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Biologie moléculaire techniques expérimentales

Biochimie et Biologie moléculaire (Université de Lorraine)

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5.14. Biologie moléculaire


SCHAERLINGER
PLAN
-Techniques de biologie moléculaire
-Marquage des acides nucléiques et ses applications
-Séquençage d’ADN
-Détermination du site d’initiation de la transcription
-Mise en évidence d’interactions ADN / protéines
-Mise en évidence d’interactions protéines / protéines
-Exercice d’application

Les marquages d’acides nucléiques pour quoi faire ?

-Southern Blot détection d’un gène sur l’ADN génomique (génotypage, détermination du nombre de copies
d’un gènes)
-Northern Blot détection et quantification d’un ARNm
-Hydridation in situ : Localisation de l’expression d’un transcrit

Les marqueurs des acides nucléiques


Radioactifs « chaud »
-Phosphore 32 (ADN), Tritium H3(ADN), Soufre 35 (protéines)
-Avantage : le + sensibles
-Inconvéniant : risque biologiques

-Fluorescent, Chimioluminescent, Bioluminescent, coloré « froid »


-Tous ne sont pas sûr d’un point de vu sécurité
-Avantage : pas de risque biologiques
-Inconvénient : 10x moins sensible que la radioactivité

Détection des marquages radioactifs


Visualisation direct
-Compteur à scintillation, précis (⇒ Tritium)
-Autoradiographie film ou écran photosensible, image et valeurs numériques relatives
-Compteur Geiger, une estimation de la quantité (P32, S35)

Les marqueurs froids des acides nucléiques


-Fluorescence
-Absorption d’énergie lumineuse par un fluorochrome
-Passage à l’état de molécule excitée
-Restitution rapide de cette énergie sous forme de lumière fluorescente et à une longueur d’émission différente
de la longueur d’excitation.

-Chimioluminescence
-Réaction chimique libère l’énergie sous forme de lumière
-Baton lumineuse de secours
-Longueur d’onde d’émission spécifique
-Intensité proportionnelle à la quantité de molécules réactives

-Bioluminescence

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5.14. Biologie moléculaire


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Détection des marquages froids
-Détection directe :
-par visualisation : œil, microscope à fluorescence
-Dosage possible avec un spectrophotomètre, spectrofluorimètre…
-Détection indirecte :
-Ac primaire spécifique puis Ac secondaire permettant la visualisation et / ou le dosage

Marquage des acides nucléiques

Autres exemples de marqueur à révélation indirecte


-Dioxygénine ⇒ Ac-maruquer fluorescent ou coloré
-Biotine ⇒ Avidine ou streptavidine -marqueur fluorescent ou coloré
Kd biotine-Streptavidine = 10-15M

Cytidine couplé à biotine qui a une forte affinité avec


l’avidine ou la streptavidine, ça veut dire qu’elle peut en lier
plusieurs. Si on couple la streptavidine avec une enzyme, la
HRP (peroxydase) ou la AP (phosphatase alcaline). Ces 2
enzymes ont un substrat transparent et lorsqu’elle le
transforme, elle le transforme en produit coloré brun pour la
HRP ou bleu pour la NBT/BCIP qui est le substrat de la
phosphatatse alcaline.
On ne contrôle pas le nombre de streptavidine ou d’avidine
qui se fixe et on ne contrôle pas non plus l’activité de
l’enzyme.

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Hybridation de type Southern Blot
Méthode
-Fragmentation de l’ADN de restriction
-Séparation des fragments par electrophorèse
-Dénaturation alcaline du gel
-Transfert des fragments par capillarité sur une membrane (nylon/ nitrocellulose)
-Fixation des fragments (UV / Chauffage)
-Pré-hybridation des sites non spécifiques par un ADN hétérologue
-Hybridation avec une sonde chaude ou froide
-Lavages (basse force ionique = force stringence) et révélation

-On coupe avec plusieurs enzyme de restriction. On aura


plusieurs morceau d’ADN. Si l’échelle est très fine on a
un Smear (nuage flou) après électrophorèse. On transfert
sur une membrane pour avoir accès à l’ADN et pouvoir
faire des hybridation. Mais pour s’hybrider il faut que
l’ADN soit sb, il faut donc dénaturer l’ADN.

On a l’ADN qui est dans la masse du gel. La méthode traditionnel c’est par capillarité avec du tampon et du
papier buvard. Par capillarité, le tampon va remonter le long des buvard etc. Comme c’est un tampon, les sel
vont monter l’ADN avec, mais les sels vont continuer à monter mais l’ADN va être coincé à la membrane.

Principe de l’hybridation moléculaire


Les conditions physico-chimiques d’une hybridation

Les paramètres pouvant modifier une hybridation


-la température
-le pourcentage en G/C
-le nombre de mésappariements
-la force ionique
-la présence d’urée ou de formamide

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Ce qui augmente la stringence, c’est à dire augmente la sélectivité de l’hybridation :
-une forte température
-L’absence de sels (faible force ionique) Il faut trouver la bonne concentration en sel, mais la plus petite
possible.
-La présence de formamide
⇒ Hybridation entre molécules très homologues.

Southern Blot
Génotypage de souris transgénique

La bande du contrôle positif montre que


l’expérience a bien marché puisqu’on a une
bande.

Bien différencier description et analyse.

Interprétation :
On sait qu’on cherche des souris transgénique/
cf légende à droite.
Pour les 2 bandes, ils ont remarqué qu’une site
de restriction s’était inséré dans le transgène, le
coupant en 2 ⇒ mutation ponctuelle

Exercice 2 : criminologie
utilisation d’une sonde reconnaissant la séquence
GGGCAGGANG (séquence répétée hypervariable
initialement découverte dans le gène de la
myoglobine)
Sur la photo suivante, on retrouve les profils
comparés de la victime d’un viol, du sperme (S)
retrouvé sur le prélèvement de la victime et des 3
suspects A, B et C

Hybridation de type Northern Blot

Buts :
-existence
-Taille de transcrits
-Abondance
Même principe que le Southern Blot mais étude des ARN
Pas de digestion préalable, mais traitement au formaldéhyde pour casser les structures secondaire (

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le contrôle c’est les conditions normales, idéales de
croissance de la plantes. La tubuline, c’est un gène de
ménage et c’est un contrôle qui permet de vérifier
qu’on a bien mis la même quantité d’ARN dans tous les
puits. Il faut utiliser plusieurs gènes de ménages dans
une expérience au cas où il y ait des modifications de
son expression.

1. description des contrôles


on voit que le gène de ménage de bouge pas, FL3 est
exprimé, DRB1 peu exprimé

ATTENTION : organiser notre description.

2. description des conditions sèches :


Quand on augmente les conditions sèches, le FL3 va
diminuer quand on augmente le temps de dessèchement et le DREB1 sera seulement présent en condition « 2h
de sécheresse ».

3. description des conditions froides


On augmente les expressions de la FL3 à 10h et on a un pic de DREB1 à 2h.

Interprétations :
DREB1, son expression est lié à un stress hydrique et/ou thermique, mais il est beaucoup plus sensible au stress
thermique. Son expression dépendant toujours de FL3, on propose l’hypothèse que DREB1 contrôle
l’expression de FL3 ( le dernier contrôle permet de le dire)

Hybridation de type Western-Blot

Buts :
-Présence
-Abondance
-MM de la protéines
-Mise en évidence d’une protéine
-Au sein d’un complexe de protéines
-ou qui ↔ avec une chaine d’acide nucléique.

-Séparation des protéines sur gel SDS (dénaturation)


Sodium Dodécyl Sulfate : charge négativement les protéines
Beta mercaptoéthanol va casser les ponts dissulfures ou le TTT.
Le SDS va entourer les protéines pour leur conférer des charges négatives.

-Un transfert des protéines sur membrane de nitrocellulose


ou PVDF (polyfluorure de vinylidène) permet la détection
et l’identification de protéines spécifiques dans un
échantillon biologique.

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-Détection des signaux d’hybridation


pour le WB on va avoir une échelle de protéines sur notre
gel. Et après hybridation sur membrane on aura qu’une seule
bande puisqu’on en identifie qu’une seule (ATTENTION
ERREUR)

On prend un Ac primaire dirigé contre notre protéine


d’intérêt de souris.
On va dirigé un Ac secondaire qui va reconnaître ses Ac
primaire de souris, il reconnaît le fragment constant de l’Ac
primaire. Le secondaire sera couplé à l’enzyme HRP
(peroxydase) On aura un substrat, le luminol, et on va
émettre une lumière non visible qui va exciter les pellicules
photos.

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Hybridation in situ

On veut identifier des ARN. On va


fixer, perméabiliser et au lieu de faire
rentrer des Ac, on va faire rentrer des
sondes marquées comme pour le
Northern Blot. Si les cellules exprime
l’ARN on aura un marquage coloré.

FISH – Hybridation in situ en fluorescence

-FISH est une hybridation in situ :


-utilisant des sondes marquées à l’aide de fluorophores
-Utilisation sur des coupes en microscopies et en imagerie moléculaire
-Techniques de cytogénétiques permettant de voir des éléments situés à l’intérieur même sur la cellule
-Les sondes peuvent être utilisés sur :
-de l’ADN (Dna-FISH)
-De l’ARN (sonde ADN, RNA-FISH)
-des protéines (sonde anticorps)

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⇒ Localiser un gène sur un chromosome
⇒ caryotypage

Séquençage de l’ADN
-Maxam et Gilbert ⇒ Technique chimique (plus utilisées
-Technique de Sanger ⇒ technique enzymatique

Determination d’un séquence ADN


Méthode chimique (MAXAM et GILBERT)
1/ Marquage des 2 extrémités de l’ADN à séquencer en 5’ (P32)
2/ Restriction enzymatique pour enlever le marquage sur un des côtés
3/ Séparation des échantillons (aliquotes)et réaction chimique pour
induire des coupures à des endroits bien précis. Un coupure / chaine
4/ Electrophorèse sur un gel et autoradiographie
5/ Lecture de la séquence

Digestion ménagers : avec peu de produits et sur un temps assez court, C’est pour ne pas couper après tous les
C d’un coup. Ca permet d’avoir des frgaments de plus en plus grand et ça c’est utilise pour la lecture des
bandes.

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Terminaison de chaine (SANGER)
La polymérase va utiliser une matrice. Et on aura un frgament d’ADN
qui va permettre d’amorcer les choses. En rajoutant des DNTP on
permet à la polymérase de polyémriser le brin complémentaire. Sauf
que dans notre tube on met de manière ménager, certaines bases qui
n’auront pas de Déoxyribonucléotide mais des didéoxyribonucléotide,
ce qui veut dire que la réaction en 3’ ne pourra plus se faire, on pourra
plus ajouter de nucléotide supplémentaires, donc on aura un
fragments d’une taille bien déterminer. On va le mettre de manière
ménagers c’est à dire que le ddNTP sera incorporé à des endroits
différents et on aura des fragments de tailles différents

On va faire plusieurs réaction parallèle.


On remet ensuite sur gel et ensuite c’est le m^me principe
que tout à l’heure

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Chacun des ddNTP est couplé à
un fluorochrome. Là on ne fait
plus migrer sur gel, mais on fait
migrer sur un capillaire. Donc il
vont migrer selon leur poids
moléculaire, les molécules vont
passer devant un laser, ce qui va
exciter les fluorochromes.
On enregistre donc les couleurs
(l’ordinateur)

48 lancements de machines / jours C’était le cas il y a 5ans, maintenant on


Chaque manip ⇒ 96puits peut en faire beaucoup plus, le séquençage
Plus de 1,100 pb par lecture est beaucoup plus rapide)

Maximum théorique : plus de 5,000,000 pb lu par jour

Determination + 1 de l’ARNm
transcriptase inverse et Nucléase S1

Détermination du site d’initiation de la transcription : Cartographie à la nucléase S1


-Permet de quantifier 1 ARNm/ Q’(quantité)ADNc obtenue
-Déterminer la nature du 1er nt de l’ARNm et donc identifie ce même nt dasn l’ADN = + 1

-Permet d’identifier les régions de régulation de la transcription de cet ARN.

On fait 2 amorces, la deuxième doit être marqué par de la radioactivité.


On utilise comme amorce, celle marqué radioactivement
On dénature pour avoir un ADN sb et on va faire une hybridation entre l’ADN qui est marqué et l’ARN (qui a
exactement la même séquence que la séquence non marquée. Ensuite on va faire une digestion avec la nucléase
S1 et elle va couper tout ce qui est acide nucléique en sb. On aura des fragments qui auront comme début le site
+ 1 et la fin de l’amorce dont on connaît la position.

En parallèle on fait un séquençage en prenant comme amorce, l’ADN marqué. La bande obtenu représente un
A.
Résultat : A en 3’ de l’ADNc, 3’TGCTAC 5’
ADN brin codant 5’ ACGATG 3’
Donc U en 5’ ARNm = +1

Transcription inverse

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5.14. Biologie moléculaire


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on utilise une polymérase qui prend comme matrice l’ARN. On prend une amorce 5’-3’ qui va s’hybrider à
l’ARN et l’ADN polymérase ARN dépendante va synthétiser le brin et quand elle n’a plus de matrice elle va
s’arrêter c’est à dire quand elle arrive au site +1. même principe, on les remt sur gel et on les séquence. On
obtiendra un A pour l’ADN mais sur la matrice d’ARN ce sera un U.

Remarque. Cartographie à la nucléasie S1 et la transcription inverse


-La quantité de sonde protégée par les transcrits est proportionnelle à la quantité de transcrits
-Quantification relative d’1 ARN donné à un moment précis du développement cellulaire

Mise en évidence in vitro des interactions protéine-Protéine ;

Immunoprecipitation
Elle permet d’identifier ou d’isoler une protéine particulière
dans toutes les protéines
On a des billes où tout autour il y a des Ac, on met ces
billes en contact avec notre lysat. Mais il faut d’abord
dénaturer les protéines car elles sont en général en
complexe. Les billes étant lourdes, en centrifugeant elles
vont tomber au fond et on peut enlever le lysat. Ensuite on
dénature le complexe Ac/Ag pour que les billes se
détachent des protéines.

Co-immunoprécipitation
Dans ce cas là, on ne va pas dénaturer les complexes.
Mais on refait la même expérience. De cette manière, on
va pouvoir isoler un complexe et c’est seulement après
qu’on fera une dénaturation pour pouvoir identifier
toutes les protéines. Puis on va es identifier par un
Western Blot.
Input, c’est le lysat cellulaire de base sans
immunoprécipitation. Alpha c’est les Ac utilisé.
Un Flag c’est une zone marqué, reconnu, et connue
d’une protéine. Ce Flag peut être couplé à un Ac pour
pouvoir reconnaître la protéine.

1, 2 et 4 sont des contrôles.


Information (1) : les 2 protéines sont bien présente
Information (2) : Il n’y a bien que AFG
Information (3) : le fait d’avoir les 2 co-transfecté, et de les identifier toutes les deux après IP, ça veut dire
qu’AFG et la paraplegin peuvent interagir
Information (4) : montre que HA ne reconnaît pas AFG. = Contrôle négatif

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GST pull-down
Glutathion S transferase : on va coller une autre enzyme à
la place d’un Flag. On va faire produire cette protéine de
fusion par des bactéries pour en avoir une grande
quantité. Ensuite, on prend des extraits cellulaire et on
veut voir des interactions qui se ferait ou pas. On va
incuber in vitro, notre lysat cellulaire avec notre protéine
de fusion. Les interactions qui doivent se faire, se feront.

On fait passer le mélange sur une colonne de chromatographique et cette colonne va retenir spécifiquement la
GST.

Recherche de protéine interagissant avec Wag31

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5.14. Biologie moléculaire


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Mise en évidence in vitro d’une interaction d’une protéine sur 1 ADN ou 1 ARN

Gel retard ou EMSA (Electrophoretic Mobility shift


Assay)
On marque un fragment d’ADN radioactivement, ça peut
être le promoteur du gène par exemple, on veut savoir si un
facteur de transcription particulier peut se lier à cette ADN.
d’une part on va faire toute l’expérience mais sans mettre de
protéine et d’autre part on va mettre en présence de notre
protéine d’intérêt. On met ensuite sur un gel natif qui ne
dénature pas les molécules.
L’ADN complexé avec une protéine pourra moins bien
passé dans le réseau et apparaitra avec un retard.

Ils ont pris des concentrations d’ADN


différentes et ils ont voulu voir l’affinité
différente des protéines.

On peut avoir un super shift, c’est quand 2


protéines vont interagir pour se lier à
l’ADN.

Protection à DNase I ou technique d’empreinte « footprinting »


Desoxyrionucléase I : endonucléase qui clive sans spécificité
de séquence des ADNdb en réalisant des coupures monobrin
(Mg2+ ⇒ Nick dans un db) ou db au niveau de la liaison 5’-
3’ phsophodiester (Mn2+)
L’activité enzymatique est strictement dépendant du Ca2+

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ChIP : Immunoprécipitation de chromatine


Rappel du principe de l’immunoprécipitation

On casse l’ADN génomique en petit morceaux


et on identifie pas les cassures. On prends des
billes avec Ac dirigé contre notre protéine
d’ADN.

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On digère les protéines ce qui nous permet
de récupérer les ADN.

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