions consécutives qui
apparaissent dans les parasites résultent de l'intervention de plusieurs mécanismes :
- Des mécanismes oxydatifs : ils incluent la participation d'O2-, ou de l'H2O2 ou d'une halogénation de la
membrane du parasite par l'action conjointe de l'H2O2 et de la peroxydase des polynucléaires éosinophiles.
- MBP semble jouer un rôle important à deux niveaux. D'une part, elle se comporte comme un ligand qui renforce
la liaison du polynucléaires éosinophiles au parasite; d'autre part, elle peut être directement toxique pour ce
dernier.
- ECP est vraisemblablement toxique elle aussi pour le parasite.

Cinétique des éosinophiles (mal connue)


Compartiment médullaire Se divise lui-même en :
- Compartiment des précurseurs (comportant la cellule-souche pluripotente et
la cellule "déterminée" pour l'éosinophilopoïèse ou CFU-Eo).
- Compartiment mitotique.
- Compartiment de maturation et de stockage.
Chez l'homme, le temps de transit médullaire serait de 9 jours.
Les éosinophiles passant 2,5 jours dans le compartiment post-mitotique.

Compartiment sanguin Demi-vie des éosinophiles dans le sang ~3-8H


Compartiment tissulaire Les polynucléaires éosinophiles s'accumulent surtout dans le tube digestif, peau,
poumons, voies urinaires, utérus.
Ils y survivent plus longtemps que les polynucléaires neutrophiles.

Régulation de la production des éosinophiles


Facteurs stimulants Facteurs inhibiteurs
- Substances produites par les lymphocytes T. - Corticostéroïdes.
- Eosinopoïétine : facteur soluble indépendant des - ACTH.
lymphocytes T.
- Histamine.
- IL5.

c. Polynucléaire basophile
➔ Présence de grosses granulations bleu-noires qui remplissent tout le cytoplasme. Ces
granules contiennent de l’histamine et de l’héparine
➔ Le nombre augmente dans la leucémie myéloïde chronique (facteur de mauvais pronostic).

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Structure - Abondantes granulations rondes ou ovales basophiles


o Métachromatiques (capables de modifier la couleur naturelle d’un colorant).
o Amas de particules.
o Circonscrit par une membrane.
- Granulations plus fines près du noyau.
- Noyau bi ou trilobé.
Composition - Glycosaminoglycanes sulfatés (basophilie).
des - Histamines (source principale de l’histamine circulante).
granulations - Protéases neutres.
- Histidine-décarboxylase.
- Médiateurs de l’hypersensibilité immédiate

Rôle dans l’hypersensibilité immédiate


Les polynucléaires basophiles partagent avec les mastocytes un rôle important dans les réactions d'hypersensibilité
immédiate.
Ces cellules portent sur leur membrane des récepteurs pour le fragment Fc des IgE. Lorsque les IgE fixées à leur
surface sont réunies par des antigènes bi- ou multivalents, le processus de dégranulation anaphylactique se
déclenche.
Ce processus, qui requiert l'intervention de Ca++, conduit à la fusion des membranes des granulations avec la
membrane plasmatique.
Médiateurs relargués (manifestation anaphylactique) :
Il en résulte la libération massive :
- D'histamine qui augmente la perméabilité vasculaire
- Glycosaminoglycanes
- ECP ,
- SRS-A
- Métabolites de l'acide arachidonique
- PAF, qui provoquent les manifestations anaphylactiques.
Des stimuli divers peuvent de plus provoquer la dégranulation massive des polynucléaires basophiles et des
mastocytes sans l'intervention des IgE; il s'agit de certains fragments du complément (C3a et C5a ou
anaphylatoxines), de protéines provenant des lysosomes des polynucléaires, de certains peptides basiques ou
hormones peptidiques, de venins d'insectes, du froid ou de certaines drogues.
Hypersensibilité cutané
Les polynucléaires basophiles participent à la réaction d'hypersensibilité cutanée dépendant de l'intervention des
lymphocytes T.
Après l'exposition de la peau à certains immunogènes (certains allergènes de contact, virus, parasites, tumeurs ou
allogreffes), les lymphocytes T s'activent et relarguent des produits qui entraînent une chémoattraction des
polynucléaires basophiles dans la peau, ainsi que leur dégranulation progressive.
Cinétique de prolifération
On suppose que les polynucléaires basophiles sont produits dans la moelle d'une manière assez similaire aux
polynucléaires éosinophiles. Les index de marquage des myélocytes neutrophiles éosinophiles et basophiles sont à
peu près identiques.
La cinétique médullaire est elle aussi assez semblable : après injection de thymidine tritiée in vivo, un marquage
s'observe :
- après 3 heures dans les métamyélocytes basophiles.
- après 1 jour dans les basophiles non-segmentés.
- après 1,5 jour dans les polynucléaires basophiles segmentés médullaires.
- après 2,5 jours dans les polynucléaires basophile.

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La demi-vie des polynucléaires basophiles dans le sang semble être de 1 à 3 jours; ils passent progressivement dans
les tissus où leur durée de vie et les mécanismes de destruction sont inconnus. Les polynucléaires basophiles
tissulaires ne donnent pas naissance aux mastocytes. La croissance est stimulée par des facteurs produis par les
lymphocytes T.

IV. Contrôle de la granulopoïèse


Les points de contrôle les plus critiques se situent vraisemblablement à ces niveaux :
- Flux de cellules-souches pluripotentes vers le compartiment des cellules souches "déterminées" pour la
granulopoïèse
- Nombre de divisions.
- Temps de doublement.
- Libération dans la circulation.
L’effet au niveau des cellules souche est tardif mais persistant.
L’effet au niveau des cellules mûres (marginalisation et démarginalisation) est immédiat, transitoire mais
évanescent.

CHAP 5 : La lignée monocytaire


Le système monocyte-macrophage ou "système phagocytaire mononucléé" est constitué de trois compartiments :
Compartiment Constitué de :
médullaire - CFU-M.
- Monoblastes.
- Promonocytes.
- Monocytes.
Compartiment sanguin Constitué de :
- Monocytes.
Compartiment tissulaire Constitué de :
(ou histiocytes) - Macrophages (différenciation des monocytes sanguins).

Monocytes
- Le noyau est réniforme et contient un ou deux nucléoles.
- La membrane plasmique comporte des microvillosités et forme des vésicules de
micropinocytose.
- L’appareil de Golgi est bien développé mais il y a peu de RER.
- Nombreux sont les ribosomes, mitochondries, microtubules et microfibrilles disposées en
faisceau autour du noyau.

Macrophages
1. Maturation des monocytes en macrophages
Augmentation de/du/des :
- La taille de la cellule.
- Volume de l’appareil de Golgi.
- Nombre de lysosomes 1aires et de l’activité des enzymes lysosomiales suivantes :
o β-glucuronidase, phosphatase acide, cathepsines, lysozyme, sulfatases, glycuronidases.
- Propriétés phagocytaires :
o Augmentation du nombre de vacuoles de phagocytose et pinocytose.

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2. Macrophages tissulaires
Une des fonctions des macrophages tissulaires est la phagocytose. Les macrophages tissulaires peuvent être :
➢ Fixés : attachés aux fibres de collagène ou de réticuline.
➢ Libres : capables de mouvement.
Ils prennent un aspect variable selon le tissu où ils se trouvent :
➢ Cellules de Kupffer (foie).
➢ Macrophages
o Médullaires.
o Spléniques.
o Ganglionnaires.
o Péritonéaux.
o Synoviaux.
o Alvéolaires.
➢ Cellules de Langerhans (derme).
➢ Ostéoclastes.
➢ Cellules microgliales (cerveau).

3. Activité métabolique
- Le nombre de mitochondrie a augmenté dans le macrophage.
- La glycolyse et l'activité respiratoires sont plus intenses :
o L'énergie est fournie par la voie glycolytique et par la voie aérobie; cette activité se maintient aussi en
anaérobiose, sauf dans les macrophages alvéolaires.
o L’énergie fournit permet la phagocytose.
- L'activité phagocytaire est inhibée en anaérobiose sévère.
- Perte de l’activité peroxydasique.

4. Récepteurs des macrophages


Les macrophages possèdent des récepteurs pour :
➔ Le fragment Fc des IgG.
➔ Le C3 du complément.
➔ Les lymphocytes.
Ces récepteurs sont plus nombreux dans les macrophages; ils leur permettent d'ingérer plus facilement les particules
opsonisées.
Opsonisation = une molécule (alors qualifiée d'opsonine) recouvre la membrane d'une cellule cible (une bactérie ou
une cellule du corps infectée par un agent pathogène) pour favoriser sa phagocytose par une cellule dotée de
récepteurs pour les opsonines.

5. Activation des macrophages


L'activation des macrophages est leur passage dans un état où ces cellules présentent un accroissement de mobilité,
de métabolisme, d'adhérence au verre, de l'activité lysosomiales et de "killing".
L'activation s'accompagne d'une augmentation de synthèse des :
- Protéases neutres - Prostaglandines
- Hydrolases acides - Facteurs chimiotactiques pour les polynucléaires
- Composants du complément neutrophiles
- Inhibiteurs enzymatiques - Interféron
- Pyrogènes endogènes - CSF

6. Déclenchement de l’activation
L'activation peut être déclenchée par le contact avec :
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➔ Les micro-organismes.
➔ Des produits relargués par les micro-organismes, notamment, :
o Les récepteurs pour le fragment Fc
o Le récepteur pour le C3
o Des lymphokines
o Le TNFα.

7. Destruction des micro-organisme


Les polynucléaires neutrophiles, les monocytes et les macrophages constituent le système phagocytaire.
Les polynucléaires ont une activité bactéricide plus importante et le chimiotactisme est plus actif sur ceux-ci.
Les macrophages phagocytent les grosses particules. Ils produisent les interférons α et β, qui protègent l'organisme
contre les agressions virales. Les protéines cationiques possèdent une activité antifongique.

8. Dégradation des cellules sénescentes


Les macrophages phagocytent :
- Les fragments d'hématies libérées lors de leur vieillissement (catabolisme de l’hémoglobine).
- Les leucocytes.
- Les plaquettes.
- Les cellules opsonisées.

9. Phagocytose des déchets


Les macrophages phagocytent ou pinocytent des débris inorganiques qui peuvent pénétrer dans l'organisme (silice,
charbon, asbeste, colloïdes...). Certains matériaux ingérés, tels l'asbeste, peuvent entraîner des lésions, et
éventuellement la mort, des macrophages.

10. Rôle dans les réactions inflammatoires.


Les macrophages sécrètent différentes substances pro-inflammatoire :
- Facteur chimiotactique pour les polynucléaires neutrophiles
- Platelet Activating Factor (PAF)
- O2 - H2O2
- Enzymes : collagénase, élastase, protéases neutres, phosphatase acide, estérases.
- Facteurs du complément
- Lysozyme - Pyrogène endogène

Effets + Effets -
Protection contre les Lésion des tissus normaux.
agressions extérieures. Génération d’activités procoagulantes :
➔ Thromboplastine tissulaire.
➔ Activation X et II.
➔ Liaison du facteur VIIa.
qui permettent la formation extravasculaire de fibrine.

11. Rôle dans l’immunité


Les macrophages fixent les antigènes qui sont soit digérés, soit modifiés d'une manière telle que les macrophages
qui les portent les présentent d'une manière appropriée aux lymphocytes B et T.
Par ailleurs, les macrophages interviennent dans la voie afférente de l'immunité. Ils possèdent des récepteurs pour
le fragment Fc des immunoglobulines, le complément, et certaines lymphokines.

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12. Autres activités


- Production de facteurs de croissance des cellules souches hématopoïétiques.
- Protection des tissus par des antiprotéases.
- Propriétés antitumorales : destruction des cellules tumorales par production de TNF-α qui active les lymphocytes
T, contrôle la production Ig, provoque une nécrose hémorragique des tumeurs, est responsable de la cachexie
cancéreuse, stimule l’angiogenèse.

13. Cinétique de croissance


Compartiment Un compartiment de cellules souches + un compartiment de
médullaire proliférations composés de promonocytes (2 mitoses chez l’homme).
Compartiment sanguin Demi-vie des monocytes sanguins : 16 à 32 H.
Il n'existe pas de pool de monocytes marginalisé.
Compartiment tissulaire Demi-vie des macrophages tissulaires : ~10j
Eliminés par les expectorations - urines -sécrétions.
Facteurs stimulants GM-CSF et M-CSF

CHAP 6 : Thrombopoïèse
I. Précurseurs des plaquettes
Les précurseurs des plaquettes sont d’origine médullaire. Les précurseurs sont identifiables au microscope ou non.
Non identifiables Identifiable
- CFU-GEMM. - Mégacaryoblaste (15 - 50 μm).
- CFU-Meg. - Mégacaryocyte basophile.
- Mégacaryocyte diploïde - Mégacaryocyte polyploïde (50 -200 µm).
o haut taux de prolifération. o Endoréplication du noyau.
o Fragmentation du cytoplasme.

a) CFU-Meg (Colony Forming Unit-Megacaryocyte)


CFU-Meg est la cellule souche mégacaryocytaire. Située dans la moelle osseuse, elle est en phase de repos (G0 – G1).
Elle peut être mise en évidence par culture cellulaire.
CFU-Meg forme en culture des petites colonies (clusters) très compactes composées de mégacaryocytes mûrs (4 à
200 cellules). Les clusters sont constitués de grandes cellules :
➢ Non-granuleuses ayant un cytoplasme clair
➢ Un noyau plurilobé
➢ Leur morphologie est identique aux CFU-GM (précurseurs des monocytes et macrophages)
➢ Identifiables par coloration spécifique :
o Anti-facteur VIII : anticorps monoclonal dirigé contre le facteur VIII
o Anti-gp IIb IIIa : anticorps dirigé contre les glycoprotéines IIb IIIa spécifiques des mégacaryocytes
Facteurs de croissance nécessaires
Stem Cell Factor IL-3
GM-CSF Plasma humain frais (30 %)
Sérum de patients atteints d’anémie aplastique Thrombopoïétine

Effet du sérum d’anémie aplastique : Plus la concentration du sérum augmente, plus le nombre de colonies
augmente.
Caractéristiques des CFU-Meg
➢ Présentes dans le sang et la moelle.
➢ Durée d’incubation pour la formation de CFU-Meg : 11 - 18 jours.
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➢ 20 % en phase S.
➢ Vitesse de sédimentation : 4.9 mm/h.
➢ Nombre observé dans la moelle : 2 - 24/10^5 cellules
Inhibiteurs des CFU-Meg
➢ Interférons α, β, γ
➢ Facteurs libérés par plaquettes (et activées par hémostase)

b) Mégacaryocyte diploïde
Les mégacaryocytes diploïdes ont un très haut taux de prolifération et sont non-identifiables au microscope. Des
antigènes de surface spécifiques des plaquettes sont exprimés et peuvent être mis en évidence par
immunofluorescence (CD 42 → GP Ib-IX).

c) Mégacaryocyte basophile
Son noyau est diploïde et sa taille est entre 50 et 150 µm.

d) Mégacaryocyte polypoïde
C’est une cellule de grande taille (50-200 µm). Le noyau polypoïde :
➢ Plurilobé.
➢ Chromatine condensée.
➢ Endoréplication du noyau.
➢ Polyploïdie 8 - 32 N.

La fragmentation membranaire :
➢ Produit entre 2000-4000 plaquettes/MGK
➢ La basophilie diminue
➢ Granules contenant du glycogène.
➢ D’autant plus importante que la ploïdie est élevée

Le temps de maturation est de 5 jours.


Les mégacaryocyte polypoïdes sont plaquettogéniques.

II. Production de plaquettes


Les plaquettes sont des fragments cytoplasmiques détachés
de précurseurs appelés mégacaryocytes.
Les plaquettes sont des particules anucléées, en forme de
disques biconvexes et leur taille varie entre 2 et 4 µm. La
taille des plaquettes peut être très variée et est inversement
proportionnelle à la ploïdie. Elle diminue avec l’âge des
plaquettes.

Le cytoplasme est clair :


• Granulations azurophiles centrales (granulomère).
• Zone claire périphérique (hyalomère).

a) Facteurs régulateurs
Thrombopoïétine (TPO) Interleukine 6
Interleukine 11 Meg-CSF

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Thrombopoïétine (TPO)
C’est une glycoprotéine produite par le rein et le foie. Elle stimule la prolifération des mégacaryocytes. Elle
augmente la polyploïdie des mégacaryocytes.
La production de TPO est constante et n’a pas de mécanisme de régulation.

Homéostasie
Les plaquettes ont des récepteurs à la TPO. La concentration de TPO diminue par absorption sur les plaquettes :
➢ Diminution de [TPO] quand le nombre de plaquette augmente
➢ Augmentation de [TPO] quand le nombre de plaquette diminue

b) Plaquettes réticulées (plaquettes jeunes)


➢ Présence de résidus de RNA.
➢ Mise en évidence par cytométrie de flux
o Coloration du RNA par le thiazole orange.
o Interférence avec les granules denses et les granules α des plaquettes → dégranuler les plaquettes
avant le marquage.
➢ Permet de mesurer la production des plaquettes par les mégacaryocytes médullaires.

III. Structure des plaquettes


Modifications conformationnelles
A l’état normal A l’état activé
Forme de disque biconvexe avec surface émission de pseudopodes et expression de
membranaire lisse molécules d’activation en surface (GMP140 ..)

Les plaquettes sont repoussées au voisinage de l’endothélium vasculaire par le flux des globules rouges.
Au microscope électronique, on peut distinguer 4 zones : Zone périphérique, Systèmes membranaires, Zone sol – gel
et Zone des organelles.

1. Zone périphérique
Elle forme la paroi plaquettaire qui présente de nombreuses invaginations permettant la communication avec le
milieu extérieur (système canaliculaire ouvert).
Elle comporte 3 parties :
Le glycocalyx Est composé de 5 types de glycoprotéines :
➢ Glycoprotéine I (Ia, Ib et Ic)
o Interagit avec le collagène →adhésion.
➢ Glycoprotéine II (IIa, IIb et IIc)
➢ Glycoprotéine III (IIIa)
➢ Glycoprotéine IV (IIIb)
o C’est le récepteur à la thrombospondine.
➢ Glycoprotéine V.

Charges électrostatiques : les glycoprotéines portent des molécules d’acide sialique qui
✓ Confèrent aux plaquettes des charges négatives.
✓ Répulsion électrostatique.
✓ Empêche l’adhésion spontanée des plaquettes
o Entre-elles.
o Endothélium vasculaire
Protéines plasmatiques : facteurs de la coagulation (fibrinogène, ...).

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Organisation en plusieurs complexes qui ont des fonctions de récepteurs :


➢ Complexe GP Ib - V – IX
o Récepteur de vWF (Ib)
o Récepteur de IIa
➢ Complexe GP IIb – IIIa
o Récepteur de I
o Récepteur de vWF
o Récepteur de la fibronectine
➢ Complexe GP Ia – IIa
o Récepteur du collagène

La membrane C’est une bicouche lipidique contenant des enzymes transmembranaires.

La sous-membrane C’est l’espace compris entre la membrane et les microtubules. Elle contient des
structures filamenteuses.

2. Zone sol-gel
Elle constitue la matrice interne de la plaquette. On y trouve :
Les microtubules qui forment une bande circulaire dans le plan équatorial des plaquettes. Ils sont composés
de tubuline polymérisée en tubule.
Les microfilaments, jouant un rôle dans les mécanismes contractiles des plaquettes.

3. Zone des organelles


Le cytoplasme des plaquettes contient différentes organelles telles que :
Les mitochondries, les lysosomes, les peroxysomes et les particules de glycogène.
Les granules denses et les granules α
Granules denses Granules α
Opaques aux électrons Plus nombreux et moins denses. Elles
Lors de la « release-réaction », elles relarguent : contiennent :
➢ ADP- ATP. ➢ Le facteur plaquettaire 4, un tétramère de
➢ Sérotonine. peptides basiques. Elle neutralise l'héparine
➢ Adrénaline. et peut fixer l'héparan-sulfate de
➢ Ions Ca++. l’endothélium.
La concentration de ces substances y est si ➢ La β-thromboglobuline.
élevée qu'elles ne se maintiennent pas en ➢ Le “Platelet derived growth factor” (PDGF)
solution mais forment des agrégats de qui stimule la croissance de nombreuses
nucléotides et de sérotonine maintenues par le cellules.
Ca++. ➢ La thrombospondine qui joue un rôle dans
les mécanismes d’adhésion et d’agrégation.
➢ La fibronectine.
➢ Les facteurs de coagulation (fibrinogène,
facteur V, facteur de von Willebrand).

4. Zone membranaire
Le système canaliculaire ouvert est formé d’invaginations de la membrane plasmique et forme un réseau tortueux à
l’intérieur de la plaquette. Il augmente la surface d’échange entre plasma et cytoplasme.
Le système tubulaire dense est dérivé du RE et forme un réseau de fines canalicules. C’est une zone de stockage du
Ca++ qui est relargué lors de l’activation plaquettaire, induisant une réponse contractile.
Ces deux systèmes interagissent pour former “le complexe membranaire”.

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IV. Métabolisme énergétique


1. Métabolisme des glucides
Le glucose est la principale source d’énergie et est utilisé par la voie d’Embden-Meyerhoff. Les plaquettes peuvent
synthétiser et lyser le glycogène. Le pyruvate est utilisé par le cycle tricarboxylique. Lors de l’activation plaquettaire,
il y a une augmentation de la glycogénolyse, de la glycolyse et de l’activité du cycle de Krebs.
AMP - ADP – ATP
La voie Embden-Meyerhoff transforme ADP en ATP. Il n’y a pas d’échange avec le pool de stockage d’ADP-ATP qui
est relargué lors de la “release reaction”. L’ATP utilisé lors de la “release reaction” est dégradé en hypoxanthine.
Les plaquettes contiennent également :
➢ Guanines nucléotides.
➢ Uracyle.
➢ Cytosine-pyrimidine.
➢ AMP cyclique.
Ces molécules jouent un rôle important dans les fonctions plaquettaires.

2. Métabolisme des protéines


Les plaquettes peuvent synthétiser des AA et des protéines.
➢ Les protéines contractiles microfilamenteuses.
➢ Les protéines contractiles thrombosthénines.
➢ Actine non polymérisée (plaquette au repos).
➢ Actine-profiline → actine polymérisée (plaquette activée)
La transformation sol-gel est facilitée par “actin binding protein”.
La myosine se polymérise lors de l’activation des plaquettes pour former des filaments bipolaires de myosine.
L’activité Mg ATPase de la myosine engendre la force contractile.
La myosine phosphatase déphosphoryle la myosine et entraine la relaxation.

Rôle du tandem actine-myosine


La molécule de myosine est composée de deux chaînes lourdes liées de manière non covalente, chacune d'entre
elles liant deux chaînes légères de myosine à son extrémité globulaire.
Les têtes de la myosine fixent :
➢ L’actine.
➢ Mg ATPase :
o Augmentation par la phosphorylation de la myosine → contraction.
o Diminution par déphosphorylation de la myosine → repos.
Phosphorylation est stimulée par “light-chain-kinase” :
➢ Augmentation par le Ca++ (dont la concentration augmente lors de l’activation plaquettaire).
➢ Diminution par la calmoduline

3. Métabolisme des lipides


80 % des constituants lipidiques des plaquettes sont des phospholipides. Les plaquettes peuvent synthétiser des
acides gras, qu'elles échangent ensuite avec le plasma.
Le métabolisme des prostanoïdes dans le système tubulaire dense joue un rôle dans la régulation de la fonction
plaquettaire.
L’aide arachidonique (AA), un substrat des prostaglandines, est libéré à partir des phospholipides membranaires. La
libération de l'AA nécessite l'activation des phospholipases C et A2. L'activité de ces enzymes est stimulée par l'ion
Ca++, dont la concentration cytoplasmique s'accroît lors de l'activation plaquettaire.

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V. Fonction plaquettaire
➔ Les plaquettes jouent un rôle essentiel dans l’hémostase.
➔ Arrêt du saignement d’un vaisseau lésé :
o Constriction vasculaire (effet transitoire).
o Adhésion à l’endothélium vasculaire.
o Agrégation.
o Activation des facteurs de la coagulation.

Activation plaquettaire
Activation plaquettaire ➢ Adhésion à l’endothélium vasculaire.
provoqué par : ➢ ADP libéré par les hématies lysées dans le caillot

Caractérisation de ➢ Changement de forme (”shape change”).


l’activation plaquettaire ➢ Relargage du contenu des granules (”release reaction”).
➢ Formation de thromboxane A2 qui potentialise la “release
reaction”.
➢ Activité procoagulante → libération de thrombine.
Hémostase primaire
L’hémostase 1iare n’implique pas de facteurs de coagulation.
- ADP - Thromboxane A2 - thrombine sont libérés dans le plasma.
- Activation des plaquettes : Accolement des plaquettes les unes aux autres.
- Activation des plaquettes → formation du clou plaquettaire.
- Cohérence du clou plaquettaire est renforcée par la fibrine.
- Rétraction du caillot sous l’action des plaquettes

Adhésion plaquettaire
Les plaquettes normales n’adhèrent pas spontanément à l’endothélium. Lorsque une brèche vasculaire survient, les
plaquettes adhèrent à des structures de l’endothélium. Les structures sont les suivantes :
Membrane basale (adhésion faible), qui contient du collagène de type IV, facteur de von Willebrand
(+élastine, fibronectine, thrombospondine, laminine, héparan sulfate)
Plus en profondeur se trouvent du collagène I et VI ainsi que des microfibrilles auxquels les plaquettes
adhèrent fortement
L'adhésion dépend des gradients de vitesse :
gradient de vitesse élevée faible gradient de vitesse
L'adhésion requiert l'intervention du vWF. Des facteurs physiques sont plus impliqués.
➔ Le vWF se fixe d'un côté sur le complexe ➔ Le fibrinogène peut former un "pont" avec le
GPIb de la plaquette et de l'autre côté sur le subendothélium.
collagènes de l’endothélium.
➔ A ce moment, les plaquettes s'activent et ➔ D'autres molécules adhésives (fibronectine,
expriment le complexe GPIIb-IIIa, qui se lie vitronectine) sont également impliquées.
au vWF fixé à la paroi vasculaire, ce qui
permet l'étalement des plaquettes.

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Les manifestations de l'activation plaquettaire


a) Le shape change
La première phase de l'activation plaquettaire est un changement de forme suite à
l’adhésion à l’endothélium ou à l’action d’autres agonistes (ADP).
➢ Les plaquettes prennent la forme de sphères émettant de longs pseudopodes
ou "filopodes"
➢ Les microfibrilles se disposent longitudinalement dans les plaquettes

Ces modifications sont dues à l'activation du système contractile par le Ca++


intracellulaire
Le "shape change" est une modification réversible. On assiste à une mise en
communication des granules avec la MP et le système canaliculaire ouvert.

b) La « release reaction » ou processus sécrétoire


Peut s’effectuer par 2 mécanismes :
- Fusion des granules avec le système canaliculaire ouvert
- Fusion des granules entre eux, formant des "super-granules" qui fusionnent ensuite avec la membrane
plasmatique.
Ce processus sécrétoire implique la labilisation des membranes en présence de Ca++.
La release reaction est potentialisée par la thromboxane A2 présente dans les plaquettes activées.
La thromboxane A2 entraine la libération du Ca++ présent dans le système tubulaire dense.

Release I Release II
Sécrétion du contenu des granules denses. Sécrétion du contenu des granules α.

c) Les activités procoagulante des plaquettes


Les plaquettes peuvent activer la coagulation de plusieurs manière :
1) Les plaquettes activées peuvent fournir une surface sur laquelle certains facteurs de la coagulation peuvent
s'adsorber, se concentrer localement, et interagir plus facilement les uns avec les autres. Pour que cette
adsorption soit possible, il faut que la face externe soit chargée négativement; or au repos, le feuillet externe de
la bicouche lipidique est constitué de phospholipides neutres (Phosphatidyl Choline et Sphingomyéline). Lors de
l'activation plaquettaire, les phospholipides chargés négativement, qui sont situés dans la couche interne
(Phosphatidyl Sérine et Phosphatidyl Inositol), se déplacent vers la couche externe ("flip-flop" lipidique). On a
donné le nom de "facteur plaquettaire 3" à la propriété qu'ont les plaquettes activées d'accélérer le processus
de coagulation leur surface

2) Les plaquettes activées peuvent aussi activer directement certains facteurs de la coagulation. En particulier,
elles contribuent à l'activation du facteur XI qui court circuite :
➢ le facteur XII
➢ les facteurs de contact tissulaire

3) Les granules α contiennent des facteurs de la coagulation qui sont relargués lors de la "release -reaction".
d) L’agrégation plaquettaire
L'agrégation plaquettaire est l'accolement des plaquettes les unes aux autres par un mécanisme actif. Elle peut être
induite par des agents proagrégants, qui peuvent se classer en deux catégories :

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Agents agrégants 1aires Agents agrégants 2aires


Induisent une agrégation par des mécanismes Induisent d'abord une « release reaction »
indépendants de la « release reaction » : ➔ libération par les plaquettes activées de :
o ADP et Tx A2
➔ induisent ensuite l'agrégation des
plaquettes

Exemples d’agents : Exemples d’agents :


- ADP - Arachidonate - Prostaglandines
- Thrombine - Collagène
- Adrénaline - Complexes antigène-anticorps.

Voies des prostaglandines

Mesure de l’agrégation

Néphélométrie Electrique
Le plasma riche en plaquettes est exposé à une Plasma riche en plaquettes ou sang total est
substance pro-agrégante et à une source exposé à une substance pro-agrégante.
lumineuse.
L’agrégation des plaquettes induit une On mesure les modifications de l’impédance.
diminution de la densité optique.

e) La rétraction du caillot
Les plaquettes émettent des pseudopodes le long des filaments de fibrine. Ensuite, le système contractile des
plaquettes est activé : la fibrine fixée à l’actine est internalisée dans les plaquettes.

Thromborégulation : interaction entre plaquettes et paroi vasculaire


1. Des mécanismes interviennent afin que le caillot qui se forme au voisinage d'une lésion vasculaire ne
s'accroisse pas indéfiniment. Ces mécanismes font intervenir le métabolisme des prostanoïdes dans les
cellules endothéliales → Prostacycline (PGI2).
2. Les Leucocytes :
➔ Produisent de la thromboxane A2 qui augmente l’agrégation.
➔ Produisent de la prostacyclines (PGI2) qui diminue l’agrégation.

3. Le monoxyde d’azote produit par les cellules endothéliales a un effet vasodilatateur.

Autres fonctions des plaquettes


Rôle dans l’inflammation : sécrètent un facteur Phagocytose de particules, bactéries (sans killing).
qui augmente la perméabilité vasculaire et des
agents chimiotactiques.

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Transport de la sérotonine. Platelet Derived Growth Factor (PDGF)


- stimule la prolifération des fibroblastes et des fibres
musculaires lisses de la paroi vasculaire.
- Rôle cicatrisant.

Durée de vie des plaquettes


La sénescence des plaquettes s’accompagne d’une sensibilité aux agressions oxydatives et d’une perte des
glycoprotéines de surface.
La destruction “au hasard” est due à l’utilisation des plaquettes lors de lésions vasculaires. La destruction est réalisée
par les macrophages et les cellules réticulo-histiocytaires dans la moelle osseuse, le foie et la rate.
La durée de vie est entre 8 - 12 jours (aspirine est un antiagrégant, inhibe l’agrégation plaquettaire de façon
irréversible donc pendant toute la durée de vie de la plaquette).
Séquestration splénique de 30 % des plaquettes produites par la moelle qui peuvent repasser dans la circulation
sanguine.

Cinétique des plaquettes : méthodes de mesure


Méthode non isotopique - Blocage de la cyclo-oxygénase et en conséquence la formation
de thromboxane A2 par l’aspirine.
- Concentration plaquettaire en thromboxane A2 inversement
proportionnelle à la demi-vie des plaquettes.
Marquage isotopique des précurseurs Peu précises et dangereuses.
DF^32 P
Marquage isotopique de plaquettes ^51 Cr-chromate.
mûres ^111 Indium-hydroxyquinoline

CHAP 7 : Méthodes d’exploration du sang


I. Composition sanguine
Plasma
Hématies (GR) Les GR sont les plus abondants et transportent l’O2 et le CO2 grâce à
l’hémoglobine.
Ce sont des disques biconcaves de ~7 μm de diamètre.
Leucocytes (GB) Ce sont les polynucléaires ( neutrophiles, éosinophiles, basophiles),
les lymphocytes et les monocytes.
Thrombocytes Ce sont des fragments de cytoplasme de ~2 - 3 μm de diamètre.
(plaquettes)

II. Méthodes d’analyse du sang


- Automates de numération des éléments
- Microscopie optique
- Microscopie électronique
- Cytochimie
- Immuno-cytologie

III. Prélèvement sanguin


Le prélèvement devrait être réalisé au même moment de la journée pour éviter les variations circadiennes.
Le prélèvement veineux au pli du coude est le plus souvent utilisé. Après ponction veineuse franche, le sang est
recueilli dans un tube contenant un anticoagulant.

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Le prélèvement par ponction à la lancette (sans anticoagulant) se fait au niveau de la pulpe digitale (bout du doigt)
du lobe de l’oreille et du talon (chez le nourrisson).
Les types d’anticoagulants utilisés :
Ethylènediamine tétra- ➢ C’est l’anticoagulant le plus fréquemment utilisé.
acétate dipotassique ➢ Appelé K2-EDTA
➢ C’est un chélateur de Ca++.
➢ Concentration : 1 mg/ml
Oxalate double ➢ C’est un chélateur de Ca++
➢ N’inhibe pas l’agrégation plaquettaire
➢ Oxalate d’ammonium 2 mg/ml (3 vol)
➢ Oxalate de sodium 2 mg/ml (2 vol)
Héparine ➢ Concentration : 15 - 20 U/ml
➢ N’empêche pas l’agglutination des leucocytes
➢ Modifie la morphologie des leucocytes

IV. L’hémogramme
La numération des éléments figurés du sang peut se faire par des méthodes manuelles ou automatiques : il est utile
de compléter ces comptages par un examen microscopique du frottis sanguin.
Méthodes ➢ Appareils à impédance (Coulter ...), modification de la résistivité des éléments
automatiques sanguins passant par un orifice calibré dans un milieu isotonique.
(compteur de ➢ Appareils optiques, diffraction de la lumière croisant un rayon lumineux (Laser ...).
particules)
Avantages :
➢ Grand nombre d’éléments comptés.
➢ Limitation des erreurs de dilution.
➢ Formule leucocytaire.
➢ Calcul de l’hématocrite.
➢ Mesure de la concentration en hémoglobine.
➢ Calcul des constantes érythrocytaires.
➢ Plus grande précision (> 200/mm3).
➢ Rapidité.
Désavantages :
➢ Imprécis pour les leucocytoses basses (< 200/mm3).
➢ Correction de la coïncidence.
➢ Coût élevé.
➢ Calibrage régulier
o Plusieurs calibrations au cours de la journée
o Fluctuation des paramètres avec la T° ambiante
Méthodes manuelles Comptage des cellules après dilution dans un hémocytomètre (Neubauer, Thomas ...)
➢ Dilution du sang dans un liquide approprié :
o Acide acétique 3 % pour les leucocytes
o Liquide physiologique pour les hématies
➢ Facteur de dilution adapté au nombre d’éléments à compter :
o Hématies → 200 x
o Leucocytes → 20 x
➢ Formule de comptage :

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Désavantages :
➢ Méthode lente.
➢ Faible précision pour les leucocytoses normales.
➢ Cummul des erreurs de dilution et de comptage.
➢ Réservé au comptage des hématies et des leucocytes dans le liquide céphalo-
rachidien et les liquides d’épanchement

a. Détermination de l’hématocrite
Mesure directe ➢ Rapport entre le volume occupé par les hématies et le volume de plasma.
o Macrométhode : tubes de Wintrobe centrifugés à 2.260 g durant 30 minutes.
o Micro méthode : tubes capillaires centrifugés à 12.000 g durant 5 minutes.
➢ Imprécis à cause du plasma séquestré entre les hématies :
o Augmentation par macrométhode.
o Hématies anormales.
o Augmentation avec des hématocrites élevés.
Mesure indirecte ➢ Cette méthode est plus précise.
➢ Les compteurs automatiques calculent l’hématocrite :
Hct = VCM x Nombre d’hématies

VCM : volume corpusculaire moyen.

b. Détermination de l’hémoglobine
➢ Transformation de l’hémoglobine (oxy- et carbohémoglobine en cyanméthémoglobine :
o Ferricyanure de potassium (K2Fe(CN)6). Réactif de Drabkin.
o Cyanure de potassium (KCN).
➢ Mesure de la densité optique à 540 nm.
➢ Pas d’interférence avec la bilirubine.
(Hb)T : taux d’hémoglobine dans le sang à tester (g/dl)
(Hb)St : taux d’hémoglobine du standard (g/dl)
DOT : densité optique du sang à tester
DOSt : densité optique du standard
Calcul du taux d’hb : d : facteur de dilution

c. Constantes érythrocytaires
Volume corpusculaire moyen (VCM)
(µm3):

Teneur hémoglobine corpusculaire


moyenne (TCMH) (pg) :

Concentration corpusculaire
moyenne en hémoglobine (CCMH)
(g/dl):

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d. Formule leucocytaire
Méthode manuelle La première étape consiste à réaliser un étalement du sang sur une lame. Ce frottis ne
doit être ni trop épais ni trop fin. La répartition des cellules doit être homogène :
➢ Les cellules les plus petites occupent le centre (lymphocytes & polynucléaires).
➢ Les cellules les plus grandes occupent la périphérie (monocytes).

La seconde étape consiste à colorer le frottis en utilisant des colorants tel que le May-
Grünwald-Giemsa (MGG).
➢ Acides nucléiques → Bleu - violet.
➢ Granulations → Rouge - orange.
➢ Cytoplasme → Bleu clair.
Le colorant de May-Grünwald est une solution méthylique d'éosine et de bleu de
méthylène; celui de Giemsa, une solution d'éosine et d'azur de méthylène.

Le pourcentage des différents types de leucocytes est déterminé en comptant 100


cellules nucléées.
Les erreurs commises en déterminant la formule leucocytaire par méthode manuelle
sont à la fois techniques (distribution irrégulière des leucocytes sur le frottis) et
statistiques (cette dernière est d'autant plus faible que le nombre de cellules comptées
est plus élevé).
Méthode automatique 1) Par microscopie :
➢ Confection automatique du frottis (spinner).
➢ Coloration automatique (stainer).
➢ Reconnaissance optique des éléments à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images relié à
un ordinateur.

2) Système à flux continu :


➢ Les cellules passent en flux continu devant un rayon laser qui diffracte la lumière
vers différents détecteurs de lumière. Les différents types de leucocytes sont
distingués selon :
o Taille.
o Forme.
o Contenu granulaire.
o Réactions cytochimiques
▪ Bleu-alcyan → basophiles.
▪ Peroxydase → polynucléaires neutrophiles et éosinophiles.
▪ Estérases → monocytes
➢ Les cellules non identifiées sont classifiées comme LUC (Large Undifferentited
Cells) et la formule doit alors être faite manuellement (si LUC > 5 %).

e. Détermination des réticulocytes


Méthode manuelle ➢ Les réticulocytes sont des érythrocytes jeunes de plus grande taille 10 μm de
diamètre, volume de 100-200 µm^3.
➢ Ne contenant plus de RE mais quelques ribosomes visibles grâce colorations supra-
vitales suivantes :
o Crésyl Brillant
o New Methylene Blue
Coloration en bleu d’un réseau réticulo-filamenteux.
➢ Disparition progressive des ribosomes en 24 - 48 h.
Méthode automatique ➢ Reconnaissance en microscopie optique.
➢ Appareil à flux continu :

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o Coloration du RNA par l’acridine orange ou la thioflavine.


➢ Avantages :
o Plus rapide.
o Analyse un plus grand nombre d’érythrocytes.
o Plus grande précision.

f. Vitesse de sédimentation
Méthode Sédimentation des hématies dans un tube de Wintrobe car le poids spécifique des
hématies est supérieur à celui du plasma plasma.
➢ Formation de rouleaux → sédimentation plus rapide
o GR en rouleaux présentent une surface moindre et un poids plus élevé.
La formation des rouleaux est facilitée si
➢ Hématocrite faible.
➢ Taux de fibrinogène et de γ-globulines est accru.
Interprétation ➢ Avec cette méthode, les valeurs normales varient entre 0 et 7 mm/h.
➢ Augmentation des valeurs au cours de la grossesse et lors des syndromes
inflammatoires.
➢ Méthode peu précise qui tend à être remplacée par le dosage du fibrinogène qui
est plus précis, rapide et qui fait partie du bilan de l’hémostase.

V. Les valeurs normales de l'examen hématologique et ses variations


physiologiques
Variation du taux des ➢ Plus élevé chez le nouveau-né.
hématies ➢ Diminution à la puberté chez les filles à cause des menstruations.
➢ Augmentation avec l’activité musculaire.
➢ Diminution avec la position déclive.
➢ Fluctuations au cours de la journée : plus élevé le matin que le soir.
➢ Augmentation avec l’altitude.
➢ Diminution au cours de la grossesse (hémodilution).

Variation du taux des ➢ Augmentation chez le nouveau-né (lymphocytose).


leucocytes ➢ Augmentation avec l’activité musculaire des polynucléaires neutrophiles
(démarginalisation).
➢ Augmentation avec l’émotion des polynucléaires neutrophiles (démarginalisation).
➢ Fluctuation au cours de la journée des polynucléaires neutrophiles.
➢ Augmentation des polynucléaires pendant la grossesse

VI. Organes hématopoïétiques


Moelle osseuse
o Os longs (tibia ...).
o Os plats (sternum, bassin..).
o Production de tous les précurseurs hématopoïétiques.
Organes lymphoïdes.
o Maturation lymphocytaire.
o Activation lymphocytaire.
Rate (dans certaines pathologies).

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Dans la moelle osseuse, se trouvent : L’hématopoïèse est la transformation de la cellule souche


Cellules souches hématopoïétiques. non identifiable morphologiquement en cellules immatures
Précurseurs des cellules puis en cellules mûres reconnaissables au microscope.
o Erythroïdes. ➔ Différenciation : perte de certaines potentialités du
o Myéloïdes. génome communes à toutes les cellules et
o Lymphoïdes. acquisition de caractéristiques propres.
o Mégacaryocytaires. ➔ Amplification : augmentation du nombre de cellules.
Stroma médullaire. ➔ Maturation : acquisition des capacités fonctionnelles
Cellules mésenchymateuses. des cellules mûres

VII. Identification des cellules sanguines


La coloration panoptique May-Grünwald Giemsa permet l’observation des caractéristiques morphologiques du
noyau, cytoplasme et du contenu en granulations. La cytochimie permet la caractérisation du contenu enzymatique
ou protéique de cytoplasme. L’immuno-cytologie permet l’identification de marqueurs spécifiques (antigènes) à la
surface ou à l’intérieur de la cellule.
Noyau Il est formé de 4 éléments :
• Chromatine (contient le DNA) qui est fine dans les cellules jeunes (euchromatine) et
condensée dans les cellules mûres (hétérochromatine).
• Nucléoplasme qui contient le suc nucléaire.
• Le(s) nucléole(s), présents dans les cellules jeunes et riches en RNA, fibrilles protéiques.
• Enveloppe nucléaire : double membranes délimitant une citerne périnucléaire et en
communication avec le réticulum endoplasmique. Présence de pores nucléaires qui
diminuent avec la maturation.

Cytoplasme Réticulum endoplasmique :


C’est un système de canalicules et de sacs aplatis, lisse ou granuleux (recouvert de ribosomes). Il
achemine les protéines synthétisées par les ribosomes vers l’appareil de Golgi.
Rarement visible sur les frottis.

Appareil de Golgi :
Appareil de Golgi (zone claire périnucléaire) forme une sphère creuse dont la paroi est formée de
dictyosomes. Chaque dictyosome est constitué d’une pile de 2 - 8 sacs aplatis. Dans l’appareil de
Golgi se déroule l’assemblage des composés sécrétés dans la cellule et la formation de vésicules de
sécrétion et de lysosomes primaires.
Sur les frottis, le centrosome et l’appareil de Golgi apparaissent comme une zone plus claire.

Lysosomes :
Ce sont des granulations contenant de nombreux enzymes : hydrolases, ribonucléases,
désoxyribonucléases.
Ils deviennent des lysosomes 2aires après la fusion avec un phagosome.
Sur les frottis, ils forment les granulations spécifiques des différentes lignées.

Vacuoles :
Il existe plusieurs types de vacuoles : contractiles, lipidiques et corps multi-vésiculaires (provenant
de la pinocytose).
Sur les frottis, elles apparaissent sous forme de zones non-colorées.

Membrane plasmique :
C’est une double couche phospholipidique de 8 nm d’épaisseur. Elle contient également des
glycoprotéines, des glycolipides et des polysaccharides lui donnant une spécificité
immunologique :groupes sanguins, antigènes T, immunoglobulines de surface.
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Endocytose et exocytose
Endocytose Exocytose
Pénétration de substances dans la cellule Sécrétion.
• Phagocytose : introduction de particules solides Ejection de corps résiduels.
(débris cellulaires, cryoglobulines, germes ...). Détachement d’un fragment de cytoplasme
• Pinocytose : introduction de gouttelettes de liquide (clasmatose plasmocytaire).
(voile cytoplasmique).
• Rhophéocytose : invagination de la membrane.

Le matériel incorporé devient intracytoplasmique.


Disparition de la membrane qui l’entourait

Locomotion
Les polynucléaires et les monocytes ont la propriété de se mouvoir. Dans un leucocyte en locomotion, on distingue
une partie antérieure émettant des pseudopodes en voile (protopode) qui contient une partie centrale, un noyau, un
centrosome, des mitochondries, des granulations et un uropode (partie postérieure).

Mort cellulaire
Nécrose Apoptose
• Mort pathologique. • Suicide cellulaire physiologique.
• Altération de la membrane → • Dégradation du DNA → fragmentation.
pénétration d’eau et d’ions • Formation de corps apoptotiques (fragmentation du
extracellulaires. cytoplasme et du noyau en vésicules).
• Gonflement de la cellule. • Phagocytose par les macrophages
• Rupture de la membrane plasmique

Réactions cytochimiques
Réaction de Permet la mise en évidence du fer intracytoplasmique. Le fer détecté est celui contenu dans
Perls l’hémosidérine des :
• histiocytes/macrophages
• GR (sidérocytes)
• érythroblastes (sidéroblastes).

Le ferrocyanure ferrique ou Bleu de Prusse se présente sous forme d’un dépôt bleu-vert
dans les cellules érythroïdes et les macrophages.
Peroxydase Elle catalyse le transfert d’hydrogène sur le peroxyde.
• La myélopéroxydase est l'enzyme contenue dans les granulations azurophiles des
polynucléaires neutrophiles et des précurseurs de la lignée myéloïde.
• Elle est exprimée faiblement dans les monocytes.
• Elle est exprimée dans les polynucléaires éosinophiles.
• Elle n’est pas exprimée par les polynucléaires basophiles.
La présence de peroxydase se manifeste par une coloration brun-noir des granulations.
Principe :
• Catalases lysosomiales.
• Transfèrent un hydrogène d’un donateur approprié (benzidine ou chloro-4-naphtol-1)
sur un peroxyde H2O2.
• Le donateur est ensuite oxydé et transformé en un colorant insoluble.

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Réactions de • Mise en évidence des mucopolysaccharides.


PAS • Mise en évidence du glycogène.
(Periodic Acid • Cellules positives PAS+ :
Shiff) o Polynucléaires neutrophiles et leurs précurseurs
o Polynucléaires éosinophiles
o Monocytes
o Thrombocytes
Principe :
• Acide périodique scinde les liaisons C-C du glycogène quand les 2 atomes de C portent
un résidu OH.
• Les groupements alcooliques libérés sont ensuite oxydés en aldéhyde qui sont colorés
par la fuchsine acide (réactif de Schiff) en rouge intense.

Phosphatases • Activité enzymatique optimale à pH alcalin.


alcalines • Exprimées par les polynucléaires neutrophiles : réaction semi-quantitative et exprimée
sous forme d’un score 0 -4.
• Diminution dans la leucémie myéloïde chronique.
Principe :
La phosphatase alcaline leucocytaire catalyse l’hydrolyse des esters phosphoriques en milieu
alcalin.
Le naphtol-1 libéré du naphtyl-1-phosphate est couplé à un sel de diazonium pour former un
colorant azoïque brun qui précipite selon la localisation de l’activité enzymatique.
Phosphatases • Activité enzymatique optimale à pH acide.
acides • Présente dans la lignée lymphoïde
o Permet d’identifier certaines sous-populations lymphocytaires.
o L’activité enzymatique est inhibée par l’acide tartrique.
Principe :
La phosphatase acide catalyse l’hydrolyse des phosphates-esters en milieu acide. Du naphtol
AS-Bl est libéré du phosphate de naphtol-AS-OL et est couplé avec un sel de diazonium pour
former un colorant azoïque rouge-brun qui précipite dans la cellule.
Estérases Estérases spécifiques :
• Cholinestérase (ester de choline).
• Lipases (ester d’acide gras).
Estérases non-spécifiques : clivage des acides gras à chaîne courte.
• α-naphtyl acétate
o Monocytes.
o Thrombocytes.
• α-naphtyl AS-D acétate
o Monocytes (inhibition par le fluorure de sodium (NaF)).
o Thrombocytes.
o Polynucléaires.
• α-naphtyl AS-D chloroacétate
o Polynucléaires et précurseurs.
Principe :
Les estérases “naphtyl-1-acétate” induisent la scission hydrolytique de l’α-naphtyl-1-acétate
en acide acétique et en naphtol-1.
Le naphtol-1 produit est couplé à un sel de diazonium pour former un colorant azoïque
rouge-brun insoluble dans l’eau.

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Mise en évidence d’antigènes spécifiques par fluorescence


• Distinction des cellules hématopoïétiques à l’aide d’anticorps spécifiques
o Lymphocytes T (CD3, CD4, CD8...)
o Lymphocytes B (IgG, IgM, IgD ...)
• L’utilisation d’anticorps spécifiques liés à un fluorochrome
o Fluorescéine → vert.
o Phycoérythrine → rouge.
• Visualisation des cellules positives
o Microscope à fluorescence.
o Cytométrie de flux.

Prélèvement de la moelle osseuse


Sites de prélèvements :
a. Sternum.
b. Crêtes iliaques postérieures et antérieures (patient obèse).
c. Tibia (chez les très jeunes enfants).

➢ Anesthésie locale de la peau et du périoste (xylocaïne 0.5 %).


➢ Prélèvement au trocart après perforation de la corticale de l’os
o Ponction - aspiration : confection d’un frottis avec la première goutte de tissu médullaire aspiré.
o Biopsie : confection d’une empreinte à partir de la carotte osseuse obtenue.

Ponction ganglionnaire
La ponction se fait à l'aiguille fine à travers la paroi cutanée → aspiration du suc ganglionnaire et confection d’un
frottis
Composition cellulaire :
On observe normalement 90 à 98% de lymphocytes, 1 à 3% de lymphoblastes, 0,5 à 2% de plasmocytes et 0,5 à 2%
de cellules réticulaires.

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