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UNIVERSITE DE KINSHASA

FACULTE DE MEDECINE
CLINIQUES UNIVERSITAIRES

Département de Biologie Médicale


SERVICE DE BIOLOGIE CLINIQUE

T.P. DE BIOLOGIE CLINIQUE / G3 BM : 2014-2015.

CONTEXTE

La Biologie Clinique est un outil important qui concoure entre


autre au diagnostic. Elle permet de faire une corrélation entre les
perturbations biologiques et les manifestations cliniques. Les TP
permettent de voir dans le concret et de manipuler le cas échéant
les notions apprises au cours théorique, constituent un atout pour
le futur clinicien qui, dès lors, aura la facilité de discuter un
résultat qu’il juge douteux et d’avoir une confrontation clinico-
biologique en rapport avec le diagnostic posé.

OBJECTIFS

A la fin des TP, l’étudiant doit être capable de :

 définir les analyses programmées pendant les TP;


 énoncer les principes des réactions de différents tests
effectués ;
 énoncer l’intérêt clinique de différents tests effectués ;
 connaître le matériel approprié pour chaque analyse ;
 connaitre les valeurs de référence;
 réaliser correctement les analyses d’hématologie et de
biochimie clinique effectuées lors des TP;
 interpréter les résultats observés.

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I. HEMOGRAMME ou NUMERATION FORMULE SANGUINE(NFS)
Définition : c’est l’étude des éléments figurés du sang en
suspension dans le plasma, de l’hémoglobine et des
constantes érythrocytaires. Cet examen est effectué sur
du sang veineux prélevé sur un anticoagulant sec,
EDTA ou Titriplex , le plus souvent. A défaut d'EDTA,
on peut utiliser l'Oxalate de K ou de Na, sans fluorure.
Quant à la formule sanguine, le sang est prélevé
directement, en piquant le bout d'un doigt et en
déposant une goutte de ce sang sur une lame porte-
objet.

Il comporte une étude quantitative (numération des GR et GB


des plaquettes ; dosage de l’hémoglobine, mesure de
l’hématocrite et établissement de la formule leucocytaire), et une
étude qualitative (étude de la morphologie des éléments du sang
(GB et GR), l’appréciation de la qualité des plaquettes sur le
frottis sanguin, la présence de certaines particules comme le
corps de Joly, le corps de Heinz,… et autres corps étrangers
appelés artéfacts).
L’hémogramme fournit quatre autres données complémentaires
importantes :
- V.G.M. : volume globulaire moyenne
- C.C.M.H. : concentration corpusculaire moyenne
en hémoglobine
- T.C.M.H. : teneur corpusculaire moyenne en
hémoglobine
- Réticulocytes : jeunes globules rouges

NB: EDTA ( Ethylène Diamine Tétra Acetic Acid, sel sodique)

Prélèvement

Prélever 5ml de sang sur EDTA ou 2ml de sang sur titriplex


(éviter les anticoagulants liquides comme l’héparine, afin d’éviter
les erreurs de comptage dues à la dilution du sang par excès de
liquide). En cas de transport de l'échantillon sur une longue
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distance, maintenir de préférence entre 2 et 8°C (température
du frigo).
Il n'est pas nécessaire d’être à jeun ; la digestion provoque
certes une leucocytose mais très discrète < 5%. Mais il faut être
au repos car l’effort physique, même bref, peut provoquer des
hyperleucocytoses ou augmentation des GB.

Technique

On distingue deux grands groupes de méthodes de mesure :


- méthodes automatiques
- méthodes manuelles

a) Méthodes Automatiques

Utilisent deux types de compteurs optiques ou électroniques


analyseurs des particules cellulaires, ayant comme principe :
*Détection volumétrique par variation d’impédance ; ici les
particules traversent un micro-orifice et il se crée une DDP
(différence de potentiel) entre les deux électrodes (variation de
résistivité).
*Détection optique en flux continu ; ici, les particules passent
un micro tube au même moment qu’un faisceau lumineux
perpendiculaire qu’ils absorbent en partie et qu’ils diffractent
aussi en partie. L’absorption et la diffraction de la lumière
permettent la numération et la mesure de volume.

b) Méthodes Manuelles

Sont encore précieuses, très répandues dans notre pays et


nécessitent un prélèvement d’une quantité précise de sang, des
réactifs diluants et des cellules hématimètres ou chambre à
numération (NEUBAUER, BURKER, MALASSEZ, NAGEOTTE,
THOMAS, FUSH ROSENTHAL, …).
Il est à noter que l’utilisation des compteurs a permis de
diminuer les marges d’erreur.

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*Intérêt Clinique

- détermination de l’anémie ;
- caractérisation de l’anémie, dans ce dernier cas, on a besoin
du taux de l’hémoglobine, de l’hématocrite et du nombre des GR.

a) anémie normocytaire :
Ht = Hb X 3+2 ; dans ce cas, la formule se maintient mais l’Ht et
l'Hb sont parallèlement diminuées. L'anémie est quantitative, par
perte sanguine : hématémèse récente, hémolyse, mélaena, ulcère
gastrique, hémorragie traumatique récente.

b) anémie macrocytaire :
Ht > Hb X 3+2 ; ici, l’anémie est causée par une baisse de l’Hb.
L’anémie est qualitative par diminution préférentielle de l’Hb ; en
cas de malnutrition, manque de fer, immaturité du GR, brûlure.

c) anémie microcytaire :
Ht < Hb X 3+2 ; ici, l’anémie est caractérisée par la baisse du
volume globulaire (sphérocytose, microcytose avec hémolyse,
hémodilution).

Les constantes globulaires sont calculées sur base des formules


suivantes :
VGM = Ht/GR X 10 → Valeurs normales 90 ± 10 fl
TCMH = Hb/GR X 10 → » 29 ± 3 pg
CCMH = Hb/Ht X 100 → » 34 ± 4 %

- Intérêt pour la numération des GB et l'établissement de la FL.

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1. DOSAGE DE L’HEMOGLOBINE (Hb)

*Définition

L’hémoglobine est une hétéroprotéine formée d’un groupement


prosthétique (Hème) et d’un groupement protéine appelé globine.
C’est le transporteur de l’O2 dans le sang, le CO2,certaines
molécules médicamenteuses,....

*Principe

La transformation de l’hémoglobine en cyanméthémoglobine dont


la densité optique (D.O) est lue au spectrophotomètre à la
longueur d’onde de 540nm.
Les GR contenus dans l’échantillon sanguin total sont lysés par la
solution de ferricyanure de potassium K3[Fe(CN)6] , qui oxyde l’Hb
en méthémoglobine(met-Hb).
La met-Hb formée est complexée avec le cyanure de K+ (KCN) en
cyanméthémoglobine, composé stable, dont l’absorbance est
proportionnelle à la concentration.

*Matériel et Réactifs

-Tube à essai
-Micropipette ou pipette de Sahli
-Pipette graduée
-Poire d'aspiration
-Spectrophotomètre
-Courbe d’étalonnage
-Réactif : Solution de DRABKIN (1g de HCOˉ3 ; 0,2g de KCN ; 0,2g
de K3Fe(CN)6 ; 1vol. d’ H2O distillée);à conserver dans un flacon
en verre blanc bouché à l’émeri.
-Echantillon de sang veineux prélevé sur EDTA ou sang capillaire.

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*Mode opératoire

- prélever 5ml de Drabkin (sol.de ferricyanure de K+) dans un


tube à essai;
- y ajouter 20μl de sang rendu incoagulable (sang prélevé sur
anticoagulant), homogénéiser en mélangeant par un mouvement
de retournement ou à l’aide d’un mélangeur automatique.
Toujours essuyer l’embout sans toucher le boût avant de déposer
le sang prélevé, car nous travaillons avec de petits volumes. Les
mesures peuvent être faussées si la sol. de Drabkin est trouble,
cas des solutions déjà anciennes, à écarter ;
- laisser reposer le mélange pendant 5minutes pour faciliter la
réaction;
- procéder à la lecture au spectrophotomètre à la longueur d’onde
de 540nm après calibrage de l’appareil avec du blanc;
- rapporter le chiffre obtenu à la courbe d’étalonnage afin de
déterminer la valeur de l’hémoglobine (la D.O. obtenue est
proportionnelle au taux d’Hb).
La courbe d’étalonnage donne la concentration en g d’Hb pour
100ml de sang (actuellement en mol/l, plus exactement en mmol/l).

*Interprétation des résultats

Homme : 12,5 – 18 g/dl ou 1,9 – 2,8 mmol/l


Femme : 10,5 – 15 g/dl ou 1,6 – 2,3 mmol/l
Enfant (1 à 10ans) : 11,2 – 12,9 g/dl ou 1,8 – 2,0 mmol/l
Nouveau né : 15,6 – 19,6 g/dl ou 2,1 – 3,0 mmol/l

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2. MESURE DE L’ HEMATOCRITE (Ht)

*Définition

-Le terme hématocrite signifie étymologiquement, séparation entre


le plasma et les éléments figurés du sang notamment les globules
rouges.
-C’est en fait la fraction des éléments figurés en pourcentage du
sang total ou encore le volume qu’occupent les GR et autres
éléments figurés dans 100ml de sang.

*Principe

La centrifugation du sang total jusqu’à ce que les éléments aient


atteint un volume minimal. La hauteur de la colonne des cellules
est ensuite comparée à la hauteur totale qui représente 100%.

*Matériels

-Tube capillaire hépariné ou non (micro tube capillaire)


-Micro centrifugeuse à hématocrite
-Hématocritomètre ou abaque
-Plasticine (ou Mastic): pour boucher l’extrémité du tube par
laquelle l’échantillon de sang a été prélevé
-Echantillon de sang veineux prélevé sur EDTA ou échantillon de
sang capillaire.

*Mode opératoire

- Homogénéiser préalablement le sang contenu dans le flacon par


des mouvements de retournement ou à l’aide d’un mélangeur
automatique pour ramener tous les éléments figurés en
suspension et rendre ainsi l’échantillon homogène.
- A l’aide d’un tube capillaire, prélever du sang jusqu’au ¾.

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- Boucher l’extrémité du tube par laquelle on a prélevé, avec
de la plasticine ou du mastic.
- Placer le tube sur le plateau de la micro centrifugeuse
avec le bout bouché du coté externe, en assurant l’équilibre avec
un autre tube en regard du tube contenant l’échantillon.
- Centrifuger pendant 5 min à 3000 tours/min.
- Dans le Service, nous centrifugions à 5000 tours/min pendant 5
min.
- Faire la lecture à l’aide de l’abaque en mesurant la hauteur du
culot globulaire par rapport à la hauteur totale.

*Interprétation des résultats

Homme : 38 - 52%
Femme : 32 - 42%
Enfant (1 à 10ans) : 35 – 37%
Nouveau né : 44 – 62

3. NUMERATION DES GLOBULES BLANCS (GB)

Principe
Le sang est dilué au 1/20ème dans la solution de Türk. L’acide
acétique glacial contenu dans celui-ci lyse les GR et les plaquettes,
tandis que le violet de gentiane ou le bleu de méthylène colore le
noyau des GB.

Matériels
-Solution de Türk (liquide de dilution)
-Pipette de 2 ml en verre: pipette pasteur
-Poire d'aspiration
-Chambre à numération
-Compteur (manuel, électricité)
-Tube à essai
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-Microscope optique
-lamelle couvre-objet spéciale ( un peu dure),pas ordinaire.

Mode opératoire

-mettre dans un tube à essai: 1,9 ml de solution Türk et 0,1 ml de


sang: on réalise une dilution de 1/20;
-bien mélanger et incuber pendant 3 à 5 min;
-prélever le mélange avec une pipette Pasteur, et remplir la
chambre de numération (Neubauer ou Bürker), en évitant des
bulles d'air;
-compter les éléments, à l’objectif X 20 ou 40, dans 64 grands
carrés pour la cellule de Neubauer ou dans 50 grands carrés (soit
4 rangés de 12 grands carrés + 2 grands carrés) pour la cellule de
Bürker, en fonction de la cellule utilisée.

Justification du Calcul

a) Cellule de Neubauer :

On multiplie le nombre (N) des globules blancs comptés dans 64


grands carrés par 50 pour connaître le nombre de GB présents
dans un millimètre cube (mm3) de sang.
N = C x C x P x 50
C = le côté d’un grand carré de la cellule (= 1/4mm)
P = la profondeur de la cellule (= 1/10mm)
1/4 x 1/4 x 1/10 x 64 = 4/10, soit 1/2,5
N x 2,5 x 20 → N X 50 = GB/mm3

Formule pratique :
-le groupe de 16 carrés du coin = 0,1 mm3
-compter dans le 4 groupes du coin = 0,1 x 4 = 0,4 mm3
-pour avoir 1mm3 = 0,4 x 2,5
-la dilution étant de 1/20, la formule devient :
2,5 x 20 = 50, soit N x 50.

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b) Cellules de Bûrker :

On multiple le nombre (N) des globules blancs comptés dans 50


grands carrés par 100 pour connaître le nombre de GB présents
dans un millimètre cube (mm3) de sang.

N X 100 = GB/mm3
Le volume correspondant à 50 grands carrés, la profondeur de la
cellule étant de 0,1mm, peut se calculer comme suit :
50 x 1/5 x 1/5 x 1/10 = 1/5 mm 3

Comme le sang a été dilué 20 fois, le nombre d’éléments contenus


dans 1 mm3 sera de : N x 20 x 5, soit donc Nx100.

Valeurs de références

Adulte : 3500 – 8000 /mm 3


Nouveau-né :10000 – 25000 /mm 3
1 an : 8000 – 18000 /mm 3
4 – 7 ans : 6000 – 15000 /mm 3
8 – 12 ans : 4000 – 13500 /mm 3

Valeurs pathologiques

 Leucopénie : diminution du nombre de leucocytes < à 3500


éléments/mm3
-Fièvre typhoïde, Brucellose, Viroses, intoxication, leucémie
aleucémique, leishmaniose,…

 Hyperleucocytose : augmentation du nombre de leucocytes > à 8000


éléments /mm3
-Leucémies (200.000 et plus), beaucoup d’états infectieux,…

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4. DETERMINATION DE LA FORMULE LEUCOCYTAIRE (FL)
OU NUMERATION-FORMULE LEUCOCYTAIRE (NFL)

*Définition

C’est la répartition du nombre de chacune des catégories de


leucocytes par unité de volume ou encore c’est la répartition en
pourcentage des différentes sous-populations de leucocytes, qui
peut être établie manuellement par comptage.........des cellules sur
frottis mince coloré au MGG(May-Grünwald et Giemsa) à l'aide
d'un microscope ou par un appareil automatique intégrant la
formule sanguine au circuit.

*Principe
La technique de May-Grünwald et Giemsa consiste en la coloration
d'un étalement mince sur une lame d’une goutte de sang.
L’étalement est séché et ensuite coloré au MGG puis la lecture est
faite au microscope.

*Matériels
-lancette/ aiguille
-lame porte-objet
-lame rodée sur le bord
-compteur (manuel/ électrique)
-microscope optique
-réactifs : solution de May-Grünwald et solution de Giemsa
-bacs pour lavage

*Mode opératoire

-dégraisser la lame porte objet


-désinfecter la pulpe du doigt et piquer à l’aide d’une aiguille ou
lancette
-déposer une goutte de sang à 5mm de l’extrémité droite de la
lame porte-objet
-prendre la lame rodée, mettre en contact avec la lame porte-objet,

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sous un angle d’environ 45°.
-déplacer la lame rodée de gauche à droite jusqu’à ce qu’elle entre
en contact avec la goutte. Immédiatement, la goutte s’étale le long
de l’arrête de la lame rodée. Eviter de faire pénétrer directement
la lame dans la goutte, car risque de provoquer la destruction
d’un grand nombre de cellules.
-Le sang qui adhère à la lame rodée est tiré et étalé de droite vers
la gauche, d'un mouvement rapide.
-sécher le sang étalé
-colorer le frottis en déposant quelques gouttes de May Grünwald
sur la préparation.
-au bout de 2min, ajouter le même nombre de gouttes, mais cette
fois-ci d’eau tamponnée sur la préparation pendant 1min.
-renverser le mélange de MG-H20 tamponnée.
-colorer ensuite avec le Giemsa pendant 8 à 10min.
-laver à l’eau courante et laisser sécher la lame
-faire la lecture au microscope optique à l’objectif X100, du côté
de la queue d’étalement là où les cellules sont séparées les unes
des autres.
Compter jusqu’à 100 à 200 cellules de la lignée blanche tout en
les catégorisant(différencient).

*Interprétation des résultats

L’interprétation d’une formule sanguine doit se faire à partir du


nombre absolu, les % sont sources de confusion.

Valeurs en % valeurs absolues


Neutrophiles = 30 – 67% ----------------> 1800 à 7500
Lymphocytes = 26 – 60% ------------------> 1500 à 4000
Monocytes = 0 – 8% ------------------> 40 à 1500
Eosinophiles = 0 – 12% ------------------> 200 à 1000
Basophiles = 0 – 2% ------------------> 0 à 200

Noter la présence des cellules anormales et les anomalies des


globules rouges.

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*Description des cellules sanguines

CELLULE TAILLE NOYAU CYTOPLASME GRANULATION


Neutrophile 10 à 12 -Segmenté,--- ----- Acidophile ---------- Nombreuses,
µm -polylobé généralement fines,
(3 à 5 lobes) rougeâtres

Eosinophile 14 µm -Bilobé (svt),- ---- Orangé -------------- Grosses


-bisac, (orangées)
-combiné

Basophile ---------- Volumineux-- Recouvert par de grosses Grosses, noirâtres


granulations noirâtres

Lymphocyte ---------- Arrondie, ---- Réduit à un liseré péri- Sans granulation


régulier nucléaire ou important ou quelques

Monocyte ---------- Réniforme --- Légèrement basophile ou Fines granulations


ou arrondi ciel d’orange en poussière

*Intérêt clinique

La formule leucocytaire permet de voir s’il y a hyperleucocytose


(GB↑) ou hypoleucocytose (leucopénie) (GB↓),et d'en déterminer le
type ou la prédominance des cellules perturbées(lymphocytose,
hyper ou hyponeutrophie,monocyte,éosinophilie....)

5. NUMERATION DES GLOBULES ROUGES (GR)

Principe
Le sang est dilué au 1/200ème dans le liquide de Hayem (1 volume
de formol commercial à 40% + 99 volumes de citrate de sodium à
3%). Ce liquide a la particularité de conserver les globules rouges
et lyser les autres éléments figurés du sang.

Matériels

- Pipette de 0,02 ml (20μl) bien calibrée.


- Pipette Pasteur
- Tube à essai.
- Liquide de dilution : HAYEM.
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- Chambre à numération: Cellules de BURKER, de NEUBAUER..
- Microscope optique
- Lamelle spéciale couvre objet.
- Echantillon de sang prélevé sur EDTA
- Compteur manuel ou électrique

Mode opératoire

- Diluer le sang à 1/200 en pipetant 0,02 ml de sang dans 4 ml


de liquide de Hayem placé au préalable dans un tube à essai.
- Boucher le tube et retourner plusieurs fois pendant 1 à 2
minutes (Ne pas agiter pour ne pas détruire les G.R).
- Au moyen d'une pipette de Pasteur remplir la chambre à
numération recouverte de son couvre-objet. Il faut remplir la
chambre en une seule opération en prenant bien soin que le
liquide ne déborde pas et ne souille pas la surface supérieure
du couvre-objet. Eviter les bulles d'air.
- Laisse reposer en position horizontale pendant 3 minutes pour
permettre la sédimentation des éléments.
- Faire rapidement la numération en comptant dans 40 petits
carrés, car l'évaporation peut concentrer le liquide de dilution
et fausser les résultats.
- Multiplier le nombre d’éléments comptés par 20.000 si la
dilution est de 1/200.
La cellule de Bürker est divisée en grands et en petits carrés.
Les grands carrés ont 1/5 mm de côté et les petits, 1/20 mm
de côté.

La justification des calculs est la même (Cfr.GB.)

-40 petits carrés = 1/20 x 1/20 x 1/10 = 1/4000 mm3


1/4000 x 40 = 1/100 mm3
-Ramener à 1 mm3 : 1/100 x 100 = 1 mm3
-Tenir compte de la dilution (1/200) = 200 x, soit 100 x 200 = 20.000
GR = N x 20.000 si dilution est de 1/200
N x 10.000 si dilution est de 1/100
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Valeurs de référence

Homme : 4 à 6 millions/mm3

Femme : 3,8 à 5,5 millions/mm3


Enfant : 4,5 à 5,6 millions /mm3

La numération des GR étant fastidieuse et ne donnant pas de


résultats très précis, on ne l’utilisera pas pour rechercher la
présence d’une anémie.
Néanmoins, elle reste indispensable pour établir le caractère
macrocytaire d’une anémie, par le calcul des constantes
érythrocytaires.

1/4mm 1/20mm ┌┐1/20mm ┌┐1/5mm

Fig1.Cellule de Neubauer Fig2. Cellule de Bürker

6. VITESSE DE SEDIMENTATION (VS)

Définition:

c'est la vitesse avec laquelle les GR, en suspension dans le plasma,


sédimentent ou tombent au fond d'un tube dit “tube de
westergeen”, et dont la hauteur en un temps donné,
habituellement en 1heure, traduit certains états pathologiques;
notamment inflammatoires ou infectieux.

Explication du phénomène
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Lorsque l'on place du sang avec anticoagulant dans un tube en
position verticale ou inclinée, les GR tendent à tomber au fond du
tube , car leur poids spécifique est supérieur à celui du plasma.

Cette chute s'accompagne cependant d'un courant ascendant du


plasma qui retarde cette sédimentation.

Normalement, cette vitesse de sédimenter est donc lente ou


freinée.

Mais, si le nombre des GR est nettement diminué( cas d'anémie), le


courant ascendant du plasma est retardé, lent et donc les GR ne
sont pas freinés dans leur chute et tombent vite; on dit que la VS
est accélérée ou augmentée.

Ce dernier phénomène se produit également quand la surface des


GR ,même en cas de nombre suffisant ( sans anémie),n'est pas
suffisamment en contact le plasma, enveloppés par l'augmentation
des globulines(hyperglobulinémie) qui regroupent ou agglutinent
les GR(cas de l'inflammation ou d'une infection).

MATERIEL ET REACTIFS

- Statif de Westergreen

- Tube de Westergreen, gradué en mm sur une longueur de 20 cm

- Tube de recueil de sang, dit tube à hémolyse, marqué d'un trait à


la hauteur de 2cm.

- Ou à la place, une seringue stérile graduée, d'une capacité


minimale de 5 ml

- Poire d'aspiration.

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- Solution stérile de Citrate de sodium à 3,8g%(Na2O6H5O7.2H20)

- Le malade doit être à jeun.

- Les tubes de Westergreen doivent être propres, rincés à l'eau,


alcool-éther et bien séchés.

MODE OPERATOIRE

- Prélever avec un minimum de stase (sans maintenir trop


longtemps le garrot) 1,6 ml de sang dans une seringue de 2 ml
contenant 0,4 ml de citrate de sodium à 3,8%.

- On laisse couler directement le sang dans un tube à hémolyse


marqué d'un trait à 2 cm de hauteur contenant préalablement 0,4
ml de citrate.

- Bien mélanger par inversions successives, sans agiter.

- Le sang étant bien homogéneïsé, pipeter avec une poire jusqu'au


trait 0 dans un tube de Westergreen, en évitant d'aspirer de l'air.

- Fixer verticalement le tube de Westergreen dans le statiff ad'hoc.

- Lire la hauteur de la sédimentation exactement après une heure.

PRECAUTIONS

- La proportion sang-citrate, soit de 0,4 ml de citrate pour 1,6 ml


de sang, soit de 0,8 ml de citrate pour 3,2 ml de sang doit être
scrupuleusement respectée, car c'est ainsi que la méthode est
standardisée.

- Eviter des bulles d'air en pipetant le sang

- Eviter la coagulation du sang, même microscopique

- La position inclinée des tubes accélère la VS

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- Si la limite de GR-plasma est imprécise, car progressive, le
signaler dans le rendu des résultats.

- Ne pas dépasser 1H de temps. Bien chronométrer le montage de


chaque tube.

INTERPRETATION DES RESULTATS

Homme: 1 à 16 mm ⁄h

Femme: 2 à 22 mm ⁄h

NB: Valeurs chez le noir africain

VALEURS PATHOLOGIQUES

- Augmentation modérée: < 40 mm ⁄h: états inflammatoires,


infections aiguës, subaiguës, chroniques, nécrose
tissulaire(infarctus), maladies immunitaires, grossesse avancée(10e
semaine).

- Augmentation importante : > 50 mm ⁄h: myélomes multiples,


TBC, Cancer , Anémie.

- Diminution : polycythémies, hémoconcentration( brûlure


étendue...)

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II. BIOCHIMIE CLINIQUE

1. LE TEST DE RIVALTA

*Définition
C’est une méthode qualitative qui consiste à mettre en évidence la
présence ou l’absence des protéines dans un liquide
d’épanchement en vue d’en déterminer la nature : Exsudative ou
Transsudative; afin d'affirmer si ce liquide est un Exsudat ou un
Transsudat.

*Principe
La dénaturation et la précipitation des protéines par l’action d’un
acide fort (Acide acétique glacial).

*Matériels
-verre à pied (Erlenmeyer, éprouvette graduée),
-pipettes Pasteur,
-eau distillée (100ml),
-Acide acétique glacial,
-liquide d’épanchement.

*Mode opératoire

-remplir le verre à pied avec de l’eau distillée jusqu’au trait 100ml,


-ajouter 3 à 5gouttes d’acide acétique glacial à l’aide de la pipette
Pasteur, et bien mélanger,
-avec une autre pipette pasteur, prélever une quantité du liquide
d’épanchement et laisser tomber goutte à goutte quelques 3 ou
4 gouttes et observer la réaction.

*Interprétation des résultats

-Si les gouttes précipitent avec apparition d’une traînée blanchâtre


sous forme de nuage en fumée : Test de Rivalta= Positif , il s'agit
d'un EXSUDAT.
-Si les gouttes se dissipent avec absence de traînée blanchâtre :
Test de Rivalta= Négatif ; c’est un TRANSSUDAT.

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*Intérêt clinique

En clinique, la réaction de Rivalta permet déterminer la nature d’un


épanchement ; de distinguer les épanchements inflammatoires des
épanchements d’origine mécanique.

*Diagnostic différentiel entre exsudat et transsudat

TRANSSUDAT EXSUDAT
Aspect limpide trouble/opaque

Couleur Jaune citrin Jaune citrin, bleu,


verdâtre, rouge

Rivalta Négatif Positif

M.G.G. Cellules endothél., Neutrophiles,


qlqs GB lymphocytes
Odeur Inodore/fade Putride

Teneur en protéines <25g% >25g%

Tendance à la coagulation Négatif Positif

Microscopie Cell. épithéliales ; qlqs GB Polynucléaires,


cellules néoplasiques

2. LA RECHERCHE DES PROTEINES DANS LES URINES

Il existe deux types de recherche des protéines dans les urines :


- protéinurie qualitative
- protéinurie quantitative

1° RECHERCHE QUALITATIVE DE LA PROTEINURIE

*Définition

Elle consiste à mettre en évidence la présence ou l’absence des


protéines dans les urines.
Il existe plusieurs méthodes :
- méthode à ébullition (la chaleur);
- méthodes utilisant des réactifs (acide fort);
- méthodes à bandelettes réactives ;

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a) Méthode à ébullition

*Principe
C’est la dénaturation et précipitation des protéines par la chaleur.

*Matériels

-tube à essai
-pipette pasteur ou compte goutte
-source de chaleur
-portoir
-gants stériles
-porte tube (pince en bois)

*Mode Opératoire

-à l’aide d’une pipette pasteur, remplir le tube à essai avec des urines
jusqu’au 1/3.
-porter le tout à l’ébullition
-observer la réaction.
-si apparition d’un trouble, ajouter 3 à 5gouttes d’acide fort et
observer la réaction.
-si persistance du trouble : Protéinurie Positive
-si disparition du trouble : Protéinurie Négative

*Interprétation des résultats

-aucun trouble= négatif


-trace de protéines= +
-troubles granuleux sans floculation ≈1g% ; ++
-nuage dense avec fluctuation ≈ 2 à 3g% ; +++
-précipitation très dense ≈ 5g% ; ++++

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NB : la protéine de BENCE-JONES est une protéine spécifique que
l’on retrouve dans l’urine en cas de Myélome Multiple(Kahler),
leucémie.
Elle a la caractéristique d’être thermosoluble c.à.d. tendance à la
floculation à 60°C (précipitation) et se solubilise à 100°C. Cette
protéine thermosoluble apparait à 60°C et disparait à 100°C.

b) Méthode d’acidification

*Principe
C’est la dénaturation et précipitation des protéines par un acide fort.

*Matériels
-tube à essai
-pipette pasteur
-portoir
-gants stériles
-acide fort, acide trichloro-acétique

*Mode opératoire

- à l’aide d’une pipette pasteur, remplir le tube à essai jusqu’à 1/3


- ajouter 3 à 5gouttes d’acide fort
- observer la réaction et interpréter les résultats comme précédemment.

2° RECHERCHE QUANTITATIVE DE LA PROTEINURIE

*Définition

Elle consiste à déterminer, évaluer les pertes exactes en protéines


par les urines en vue d’une compensation parentérale.
La méthode utilisée est celle d’ESBACH

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*Matériels

-Tube d’esbach (gradué en gramme pour 1000)


-Erlenmeyer
-Acide picrique : 10g
-Acide citrique : 20g
-Eau distillée : 1000ml

*Mode Opératoire

-quantifier la diurèse (D) du patient à l’aide d’un Erlenmeyer


-remplir le tube d’Esbach d’urine jusqu’au trait U
-ajouter le réactif picro-citrique d’Esbach jusqu’au trait R
-boucher le tube
-faire des mouvements par retournement environ une dizaine de fois
-laisser reposer le tube pendant 24 heures sur une surface plane

*Interprétation des résultats

Après 24heures, lire le résultat (X) correspondant à la hauteur du


précipité des protéines obtenu.
Faire la correction à l’aide de la formule suivante :
X.D/1000 = Gr de protéines par ml d’urine émis par 24heures

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3. RECHERCHE DU GLUCOSE DANS LES URINES

*Définition

C’est la recherche qualitative ou semi-quantitative du glucose dans


les urines.

« Méthode réductimétrique de FEHLING »

*Principe

Le glucose est un réducteur : il transforme le sulfate de cuivre


(bleu) de la solution de Fehling en oxyde cuivreux (rouge), qui est
insoluble. Donc c’est la réduction cuivrique (Cu+++  Cu++) en
présence du glucose.

*Matériels
-Tube à essai
-Porte-tube ou pinces en bois pour tube à essai
-Bécher
-Lampe à alcool (Bec de Bunsen) ou autre source de chaleur
-Pipettes pasteur
-Solution de Fehling A = Sulfate de cuivre 5 fois hydraté
(CuSO4.5H2O); de couleur bleu ciel
-Solution de Fehling B = Tartrate de sodium et de potassium;
incolore.

*Mode Opératoire

On distingue deux temps :


- 1er temps : contrôle du réactif
- 2ème temps : examen proprement dit
a) Contrôle du réactif
A l’aide d’une pipette Pasteur ou compte goutte, prendre un
volume du réactif de Fehling A et le mettre dans le tube à essai.

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Avec une autre pipette Pasteur prendre un volume équivalent de
Fehling B et ajouter dans le tube à essai qui contient le Fehling
A. Il se forme un mélange de couleur bleu foncé, ensuite porter
le tout à ébullition et voir si persistance de la couleur bleu
foncé; conclure que le réactif est de bonne qualité. Sinon,
changer des réactifs.

b) Examen Proprement dit


-Prendre un volume du mélange de Fehling (A+B), mettre dans
un tube à essai; ajouter 1 volume équivalent d’urine dans le
même tube à essai; porter le tout à ébullition.
-Observer la réaction et interpréter les résultats obtenus en
fonction de l’échelle colorimétrique suivante :

Lecture du résultat : observer tout changement de couleur ou


apparition de précipité

Couleur Résultat (Glucosurie)


Bleu Négative
Vert Trace
Vert avec précipité jaune Positive (+)
Jaune à vert foncé Positive (++)
Brun Positive (+++)
Orange à rouge brique Positive (++++)

*Intérêt clinique

- le dépistage ou le diagnostic des troubles du métabolisme du


glucose
- chez la femme enceinte, prévenir une pré-éclampsie

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*Diagnostic différentiel des diabètes

Diabète sucré Diabète Diabète


rénale insipide
Glycémie Augmenté (↑) Normal (N) Normal (N)
Glycosurie Positif (+) Positif (+) Normal (N)
Polyurie Augmenté (↑) Normal (N) ou Augmenté (↑)
Augmenté (↑)
Polydipsie Augmenté (↑) Normal (N) Augmenté (↑)
sauf exagérer
Polyphagie Augmenté (↑) Normal (N) Normal (N)
sauf appétit

4. MESURE DE LA DENSITE OU POIDS SPECIFIQUE DE


L’URINE

*Définitions :

-La densité d’un corps est le rapport de sa masse volumique à la


masse volumique d’un corps pris comme référence.
Le corps de référence est l’eau pure à 4°C pour le liquide et le solide.
Dans le cas de gaz ou vapeur, le corps de référence est l’air à la
même température et sous la même pression.
-La densité urinaire est le poids spécifique de l’urine qu’on mesure
en rapport avec le poids spécifique de l’eau, pris comme référence, en
sachant que tout corps a un poids spécifique.
-La densité est une grandeur sans dimension et sa valeur s’exprime
sans unité de mesure.
Densité = Poids spécifique du corps
Poids spécifique de référence

- Poids spécifique du corps= masse volumique du


corps
- Poids spécifique de référence=masse volumique
du corps de référence.

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*Principe :
Le densimètre plongé dans l’urine, donne un chiffre qui sera corrigé
en fonction de la température.
*Matériels :
-densimètre ou urinomètre
-thermomètre (0° à 50°C)
-éprouvette (50ml) ou cylindre de 500ml ou plus
-échantillon d’urine
*Mode opératoire

- verser environ 40ml d’urine dans l’éprouvette ou remplir au ¾ le


cylindre ;
- y plonger l’urinomètre ou le densimètre et le lâcher doucement ;
- attendre qu’il se stabilise. Il ne doit pas toucher les parois ou le
fond du cylindre ou éprouvette;
- lire la densité correspondant au niveau de la surface de l’urine
(bord inférieur du ménisque) jusqu’à la troisième décimale.
- retirer le densimètre, mesurer aussitôt la température de l’urine au
moyen d’un thermomètre.

Calcul :

-vérifier la température d’étalonnage du densimètre indiquée par le


fabricant (souvent 15°C et 20°C)
-corriger la densité lue en fonction de la température de la manière
suivante :
>si la température de l’urine dépasse la température
d’étalonnage de 3°C, ajouter 0,001 à la densité trouvée, et
ainsi de suite pour chaque tranche de 3°C.
>si elle est inférieure de 3°C à la température d’étalonnage,
soustraire 0,001 et ainsi de suite pour chaque tranche de 3°C.
>si protéinurie, retirer une unité à la troisième décimale pour
chaque 4g‰ de protéines urinaires
>si glycosurie, retirer une unité à la troisième décimale pour
chaque 2,7g‰ du glucose. Pour faciliter les calculs, on

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retirera une unité à la troisième décimale pour chaque 3g%.
>si volume urinaire insuffisant : diluer le petit volume
urinaire obtenu avec un même volume d’eau distillée et on
multiplie la fraction décimale de la densité trouvée par 2.

*Interprétation des résultats

- La densité urinaire est normalement de 1,010 à 1,025 avec des


variations extrêmes de 1,003 à 1,030.
- La densité diminue dans le diabète insipide, néphrite aiguë,
toxique ou chronique.
- Elle est élevée dans le diabète sucré (présence de glucose), dans la
décompensation cardiaque avec oligurie (urine dense).
- Une faible densité n’est pas significative si le sujet a bu une grande
quantité de liquide avant la mesure.

NB : Le densimètre ou l’urinomètre doit être contrôlé tous les 3 mois,


en le plongeant dans l’eau distillée à la température d’étalonnage.
On doit trouver =1,000. Sinon, l’appareil est défectueux.

Exemple 1:
-densimètre étalonné à 20°C
-température de l’urine : 26°C
-densité lue : 1,021
La température de l’urine est supérieure de 6°C à la température
d’étalonnage. Il faut donc ajouter au chiffre de densité : 0,002
c.à.d.: 6/3 x 0,001 = 2 x 0,001 = 0,002
La densité réelle de l’urine est donc : 1,021 + 0,002 = 1,023

Exemple 2:
-densimètre étalonné à 15°C
-température de l’urine : 24°C
-densité lue : 1,020
La température de l’urine est supérieure de 9°C à la température
d’étalonnage. Il faut donc ajouter au chiffre de densité : 0,002
c.à.d.: 9/3 x 0,001 = 3 x 0,001 = 0,003
La densité réelle de l’urine est donc : 1,020 + 0,003 = 1,023
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