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Électrophorèse capillaire

Applications
par Myriam TAVERNA
Maître de conférences en chimie analytique
Laboratoire de chimie analytique
Faculté de pharmacie (Châtenay-Malabry)
Isabelle LE POTIER
Maître de conférences en chimie analytique
Laboratoire de chimie analytique
Faculté de pharmacie (Châtenay-Malabry)
et Philippe MORIN
Professeur de chimie analytique
Institut de chimie organique et analytique
Université d’Orléans

1. Analyse des ions ...................................................................................... P 3 367 – 2


1.1 Cations inorganiques .................................................................................. — 2
1.2 Anions organiques et inorganiques ........................................................... — 3
2. Séparations chirales................................................................................ — 5
2.1 Sélecteurs chiraux ....................................................................................... — 5
2.2 Principe......................................................................................................... — 5
2.3 Exemples de séparations ............................................................................ — 6
3. Acides aminés, peptides et (glyco)protéines ................................... — 7
3.1 Acides aminés.............................................................................................. — 8
3.2 Peptides et (glyco)protéines ....................................................................... — 10
4. Oligosaccharides et polysaccharides ................................................. — 12
4.1 Oligosaccharides.......................................................................................... — 12
4.2 Polysaccharides ........................................................................................... — 14
Références bibliographiques ......................................................................... — 14

’électrophorèse capillaire (EC) a été initialement développée pour l’analyse


L de protéines, de manière à proposer une méthode plus rapide et générant
moins de déformations de bandes que l’électrophorèse classique. De nombreux
problèmes liés à l’adsorption des protéines sur les capillaires de silice et à leur
solubilité ont freiné au départ le développement de la technique dans le domaine
de l’analyse des protéines et des macromolécules en général. Les progrès réa-
lisés dans ce domaine ont été particulièrement importants. Par ailleurs, le champ
d’application de l’EC s’est considérablement étendu, notamment à l’analyse des
petites molécules, en mettant en œuvre les nombreux modes de séparation de
cette technique. Ainsi, la technique couvre actuellement le domaine de l’analyse
des petites molécules, neutres ou chargées, polaires ou apolaires, organiques ou
inorganiques et celle des macromolécules biologiques (protéines, ADN, polysac-
charides...). L’EC est un outil performant qui trouve notamment sa place aussi
bien dans l’industrie pharmaceutique (analyse chirale, dosage et détermination
de la pureté des principes actifs...) que dans les domaines de l’environnement et
de l’agroalimentaire (analyse d’eaux, de boissons...).
Ce fascicule est le troisième volet de l’étude sur l’électrophorèse capillaire présentée dans ce
traité et qui comprend :
[P 3 365] : Électrophorèse capillaire. Principe ;
[P 3 366] : Électrophorèse capillaire. Appareillage ;
[P 3 367] : Électrophorèse capillaire. Applications.
Pour un exposé sur la théorie générale de l’électrophorèse, le lecteur pourra consulter l’article
[P 1 815], référence [27], dans ce traité.

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© Techniques de l’Ingénieur, traité Analyse et Caractérisation P 3 367 − 1
ÉLECTROPHORÈSE CAPILLAIRE ___________________________________________________________________________________________________________

1. Analyse des ions 1.1 Cations inorganiques

Dans la littérature, plusieurs tampons électrophorétiques conte-


La séparation des ions en électrophorèse capillaire de zone est nant généralement un hétérocycle azoté absorbant dans le domaine
basée sur la différence de leur vitesse électrophorétique lorsqu’ils UV ont été testés parmi lesquels l’imidazole, les composés UV-Cat 1
sont soumis à un champ électrique élevé. Le domaine d’applications et UV-Cat 2 (brevets Waters), la pyridine, la p-aminopyridine, le
comprend l’analyse des ions inorganiques et organiques. Si la plu- cation phényltriméthylammonium, l’éphédrine et la naphthyl-1-
part des séparations d’ions en électrophorèse capillaire s’effectue amine (tableau 1). La sélection raisonnée du co-ion du tampon per-
en utilisant une détection spectrométrique UV par diminution met d’améliorer la symétrie des pics des cations et donc la sensibi-
d’absorbance (ou indirecte), d’autres détecteurs ont été utilisés lité de détection (d’un facteur 1 à 4). Ainsi, il est conseillé d’utiliser
parmi lesquels on peut citer la détection fluorimétrique indirecte, la un tampon électrophorétique à base d’imidazole ou d’UV Cat-2 pour
conductométrie ou la spectrométrie d’absorbance directe (cf. article séparer les cations alcalins et alcalino-terreux, la pyridine pour les
[P 3 366]). Quel que soit le détecteur utilisé, le tampon électrophoré- cations des métaux de transition, l’éphédrine ou l’UV Cat-1 pour les
tique doit avoir les caractéristiques suivantes : lanthanides légers et enfin le naphthyl-1-amine ou le phényltrimé-
thylammonium pour les lanthanides lourds. Dans le cas où l’ion
— le co-ion du tampon doit avoir une mobilité électrophorétique analysé a une mobilité électrophorétique supérieure à celle du co-
proche de celles des ions à analyser afin de minimiser l’élargis- ion, un gain identique peut être obtenu en ajoutant au tampon un
sement du pic électrophorétique par dispersion due à agent complexant (neutre ou anionique) de l’ion analysé afin de
l’électromigration ; réduire sa mobilité électrophorétique et limiter ainsi la dispersion
due à l’électromigration.
— le contre-ion doit assurer un bon pouvoir tampon au pH de
travail ; ■ D’autre part, certains cations ont une mobilité électrophorétique
proche (citons parmi les plus connus les cations ammonium et
— en mode de détection indirect, le co-ion du tampon doit possé- potassium, baryum et plomb, certains cations métalliques divalents
der un groupement chromophore (détecteur spectrométrique UV) ou enfin les lanthanides) et co-migrent. Dans de tels cas, l’addition
ou fluorophore (détecteur fluorimétrique) ; au tampon électrophorétique d’un agent de complexation (généra-
— en mode de détection direct, le tampon ne doit pas absorber à lement anionique ou neutre) permet de modifier sélectivement la
la longueur d’onde d’absorbance des ions analysés (détection mobilité électrophorétique d’un des cations qui co-migrent. Plu-
spectrométrique) ; sieurs agents complexants ont été testés et les plus efficaces sont
les éthers couronnes 18-C-6 ou 15-C-5, l’acide lactique, l’acide tar-
— le tampon doit avoir une faible conductivité afin de minimiser trique ou l’acide α-hydroxyisobutyrique. Le plus utilisé est, sans
l’effet Joule dans le capillaire de séparation. doute, l’éther couronne 18-C-6, qui est un complexant du cation
potassium ; ainsi, la sélectivité entre les cations ammonium et
Comme la plupart des ions inorganiques n’ont pas de groupe- potassium peut être contrôlée par la concentration de l’éther cou-
ments chromophores ou des coefficients d’absorptivité molaires ronne. L’analyse rapide d’un mélange de cations alcalins et alcalino-
trop faibles, la détection spectrométrique indirecte, dont le principe terreux ayant des concentrations du même ordre de grandeur est
est décrit dans l’article [P 3 366], est mise en œuvre. Le tableau 1 possible, comme le montre la figure 1, en ajoutant au tampon clas-
présente les principaux tampons électrophorétiques utilisés lors de sique imidazole-acide acétique (pH 4,5) une faible concentration
l’analyse des ions. d’éther couronne 18-C-6. (0)

Tableau 1 – Principaux tampons électrophorétiques fréquemment utilisés pour l’analyse d’ions


en électrophorèse capillaire
Co-ion pour la séparation Mobilité électrophorétique Coefficient d’absorptivité à 214 nm
pKa
des cations (10−5 cm2/V · s) (L · mol−1 · cm−1)
Imidazole 7,15 + 52 5 000
UV Cat 2 (1) – + 64 –
Pyridine 5,25 + 51 1 800
Éphédrine 9,54 + 30 7 000
Naphtyl-1-amine 3,92 + 17 50 000

Co-ion pour la séparation Mobilité électrophorétique à pH 6,5 Longueur d’onde de détection Coefficient d’absorptivité
des anions (10−5 cm2/V · s) (nm) (L · mol−1 · cm−1)
Chromate − 56,7 254 5 000
Pyromellitate − 52,8 214 23 900
Trimellitate − 47,3 254 1 800
Pyridine-2,6- − 41,5 192 43 680
dicarboxylate
Sorbate − 33,3 (à pH 6) 253 25 000
Phtalate − 41,2 196 37 160
Benzoate − 26,7 194 44 480
(1) Commercialisé par Waters.

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Absorbance

Mg2+ Li+ – 0,034

Absorbance
0,008 Li+
Na+

Na+
0,005 – 0,036
Ca2+
Mg2+
NH4+ NH4+ Ca2+
K+ K+
0,002
– 0,038

– 0,001
1,8 2,1 2,3 2,6 – 0,04
Temps (min) 3 4 5 6 7 8
Temps (min)
Capillaire : 57 cm  50 µm
Tampon : 10 mM imidazole, 26,3 mM acide acétique, 2,5 mM éther- a rapport 1/500
couronne 18-C-6 (pH : 4,5, force ionique : 10 mM, pouvoir tampon :
14,9 mM/pH) 0,002

Absorbance
Tension : + 30 kV Mg2+
Température : 25 °C
Injection : 5 s
0,001
Longueur d'onde : 214 nm
Concentration des cations : 5 mg/L Ca2+
Na+ Li+
Figure 1 – Séparation d’un mélange de cations inorganiques
0
par électrophorèse capillaire [1] [2] K+

■ Dans le cas d’échantillons contenant simultanément des cations – 0,001


en faible et forte concentrations, le tampon imidazole-acide acé- 1 1,5 2 2,5 3
tique classique n’est plus adapté. Pour pallier ce problème de Temps (min)
matrice ionique, une solution simple consiste à ralentir la migration
b rapport 1/2 000
de l’ion majoritaire par un mécanisme de complexation spécifique.
Après optimisation de la composition du tampon par l’ajout d’un
0,0055
Absorbance

agent complexant (l’éther couronne 15-C-5, l’acide dipicolinique ou Na+


l’acide oxalique dans le cas d’une matrice sodium, calcium ou
magnésium, respectivement), il est possible de quantifier de très fai-
bles teneurs (0,05 %) de cations alcalins et alcalino-terreux présents
0,0035
dans un échantillon à matrice sodium, calcium ou magnésium
(figure 2).
■ Si l’échantillon contient, en plus des cations alcalins et alcalino-
terreux, des cations de métaux de transition, il est souhaitable 0,0015 Mg2+
d’ajouter au tampon imidazole-acide acétique (pH 4,5 ; force ionique Li+
10 mM) deux complexants, l’anion lactate pour optimiser la sépa- K+
ration des cations métalliques et l’éther couronne 18-C-6 pour la
séparation des couples NH 4+ ⁄ K + et Pb2+/Na+ (figure 3). – 0,0005
1,8 2,2 2,6 3
■ D’autre part, des analyses plus sensibles de cations inorganiques Temps (min)
ont été réalisées en utilisant un détecteur à fluorescence laser en
mode de détection indirecte. En utilisant le sel de sodium de la fluo- c rapport 1/2 000
rescéine pour générer le signal de fond, la sensibilité de détection
est de quelques dizaines de ppb. Capillaire : 47 cm  75 µm Injection : 5 s
Tension : +30 kV Longueur d'onde : 214 nm
■ Enfin, la détection conductométrique peut être mise en œuvre Température : 25 °C
pour séparer un mélange de cations alcalins, alcalino-terreux et
d’amines organiques avec un tampon histidine/acide morpholino-
éthane sulfonique à pH 6,1. Tampon : 10 mM imidazole - acide acétique (pH 4,5) + agent complexant :
a 500 mM éther couronne 15-C-5
b 0,75 mM acide oxalique
c 0,2 mM acide dipicolinique
1.2 Anions organiques et inorganiques
Concentration des cations :
a 1 mg/L NH4+ , K+ , Mg2+ , Li+ , Ca2+ et 500 mg/L Na+
La séparation des anions en électrophorèse capillaire nécessite b 0,5 mg/L NH4+ , K+ , Li+ , Ca2+ , Na+ et 1 000 mg/L Mg2+
un tampon contenant non seulement un co-ion de mobilité voisine c 0,5 mg/L NH4+ , K+ , Mg2+ , Li+ , Na+ et 1 000 mg/L Ca2+
de celle des anions (tableau 1) mais aussi, pour obtenir une analyse
rapide et permettre la détection de tous les anions quelle que soit Figure 2 – Séparation par électrophorèse capillaire de cations
leur mobilité, un composé chimique permettant d’inverser le flux à l’état de traces dans un échantillon à matrice ionique [2] [3]

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0,0055

Absorbance
0,007 Lithium F–

Absorbance

Sodium, plomb
Magnésium

Manganèse, SO42–
fer (II)

Calcium
0,005 0,0035 –

Ammonium,
Cl– NO2

potassium

NO3 HPO42–

Cobalt

Nickel
ClO3

Strontium

Cadmium
0,003 Br–
HCO3–

Baryum

Cuivre
Zinc
0,0015

Césium
0,001

– 0,0005
– 0,001 3,4 3,9 4,4 4,9 5,4
2 2,17 2,33 2,5 2,67 2,83 3 3,17 3,33 3,5 3,67 Temps (min)
Temps (min)
Capillaire : 37 cm  50 µm
a Tampon : 5 mM K2Cr2O7 , 1,6 mM triéthanolamine, pH 8
Inversion du flux électroosmotique par rinçage du capillaire durant
0,007

Absorbance
Magnésium Lithium 1 min avec une solution de polybrène (0,1 %)
Sodium, plomb
Manganèse Tension : – 18 kV

Calcium
Fer (II)
0,005 Température : 25 °C

Ammonium,
Cadmium

potassium
Injection hydrodynamique : 5 s
Zinc

Cobalt
Détection à 254 nm

Strontium

Nickel
0,003 Concentration des anions : 10 ppm

Baryum
Césium

Cuivre
Figure 4 – Séparation d’un mélange d’anions inorganiques
0,001 par électrophorèse capillaire [2]

– 0,001
électroosmotique. Pour ce faire, la charge de la paroi interne du
2,2 2,53 2,87 3,2 3,53 3,87 4,2 4,53
Temps (min) capillaire de silice, qui est négative en raison de l’ionisation des
groupements silanols à pH supérieur à 2,5, est rendue positive suite
b à l’adsorption de molécules de tensioactifs cationiques ajoutées au
tampon. Plusieurs tensioactifs ont été testés avec succès parmi les-
0,009 quels le bromure de tétradécyltriméthylammonium (TTAB), le
Absorbance

Fer (II)
Magnésium Cadmium bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB), l’hydroxyde
Sodium, plomb Lithium d’hexaméthonium (HMOH) ou, mieux encore, un polymère cationi-
0,007
que comme le polybrène (bromure d’hexadiméthrine). D’un point
Calcium

Manganèse
de vue pratique, il est préférable et plus simple de rincer le capillaire
Ammonium,
potassium

0,005 entre deux analyses avec une solution aqueuse contenant l’inver-
Cobalt
Strontium

seur de flux électroosmotique plutôt que d’ajouter le tensioactif


cationique au tampon électrophorétique.
Baryum

Nickel

0,003
Zinc
Césium

Cuivre
■ Les anions inorganiques et organiques n’ont pas tous une absor-
0,001 bance suffisante dans le domaine UV, si bien que la détection spec-
trométrique par diminution d’absorbance est très souvent mise en
– 0,001 œuvre. La nature du co-ion du tampon varie selon la nature des
2,2 2,7 3,2 3,7 4,2 4,7 5,2 5,7 anions inorganiques ou organiques analysés : l’anion chromate
Temps (min) (figure 4) ou pyromellitate pour les anions très mobiles (chlorure,
nitrate, bromure, sulfate, phosphate), les anions trimellitate ou le
c 2,6-pyridinedicarboxylate pour les anions de mobilité moyenne
(citrate, tartrate, malate, succinate) ou enfin l’anion benzoate pour
Tampon : 10 mM imidazole - acide acétique pH 4,5 + acide lactique les anions peu mobiles comme ceux des acides carboxyliques à
Capillaire : 57 cm  50 µm chaîne courte (acétate, pyruvate, lactate, octanoate). En général, le
Température : 25 °C groupe des trois anions suivants, nitrate, nitrite et sulfate, est relati-
Tension : + 20 kV vement difficile à séparer et la forme des pics carbonate et phos-
Longueur d'onde : 214 nm phate est à optimiser.
Injection hydrodynamique : 2 s
Concentration des cations : 5 ppm ■ Le système de détection fluorimétrique avec un mode d’absor-
Concentration de l'acide lactique : bance indirecte est apparu bien adapté à l’analyse d’anions inorga-
a 1 mM niques ou organiques en utilisant toujours le sel de sodium de la
b 5 mM fluorescéine comme fluorophore générateur du signal de fond.
c 10 mM
■ La détection spectrométrique directe est une technique simple et
fiable et peut s’appliquer aux anions possédant des groupements
Figure 3 – Influence de la concentration en acide lactique chromophores. Une application fréquente est l’analyse des halogé-
sur la séparation par électrophorèse capillaire des cations nures, halogénates et oxoanions avec un simple tampon phosphate
métalliques et, en particulier, celle des cations fer (II) à pH 8 ; la détection est réalisée à 200 nm, puisque la plupart de
et manganèse [2] [4] ces anions ont un maximum d’absorption entre 190 et 210 nm

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avec des coefficients d’absorptivité molaire non négligeables Parmi les cyclodextrines utilisées en électrophorèse capillaire, les
(ε = 1 à 10 000 L · mol−1 · cm−1) ; le seuil de détection est de l’ordre β- et γ-cyclodextrines (sous leur forme native ou dérivée méthyle ou
du ppm. Ce mode de détection directe est utile pour analyser des hydroxypropyle) sont les plus utilisées en raison des dimensions de
anions nitrate ou nitrite en présence d’anions transparents aux UV leurs cavités, leur coût, leur disponibilité commerciale et de leur
(sulfate, phosphate). adéquation stérique avec un grand nombre de molécules pharma-
ceutiques. L’hydrophobie de la cavité permet la formation de com-
■ Enfin, des séparations sensibles peuvent être obtenues avec une plexes d’inclusion avec un grand nombre de molécules chimiques.
détection conductométrique en utilisant le tampon CHES (acide 2– Le mécanisme de reconnaissance chirale fait intervenir diverses
(N – cyclohexyl amino) éthanesulfonique) 50 mM, LiOH 10 mM, interactions intermoléculaires qui sont des interactions hydropho-
0,03 % Triton X-100 à pH 9,2. Le flux électroosmotique est inversé et bes (dues à l’inclusion partielle de la partie hydrophobe du soluté
la tension de séparation négative. dans la cavité de la CD), des interactions par liaisons hydrogène
(entre les groupements voisins du carbone asymétrique du soluté et
les hydroxyles secondaires et primaires de la cyclodextrine) et enfin
des interactions stériques entre le soluté et la cyclodextrine.
2. Séparations chirales
Une des principales applications de l’électrophorèse capillaire
2.2 Principe
concerne la séparation des énantiomères de molécules chirales, en
particulier dans le domaine pharmaceutique, car les énantiomères
présentent souvent une activité pharmacologique et une toxicité dif- Le principe de la séparation des énantiomères d’une molécule
férentes. chirale de charge apparente positive par une cyclodextrine neutre
est indiqué ci-dessous. Sous leur forme libre, les deux énantiomères
En électrophorèse capillaire, il suffit d’ajouter au tampon électro- notés R+ et S+ possèdent la même mobilité électrophorétique et ne
phorétique un agent de reconnaissance chirale qui permet la diffé- peuvent être séparés en électrophorèse capillaire de zone. L’ajout
renciation des énantiomères d’un soluté suite à la formation de d’une cyclodextrine neutre (C) comme sélecteur chiral permet la for-
complexes d’inclusion de stabilité différente. Le principe est diffé- mation de deux complexes diastéréoisomères notés RC+ et SC+
rent de la chromatographie en phase liquide où l’on utilise généra- selon les réactions de complexation suivantes :
lement une phase stationnaire chirale et une phase mobile non
chirale.
KR
→ RC +
R+ + C ←

2.1 Sélecteurs chiraux


KS
→ SC +
S+ + C ←
Les sélecteurs chiraux les plus employés sont les cyclodextrines
(CD) et leur utilisation a d’ailleurs largement contribué au dévelop-
pement actuel des méthodes de séparation énantiomériques. Les La mobilité électrophorétique de l’énantiomère R+ dépend alors
cyclodextrines sont des oligosaccharides cycliques constitués de 6, des mobilités électrophorétiques de sa forme libre ( m R + ) et de sa
7 ou 8 unités D-glucopyranosiques reliées par des liaisons 1-4 et forme complexée ( m RC + ) selon l’expression suivante :
dénommées respectivement α, β et γ cyclodextrines. Elles ont une
forme de cône tronqué et possèdent une cavité hydrophobe due au
squelette carboné glycosidique et deux faces extérieures hydro- 1 KR [ C ]
philes dues à la présence de groupements hydroxyles (figure 5). m R+ = -------------------------- m R + + -------------------------- m RC +
1 + KR [ C ] 1 + KR [ C ]

avec KR constante de complexation de l’énantiomère R+


avec la cyclodextrine C.
HOCH2
O Après calcul, la différence de mobilité électrophorétique ∆m+
CH2OH entre les deux énantiomères est donnée par l’expression suivante :
O
O O
HO HO HO
OH O H H ( m R + – m RC + ) ( K S – K R )
HOH2C
HO ∆m + = ------------------------------------------------------------------------------ [ C ]
O O 1 + ( KS + KR ) [ C ] + KR KS [ C ]2
O OH HO O
-CD CH2OH 2 3
O OH La séparation des deux énantiomères n’a lieu que si les constan-
HO 6 tes de complexation KR et KS ainsi que les mobilités électrophoré-
HOH2C OH HO O O tiques m R + et m RC + sont différentes. La concentration du sélecteur
O OH H 2C chiral est le paramètre primordial vis-à-vis de la résolution. La sépa-
OH
HO OH ration des deux énantiomères est insuffisante lorsque le tampon est
O soit peu complexant (faible concentration en CD) ou trop com-
O CH2OH
O
plexant (concentration élevée en CD). La différence de mobilité ∆m+
CH2OH passe par un maximum pour une concentration en sélecteur chiral
optimale (Copt) égale à :
Les chiffres 2, 3, 6 correspondent à la position des groupements OH sur
les carbones du glucose (C1, C2, … C6)
1
C opt = -------------------
Figure 5 – Représentation de la β-CD
KR KS

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Mobilité électrophorétique
( 105 cm2 · V–1 · s–1)
0,6

Différence de mobilité électrophorétique


( 105 cm2 · V–1 · s–1)
8
7
6 0,5
5
4
3 0,4
2
1
0 0,3
1 2 3 4 5
– lg [β-CD]
0,2
a variation de la mobilité électrophorétique de chaque énantiomère
en fonction de l'expression – lg [-CD]

0,1
100

Degré de complexation (%)


90
80
70 0
0 10 20 30 40 50 60 70
60
50 [β-CD] (mM)
40 4

Résolution
30
DPAC
20
3,5 5-MeO-DPAC
10
5-OH-DPAC
0
1 2 3 4 5 3
– lg [β-CD]

b variation du degré de complexation de chaque énantiomère 2,5


en fonction de l'expression – lg [-CD]

Capillaire en silice fondue : 70 cm  50 µm 2


Électrolyte : 50 mM phosphate/borate (pH 7), β-CD
Injection hydrodynamique : 1 s 1,5
Tension : + 18 kV
Détection : 210 nm
1
Température : 25 °C
Énantiomère R 0,5
Énantiomère S

0
Figure 6 – Complexation des deux énantiomères 0 10 20 30 40 50 60 70
par une cyclodextrine [5]
[β-CD] (mM)

Capillaire en silice fondue : 70 cm  50 µm


Électrolyte : 50 mM phosphate/borate (pH 7) + β-CD
2.3 Exemples de séparations
Injection hydrodynamique : 1 s
Tension : + 18 kV
Les variations de la mobilité électrophorétique et du degré de Détection : 210 nm
complexation de chaque énantiomère avec la concentration en Température : 25 °C
agent chiral sont indiquées figure 6.
Conformément au modèle de complexation, il existe une concen-
tration de l’agent chiral pour laquelle l’énantiosélectivité et l’énan- OH OCH3
tiorésolution passent par un optimum (figure 7). N N N
Dans cet exemple, la différence de mobilité électrophorétique * * *
entre les deux complexes diastéréoisomères est optimale pour une O O O
concentration en β-CD égale à 6,4 mM. L’excellente résolution obte- 5-OH-DPAC 5-MeO-DPAC DPAC
nue (3,5) lors de la séparation de ces énantiomères prouve que
l’électrophorèse capillaire permet, malgré une faible sélectivité DPAC : 3-(di-n-propylamino) chromane
(1,02) mais grâce à de fortes efficacités de pic (400 000 plateaux
théoriques), de quantifier l’énantiomère minoritaire à une teneur fai-
ble (0,1 %) en présence de l’énantiomère majoritaire (figure 8). De Figure 7 – Variation de la sélectivité et de la résolution entre
plus, la constante de complexation de chaque énantiomère avec la les énantiomères de composés basiques en fonction
CD peut facilement être déterminée (KR = 138 M−1 et KS = 166 M−1). de la concentration en β-CD [5]

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0,0019 0,0013 0,0019


Absorbance

Absorbance

Absorbance
DPAC 5-MeO-DPAC 5-OH-DPAC
R
S
0,0014
0,0008 0,0014

0,0009
0,0003 0,0009
0,0004

– 0,0003 0,0004
– 0,0001

– 0,0006 – 0,0008 – 0,0001


12,5 13 13,5 11,5 12 12,5 13 13,5 14
Temps (min) Temps (min) Temps (min)

Capillaire : 70 cm  50 µm
Électrolyte : phosphate/borate (pH 7) + β-CD
Injection hydrodynamique : 1 s
Tension : + 18 kV
Longueur d'onde : 210 nm
Température : 25 °C
Concentration en β-CD : 10 mM (DPAC), 20 mM (5-MeO-DPAC) ou 6 mM (5-OH-DPAC)

Figure 8 – Séparation optimale des énantiomères de composés basiques [5]

Ainsi la séparation des 4 diastéréoisomères du labétalol, com-


Injection E Détection posé possédant 2 carbones asymétriques, peut être réalisée en pré-
sence de β-cyclodextrine sulfatée (figure 12).

mep meo Les énantiomères d’un composé de charge apparente positive,


Anode M Cathode tels que la terbutaline, peuvent être également séparés en présence
M (complexé) de la CM-β-CD utilisée comme sélecteur chiral neutre lorsque le tam-
pon d’analyse est acide (figures 13 et 14).
– –
M + CD(n ) M – CD(n ) La séparation d’énantiomères par électrophorèse capillaire
apporte une grande souplesse d’utilisation, liée à la possibilité
Neutre Complexe
d’opérer avec un simple capillaire de silice fondue en ajoutant sim-
E tension plement le réactif chiral dans l’électrolyte. Elle permet fréquemment
mep mobilité électrophorétique de choisir l’ordre de migration des solutés, ce qui est un avantage
meo mobilité électroosmotique dans le cas du contrôle de la pureté optique d’une molécule. La
CD cyclodextrine consommation en réactif chiral, et donc le coût de l’analyse, sont
réduits et, enfin, les efficacités des séparations, bien plus élevées
Figure 9 – Représentation du mode de migration des énantiomères qu’en CPL, peuvent compenser, dans bien des cas, la diminution de
d’un soluté neutre dans un électrolyte en présence d’une cyclo-
sélectivité qui résulte de l’absence d’une phase stationnaire chirale.
dextrine chargée négativement (degré de substitution moyen n) [26]

Les cyclodextrines polychargées sont indispensables lors de la


séparation d’énantiomères neutres en électrophorèse capillaire. Les
plus utilisées sont anioniques dans un domaine de pH restreint 3. Acides aminés, peptides
(pH > 5) comme la carboxyméthyl-β-cyclodextrine (CM-β-CD), ou
dans tout le domaine de pH comme la sulfobutyléther-β-cyclodex- et (glyco)protéines
trine (SBE-β-CD) ou la β-cyclodextrine sulfatée (S-β-CD).
Tout énantiomère neutre acquiert une mobilité électrophorétique
négative par complexation (figure 9). La figure 10 illustre la sépa- L’essor des biotechnologies et de la recherche sur la protéomique
ration des énantiomères neutres du phényl-1-propan-1-ol en pré-
a contribué à mener, ces dernières années, un effort considérable
sence d’une cyclodextrine chargée négativement (SBE-β-CD ou CM-
β-CD). pour développer de nouvelles stratégies analytiques performantes
pour l’analyse des protéines et de leurs fragments. Pouvoir de réso-
L’utilisation d’une cyclodextrine anionique polychargée présente
lution élevé, rapidité des analyses et utilisation de faibles quantités
aussi un fort intérêt en termes d’amélioration de la résolution lors
de la séparation des énantiomères d’un soluté de charge apparente d’échantillon sont autant d’atouts qui ont placé l’électrophorèse
positive, puisque les formes libre et complexée de chaque énantio- capillaire comme alternative efficace aux techniques de chromato-
mère auront des charges apparentes de signe contraire et migreront graphie en phase liquide ou d’électrophorèse sur des supports clas-
dans des directions opposées (figure 11). siquement employées dans ce domaine.

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Labétalol
0,0087

Absorbance (mAU)
HO
*
0,0085

0,0083

S-β-CD
0,0081

0,0079

0,0077
9 10 11 12 13 14 15
Temps (min)
a
12 14 16 18 20
Temps (min)

Absorbance (mAU)
0,0096
Capillaire : 47 cm  50 µm DI
Tension : + 15 kV
Température : 30 °C
0,0091 Détection UV : 200 nm
Électrolyte : tampon phosphate 30 mM (pH 6,5) + S-β-CD 7,7 mg/mL

Figure 12 – Séparation des diastéréoisomères du labétalol


0,0086 en présence de β-cyclodextrine sulfatée [6]

0,0081 Injection E Détection


6 7 8 9 10 11
Temps (min)
mep
b
(M complexé)
Capillaire : 44 cm  50 µm DI Anode M+ mep Cathode
meo
Tension : + 15 kV (M libre)
Température : 25 °C
Détection UV : 200 nm
M(+) + CD M – CD(+)
Électrolyte : a acide phosphorique 50 mM - soude 55,3 mM (pH 6 ),
SBE-β-CD 10 mg/mL Cation Complexe
b acide phosphorique 20 mM - soude 21,9 mM (pH 6 ),
CM-β-CD 20 mg/mL Figure 13 – Représentation des modes de migration
AU : unités d'absorbance des énantiomères d’un soluté cationique dans un électrolyte
contenant la CM-β-CD neutre [26]

Figure 10 – Séparation des énantiomères du phényl-1-propan-1-ol


en présence d’une cyclodextrine chargée négativement (SBE-β-CD
ou CM-β-CD) [26] 3.1 Acides aminés

E L’identification et le dosage des acides aminés contenus dans un


Injection Détection mélange complexe comme, par exemple, un hydrolysat de peptides
ou de protéines sont principalement effectués par les modes ECZ et
CEM (cf. article [P 3 365]).
mep meo
Anode M+ mep Cathode La détection spectrométrique UV est généralement utilisée mais,
(M complexé) (M libre)
en raison du faible coefficient d’absorptivité molaire de la plupart
des acides aminés, une réaction de dérivation par un groupement
chromophore est souvent nécessaire afin d’abaisser la limite de
M(+) + CD(n–) M – CD[(n – 1)–] détection. Les agents chromophores fréquemment utilisés sont le
chlorure de 5-diméthylaminonaphtalène-1-sulfonyle qui permet
Figure 11 – Représentation du mode de migration d’obtenir les dérivés dansylés (DNS), le 9-fluorométhylchlorofor-
des énantiomères d’un soluté cationique en présence mate (FMOC), l’o-phtaldialdéhyde (OPA) ou encore le naphtalène-
d’un sélecteur chiral anionique de charge apparente négative n [26] 2,3-dicarboxaldéhyde (NDA).

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0,015
Absorbance (mAU)

6 000

Absorbance (254 nm)


0,014
5 500
0,013

di-DNS-K
0,012 5 000

di-DNS-Y
0,011
4 500
0,01
K
4 000
0,009
9 10 11 R
Temps (min)
3 500
Capillaire : 44 cm  50 µm DI
Tension : + 20 kV
3 000
Température : 25 °C
Détection UV : 200 nm
Électrolyte : acide phosphorique 20 mM - soude 11 mM (pH 2,5) 400 600 800 1 000 1 200 1 400 1 600
+ CM-β-CD 10 mg/mL Temps (s) a
AU : unités d'absorbance

6 000
Absorbance (254 nm)

N, Q I
Figure 14 – Séparation des énantiomères de la terbutaline
avec la CM-β-CD neutre (pH 2,5) [24] T V
5 500

di-DNS-C
P

G
L’augmentation de la sensibilité de détection peut également être 5 000 L
obtenue en utilisant la détection par fluorescence induite par laser ou D F
la détection électrochimique. Les groupements fluorophores les plus
couramment utilisés pour la réaction de dérivation des acides aminés 4 500
sont la fluorescéine isothiocyanate (FITC), la fluorescamine, l’OPA et
le NDA, ces deux derniers agents permettant, en outre, de former des S A
4 000
dérivés électroactifs. Une présentation plus exhaustive des agents de
dérivation est présentée dans l’article [P 3 366]. Les acides aminés E W
possédant des masses et quelquefois des charges comparables, leur 3 500
mobilité électrophorétique est proche et la séparation d’un mélange
complexe d’acides aminés par ECZ reste difficile. Afin de modifier
sélectivement la mobilité électrophorétique de certains d’entre eux, 3 000
l’ajout au tampon d’analyse d’additifs tels que des acides alkylsulfo-
niques qui forment des paires d’ions avec les acides aminés permet 400 500 600 700 800
d’améliorer la sélectivité [7]. En électrophorèse capillaire micellaire, à Temps (s) b
l’électromigration des acides aminés s’ajoute un facteur supplémen- G glycine M méthionine
taire de séparation basé sur leur partage entre la phase aqueuse et A alanine D acide aspartique
l’intérieur hydrophobe des micelles. Là encore, le pouvoir de résolu- S sérine N asparagine
tion peut être augmenté par mélange de plusieurs surfactants tels C cystéine I isoleucine
que le dodécylsulfate de sodium et le cholate de sodium [8] ou par H histidine L leucine
ajout d’additifs organiques tels que le 1,2-hexanediol ou encore l’iso- F phénylalanine R arginine
propanol. L’utilisation simultanée de ces alcools à des concentrations Y tyrosine E acide glutamique
respectivement égales à 200 mM et 5 % v/v a permis de séparer, en W tryptophane G glutamine
mode CEM, en présence de 100 mM de SDS, 18 acides aminés dansy- V valine K lysine
lés avec une résolution supérieure à 1,6 entre toutes les paires adja- T thréonine P proline
centes en seulement 25 min (figure 15).
Capillaire en silice fondue : 50 µm DI, longueur effective = 40 cm,
La séparation chirale des énantiomères D et L des acides aminés longueur totale = 47 cm
peut être également obtenue par électrophorèse capillaire selon Tampon : 20 mM Tris pH 8 contenant 100 mM SDS,
200 mM 1,2-hexanediol et 5 % (v/v) isopropanol
deux méthodologies. La méthode la plus simple consiste à ajouter
Tension : + 20 kV
au tampon d’analyse un sélecteur chiral [10], les cyclodextrines
Température : 20 °C
étant les plus couramment utilisées (cf. (§ 4.2)) ; la seconde
Détection UV : 254 nm
méthodologie nécessite une réaction de dérivation des énantio-
Injection hydrodynamique : 3 s
mères avec un réactif chiral conduisant à la formation de diastéréo-
isomères qui peuvent alors être séparés en utilisant les modes
classiques de séparation achirale de l’électrophorèse capillaire [11]. Figure 15 – Analyse d’acides aminés dansylés par CEM [9]

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3.2 Peptides et (glyco)protéines Exemple : les glycoformes de l’érythropoïétine recombinante ont


été séparées sur un capillaire de silice fondue en tampon 0,01 M tri-
cine-0,01 M acétate de sodium pH 5,5 en présence d’urée ; l’ajout de
0,025 mM de putrescine au tampon d’analyse limite le phénomène
■ La plupart des modes d’électrophorèse capillaire sont employés d’adsorption et permet d’améliorer la résolution des huit glycoformes
dans l’analyse des peptides et protéines, le mode ECZ (cf. article (figure 16 a) [15].
[P 3 365]) étant, pour des raisons de simplicité de mise en œuvre, le
plus souvent retenu en première approche. L’identité d’une protéine peut être vérifiée de façon fine en lui fai-
sant subir une hydrolyse enzymatique ou chimique puis en séparant
Si l’analyse d’un mélange de peptides par ECZ reste assez simple les fragments peptidiques obtenus. La carte peptidique de la macro-
à optimiser, la séparation des protéines peut poser plus de problè- molécule, qui constitue une véritable empreinte de celle-ci, peut être
mes. Afin de remédier aux problèmes de précipitation de certaines obtenue par ECZ, la méthode étant susceptible de mettre en évi-
protéines présentant une solubilité limitée en solution aqueuse ou dence des différences minimes dans la composition en acides ami-
un caractère hydrophobe important (cas des glycoprotéines mem- nés de la protéine, comme le montrent les cartes peptidiques,
branaires), le mode CEM peut être une alternative efficace, la pré- présentées figure 17, des β-lactoglobuline A et B ne différant que
sence de surfactants tels que le SDS facilitant leur solubilisation. Par par 2 acides aminés. Afin de limiter l’adsorption des peptides, la
ailleurs, afin de limiter le phénomène d’adsorption des protéines à séparation est réalisée en utilisant un tampon phosphate 50 mM
la surface des capillaires de silice fondue classiquement employés pH 2,1 sur un capillaire de silice fondue préalablement traité par une
en ECZ, plusieurs stratégies peuvent être employées : solution aqueuse de polybrène. Il est nécessaire de dessaler les
échantillons d’hydrolysats avant analyse en ayant recours aux tech-
— les interactions électrostatiques peuvent être diminuées en uti- niques de dialyse ou de chromatographie liquide de partage à pola-
lisant un tampon d’analyse acide permettant de réduire la quantité rité de phases inversée avec un gradient d’élution rapide ; en effet,
de charges négatives liées à l’ionisation des groupements silanols à la présence des sels utilisés lors de l’hydrolyse perturbe la résolu-
la surface du capillaire ; tion, la sensibilité de détection et la reproductibilité des analyses.

— alternativement, travailler à un pH supérieur au pI des proté- Le dosage de peptides ou protéines thérapeutiques dans des spé-
ines entraîne des répulsions électrostatiques entre les molécules de cialités pharmaceutiques est principalement réalisé par ECZ. Dans
protéines chargées alors négativement et la surface du capillaire tous les cas, l’analyse quantitative peut être envisagée si l’on dis-
également chargée négativement. pose de la protéine de référence, en s’assurant au préalable qu’il
n’existe pas d’interférences entre la protéine à doser et les autres
Une autre méthode consiste à introduire différents additifs dans constituants du produit fini ; la méthode doit être validée en testant
le tampon électrophorétique. Les agents les plus fréquemment utili- notamment la linéarité de la réponse du détecteur et la reproductibi-
sés sont les amines ou les polyamines (triéthylamine, spermidine...) lité des analyses [16].
qui entrent en compétition avec les protéines basiques vis-à-vis des
groupements silanols négatifs de la surface du capillaire. On notera ■ Le mode IEFc est également largement utilisé pour l’analyse des
également l’intérêt de l’ajout, au tampon d’analyse, de polymères protéines. Le contrôle de l’identité d’une protéine peut être réalisé
neutres ou cationiques tels que l’alcool polyvinylique ou le chlorure en vérifiant son point isoélectrique (pI) par calibrage à l’aide de
de cétyltriméthylammonium qui modifient la surface du capillaire. mélanges de protéines de pI connus. Ce mode se révèle être éga-
Cette modification est encore plus efficace lorsque l’on utilise une lement une alternative efficace au mode ECZ pour effectuer la sépa-
méthode de revêtement statique du capillaire : le composé de ration, selon des différences de pI, d’isoformes ou de glycoformes
recouvrement est alors exclu du tampon d’analyse ; il peut être soit de (glyco)protéines. Il est particulièrement bien adapté à l’analyse
adsorbé à la surface du capillaire par un lavage de celui-ci préalable de glycoprotéines dont les différentes glycoformes présentent des
à l’analyse, soit fixé au capillaire de manière covalente. Selon la degrés variables de sialylation, sulfatation ou phosphorylation. Les
nature du polymère utilisé, la surface du capillaire devient neutre paramètres à optimiser en IEFc sont nombreux et afin de limiter le
(revêtement par de l’alcool polyvinylique ou du polyacrylamide) ou temps d’optimisation de la méthode, l’approche « one-step » est
chargée positivement (utilisation de polyéthylènimine, de poly- souvent préférable, l’étape de mobilisation étant assurée par le flux
brène). Ces différentes stratégies de recouvrement permettent de électroosmotique lui-même (cf. article [P 3 365]). Quel que soit le
diminuer efficacement l’adsorption des protéines et offrent en mode retenu (« one-step » ou « two-step »), la première étape de
supplément la possibilité de moduler le flux électroosmotique dont mise au point de la méthode consiste à estimer la valeur des pI des
le contrôle est un paramètre important dans l’optimisation d’une glycoformes en utilisant les différents ampholytes commercialisés
méthode d’analyse [12]. sur une large gamme de pH. L’optimisation consiste ensuite à sélec-
tionner le mélange d’ampholytes de large et de faible gammes de
Le haut pouvoir de résolution de l’électrophorèse capillaire en pH le plus approprié et à tester différents agents de solubilisation
mode ECZ permet de mettre en évidence des modifications mineu- permettant d’éviter la précipitation des protéines. Le problème de
res d’une protéine ou d’un peptide. précipitation est particulièrement important en mode IEFc puisque
Exemples : beaucoup de protéines sont sujettes à la précipitation au voisinage
de leur pI. Ainsi, a-t-on recours à toute une gamme de solubilisants
– la séparation de l’insuline native et des formes acétylées de la
tels que le glycérol, le propylèneglycol, les sulfobétaïnes, certains
molécule a pu être réalisée sur un capillaire de silice fondue en tampon
tampons zwittérioniques (acide 3-cyclohexylamino-1-propanesulfo-
25 mM Tris-192 mM glycine pH 7,4 [13] ;
nique, bicine, taurine) ou des sucres tels que le sorbitol, le saccha-
– l’utilisation d’un capillaire recouvert par un revêtement en poly- rose. L’apparition de pics extrêmement fins en IEFc qui
acrylamide et d’un tampon 20 mM citrate – acide 2-N-morpholinoétha- correspondent à des particules de protéines agrégées témoigne
nesulfonique (MES) a permis de séparer huit variants de l’albumine du d’une précipitation [17]. Il est généralement nécessaire de dessaler
sérum humain ; la résolution entre les différentes espèces est nette- les échantillons de protéines avant analyse, la présence de sels pou-
ment améliorée en sélectionnant un pH de 5,2 proche du pI de la pro- vant perturber le gradient de pH ou détériorer la reproductibilité des
téine, qui accentue les différences du rapport charge sur masse des analyses. La séparation des glycoformes de l’érythropoïétine
différentes formes [14]. recombinante par IEFc en mode « two-step » illustre le haut pouvoir
de résolution de la méthode. Comme le montre la figure 16 b, la
Les performances de l’électrophorèse capillaire en mode ECZ per- résolution entre les différentes glycoformes est similaire à celle
mettent également la séparation des glycoformes d’une gly- obtenue en mode ECZ, la méthode IEFc permettant en outre de dimi-
coprotéine. nuer d’un facteur 3 le temps d’analyse [15].

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0,008 Absorbance
Absorbance

5
6
0,07
0,006

4
0,004 0,06
7
Blanc
0,002 0,05
3
2
1 8 0,04
0

– 0,002 0,03 β-LgA


0 5 10 15 20 25 30 35
Temps (min)
0,02
a par ECZ

Capillaire en silice fondue : 50 µm DI, longueur effective = 100 cm, 0,01


longueur totale = 107 cm
Tampon : 0,01 M tricine, 0,01 M acétate de sodium, pH 5,5, 0,01 M NaCl, β-LgB
7 M urée, 0,025 mM putrescine 0
Tension : + 15,4 kV
Température : 35 °C 0 5 10 15 20
Détection UV : 214 nm Temps (min)
Injection hydrodynamique : 25 s (0,5 psi) Capillaire en silice fondue modifié par une solution
aqueuse de polybrène à 0,2 % (50 µm DI, longueur
0,008 effective = 50 cm, longueur totale = 57 cm)
Absorbance

Tampon : 50 mM phosphate pH 2,1


Tension : – 20 kV
0,006 Mobilisation Température : 25 °C
5
6
Détection UV : 200 nm
0,004 4 Injection hydrodynamique : 10 s (0,5 psi)
7
Échantillon : 5 mg/mL

0,002
3
1 2 Figure 17 – Cartes peptidiques de la β-lactoglobuline A
et de la β-lactoglobuline B (Le Potier 2001, non publié)
0

– 0,002
0 2 4 6 8 10 12 14 [P 3 365]). Ce mode se révèle également très utile pour vérifier la
Temps (min) pureté et la stabilité de protéines : il permet en effet de détecter des
b par IEFc formes agrégées de la macromolécule qui présenteront un temps
de migration plus lent que celui attendu pour la protéine ou, au con-
Capillaire : polyacrylamide (50 µm DI, longueur effective = 20 cm, traire, des fragmentations de celle-ci par détection de peptides de
longueur totale = 27 cm) faible masse moléculaire.
Focalisation : 6 kV (0,5 min), mélange d'ampholytes, (1:2, v/v) pH 3-10
et 2,5-5 La pureté d’un anticorps monoclonal recombinant humain a été
Échantillon : rhEPO dans gel IEFc Beckman, 7 M urée et ampholytes ainsi évaluée par ECG en présence de dodécylsulfate de sodium
(figure 18). Cette méthode, réalisée dans des conditions réductrices
qui entraînent la rupture des ponts disulfures au sein de la macro-
Figure 16 – Séparation des glycoformes de l’érythropoïétine molécule, permet de visualiser deux pics principaux de cet anticorps
recombinante (rhEPO) [15] provenant des chaînes lourdes et des chaînes légères. En effectuant
le même type d’analyse dans des conditions non dénaturantes, la
masse moléculaire de l’anticorps a été déterminée. Le pic principal
est accompagné de sept autres pics qui correspondent à des frag-
■ Le mode ECG est un outil puissant pour déterminer la masse ments de la molécule de départ. Un autre pic minoritaire correspon-
moléculaire d’une protéine inconnue dans une gamme de masses dant à une molécule possédant une masse plus élevée que
allant de 15 000 à 150 000 Da et est fréquemment utilisé pour l’anticorps met en évidence la présence de formes agrégées de la
contrôler l’identité d’une protéine. L’estimation de ce paramètre molécule [18].
physico-chimique est effectuée par calibrage à l’aide de mélanges
de marqueurs de masse moléculaire connue en présence de SDS Bien que moins adapté que les modes ECZ et IEFc à la séparation
qui confère la même densité de charge à toutes les protéines, à des variants d’une protéine, l’utilisation du mode ECG peut éga-
l’exception des protéines basiques et des glycoprotéines qui pré- lement être indiquée pour la séparation des glycoformes de gly-
sentent un comportement marginal avec le surfactant conduisant à coprotéines possédant d’importantes variations dans leur
une estimation erronée de leur masse moléculaire (cf. article glycosylation.

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7
200 6 200
5
116 4 116
87 3 87
66 66
2 HC
45 45
31 31
93,8 1 90 LC

Absorbance (mAU)

Absorbance (mAU)
21 21
14
rhuMAb
14
116
HER2
6,5 (non réduit) 6,5 rhuMAB
MW MW HER2
Stds Stds (réduit) 14
116
70,28 67,43 31
14 6,5
21
31 200
6,5 45
97 Masses
46,74 21 44,86 moléculaires
66
45 200 standards
97 Masses (MW Stds)
66 moléculaires
standards
23,2 (MW Stds) 22,3 Chaînes Chaînes
légères (LC) lourdes (HC)
rhuMAb rhuMAb
HER2 (non réduit) HER2
1 2 5
3 4 7 (réduit)
– 0,34 – 0,27

0 6 12 18 24 30 0 6 12 18 24 30
Temps (min) Temps (min)

a dans les conditions natives b en conditions réductrices (en présence de mercaptoéthanol)

Kit ECG BioRad Tension appliquée : 333 V/cm Échantillon injecté par mode électrocinétique 40 s à 10 kV
rhuMAb anticorps monoclonal humain recombinant

Figure 18 – Analyse d’un anticorps monoclonal par SDS-ECG [18]

En raison de sa simplicité d’utilisation, la détection spectromé- séparation peut être également menée en l’absence d’agents com-
trique UV est la plus fréquemment utilisée pour l’analyse des protéi- plexants en utilisant des conditions de pH extrêmement basiques
nes, la longueur d’onde de détection étant fixée à 200 nm ou aux permettant la déprotonation des sucres. L’analyse par ECZ des oligo-
alentours de 250 à 280 nm correspondant au maximum d’absor- saccharides comportant des groupements acides comme, par
bance des acides aminés aromatiques. Un gain important en sensi- exemple, les acides sialiques, peut en revanche être menée en utili-
bilité peut être obtenu avec la détection par fluorescence induite par sant une gamme de pH beaucoup plus large.
laser et la limite de détection peut être diminuée par dérivation des En raison du faible coefficient d’absorptivité molaire des carbo-
protéines avec un agent fluorophore (cf. article [P 3 366]). Enfin, le hydrates, la détection par spectrométrie UV indirecte, réalisée en
couplage avec la détection par spectrométrie de masse est de plus ajoutant au tampon d’analyse un additif possédant un groupement
en plus développé, notamment pour les études nécessitant l’identi- chromophore tels que le tryptophane, l’acide 1-naphtylacétique ou
fication des protéines. l’acide sorbique, est souvent préférée à la détection directe. La
dérivation des oligosaccharides par un agent chromophore ou fluo-
rophore, dont la liste est présentée dans l’article [P 3 366] concer-
nant les modes de détection, est une alternative souvent retenue
4. Oligosaccharides car, dans le cas des sucres neutres, outre le gain en sensibilité, le
et polysaccharides choix judicieux de l’agent de dérivation peut permettre d’introduire
une charge sur le dérivé. Cette stratégie est fréquemment retenue
pour établir par ECZ le profil en oligosaccharides d’une
Pour une revue plus complète, consulter la référence [19]. glycoprotéine : après hydrolyse chimique ou enzymatique de la
glycoprotéine, la réaction de dérivation des oligosaccharides, selon
une réaction d’amination réductrice, avec des composés de la
famille des acides sulfaniliques tels que le 8-aminopyrène-1,3,6-tri-
4.1 Oligosaccharides sulfonate (APTS), confère une charge négative aux dérivés formés
permettant leur analyse directe en ECZ avec une détection sensible
par fluorescence induite par laser [20]. Lorsque des agents de
L’ECZ et l’ECG sont les deux modes principalement utilisés pour dérivation non chargés tels que le 2-aminobenzamide, le 2-amino-
analyser les oligosaccharides libérés des protéines. acridone sont employés, l’ajout de surfactants ou de cyclodextrines
au tampon d’analyse permet parfois d’améliorer la sélectivité de la
■ La séparation en mode ECZ des oligosaccharides de type oligo- séparation [21].
mannose possédant des groupements ionisables faibles (sucres
neutres) est généralement effectuée en utilisant un tampon borate. ■ Les séparations effectuées en fonction de la taille des oligosac-
Le principe de la séparation repose sur la complexation des sucres charides sont généralement réalisées selon le mode ECG (article
avec le borate pour former des complexes chargés négativement. La [P 3 365]) sur un capillaire rempli de gel de polyacrylamide ; alterna-

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Absorbance

7
D2 D4 D6 0,06

Absorbance (UA)
15 min
Acide cinnamique

a
5
6
3 5
0,04
4 7
2 9-12
1 8 13, 14
b
3
7 8 9 10 11
Temps de migration (min) ∆Di-6S
Capillaire ecap PVA-1 (Beckman) 0,02
Tampon d'analyse : acétate 25 mM, pH 4,75 avec 0,4 % de POE

∆Di-4S
Champ électrique appliqué : 500 V/cm
5
D2 (glucose)2 , D4 (glucose)4 , D6 (glucose)6 4
12 3 6
Figure 19 – Analyse par ECG d’un hydrolysat de maltooligo-
saccharides a et des oligosaccharides libérés de la fétuine b 0
après dérivation par l’APTS [25] 0 2 4 6 8
Temps (min)

0,06
Absorbance (UA)

255 min
Absorbance

∆Di-6S

Acide cinnamique
0,004

0,003 Héparine

0,002 0,04

0,001

0 ∆Di-4S

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0,02
Temps de migration (min)

Capillaire en silice fondue (50 µm DI, longueur effective = 11 cm,


longueur totale = 60,2 cm)
Électrolyte : tampon phosphate 50 mM pH 3
Tension appliquée : + 20 kV
Température : 25 °C 0
0 2 4 6 8
Détection UV : 200 nm Temps (min)
Injection hydrodynamique : 20 s (0,5 psi)
Capillaire en silice fondue : 50 µm  57 cm
Figure 20 – Analyse par ECZ de l’héparine dans une formulation Électrolyte : tampon borate 100 mM pH 9
pharmaceutique [22] Tension appliquée : 20 kV
Température : 45 °C
Détection UV : 200 nm
tivement, un polymère neutre (dextran, polyéthylèneglycol) peut Injection hydrodynamique : 3 s (0,5 psi)
être ajouté au tampon d’analyse, créant une matrice qui retarde plus Acide cinnamique : étalon interne
ou moins les analytes suivant leur masse moléculaire. La figure 19 UA : unités arbitraires
représente les séparations par ECG d’oligosaccharides dérivés par
l’APTS après hydrolyses respectives de maltooligosaccharides et
d’une glycoprotéine, la fétuine. La séparation est effectuée sur un
capillaire revêtu par de l’alcool polyvinylique en utilisant un tampon Figure 21 – Séparation par ECZ des disaccharides issus
acétate 25 mM, pH 4,75 contenant 0,4 % d’oxyde de polyéthylène de la digestion de la chondroïtine-6-sulfate par la chondroïtinase
(POE) avec une détection par fluorescence induite par laser. après 15 et 255 minutes d’incubation [23]

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4.2 Polysaccharides
6
10

Absorbance
L’analyse des polysaccharides peut être réalisée sur les macromo- 4
12 14 18
lécules natives, en utilisant soit le mode ECZ soit le mode ECG si 16 20 30
leur taille dépasse 10 000 Da. L’analyse d’une telle macromolécule 8 40
ne permet pas de détecter des impuretés ou des fragments car les
pics obtenus sont généralement larges en raison de la polydisper- 50
sité de ces composés. Un gain important en efficacité peut cepen-

0,001
dant être obtenu en diminuant la longueur effective du capillaire 60
comme le montre la figure 20 représentant l’analyse d’héparine
dans une préparation pharmaceutique en mode ECZ [22]. 70
80
La stratégie d’analyse des polysaccharides par électrophorèse 90
capillaire la plus fréquemment suivie consiste à procéder à une
hydrolyse enzymatique ou acide du polymère et à analyser le
mélange d’oligomères générés. Ces fragments de polymères dans le
cas des glycosaminoglycannes, par exemple, présentent un rapport
11 13 15 17 19
charge sur masse relativement constant en fonction de leur degré de Temps (min)
polymérisation, ce qui rend leur séparation par ECZ difficile.

Cependant, comme le montre la figure 21 qui illustre le profil Capillaire en silice fondue revêtu avec (50 % phényl) méthylpolysiloxane
électrophorétique en mode ECZ de la chondroïtine sulfate hydroly- (100 µm DI, longueur effective = 20 cm, longueur totale = 27 cm)
sée par voie enzymatique pendant 15 et 255 min, la complexation Tampon : 0,1 M Tris-0,25 M borate pH 8,5 contenant PEG 70000 à 10 %
avec le borate peut permettre de séparer les disaccharides produits Tension : + 20 kV
∆Di-4S, ∆Di-6S qui ne diffèrent que par la position du groupement Détection UV : 200 nm
sulfate en position 4 ou en position 6 [23]. Injection électrocinétique : 5 kV (10 s)
Échantillon : 1 mg/mL
La séparation par ECG des oligomères générés par hydrolyse par-
PEG : polyéthylèneglycol
tielle de polysaccharides est généralement efficace. La figure 22
représentant la séparation par ECG en présence d’un gel constitué Les nombres indiquent le degré de polymérisation des oligomères
de PEG70000, d’oligomères de l’acide hyaluronique, issus de leur de glucose
digestion par la hyaluronidase illustre le haut pouvoir de résolution
de cette technique qui permet de séparer les fragments allant de 2 à Figure 22 – Séparation d’oligomères de l’acide hyaluronique par ECG
90 unités monosaccharidiques [24]. [24]

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