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TP N°01 La mise en évidence de l’activité antimicrobienne en milieu solide

I. Introduction

La résistance bactérienne aux agents antimicrobiens apparaît de nos jours comme une
des préoccupations majeures de santé publique. Un grand nombre des antibiotiques existants
sont constitués de molécules naturelles, fabriquées par des micro-organismes : des
champignons ou d'autres bactéries (Actinomycètes). Les actinomycètes sont des bactéries
filamenteuses à coloration de Gram positive qui subissent des différenciations
morphologiques durant leur cycle de vie. Plusieurs travaux confirment que les actinomycètes
isolés à partir des écosystèmes extrêmes, sécrètent des molécules utiles. Ils représentent une
grande proportion de la biomasse microbienne du sol. Ils ont la capacité de produire une large
variété de molécules bioactives entre autres des antibiotiques et d’enzymes extracellulaires.
On s’intéresse beaucoup plus dans ce TP à tester la sensibilité de deux souches bactériennes
vers quelques agents antimicrobiens produites par les actinomycètes en réalisant un
antibiogramme.

II. Objectif du TP
La mise en évidence de l’activité antimicrobienne d’une souche test (actinomycète) vis-à-
vis d’une souche cible (staphylocoques / Escherichia coli) sur un milieu solide (Mueller
Hinton).

II. Partie théorique

III.1. Quelques définitions

III.1.1.Les actinomycètes

Les actinomycètes sont des bactéries filamenteuses, septées, ramifiées, à coloration


de Gram positive. La morphologie des différents groupes d’actinomycètes est très variable,
elle va de formes peu évoluées comme Mycobacterium, à des formes très évoluées comme le
genre Streptomyces qui forme un véritable mycélium non fragmenté et sporulant.
Leurs propriétés chimiques, physiologiques, et immunologiques les rangent parmi les
procaryotes. Leur paroi cellulaire renferme une glycoprotéinecontenant de la lysine (formes
fermentatives) ou de l’acide diaminopimélique (formesoxydatives), et leur cytologie est celle
des bactéries.

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TP N°01 La mise en évidence de l’activité antimicrobienne en milieu solide

III.1.2. L’antibiogramme

Un antibiogramme est une technique de laboratoire visant à tester la sensibilité


d’une souche bactérienne vis-à-vis d'un ou plusieurs antibiotiques supposés ou connus.
Il existe 03 méthodes pour réaliser un antibiogramme :
1. Méthodes des cylindres
2. Méthodes des stries
3. Méthodes de double couche
III.1.3. Milieu Mueller Hinton
C’est un milieu complexe riche utilisé pour la réalisation de l’antibiogramme. Il composé
de :
1. Extraits de viandes
2. Peptone de caséine
3. Amidon de mais
4. Agar agar
5. pH= 7.4
III.1.4. Milieu Bennett

C’est un milieu de culture spécifique pour les actinomycètes, il composé de :

1. Peptone 2g/l
2. Extrait de viande 1g/l
3. Extrait de levure 1g/l
4. Glucose 10g/l
5. pH = 7,2
6. Agar 16g/l
III.1.5. CMI
La concentration minimale d’inhibition de la croissance bactérienne est la
concentration d’un antibiotique inhibant totalement la croissance bactérienne.
III.1.6. CMB
Concentration minimale bactéricide permettant de détruire ou de tuer 99,99% des
bactéries après 18 à 24h de contact avec l’antibiotique.

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III. Partie pratique


IV.1. Matériel
- Souches utilisées : - Pipette pasteur
 Staphylocoque (souche - Bec bunsen
cible) - L’eau de javel
 Actinomycètes (souche - Un marqueur
test) - Pince métallique
- Milieu de culture : - Ecouvillon
Boite pétri contenant le milieu - Etuve
Mueller Hinton

Figure 1 : Représente le matériel utilisé lors de la


manipulation

IV.2. L’aspect macroscopique des actinomycètes

On a constaté la présence de deux types de mycéliums :

- Mycélium aérien : petites colonies sphériques de couleur blanchâtre à crème.


- Mycélium du substrat : petites colonies sphériques de couleur brune à marron.

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(A) (B)

Figure 2 : Représente l’aspect macroscopique des actinomycètes : (A) mycélium aérien, (B)
mycélium de substrat

L'aspect morphologique du mycélium de substrat des actinomycètes est compact,


souvent coriacé, avec une surface sèche sur les milieux de culture et il est fréquemment
recouvertes de mycélium aérien.

IV.3. Méthodes

 L’ensemencement en quadrants

Il a pour objectif d'isoler des bactéries et d'obtenir des colonies bactériennes distinctes :

- Après avoir bien désinfecté la paillasse avec de l’eau de javel, on a allumé le bec
bunsen pour créer une zone stérile évitant tout contamination lors de manipulation.
- Puis, à l’aide d’un écouvillon on a prélevé une quantité (4 ou 5 colonies) de culture
bactérienne qui s’agit dans notre expérience de staphylocoque.
- On a déposé par la suite l’inoculum prélevé près d’un bord de la moitié de la boite
(Contenant Mueller Hinton) correspondante au quadrant 1.
- On a étalé ce dépôt en réalisant des stries très serrées puis élargis allons du quadrant 1
jusqu'à la moitié du quadrant 2.
- Par la suite, après avoir tourné la boite d’environ 90° ; on a étalé une partie des stries
précédentes sur le quadrant 2 jusqu'à la moitié du quadrant 3.

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- Puis, après avoir tourné la boite 90° on a répété une dernière fois l’étalement en stries
dans la moitié correspondante au quadrant 3 et en faisant un Z final vers le centre de
la gélose du quadrant 4.
 L’antibiogramme

L’antibiogramme qui est pour but de prédire la sensibilité d’un germe à un ou


plusieurs antibiotiques dans une optique essentiellement thérapeutique. Il sert également :
 À la surveillance épidémiologique de la résistance bactérienne ;
 À l’identification bactérienne par la mise en évidence de résistances naturelles.
- On a réalisé l’antibiogramme par la méthode des cylindres.
- On a établi à l’aide d’une pipette pasteur bien stérile des cylindres sur le milieu
contenant la souche test.
- On a récupéré les cylindres par une pince métallique stérile.
- On les a met sur la boite ensemencée préalablement de sorte que la face de gélose
couverte par les colonies des actinomycètes est en contact avec les staphylocoques.
- On a placé notre antibiogramme dans réfrigérateur à 4°C afin de faciliter la diffusion
les colonies dans le milieu puis on l’a incubé à l’étuve pendant 24h à 37 °C.

Figure 3 : Représente notre antibiogramme effectué avant l'incubation.

IV.4. Résultats

On a observé la formation de colonies rondes de couleur beige mat alors qu’aucune


zone d’inhibition n’est apparue.

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Figure 4 : Représente les résultats d'antibiogramme


obtenus après l’incubation.
IV.5. Discussion

Les bactéries (staphylocoques et actinomycètes) durant l’étuvage vont se développer et


normalement les actinomycètes qui sont en phase stationnaire vont synthétisées des
antibiotiques qui vont diffuser dans le milieu pour éliminer les staphylocoques (compétition).

Si les bactéries (staphylocoques) sont sensibles aux antibiotiques, elles ne vont pas se
développer dans la zone où ils se trouvent ; cela va créer une zone plus ou moins importante
sans croissance bactérienne autour d’eux.

Si elles sont résistantes aux agents antimicrobiens synthétisés (antibiotiques) on


n’aura pas la formation d’une zone d’inhibition, donc c’est ce qu’explique notre résultat
qu’aucune zone d’inhibition n’est apparue.

Donc on peut dire que l’absence de la zone d’inhibition est due soit :

 A la résistance des staphylocoques aux antibiotiques synthétisés par les actinomycètes.


 A une mauvaise manipulation lors de la réalisation de l’antibiogramme.
 A la dose nécessaire pour tuer ces bactéries est beaucoup trop élevée.

V. Conclusion
D’après ce TP, on a pu déterminer que certains bactéries tel les actinomycètes
synthétisent des antibiotiques possédant un effet antimicrobien contre une large gamme de
microorganisme ainsi que pour choisir un antibiotique bien précis contre un pathogène ou
infection, on doit réaliser un test qui s’agit d’antibiogramme pour constater le spectre
d’activité et le mode d’action de ce dernier ( inhibiteur ou bactéricide) qui s’apparaitra
sous forme d’une zone plus ou moins claire et grande. On plus, on a pu conclure qu’il
existe des bactéries résistantes d’autres sensibles et certaines intermédiaires aux
antibiotiques.
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