FILIPE MATOS PEREIRA LIMA

JOÃO MARCOS LENHARDT SILVA

LEONARDO VIANA DAS CHAGAS LIMA
RAFAEL MARTINS DE PAULA
RICARDO MELLEGARI DE OLIVEIRA

DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS &

FRACIONAMENTO E DOSAGEM DAS PROTEÍNAS DO LEITE

Relatório acadêmico apresentado a

disciplina de Bioquímica do curso de
Bacharelado em Química Tecnológica /
Licenciatura em Química da
Universidade Tecnológica Federal do
Paraná - UTFPR – para obtenção de
nota parcial.

Orientador: Profª. Drª. Adriane Martins

de Freitas.

CURITIBA
2010
1 CONSTRUÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO

Foram preparadas seis soluções padrão com base em uma solução padrão de
albumina de soro bovino (BSA) (5 mg/mL). As soluções apresentaram absorbância
(540 nm) e concentrações relacionadas na Tabela 1:

Tabela 1 – Concentração e Absorbância das soluções padrão

Solução Concentração (mg/mL) Absorbância
1 0 0,11
2 0,167 0,16
3 0,33 0,20
4 0,50 0,25
5 0,67 0,28
6 0,83 0,34
Fonte: Autoria Própria.

Descontando o valor do branco (solução 1):

Tabela 2 – Concentração e Absorbância das soluções padrão II

Solução Concentração (mg/mL) Absorbância
1 0 0,00
2 0,167 0,05
3 0,33 0,09
4 0,50 0,14
5 0,67 0,17
6 0,83 0,23
Fonte: Autoria Própria.
 Com os dados da Tabela 2 construiu-se uma curva de calibração:

Gráfico 1 – Concentração VS Absorbância (Padrão)

Fonte: autoria Própria.

O coeficiente de correlação (R) obtido foi de R = 0,99521. A equação da reta

obtida é dada por:

Absorbância = 0,26391 [Proteína] + 0,0042 (1)

1.1 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PROTEÍNAS

Com a equação da reta e as absorbâncias de soluções de uma amostra

desconhecida é possível fazer a quantificação de proteína na amostra. As absorbâncias
das soluções foram relacionadas na Tabela 3:

Tabela 3 –Absorbância das soluções desconhecidas

Solução Volume de amostra (mL) Absorbância
7 0 0,12
8 1 0,23
9 0,5 0,17
10 0,4 0,16
Fonte: Autoria Própria.

Descontando o branco das absorbâncias (solução 7):

 Tabela 4 –Absorbância das soluções desconhecidas II
Solução Volume de amostra (mL) Absorbância
7 0 0,00
8 1 0,11
9 0,5 0,05
10 0,4 0,04
Fonte: Autoria Própria.

As absorbâncias da Tabela 4 foram utilizadas na equação (1) e assim foi obtida

uma concentração para cada solução:

Tabela 5 –Concentração das soluções desconhecidas

Solução Concentração (mg/mL)
8 2,63
9 2,53
10 2,60
Fonte: Autoria Própria.

As concentrações encontradas foram corrigidas, pois volumes diferentes de

amostra foram utilizados. Para tal utilizou-se a seguinte equação:

C1V1=C2V2 (2)

C1 é a concentração corrigida, C2 é a concentração determinada, V1 é o volume

de amostra utilizado e V2 é 6 mL (volume da solução):

Tabela 6 –Concentração das soluções desconhecidas II

Solução Concentração (mg/mL)
8 2,40
9 2,08
10 2,03
Fonte: Autoria Própria.

Com os três dados pode-se fazer uma média e expressar o valor da

concentração de proteína na amostra desconhecida:

[Proteína] = (2,17 ± 0,164)

1.2 DETERMINAÇÃO DE PROTEINAS EM LEITE

A curva de calibração construída pode ser utilizada para determinação da

concentração de proteínas em uma amostra de leite. Foram preparados 4 tubos.

Tabela 7 – Composição dos tubos

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4
Reagentes
Água 1 0,4
Solução de 0,6
proteína
Filtrado 1
Leite diluído 1
Biureto 5 5 5 5
Fonte: Autoria Própria.

As Absorbâncias medidas para cada tubo foram relacionadas na Tabela 8:

Tabela 8 –Absorbância das soluções

Solução Absorbância
11 0,21
12 0,32
13 0,45
14 1,07
Fonte: Autoria Própria.

Descontando-se o branco (solução 11):

Tabela 9 –Absorbância das soluções II

Solução Absorbância
11 0
12 0,11
13 0,24
14 0,86
Fonte: Autoria Própria.

Utilizando-se a equação (1) e os dado da Tabela 8, calculou-se as

concentrações:
 Tabela 10 – Concentrações das soluções
Solução Concentração (mg/mL)
12 0,40
13 0,89
14 3,24
Fonte: Autoria Própria.

A concentração encontrada no tubo 12 foi corrigida, pois utilizou um volume de

0,6 mL da solução de proteína (5 mg/mL). Para tal utilizou-se a equação (2). Na qual C1
é a concentração corrigida, C2 é a concentração determinada, V1 é o volume de amostra
utilizado e V2 é 6 mL (volume da solução):

Tabela 11 – Concentrações das soluções II

Solução Concentração (mg/mL)
12 4
13 0,89
14 3,24
Fonte: Autoria Própria.

O tubo 14 tem a concentração da proteínas em 1ml de leite logo por uma regra
de três simples pode-se obter a concentração em g/100mL de leite:

3,24 mg ----------------------------------------- 1 mL
X mg ------------------------------------------ 100 mL
X = 324 mg/100 mL = 0,324 g/100 mL

Com as concentrações do tubo 13 que corresponde a concentração de

proteínas não precipitadas em 1 mL de leite filtrado, ou seja a concentração das
proteínas que não a caseína, desse modo pode-se determinar a porcentagem de
caseína no leite. Para um mesmo volume (1 mL) tem-se 3,24 mg de proteínas totais e
0,89 mg de proteínas que não a caseína:

0,89 mg/ 3,24 mg = 0,27 = 27% de proteínas que não a caseína

A partir desse dado determina-se a porcentagem de caseína:

100% - 27% = 73% de caseína.
2 PERGUNTAS

01. Determine a composição e defina a importância dos tubos brancos e padrão na

determinação da concentração de um composto por espectrofotometria.

O tubo a ser usado como “branco” tem em sua composição apenas a água
destilada e a solução de biureto, este tem como finalidade identificar o valor do pico
no comprimento de onda de 540nm que a solução tem sem que qualquer porção de
amostra ou de solução padrão seja adicionada, permitindo assim a exclusão do sinal
gerado por interferentes.
No caso dos padrões, diferentes proporções de solução padrão de proteína
e água são misturadas ao biureto e colocadas no espectrofotômetro para encontrar
o valor do pico da solução em 540nm. Estes dados podem ser então usados para
compor uma curva de calibração, que são valores de picos de concentrações
conhecidas, alinhadas em uma reta de equação calculável, a qual pode ser usada
para identificar a concentração de proteína em uma amostra pela substituição da
variável “y” na equação pelo valor do pico da amostra.

02. Três mL de uma solução de azul de metileno (sol. A) foram diluídos a 7,5 mL
com água destilada (sol. B). A absorbância da solução B a 550 nm foi 0,4. Como
você determinaria a concentração da solução A?

A concentração da solução A pode ser expressa da seguinte forma:

ou
Na qual:
u.m: unidade de massa

A quantidade em massa de azul de metileno é igual nas duas soluções,

então podemos dizer que:

Pela Lei de Beer, temos:

 Tanto o caminho óptico quanto o coeficiente de extinção molar são os
mesmos, podemos dizer que a concentração é diretamente proporcional a
absorbância, então sendo a absorbância da solução B igual a 0,4, temos: