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Université de Tunis El Manar

Faculté des sciences de Tunis

Département chimie

Mémoire de projet de fin d’études

Présenté pour l’obtention de

Diplôme Universitaire de La licence Appliquée

Spécialité : chimie fine

Réalisée par

BEN HASSINE Omnia

Sujet

Validation analytique de dosage d’un principe actif dans une spécialité pharma-

ceutique « Azithromycine comprimés » par HPLC

Soutenu le /06/2014 devant le jury d’examen composé de :

Mr. BEN AKECHA Azaiez Professeur, Faculté des Science de Examinateur


Tunis
Mr. AMRI Hassan Professeur, Faculté des Science de Encadreur universitaire
Tunis
Mr. ATTIA Mouez Directeur industrialisation, Medis Encadreur industriel

Année universitaire : 2013/2014


Dédicace

À Dieu tout puissant qui m’a toujours soutenu


À mes chers parents qui m’ont toujours entouré de leur soutien et de leur affection

Surtout à ma mère, Jalila, pour sa tendresse, sa présence irremplaçable


et son amour sans faille.

À mon frère Racem et ma sœur Oumaima, qui auront toujours une place à part dans
mon cœur et pour tous les précieux moments passés ensemble.

À mes amis, surtout, BEN HSEN Élé , Lauleb Maroua et BEN HAMOUDA

Maha qui ont su me redonner de la force quand il le fallait et croire en moi juste parce que
c’était moi, qui m’ont protégé, guidé et conseillé et qui m’ont comblé par leur amour et leur
affection inestimable.

À toute la promotion chimie fine 2014, en souvenir de nos efforts communs

À toute personne qui a contribué de près ou de loin à la réalisation de ce travail

Que ce mémoire soit le témoignage de mon profond amour,


gratitude et mon éternelle reconnaissance.
Remercîment

Ce travail a été réalisé au sein du laboratoire de recherche et développement de la société


Medis dans le cadre d’élaboration d’un projet de fin d’étude pour l’obtention du diplôme univer-
sitaire de la licence appliquée.

Ma profonde gratitude et mes sincères remercîments s’adressent à Monsieur BOUJBAL

Lassaad, directeur général des laboratoires Medis qui a m’accepté au sein de son entreprise.

Je voudrais exprimer ma plus vive reconnaissance à Monsieur ATTIA Mouez, directeur


industrialisation, pour m’avoir accueilli au sein de son département.

Je tiens aussi à exprimer mes vifs remercîments à mon encadreur industriel Madame BEL-

LAHIRICH Wafa, ingénieur en biologie industrielle, pour sa proposition du sujet et pour


tout le temps qu’elle a consacré pour m’encadrer.

Mes profonds remercîments vont aussi à Monsieur BELLILI Naceur et Monsieur

KRAMTI Omar pour leur disponibilité, et pour m’avoir fait profiter de leurs expériences et
fait partager leur. Connaissances.

Je remercie sincèrement, Mademoiselle BASSOUMI Darine, Madame ABIDI

Henda et Madame BEN ALI Maroua pour leur aide précieuse et le temps qu’elles
m’ont consacré pour effectuer plusieurs tâches.

Ma profonde gratitude s’adresse également à mon encadreur universitaire Monsieur AMRI

Hassan qu’il n’a pas cessé de m’apporter son bénéfique encadrement et qui m’a permis de
mener à bien le présent travail.
J’ai l’honneur et le plaisir d’exprimer ma gratitude à tous mes professeurs de la FST
pour la précieuse formation dont ils m’ont fait profiter et les connaissances qu’ils
m’ont fait acquérir durant mes trois ans d’étude.

En fin, merci à toute personne qui a pu, de près ou de loin, favoriser l’élaboration de
ce travail.
Liste des abréviations
Liste des tableaux
Liste des figures
Sommaire
Les laboratoires Medis

I-Présentation de l’entreprise:

Les Laboratoires Medis sont une société anonyme de droit tunisien ayant le mandat de fabriquer et
de commercialiser divers médicaments génériques.
Fondée en 1995, Medis a obtenu la licence d’exploitation en juin 1999. Elle possède une certification de
conformité aux BPF selon les recommandations de l’OMS.

La première Autorisation de Mise sur le Marché, A.M.M, remonte au mois de Février 2000. Ac-
tuellement, Medis jouit maintenant d'une forte présence sur le marché tunisien des médicaments
génériques et produit près de 150 produits de qualité.

II- Les produits de Medis:


Les laboratoires de Medis maitrisent la fabrication :
 Des carpules dentaires
 Des ampoules
 Des flacons de lyophilisats
 Des flacons de poudres
 Des flacons de Collyres
 Formes sèches orales (comprimés et gélules)
 Les seringues pré-remplies
III-Objectif de l’entreprise :
Le principal objectif est de mettre en place une infrastructure technologique permettant
d’optimiser l’usage de l’usine de production et de favoriser le développement de produits de
haute qualité à des couts compétitifs.
II-Structure de l’entreprise :
L’organisation générale de la société se traduit à travers l’organigramme suivant : [1]
Direction
Générale

Direction Direction de Direction Direction administration et


pharmaceutique Production recherche et finance
développement

Assistance de Département commercial et


Département production Marketing
Assurance qualité

Assistance Département Logistique centrale


Déparetement de Pharmaceutique
controle qualité

Département ressources
Humaines et moyens Généraux

Développement de
maintenance et
securité
Département des finances et
comptabilité

Figure I-1 : Structure des laboratoires Medis


Introduction Générale

L’industrie pharmaceutique est l’une des industries les plus importantes économiquement dans
le monde entier et qui regroupe les activités de recherche, de fabrication et de commercialisation
des médicaments ainsi L’industrie pharmaceutique tunisienne a connu un développement rapide et re-
marquable ces dernières années, puisque jusqu’en 1989 une seule unité étatique, à savoir la Pharmacie
Centrale de Tunisie, assurait la fabrication de quelques médicaments à usage humain.

La Tunisie, qui ne produisait qu’à peine 8% de ses besoins en 1987, en assure actuellement plus de 56 %
grâce à une trentaine d’unités industrielles privées et publiques. En effet, sur les 50 premiers médica-
ments consommés en Tunisie, environ une quarantaine est fabriquée localement. Au cours des années 90,
la production a connu une forte croissance : elle a enregistré un taux d’accroissement annuel moyen égal
à 25,5%. Les produits génériques représentaient près de 45% de cette production contre 55% pour les
produits sous licence d’où le système de contrôle qualité joue un rôle primordial dans
l’assurance qualité de produit pharmaceutique en faisant souvent appel aux méthodes sépara-
tives pour des analyses des mélanges complexes dans les matrices pouvant être riches en interfé-
rences. Dans ce contexte, la validation d’une méthode d’analyse représente également un des
principaux outils de l’assurance qualité, permettant de construire la qualité de produit et d’en
conserver les standards depuis sa conceptions jusqu’ à la fin de sa commercialisation ainsi elle
est fondée sur une analyse statistique basée sur un certain nombre de critères aboutissant à des
méthodes analytiques permettant de donner des résultats fiables et traçables. Donc, elle a pour
but de démontrer qu’elles correspondent à l’utilisation pour laquelle elles sont proposées afin
d’aider concrètement les spécialistes du médicament à appliquer les recommandations réglemen-
taires concernant la validation.

C’est dans ce cadre que se situe ce projet effectué aux laboratoires Medis dont l’objectif prin-
cipal de ce travail est la validation analytique d’une méthode de dosage par chromatographie li-
quide à haute performance du principe actif dans son produit fini afin de démontrer que la pro-
cédure correspond à l’usage pour lequel elle est prévue et qu’ elle donne régulièrement des résul-
tats escomptés.

1
Après une brève présentation de l’entreprise, ce travail comporte trois chapitres :

 Le premier est consacré à l’étude bibliographique du projet dans laquelle nous présentons
l’importance de la spécialité pharmaceutique ainsi qu’une description des méthodes d’analyses
chromatographiques en particulier la HPLC et la validation analytique dans le domaine pharma-
ceutique.
 Le deuxième chapitre est dédié à la présentation de la méthodologie de travail et du matériel uti-
lisé.
 Dans le troisième chapitre, on trouve les différents résultats obtenus au cours de la validation de
la méthode d’analyse et la discussion fruits de notre travail.

Enfin, cette mémoire est terminée par une conclusion générale qui sera tirée à partir des résul-
tats des différents critères de validation étudiés lors de ce travail afin de qualifier la méthode
adoptée est validée ou non.

2
Chapitre I

Généralités
Chapitre I Généralités

A. La spécialité pharmaceutique:
I- Présentation de la spécialité pharmaceutique :
I.1 Définition :
« Tout médicament préparé à l’avance, présente sous un conditionnement particulier et carac-
térise par une dénomination spéciale ». Il s’agit donc de la majorité des médicaments vendus
tous les jours dans les officines, élaborés en grand nombre dans l’industrie pharmaceutique, et
qui possède pour la plupart des noms de fantaisie. [2]

II- Présentation d’un médicament :


II-1Définitions :
 Médicament : un médicament est un mot masculin d’origine latine (medicamentum) dans la
première apparition date de 1314. Il est définit comme « une substance employée pour traiter une
affection ou une manifestation morbide». [3]

Le CSP nous donne une définition plus précise «On entend par médicament toute substance ou
composition présentée comme possédant des propriétés curatives ou préventive à l’égard des
maladies humaines ou animales , ainsi que tout produit pouvant être administrée a l’homme ou à
l’animal, en vue d’établir un diagnostic médical ou de restaurer, corriger ou modifier leur fonc-
tion organique».

 Générique : le générique est un médicament ayant la même composition qualitative et quantita-


tive en principes actifs qu’une spécialité de référence. [4]

Chaque médicament est défini par le nom chimique de son principe actif, la dénomination com-
mune internationale D.C.I et un plusieurs noms de marque également appelés nom de fantaisie.
[5]

II-2 Composition d’un médicament :


Un médicament comporte essentiellement deux constituants :

 Principe actif : Tout composant d’un médicament qui est destiné à exercer une action pharma-
cologique ou un autre effet direct en rapport avec le diagnostic, le traitement ou la prévention
d’une maladie, ou à agir sur la structure ou les fonctions de l’organisme humain

3
Chapitre I Généralités

ou animal par des moyens pharmacologiques. Un médicament peut contenir plusieurs principes
actifs.
 Excipient : Tout composant, autre que le(s) principe(s) actif(s), qui est présent dans un médi-
cament ou utilise pour sa fabrication. La fonction d’un excipient est de servir de vecteur (véhi-
cule ou base) au(x) principe(s) actif(s), ou d’entrer dans la composition du vecteur, contribuant
ainsi à certaines propriétés du produit telles que la stabilité, le profil biopharmaceutique, l’aspect
et l’acceptabilité pour le patient, la facilite de fabrication. La formulation d’un médicament
comprend généralement plusieurs excipients. [6]

III-Présentation de PA : Azithromycine :
III-1Définition :
L’azithromycine (Azithromax®) est un macrolide hemisynthétique C15 de la famille des aza-
lides. [7]

 Propriétés physico-chimiques :

 Formule développée :

 Formule brute : C38H72N2O112, X H2O Avec X= 1 ou 2


 Structure chimique : Les macrolides sont caractérisés par un cycle lactonique réuni à des oses,
substitués par des hydroxyles, des groupements alkyles et une fonction basique.[8]

Le cycle de base est de grande taille (macro). [9]

 Aspect : poudre blanche ou sensiblement blanche


 Solubilité : pratiquement insoluble dans l’eau, facilement soluble dans l’éthanol anhydre et dans
le chlorure de méthylène. [10]

4
Chapitre I Généralités

 Mode d’action : Les macrolides constituent une famille d’antibiotiques assez homogène sur le
plan du spectre antibactérien.
 Spectre d’action : le spectre est réduit essentiellement aux cocci Gram +.Les macrolides n’ont
presque plus d’activité sur le pneumocoque et l ’Haemophilus,
en raison des résistances croissantes. Ils sont actifs sur les bacilles Gram + mais pas sur les ba-
cilles Gram- . Ils ont une bonne activité sur les apparentes : mycoplasmes, chlamydias, et sont
efficaces sur les anaérobies.
 Indications : Les macrolides sont utilisés dans les cas de bronchites et de sinusites aigues et su-
rinfectées, en raison de leur bonne diffusion pulmonaire et ORL.
 Mode d’action : elle est bactériostatique. En bloquant la synthèse protéique, on empêche la
bactérie de produire les protéines de structure nécessaires au dédoublement de la bactérie lors de
sa multiplication.
 Cinétique : ils ont une très bonne diffusion pulmonaire et sont capables d’aller où là les autres
ont du mal à se concentrer en particulier dans l’os et la salive. Ils ne passent pas dans le liquide
céphalo-rachidien, et donc ne pourront pas être utilisés dans les cas de méningite. L’élimination
est hépatique. L’absorption digestive est réduite par les aliments.
Azithromycine résiste beaucoup à pH gastrique acide que les autres macrolides, ce qui lui as-
sure une meilleure absorption, sa biodisponibilité est de 37%. [11]
 Principaux effets indésirables :
 Nausée, vomissements, diarrhées, douleurs abdominales ;
 Elévation des transaminases hépatiques ;
 Réduction légère et transitoire des polynucléaires neutrophiles.
 Contre-indication : Insuffisance hépatique sévère.
 Précaution d’emploi :
 Prudence en cas d’atteinte hépatique
 Prudence si la clairance de la créatinine est < 4 ml/min. [12]
B. La chromatographie :
I-Introduction :
Les méthodes chromatographiques sont des méthodes de séparation mettant en jeu différents
processus physicochimiques.

5
Chapitre I Généralités

Historiquement, l’apparition de ces techniques remonte à 1903, date à laquelle le botaniste russe
M.Tswett à réaliser la séparation de pigments végétaux de la chlorophylle sur une colonne
remplie de carbonate de calcium avec de l’éther de pétrole.

La séparation du mélange en différentes bandes colorées a donné son nom à la méthode chroma-
tographique du grec khroma qui signifie couleur. Alors que cette première séparation

était basée sur les différences d’adsorption des pigments. Des évolutions ont suivi la première
expérience de Tswett.

L’origine de l’efficacité des techniques chromatographiques réside incontestablement dans le fait


que les constituants du mélange à résoudre entrent dans une suite continue d’un nombre considé-
rable d’équilibre avec deux phases :

 l’une stationnaire, appelle phase fixe ;


 l’autre dite mobile qui parcourt la première avec une vitesse déterminée.

II-Intérêt de la chromatographie :

Les méthodes chromatographiques sont les méthodes les plus importantes de l’analyse immé-
diate. Elles permettent, bien sûr, de séparer les constituants d’un mélange plus ou moins com-
plexe mais là ne se borne pas leur intérêt car elles

peuvent également assurer dans certaines conditions l’identification et la détermination quantita-


tive des substances.

III-Grandeurs caractéristiques d’une séparation :

III-1 Temps de rétention :


tm temps mort : temps de passage de la phase mobile dans la colonne.
tR temps brute de rétention : temps écoulé entre l’introduction du compose dans la colonne et le
moment où la substance sort a sa concentration instantanée maximale.
t´R temps de rétention réduit : tR-t0 . [13]

6
Chapitre I Généralités

III-2 chromatogramme :

Représentation graphique ou autre, de la réponse d’un détecteur, de la concentration d’un ef-


fluent ou d’une grandeur utilisée comme mesure de la concentration d’un effluent en fonction du
temps ou du volume. Idéalement, un chromatogramme se présente comme une séquence de pics
gaussiens au-dessus d’une ligne de base.

III-3 pic chromatographique :


Partie d’un chromatogramme enregistrant la réponse du détecteur lorsqu’ un composant (ou plu-
sieurs composants non séparés) sort de la colonne. [14]

IV-La chromatographie à haute performance en phase liquide HPLC :


IV-1 Définition :
La chromatographie liquide haute performance (CLHP, en anglais HPLC) : c’est une chromato-
graphie de partage dans laquelle la phase mobile liquide est sous haute pression (300 à 600 bar).
[15]

IV-2 Principe :
La HPLC est une technique de séparation des molécules qui se fait par entraînement au moyen
d’une phase mobile liquide le long d’une phase
stationnaire contenue dans une colonne. Aussi, elle permet d’identifier, analyser et doser les
constituants d’un mélange. [16]

IV-3 Mécanisme de séparation :


Une phase mobile liquide est filtrée et dégazée. Elle sera poussée par l’intermédiaire d’un sys-
tème de pompage au niveau d’un système d’injection.

Cette phase mobile entraine le volume d’échantillon injecté sur une phase stationnaire. Les diffé-
rents constituants du mélange appelés solutés seront séparés par interactions phase mobile/phase
stationnaire/échantillon à analyser. Ces solutés sont retenus pendant la traversée de la colonne.
Les vitesses de déplacement des constituants sont différentes, ainsi ils sont ainsi

élués les uns les autres et donc séparés, c’est le phénomène de rétention. Ils sont ensuite détectés.

Au passage de chaque soluté séparé, il y aura enregistrement d’un pic.

7
Chapitre I Généralités

Dans les conditions chromatographiques données, le temps de rétention caractérise qualitative


ment une substance. [17]

IV-4 Appareillage :
Ce type de chromatographie nécessite un appareillage plus sophistiqué, ce qui explique son utili-
sation en milieu industriel pour la purification et le contrôle des matières premières et des pro-
duits finaux. [16]

Un appareil de chromatographie en phase liquide comporte quatre parties : un système de pom-


page, un injecteur, une colonne et un détecteur à travers lesquelles un liquide entraine les subs-
tances d’un mélange à séparer.

Détecteur

Pompe
Intégrateur

Colonne

Injecteur

Porteur échantillons
Figure I-2: Appareillage de la HPLC

Le dégazage de la phase mobile est une opération obligatoire en chromatographie en phase li-
quide. Il se fait par barbotage de l’Hélium dans la phase mobile.

VI-4-1 Pompe :
Dans la HPLC, les pompes servent à faire passer la phase mobile ou le mélange de solvants à
travers la colonne pour entrainer les composés à analyser.

Les pompes utilisées dans les appareils HPLC sont programmables pour pouvoir effectuer
l’analyse en mode « isocratique » ou en mode « gradient ».

8
Chapitre I Généralités

V-4-2 Injecteur :
Le type d’injecteur le plus couramment utilisé comporte une vanne à bouche d’échantionnage
d’une capacité fixée à 20 µl. Cette boucle calibrée, remplie de

l’échantillon à étudier, peut être introduire, sans variation importante de la pression, dans le cir-
cuit allant des pompes vers l’entrée de la colonne.

IV-4-3 Colonne :
La colonne est l’instrument où s’effectue la séparation des composants. C’est un tube cylin-
drique compact qui renferme des microparticules qui jouent le rôle de la phase stationnaire. Une
fois la phase mobile entrainant les composés à analyser est véhiculée, l’affinité des

composés à chaque phase leur permet de faire la séparation. La séparation peut être réalisée en
phase normale (phase stationnaire

polaire et phase mobile polaire) ou(en phase inversée phase stationnaire apolaire et phase mobile
très polaire).

IV-4-4 Détecteur :
Il permet d’analyser chaque composé à sa sortie de la colonne. Généralement, le détecteur utilisé
est du type UV-visible.

Le détecteur UV-visible émet des rayons à une longueur d’onde ou dans un domaine bien dé-
tersminé, chaque composé qui sort de la colonne et qui absorbe ces rayons, donne un signal à sa
sortie. [18]

C. Validation d’une méthode d’analyse :


I- Définition :
La clause 5.4.5.1 de la norme ISO 17025 :2005 donne une définition de la validation sur laquelle
nous reviendrons : « La validation est la confirmation par examen et l’apport de preuves objec-
tives du fait que l’exigences particulières en vue d’utilisation prévue déterminée sont rem-
plies ». [19]

9
Chapitre I Généralités

II -Objectif de la validation :
Le but de la validation d’une procédure analytique est de démontrer que cette dernière

correspond à l’usage pour lequel elle a été conçue, l’objectif d’une méthode étant généralement

de pouvoir doser le plus exactement et le plus précisément possible une liste de molécules dont
le laboratoire a en charge l’analyse.

Il s’agit de donner au laboratoire et aux autorités des garanties suffisantes que les résultats obte-
nus sont fiables, c’est à dire que chacune des mesures réalisées en routine avec cette méthode est
proche de la «vérité». [20]

III- les critères de la validation analytique :


III-1 Spécificité :
Capacité d’une méthode à mesurer un analyte particulier dans un échantillon sans que cette me-
sure soit faussée par d’autres composants de l’échantillon.

III-2 linéarité :
Établissement qu’il existe une relation linéaire entre les quantités retrouvées (ou quantifiées)
dans des échantillons et leurs valeurs de référence. [19]

III-3 Fidélité :
La Fidélité d’une procédure analytique exprime l’étroitesse de l’accord (mesure de la disper-
sion) entre des mesures obtenues à partir de plusieurs prises d’essai d’un même échantillon
homogène.

III-4 L’exactitude :
L’exactitude exprime l’étroitesse de l’accord entre les résultats d’essais et la valeur de référence
acceptée. Elle renseigne sur l’erreur totale qui implique une combinaison de composantes aléa-
toires et une composante de biais. [20]

10
Chapitre II

Matériels & Méthodes


Chapitre II Matériels et méthodes

Un protocole a été effectué afin de détailler la démarche à suivre pour assurer validation analy-
tique et qui comprend :
 L’état des matières premières et des réactifs
 La liste des équipements utilisés .
 La manipulation : préparation des solutions (tampons, solvants, phase mobile)
 Planning journalier

II-1 Réactifs et échantillons de matières premières utilisés :


Les tableaux ci-dessous présents les échantillons de matière première et de réactifs chimiques à
utiliser.
Tableau II-1 : Réactifs et matières premières
Réactifs Matières premières
Potassium phosphate diba- Azithromycine
sique K2HPO4
Sodium 1- octane sulfonâtes Amidon prégélatinisé
Acide phosphorique Monohydrogénophosphate de
calcium anhydre
Acétonitrile Opadry
Méthanol Stéarate de magnésium
Ammonium phosphate mo- Laurysulfate de soduim
nobasique NH4 H2PO4

II-2 Appareillage :
Les appareils utilisés lors de cette analyse doivent aussi être conforme aux normes, ils doivent
subir un suivi quotidien afin de s’assurer de leurs performances pour fournir les meilleurs résul-
tats.
Les appareils utilisés pendant le protocole de validation sont présentés dans le tableau suivant :
Tableau II-2 : Équipements utilisés
Désignation Marque
Balance analytique MS METTLER TOLEDO
Chaine HPLC Waters alliane 2695
Agitateur mécanique IKA®-WERKE
Bain a ultrason ROHS
Centrifugeuse Seven Multi METTLER
TOLEDO
pH-mètre ROTOFIX 32A Hettich
ZENTRIFUGEN

11
Chapitre II Matériels et méthodes

II-3 Conditions chromatographiques :


On vise à partir de ce protocole de doser l azithromycine dans le produit fini par HPLC.
Les conditions de dosage sont les suivantes :

Tableau II-3 : conditions chromatographiques

Colonne : Longueur : 15 cm
Phase stationnaire : Packing L1
Taille des particules : 5µm
Diamètre intérieur : 4.6 mm
Débit : 1.5 ml/min
Double détection : UV a 210 nm
Volume injecté : 50 µl
Température : 50 ̊C
Durée d’injection : 16 minutes

II-4 Teneur en principe actif :

[𝒔𝒖𝒓𝒇𝒂𝒄𝒆 𝒆𝒔𝒔𝒂𝒊] [𝒎𝒂𝒔𝒔𝒆 𝒕é𝒎𝒐𝒊𝒏 𝒎𝒆𝒔𝒖𝒓é𝒆] [𝒎𝒂𝒔𝒔𝒆 𝒆𝒔𝒔𝒂𝒊 𝒕𝒉é𝒐𝒓𝒊𝒒𝒖𝒆]


Tpa(%) = [𝒔𝒖𝒓𝒇𝒂𝒄𝒆 𝒕é𝒎𝒐𝒊𝒏] 𝑋 𝑋
[𝒎𝒂𝒔𝒔𝒆 𝒕é𝒎𝒐𝒊𝒏 𝒕𝒉é𝒐𝒓𝒊𝒒𝒖𝒆] [𝒎𝒂𝒔𝒔𝒆 𝒆𝒔𝒔𝒂𝒊 𝒆𝒙𝒑é𝒓𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒂𝒍𝒆]
𝑋𝑡

Avec Tpa : titre en % d azithromycine dans l’essai.


Surface essai : aire du pic d azithromycine dans l’essai
Surface témoin : d azithromycine dans le témoin
Masse témoin mesurée : masse du témoin de référence mesurée
Masse témoin théorique : masse théorique du témoin
Masse essai théorique : masse théorique de l’essai
Masse essai expérimentale; masse expérimentale de l’essai
t : titre de substance de référence tel quel en %

12
Chapitre II Matériels et méthodes

II-5 Mode opératoire à valider :


II-5-1 Préparation des solutions :
a. Préparation de la phase mobile :

Solution A :

Dissolvez 4.4 g de potassium phosphate dibasique (K2HPO4) et 0.5g de sodium 1-octane sul-
fonâtes dans un litre d’eau. Ajuster le pH a 8.2 ±0.05 avec l’acide phosphorique.
Phase mobile :
Elle comporte 45% Acétonitrile, 15% Méthanol et 40% solution A.
b. Préparation de diluent :

Solution B :

Dissolvez 1.7g d’ammonium phosphate monobasique ((NH4) H2PO4) dans 1 litre d’eau
puis ajuster le pH a 10.0 avec l’ammoniaque.
Diluent A :

Il contient 350 ml de méthanol, 300 ml d’acétonitrile et 350 ml de solution B.

c. Préparation de la solution standard (Pa seul) :

Dissoudre 41.9mg d azithromycine dihydrate dans 75 ml de diluent A puis compléter a 100.0 ml


avec le même solvant.
(Cc= 419.2 µg/ml en azithromycine dihydrate équivalent à 400.0 µg/ml en azithromycine base.)
d. Préparation de la solution à examiner (PA+ placébo) :

Pesez une quantité de poudre (700mg du vrac) équivalente à524.2mg d azithromycine dihydrate
dans une fiole de 50.0ml dissoudre dans le diluent A, agiter 15 minutes puis compléter au vo-
lume avec le même solvant.
Centrifuger a 3000trs/min pendant 5 min. Diluez 2.0ml de surnageant dans 50.0 ml de diluent A.
(Cc= 419.2 µg/ml en azithromycine dihydrate équivalent à 400.0 µg/ml en azithromycine base)

II-6 Planning journalier :


Cette manipulation sera effectuée au bout de trois jours et sera repartie de la manière suivante :
II-6-1 Premier jour :
II-6-1-1 Étude de la spécificité :
On étudie la spécificité pour s’assurer qu’il n y a pas d’interférence entre l analyte (PA) et les
différents produits (excipients, produits de dégradation, impuretés).

13
Chapitre II Matériels et méthodes

Pour l’étude de la spécificité de la méthode on prépare trois solutions :


 Préparation d’un placébo (ou matrice) :c’est un mélange de tous les excipients excepté la subs-
tance active.
 Préparation d’une solution contenant le principe actif (PA) seul : l’azithromycine.

 Préparation d’une solution qui comporte la forme pharmaceutique reconstituée : c’est un mé-
lange qui contient le placébo et le principe actif.

Tableau II-4 : Étude de la spécificité


Matrice Azithromycine
Solution (mg) (mg)

Azithromycine 524.2
Matrice 175.8
FPR 175.8 524.2

II-6-1-2 Étude de la linéarité :


L’étude de linéarité nécessite la préparation de deux séries de solutions : la première consiste à
préparer 5 essais de concentration en (%) 60, 80, 100,120et 140 en PA et la deuxième consiste à
préparer des solutions de même concentration que la première en ajoutant la matrice afin d’avoir
la FPR sous différentes concentrations de PA.
Les quantités à prélever sont présentées dans les tableaux suivants :
 Série 1 : PA seul
Tableau II-5 : Étude de la linéarité de PA seul
Échantillon Teneur azi-
en PA thromycine
(%) (mg)

L1 60 25.152
L2 80 33.536
L3 100 41.92
L4 120 50.304
L5 140 58.688

14
Chapitre II Matériels et méthodes

 Serie2 : FPR

Tableau II-6 : Étude de la linéarité de FPR


Teneur en PA (%) azithromycine (mg) Matrice
(mg)

60 314.52 175.8
80 419.36 175.8
100 524.2 175.8
120 629.04 175.8
140 733.88 175.8

II-1-3 Étude de la fidélité :


La fidélité intermédiaire est déterminée suite à l’injection six fois de la concentration théorique
correspond à 100% en principe actif de la forme pharmaceutique reconstituée et a raison d’une

série par jour comme il est indiquée dans le tableau suivant :

Tableau II-7 : Étude de la fidélité de la FPR

Échantillon Teneur Matrice azithromycine


en PA (mg) (mg)
(%)
F1 100 175.8 524.2

F2 100 175.8 524.2

F3 100 175.8 524.2

F4 100 175.8 524.2

F5 100 175.8 524.2

F6 100 175.8 524.2

II-6-1-4 Étude de l’exactitude :


Selon l’ICH, l’exactitude est déterminée quand la spécificité, la fidélité et la linéarité ont été éta-
blies. On utilise la même gamme de concentration déjà utilisée pour l’étude de la linéarité du
principe actif seul et de la FPR en effectuant trois mesures pour chaque niveau de concentration
(60 à 140 %) a raison d’une mesure par jour.

15
Chapitre II Matériels et méthodes

Tableau II-8: Étude de l’exactitude de la FPR


Échantillon Teneur Azithromycine Matrice
en PA (mg) (mg)
(%)
E1 60 314.52 175.8
E2 80 419.36 175.8
E3 100 524.2 175.8
E4 120 629.04 175.8
E5 140 733.88 175.8

II-6-2 Deuxième jour et troisième jour :


Durant ces deux jours successifs, on va étudier encore une fois la linéarité, la fidélité et
l’exactitude avec le même protocole décrit au cours du premier jour a été suivie.

II-7 Etude statistique des données :


II-7-1 Test d’homogénéité des variances (Cochran) :
Le test de Cochran permet de vérifier si on a des mesures aberrantes ou suspectes, ainsi, que
l’homogénéité des variances constitutives des erreurs expérimentales.

Le critère à utiliser est : k


Ccalculée  S2m ax S
j1
2
j

Avec : Sj2 : Variances des groupes « j »

Smax2 : Valeur maximale des variances Sj2

K : nombre d’échantillons par groupe

Si l’inégalité suivante est vérifiée : C calculé < C (α, k, n-1), l’ensemble des variances des différents
groupes « j » peut être considéré comme homogène au risque α = 5% et n = nombre de groupes
d’essai.

II-7-2 Test de comparaison de l’ordonnée à l’origine des droites de régression avec

zéro (STUDENT) :
Le test de « STUDENT » permet de vérifier que l’ordonnée à l’origine n’est pas significative-
ment différente de 0 au seuil de significativité de 5% donc il permet de montrer que la courbe
peut être considérée comme une fonction linéaire.

16
Chapitre II Matériels et méthodes

On doit vérifier que t test < t (α, N-2) où


a
t test =
Avec : a : ordonnée à l’origine Sa

Sa: écart type de l’ordonnée à l’origine

N : nombre de groupes d’essai

Si l’inégalité est vérifiée, on considère que l’ordonnée à l’origine n’est pas significativement
différente de zéro au seuil de probabilité de 5%.

 Variation des erreurs aléatoires :

  y  y   a    x
² ²
 x 
k nj k nj
²
j1i1
ij
 j1i1 ij 
SR² 
N2

 Variation de l’erreur systématique :

 
 2

1
²  SR²   x 
Sa
N


k nj
²
  x ij  x 
j1 i1 

II-7-3 Test de l’existence d’une pente significative (FISHER) :
Ce test consiste à comparer les variations dûes à la régression et aux erreurs résiduelles (expé-
rimentales et d’ajustement) :

F1  Sl2 S2R

Avec : F : Test de Fisher

S2 : Variances

17
Chapitre II Matériels et méthodes

Les calculs sont rassemblés dans le tableau suivant :

Tableau II-9 : Test de l’existence d’une pente significative

Variations DDL Somme des carrés Variances F calculé

Variation k nj 2

Yij  Y
totale
N-1
T²  
j1 i1 

F 1  S l2 S 2R
l
 
Variation k
S 2
l
2
2
due à la
régression
1
l 2
b 2  n j X j  X
j 1

Variation S2R   R 2 N  2
R  T  l
N-2 2 2 2
résiduelle

Avec : DDL : Degré de liberté

Si F1 est significatif, c'est-à-dire que F1 > F (α, 1, N-2), on conclut à l’existence d’une pente signifi-
cative, donc à une dépendance linéaire entre la variable dépendante et la variable indépendante,
au seuil de probabilité égale à 0.95.

II-7-4 Test de validité de la droite de régression (FISHER) :


Ce test permet de comparer les erreurs d’ajustement SL2 et les erreurs expérimentales SE2.

18
Chapitre II Matériels et méthodes

Les calculs sont rassemblés dans le tableau suivant :

Tableau II-10: Test de validité de la droite de régression

Variations DDL Somme des carrés Variances F calculé F tabulé

 
2
k nj
2
Erreur expé-
rimentale
N-K  E    Yij  Yj S2E   E 2 N  k 
j 1i 1

F2  S 2L S 2E F
2  α; k - 2; N  k 

Erreur de la
régression
K-2 L  R  E
2 2 2
S2L   L2 k - 2

Si F2 < F (α, K-2, N-2), on conclut que l’ajustement est considéré comme valide au
seuil de probabilité égale à 0.95.
II-7-5 Calcul du pourcentage de recouvrement :
On calcule l’intervalle de confiance de recouvrement moyen :

 Recouvrement moyen

t α;N1  ST
Y
N
 L’intervalle de confiance :

k nj
Y   (1 / knj )  Yij
j 1 i 1

Avec : « m » est la moyenne des recouvrements

19
Chapitre II Matériels et méthodes

II-7-6 Critères d’acceptation de la validation analytique :

Pour chaque paramètre étudié, des critères d’acceptation sont prédéfinis afin de conclure de sa significa-
tion. Les critères d’acceptation de la validation analytique sont résumés dans le tableau suivant :

Tableau II-11: Critères d’acceptation de la validation analytique

Paramètres Tests Critères d’acceptation


-Test d’homogénéité des va- Non significatif au seuil de 5%
riances (Test de Cochran)
Linéarité -Test de l’existence d’une pente Significatif au seuil de 5%
significative
-Test de validité de la droite de
Non significatif au seuil de 5%
régression
-Test de comparaison de
l’ordonnée à l’origine avec zéro.
Non significatif au seuil de 5%
-Coefficient de corrélation des 3
séries

≥0.997

-Test d’homogénéité des va- Non significatif au seuil de 5%


riances
Exactitude
-Test de validité des moyennes Significatif au seuil de 5%
-Moyenne des recouvrements
[95%-105%]
-Test d’homogénéité des va- Non significatif au seuil de 5%
Fidélité
riances

Coefficient de variation ≤ 2
-Fidélité intermédiaire
(dosage principe actif)
Coefficient de variation ≤ 2
(dosage impuretés)

20
Chapitre III

Résultats & Interprétations


Chapitre III Résultats et interprétations

Les résultats obtenus ont été interprétés en utilisant le logiciel Empower 3 qui est conçu spécifi-
quement pour l’étude statistique de la validation des méthodes analytiques.

III-1 Spécificité :
L’injection du blanc (la phase mobile) et du placebo n’a généré aucun pic spécifique alors que
l’injection du principe actif seul et du principe actif dans la forme pharmaceutique reconstituée
donne la même surface des pics et le même temps de rétention. Les résultats sont présentés dans
le tableau suivant :

Tableau III-12: Étude de la spécificité

Solution Temps de Aires des Facteurs


injectée rétention : pics de symé-
tR (min) trie
Principe 12,424 1061047,647 1,38
actif seul

FPR 12,398 1060587,256 1,37

L’examen des chromatogrammes en annexe 1 (partie 1) et le tableau précèdent montrent que le


pic d’azithromycine est unique. La présence d’excipients n’a pas d’influence sur les pics d azi-
thromycine seul et dans son produit. Par conséquent, il n’existe pas d’interférences au niveau des
signaux provenant de la phase mobile et du placebo avec le signal provenant du principe actif.

Les différents résultats et enregistrements permettent de conclure qu’il n’y a pas d’interférences
au niveau des signaux ainsi la méthode de dosage d’azithromycine est spécifique.

III-2 Linéarité :
La démarche de l’analyse statistique est de démontrer statistiquement que la méthode est linéaire
dans l’intervalle de concentration choisi pour le composant seul et pour le composant dans son
produit puis de démontrer que les deux droites ne sont pas statistiquement différentes.

Les données regroupent 15 valeurs indépendantes : 5 points de gamme avec 3 valeurs par point
de cette gamme.

Les résultats suivants sont obtenus à partir des chromatogrammes e des injections de la première
et la seconde série d’étude de la linéarité en annexe 2 (partie 1) puis une analyse statistique
grâce au logiciel informatique nous a permis l’étude statistique de ses données.

21
Chapitre III Résultats et interprétations

Les données brutes sont indiquées dans les tableaux suivants :

Tableau III-13 : Résultats d’étude de la linéarité de PA seul


Masse Masse Cexp en
Essai Teneur Azithromy-
Jour Référence théorique expérimentale Surface
(j/i) (%) cine
(mg) (mg) (mg/ml)
1/1 60,0 J1 L1.1 25,15 25,70 0,2570 640253,99
2/1 60,0 J2 L2.1 25,15 25,45 0,2545 639448,57
3/1 60,0 J3 L3.1 25,15 25,52 0,2552 636109,24
1/2 80,0 J1 L1.2 33,53 33,65 0,3365 854810,54
2/2 80,0 J2 L2.2 33,53 33,70 0,3370 852837,03
3/2 80,0 J3 L3.2 33,53 33,55 0,3355 850069,50
1/3 100,0 J1 L1.3 41,92 41,99 0,4199 1067774,63
2/3 100,0 J2 L2.3 41,92 42,12 0,4212 1065401,29
3/3 100,0 J3 L3.3 41,92 42,22 0,4222 1063105,82
1/4 120,0 J1 L1.4 50,30 50,44 0,5044 1277479,57
2/4 120,0 J2 L2.4 50,30 50,39 0,5039 1275111,12
3/4 120,0 J3 L3.4 50,30 50,36 0,5036 1273219,89
1/5 140,0 J1 L1.5 58,68 59,02 0,5902 1495767,41
2/5 140,0 J2 L2.5 58,68 58,95 0,5895 1492173,48
3/5 140,0 J3 L3.5 58,68 58,80 0,5880 1483830,34

Tableau III-14 : Résultats d’étude de la linéarité de FPR


Masse Masse Cexp en
Essai Teneur
(j/i) (%)
Jour Référence théorique expérimentale Azithromycine Surface
(mg) (mg) en (mg/ml)

1/1 60,0 J1 L1.1 314,52 314,88 0,2519 643081,7


2/1 60,0 J2 L2.1 314,52 314,92 0,2519 643425,3
3/1 60,0 J3 L3.1 314,52 315,01 0,2520 645885,4
1/2 80,0 J1 L1.2 419,36 419,36 0,3355 852276,7
2/2 80,0 J2 L2.2 419,36 420,02 0,3360 855998,4
3/2 80,0 J3 L3.2 419,36 420,12 0,3361 858680,1
1/3 100,0 J1 L1.3 524,20 524,50 0,4196 1068813,5
2/3 100,0 J2 L2.3 524,20 524,70 0,4198 1067765,6
3/3 100,0 J3 L3.3 524,20 524,88 0,4199 1070840,5
1/4 120,0 J1 L1.4 629,04 629,25 0,5034 1285940,8
2/4 120,0 J2 L2.4 629,04 630,12 0,5041 1288894,7
3/4 120,0 J3 L3.4 629,04 629,50 0,5036 1288613,4
1/5 140,0 J1 L1.5 733,88 733,95 0,5872 1498670,6
2/5 140,0 J2 L2.5 733,88 733,99 0,5872 1496930,6
3/5 140,0 J3 L3.5 733,88 734,01 0,5872 1496268,2

22
Chapitre III Résultats et interprétations

III-2-1 Détermination de la droite de régression :


La droite de régression est déminée en fonction de la surface des pics obtenus et de la teneur
PA.

Pour la première et la deuxième série on obtient les graphiques suivant :

Figure III-3: courbe de linéarité du principe actif seul

Figure III-4 courbe de linéarité de la forme pharmaceutique reconstituée


23
Chapitre III Résultats et interprétations

FPR PA seul

L’équation de la droite : Y 2040,8x +186.1 25468-8309.6


La pente : b 2040.8 25468
L’ordonnée a l’origine : a +186.1 -8309.6
Le coefficient de corréla- 0.9999 0.9998
tion

III-2-1-1 Test de Cochran :


Le test d’homogénéité des variances intra-groupes ou test de Cochran présenté en annexe 1,
tableau 1 (partie 2) permet de vérifier si on a des mesures aberrantes ou suspectes. Ce test
montre que C calculée est de 0.47 de la FPR, est inferieur a Ctabulée (0.05 ; 5 ; 2) qui est de 0.68

On conclue ainsi qu’on ne pourrait pas trouver des valeurs aberrantes. Donc

l'ensemble des variances peut être considéré comme homogène au risque α = 5%

III-2-1-2 Test de comparaison de l’ordonnée à l’origine des droites de régression


avec zéro (STUDENT) :
Ce test consiste à vérifier que l’ordonnée à l’origine de la droite, présenté en annexe1, tableau 6
(partie 2), n’est pas statistiquement différente de 0 et inferieure a la valeur critique. Ce test
montre que ttest est de 0.085 est inferieur a t(0.05 ;13) qui est de 2.16 ainsi le test de comparaison de
l’ordonnée a l’origine est satisfaisant.

III-2-1-3 Test de l’existence d’une pente significative (FISHER) :


Ce test consiste à comparer les variations dues à la régression et aux erreurs expérimentales et
d’ajustement. Ce test, présenté en annexe 1, tableau 4 (partie 2), montre que F calculée est de
304014 pour a FPR, est supérieur à F tabulée (0.05 ; 1 ; 13) qui est de 4.67. Donc l’erreur est non signi-
fiante au risque de 5%, nous pouvons conclure ainsi l’existence d’une pente significative à une
dépendance linéaire au seuil de probabilité de 0.95 pour la FPR. Il existe une relation les X ij et
les Y ij.

III-2-1-4 Test de validité de la droite de régression (FISHER) :


Ce test consiste a démontré que le modèle de linéarisation adopté est bien valide malgré
l’existence des erreurs. Ce test, présenté en annexe 1, tableau 5 (partie 2), montre que F2 cal-
culée pour la FPR est inferieur a F2 tabulée (0.05 ; 3 ; 10) qui est de l’ordre de 3.71. D’où F2 n’est pas

24
Chapitre III Résultats et interprétations

significatif au risque de 5% et l’ajustement est considéré comme valide au seuil de probabilité


considéré.

III-2-1-5 Le calcul du coefficient de corrélation


Ce calcul montre des coefficients de 0.9999 et 0.9998, respectivement pour la FPR et le PA seul,
qui sont très proche de 1.

III-3 Fidélité
Il s’agit de démontrer que la méthode de dosage d’azithromycine est fidèle en travaillant dans
des conditions opératoires identiques et dans des conditions différentes.

La fidélité se calcule sur trois séries à raison d’une série par jour.

Six essais à 100 % du PA dans sa FPR ont été préparés pour chaque série.

Les données statistiques sont présentées au niveau des chromatogrammes en annexe 4, (partie
1) et dans le tableau suivant :

Tableau III Résultats d’étude de la fidélité de la FPR


Masse Quantité
Essai Teneur
Groupe Référence thèorique introduite xij Surface yij
(i/j) (%)
(mg) (mg)
1/1 100 F1.1 524,20 524,52 1073316,60
1/2 100 F1.2 524,20 524,25 1061759,06
1/3 100 F1.3 524,20 525,12 1073562,07
1
1/4 100 F1.4 524,20 524,33 1062515,51
1/5 100 F1.5 524,20 525,01 1074779,67
1/6 100 F1.6 524,20 524,66 1061512,51
2/1 100 F2.1 524,20 525,01 1074590,13
2/2 100 F2.2 524,20 524,50 1069962,43
2/3 100 F2.3 524,20 524,96 1073155,24
2
2/4 100 F2.4 524,20 524,88 1066484,50
2/5 100 F2.5 524,20 525,02 1062541,18
2/6 100 F2.6 524,20 524,33 1061437,70
3/1 100 F3.1 524,20 524,44 1070213,97
3/2 100 F3.2 524,20 524,76 1068579,11
3/3 100 F3.3 524,20 524,78 1065594,09
3
3/4 100 F3.4 524,20 524,62 1061397,55
3/5 100 F3.5 524,20 525,22 1068716,24
3/6 100 F3.6 524,20 524,97 1069116,62

25
Chapitre III Résultats et interprétations

III-3-1 Test d’homogénéité des variances (Cochran) :


Ce test , présenté en annexe 3, tableau11 (partie 2),montre que C calculée est de 0.537, est in-
ferieur a C tabulée (0.05 ; 3 ; 5) qui est de 0.677. On conclue ainsi qu’il n y a pas de groupes où on
pourrait trouver des valeurs aberrantes d’où les trois variances intragroupes peuvent donc
être considérées comme homogènes au risque de 5%.

III-4 Exactitude :

La démarche de l’analyse statistique est de démontrer statistiquement que la méthode est


exacte. Les données statistiques sont présentées au niveau des chromatogrammes en annexe 3
(partie 1) et les tableaux statistiques en annexe 2 (partie 2).

Les données regroupent 15 valeurs indépendantes : 5 points de la gamme d’étalonnage (60, 80,
100, 120, 140) avec 3 valeurs par point de cette gamme.

Les données brutes sont indiquées dans le tableau suivant :

Tableau III: Résultat de l’exactitude

Masse Recouvre-
Essai Teneur Masse expéri- Cexp en Azithro-
Jour Référence théorique ment
(j/i) (%) mentale (mg) mycine (mg/ml)
(mg) (%)
1/1 60,0 J1 E1.1 314,52 315,11 0,2521 100.41
2/1 60,0 J2 E2.1 314,52 314,98 0,2520 100.70
3/1 60,0 J3 E3.1 314,52 314,90 0,2519 100.72
½ 80,0 J1 E1.2 419,36 420,36 0,3363 100.38
2/2 80,0 J2 E2.2 419,36 420,15 0,3361 100.61
3/2 80,0 J3 E3.2 419,36 419,85 0,3359 100.22
1/3 100,0 J1 E1.3 524,20 524,52 0,4196 100.55
2/3 100,0 J2 E2.3 524,20 524,96 0,4200 100.66
3/3 100,0 J3 E3.3 524,20 524,75 0,4198 100.82
1/4 120,0 J1 E1.4 629,04 629,63 0,5037 100.31
2/4 120,0 J2 E2.4 629,04 629,25 0,5034 100.87
¾ 120,0 J3 E3.4 629,04 629,15 0,5033 100.11
1/5 140,0 J1 E1.5 733,88 734,20 0,5874 100.75
2/5 140,0 J2 E2.5 733,88 733,96 0,5872 100.56
3/5 140,0 J3 E3.5 733,88 733,67 0,5869 100.99

26
Chapitre III Résultats et interprétations

Les pourcentages de recouvrement sont calculs comme suit :

Qté retrouvée
Recouvrement  *100
Qté introduite

Ainsi on obtient la courbe suivante :

Figure III-5 : courbe d’exactitude d’azithromycine

III-4-1 Test d’homogénéité des variances (Cochran) :


Ce test montre que C calculée est de 0.424, est inferieur a C tabulée (0.05 ; 5 ; 2) qui est de 0.68 donc
l’ensemble des variances des différents groupes sont considérées comme homogènes au
risque de 5%.

III-4-2 Test de validité des moyennes :


Apres la vérification de l’homogénéité des variances, il est possible de s’assurer, à travers ce
test, que les erreurs intra-groupes ne diffèrent pas par une analyse de variances. Ce test doit être
non significatif au seuil de significativité de 5%.

Le test de validité des moyennes a révélé une valeur expérimentale Ftabulée de l’ordre de 0.15
qui est inférieur à une valeur thèorique Fcalculée de l’ordre de 3.49 , on peut alors dire qu’il n’y a
pas de différence entre les moyennes des recouvrements des différents séries , ce qui permet de
confirmer que la variation des résultats entre les trois jours est non significative.

III-4-3 Test de recouvrement moyen :


Après avoir vérifié l’homogénéité des moyennes des recouvrements des différents jours, le re-
couvrement moyen et sont intervalle de confiance peuvent être valablement calculés.
27
Chapitre III Résultats et interprétations

Les valeurs obtenues sont indiquées dans le tableau suivant :

Moyenne des recouvrements Intervalle de confiance (0.14)

100.71 [100.57;100.85]

L’intervalle de confiance de recouvrement (100.57% à 100.85%) dans l’intervalle 60a 140 % de


la quantité thèorique en principe actif est jugé satisfaisant.

III-5 Bilan général :


Critères conclusion

Spécificité
Les données expérimentales
ont permis de prouver la
spécificité de la méthode
pour le principe actif : azi-
thromycine
Linéarité
Le traitement statistique des
données brutes a permis de
démontrer statistiquement la
linéarité de la méthode pour
le principe actif
Exactitude
Les données brutes ont per-
mis de démontrer statisti-
quement l’exactitude sur
l’intervalle étudié.
Fidélité
Le traitement statistique des
données brutes a permis de
démontrer statistiquement la
fidélité de la méthode.

28
Conclusion générale

Afin de pouvoir valider la méthode du dosage d’azithromycine, les tests de la validation ont été
répartis sur trois jours différents pendant lesquels plusieurs paramètres ont étés étudies qui sont :
la spécificité, la linéarité, la fidélité et l’exactitude.

La validation du dosage d’azithromycine nous a permis de conclure que cette méthode d’analyse
par HPLC est spécifique puisqu’ elle fait apparaitre le pic azithromycine en gardant le même
temps de rétention, linéaire dans le domaine de 60 à 140 mg.ml-1 avec un coefficient de corréla-
tion (R2)≥ 0.97 et elle est exacte et fidèle. En plus on peut déduire que la matrice présente lors
du dosage ne provoque aucune interférence avec les substances analysées puisque le pourcentage
de recouvrement varie entre 100.57 et 100.58%.

En perspective, cette étude pourrait être complémentée, d’une part par l’étude de la stabilité du
principe actif dans le produit fini dans le but de garantir sa stabilité dans le temps et sous l’effet
de plusieurs facteurs environnementaux et ambiantes citant à titre d’exemples la température,
l’humidité et la lumière. D’autre part, on pourrait établir des protocoles permettant de bien mai-
triser et gérer les conditions opératoires et de confirmer par vérification que les documents, les
locaux, les équipements et les réactifs adoptés conduisent à des résultats fiables et répétables.

29
Références bibliographiques
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30
Partie 1 :
Les chromatogrammes
Annexe 1 : Etude de la spécificité de la méthode de dosage de l’azithromycine
 Chromatogramme 1 : résultats de l’injection du PA seul

 Chromatogramme 2 : résultats de l’injection de la forme pharmaceutique reconstituée

 Chromatogramme 3 : résultats de l’injection du Placébo.


 Chromatogramme 4 : résultats de l’injection du Diluent (blanc)
Annexe 2 : Etude de la linéarité de dosage de l’azithromycine.

Chromatogramme 1 : résultats de l’injection du principe actif (PA) pour le premier jour.

Chromatogramme 2 : résultats de l’injection de la forme pharmaceutique reconstituée pour le premier jour.


Annexe 3 : Résultats de l’exactitude de la méthode de dosage de l’azithromycine.

Chromatogrammes 1 : résultats de l’injection de la forme pharmaceutique reconstituée pour le deuxième jour.

.Annexe 4 : Etude de la fidélité de la méthode de dosage de l’azithromycine.


Chromatogramme 1 : résultats de l’injection de la forme pharmaceutique reconstituée (FPR) pour le troisième
jour.
Partie 2 :
Démarche statistique de la validation ana-
lytique du principe actif par HPLC
Annexe 1 : Résultats des tests statistiques de linéarité faite sur la forme pharmaceutique reconstituée

Tableau 1- Linéarité : Calcul de la pente b


k

j 1 i  1
nj
 x ij  x  2
329419,0

k
  x
nj
  x  y   y  672270339

    
ij ij
j 1 i  1
k nj k nj 2
b   x ij  x  yij  y  xij  x 2041
j1 i1 j1 i1

Tableau 2 - Linéarité : Calcul de l'ordonnée à l'origine (a)

524,6
x
y 1070806

a  y  b  x 186

Tableau 3 - Linéarité : test d'homogénéité des variances intra-groupes (test de


Cochran)
groupes (j) 1 2 3 4 5

nj 3 3 3 3 3

Sj2 1949049 5887462 1836193 1172114 1698004

k k
S²max  S
j 1
2
j Ccalculé  S2max S
j 1
2
j CTabulé α;k;n1
5887462 12542823 0,47 0,68

C calculé=0,47< 0,68 =C tabulé (0,05 ; 5 ; 2)

L'ensemble des variances des différents groupes j peut être considéré comme homogène au risque α = 5%
Tableau 4 - Linéarité : Test de l'existence d'une pente significative
Fcalculée FTabulée
Variations DDL Somme des carrés Variances F1  S S 2
l
2
R Fα;1;N  2 

k nj 2

 Yij  Y
N-1 T²  
j1 i1 


Variation to-
tale

14 1,37201E+12

Variation due
1
k

 l 2 b 2  n j X j  X
j 1
 
2

Sl2   l 2
à la régres- 4,67
sion
1 1,37195E+12 1,37195E+12

N-2 R  T  l
2 2 2
S2R   R 2 N  2
304014
Variation ré-
siduelle

13 58666198 4512784

Fcalculée =304014 >Ftabulée=4,67, Valeur significative au risque 5%, nous pouvons conclure l’existence d’une
pente significative, donc à une dépendance linéaire entre la variable dépendante et la variable indépendante, au
seuil de probabilité 95%.
Tableau 5 : Linéarité : Test de validité de la droite de régression
Fcalculée FTabulée

Variations DDL Somme des carrés Variances F2  S2L S2E F


2  α; k - 2; N  k 

 
2
k nj
2
N-k
 E    Yij  Yj S2E   E 2 N  k 
Erreur expérimentale
j 1i 1

10 25085645 2508565
F (0,05;3;10)
4,462
= 3,71

k-2 L  R  E
2 2 2
S2L  L2 k - 2
erreur de la régression

3 33580553 11193518
Tableau 6-Linéarité : Test de comparaison de ordonnées à l'origine avec 0 (test de
student)


k

j  1 i  1

nj
y ij  y  2
1372021880373

4164766

x 
k nj 2
b 2
   ij  x 1371953095532
j 1 i  1

k nj
  y ij  y
j 1 i  1
  ²
 b²    x ij  x 
k nj

j1 i  1  
²
68784842

k nj
  y ij  y
j  1i  1
 ²  b ²    x k

j  1i  1
nj

ij
 x 

²
5291142
S R² 
N 2

2
275219,849
x
 
 1 x
2

  
 N


k

j 1 i 1
nj
 x ij  x  ² 


0,902

4773335

a 2185

Sa -186

a
0,085
Sa

0,085< t (0,05;13)=2,16 Donc l'ordonnée à l'origine n'est pas significativement différente de 0 au seuil de
probabilité de 95% (risque de 5%)
Annexe 2 : :Résultats des tests statistiques de l’exactitude faite sur la forme pharmaceutique reconstituée

Tableau 7: Résultats ( référence étalon 100% )

Essai Qté introduite en Qté retrouvée


Teneur en PA/Qté théorique Surface Yij Recouvrement S2j
(j/i) (mg) (mg)

1/1 315,11 643439,582 316,42 100,41


60% (groupe1) 2/1 314,98 641596,142 317,19 100,70 0,03
3/1 314,90 638634,181 317,16 100,72
1/2 420,36 858082,039 421,97 100,38
80% (groupe2) 2/2 420,15 855018,285 422,70 100,61 0,19
3/2 419,85 855746,278 424,98 101,22
1/3 524,52 1072533,971 527,43 100,55
100% (groupe3) 2/3 524,96 1068863,714 528,42 100,66 0,02
3/3 524,75 1065288,249 529,04 100,82
1/4 629,63 1284396,874 631,61 100,31
120% (groupe4) 2/4 629,25 1283834,177 634,70 100,87 0,16
3/4 629,15 1280878,864 636,11 101,11
1/5 734,20 1504169,404 739,68 100,75
140% (groupe5) 2/5 733,96 1492981,158 738,10 100,56 0,05
3/5 733,67 1491898,572 740,91 100,99

PA seul J1 J2 J3
b 2  y100 x100
25429 25294 25180

Tableau 8 - Exactitude : test d'homogénéité des variances intra - groupes PA


seul (test de Cochran)

Groupes G60 G80 G100 G120 G140

Ni 3 3 3 3 3

S²i 0,03 0,19 0,02- 0,16 0,05

k K

 Si S
2 C  S 2 max 2
C Tabulé α;k;n1
S²max i 1
i

i 1

0,189 0,446 0,424 0,68

C calculée = 0,424 <0,68 =C tabulée (0,05 ; 5 ; 2)


Valeur non significative au risque de 5%, L'ensemble des variances des différents groupes i
peut être considéré comme homogène au risque a=5%
tableau 9: Test de validité des moyennes

Variations DDL Somme des carrés Variances F calculée FTabulé


F3  α; k - 1; N  k 
F3  S 2
C S 2
E

Variations
N-1
k ni

 T²    Yij  Y
i 1 i 1
  2
ST2   T 2 N  1
totale
14 0,94 0,07

  S2E   E 2 N  k 
k ni

Variation intra-
N-k   ij i
E  2
Y  Y
i 1 i 1
0,15 3,49
groupe

10 0,89 0,09

 C   T   E SC2   C2 K  1
2 2 2
Variation inter- k-1
groupe
4 0,05 0,01
F3 =0,15<F (0,05;4;10) = 3,49. La valeur de F3 n'est donc pas significative au risque de 5%

Tableau 10: Exactitude : estimation de l'intervalle de confiance du recouvrement moyen (PA,


référence utilisée étalon 100%)

Yi
100,71

tabulé (0,05;13) = 2,145


S²T 0,07
ST = 0,26
t(0,05;13)*ST 0,556961165
RACIN (N) 3,872983346
t α;N1  ST
N
0,14
IRm1 100,85
IRm2 100,57

Moyenne des Recouvrement Yi Yij /N 100,71

intervalle de confiance t=2,145; t α;N 1  S T


I Y 100,71±0,14
N=15; =0,05; ST=0,569 N

l'intervalle de confiance du recouvrement (XY% à XX% dans l'intervalle 60 à 140% de la quantité


théorique en principe actif est jugé satisfaisant.
Annexe 3 : :Résultats des tests statistiques de l’exactitude faite sur la forme pharmaceutique reconstituée

Tableau 10 - Fidélité : Résultat (Référence : étalon 100%)


Essai Qté introduite xij Surface Qté retrouvée Recouvrement Y Moyenne Recouvrement Y
Groupe S²i
(i/j) (mg) Yij Xij (%) (%)
1/1 524,52 1073317 527,81 101
1/2 524,25 1061759 522,13 100
1/3 525,12 1073562 527,93 101 100
1 0,32
1/4 524,33 1062516 522,50 100
1/5 525,01 1074780 528,53 101
1/6 524,66 1061513 522,01 99
2/1 525,01 1074590 531,25 101
2/2 524,50 1069962 528,97 101
2/3 524,96 1073155 530,54 101
2 0,19
2/4 524,88 1066484 527,25 100 101
2/5 525,02 1062541 525,30 100
2/6 524,33 1061438 526,64 100
3/1 524,44 1070214 531,49 101
3/2 524,76 1068579 530,68 101
3/3 524,78 1065594 529,20 101 101
0,09
3 3/4 524,62 1061398 527,11 100
3/5 525,22 1068716 530,75 101
3/6 524,97 1069117 530,95 101

Tableau 11- Fidélité : test d'homogénéité des variances intra-groupes (test


de Cochran) (référence : étalon 100%)
Groupe 1 Groupe2 Groupe3
nj 6 6 6
2
Si 0,32 0,19 0,09
moyennes : mi 100,10 100,70 101,00
SommeS2i 0,60
S2imax 0,32
< 0,707=C (0,05;3;5) théo-
Calculée
0,537 rique
Les trois variances intragroupes peuvent donc être considéré comme ho-
mogènes au risque de 5%
Résultat correspondant à l'étalon 100%
Pa seul Jour 1 Jour 2 Jour 3
b 2  y100 x100
25429 25294 25180
Résumé

Le travail réalisé concerne la validation analytique par HPLC de la méthode de dosage du prin-
cipe actif dans son produit fini afin d’assurer un médicament sain et efficace. Ainsi, par
l’intermédiaire des interprétations extraites des critères de la validation étudiées : spécificité, li-
néarité, fidélité et exactitude qui eux même font appel aux différents tests statistiques.

Les résultats obtenus nous ont permis de conclure la validation de cette méthode puisqu’ elle ré-
pond aux exigences de son usage.

Adresse complète de l’entreprise :

Entreprise : Medis

Adresse : Rte de Tunis Km 7- 8000 Nabeul

Tél : +216.72.235.006

Fax : +216.72.235.016

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