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12 Departamento de Ingeniería Química y Ambiental; Universidad Técnica Federico Santa María
15 Autores: C. Arismendi
Urrutia
Correo: cristobal.arismendi@gmail.com
18 Andres.urrutiaf@alumnos.usm.cl
Resumen
21 pechugas de pollo, conociendo el contenido proteico exacto de estas para fijarlo como la concentración
de sustrato para la reacción, con la enzima comercial Alcalasa 2.4 L, a través del método de Ph-Stat.
24 la concentración de enzima añadida y viceversa, para ser analizados cualitativamente y luego evaluar
Los datos obtenidos mostraron una presencia a enzima constante, de una inhibición de sustrato a
27 una concentración mayor de 50 g/L, observando una disminución en la velocidad inicial de la reacción
30 obedece a la cinética de Michaelis Menten, ya que la velocidad inicial de la reacción se comparo con la
concentración inicial de enzima y se encontró una relación lineal entre ellas, como corresponde en las
sustrato el cual se trato de ajustar a las variables medidas, lo cual no se consiguió con buenos
resultados, por lo que se concluyo que suposiciones realizadas en la deducción del modelo fueron
39 erróneas.
Introducción
42 La pechuga de pollo tiene un alto contenido proteico (22% en peso) y un bajo contenido de
grasas (3%) comparado con el tuto de pollo (18 % de proteínas y 5% grasa) y las alas (18% proteínas y
18% grasa) (TACO 2004). Además, la proteína de animal presenta un perfecto equilibrio de
45 aminoácidos esenciales que deben ser incluidos en la dieta ya que el organismo no es capaz de
Según Barbut (2002), nuevos productos procesados de aves de corral (por ejemplo, las vienesas
48 de aves) han sido introducidos en el mercado en los últimos años, debido a los bajos precios de las
materias primas. Con el fin de ser competitivos, las industrias de aves de corral deberán desarrollar
nuevos productos para satisfacer las nuevas demandas de los consumidores y aumentar la rentabilidad.
51 Así, la hidrólisis de las proteínas de la carne de pollo podría ser una solución alternativa para obtener
La hidrólisis de proteínas se puede lograr usando enzimas, ácidos o bases, pero la hidrólisis
54 enzimática es muy preferible a los métodos químicos para aplicaciones alimentarias. Las enzimas
proteolíticas se usan para disolver o descomponer la proteína muscular, lo que distingue dos fracciones,
la soluble y la insoluble. La fracción insoluble puede contener grasa y otros materiales no deseados y
57 puede ser utilizado en alimentos para animales. La fracción soluble contiene la proteína hidrolizada con
perfiles péptido bien definidos y un bajo contenido de grasa. Durante este proceso, los aminoácidos son
liberados, con esto mejora el sabor de la carne. Los hidrolizados de proteínas pueden ser utilizados
63 que no pueden digerir todo / proteína intacta. Hidrolizados rico en péptidos de bajo peso molecular,
sobre todo di y tri-péptidos con lo menos posible los aminoácidos libres, se ha demostrado que tiene
más usos dietéticos debido a sus altos valores nutricionales y terapéuticos (Bhaskar y otros, 2007). Las
en las fórmulas para lactantes hipoalergénicos (Mahmoud, 1994). Por otra parte, los péptidos, que se
absorben fácilmente, pueden ser una fuente de nitrógeno en la nutrición para deportistas y péptidos de
69 alto valor biológico son atractivos como un suplemento de proteínas en general en una amplia variedad
72 ampliamente estudiados, como el del salmón rojo, el camarón de tratamiento de residuos, las víseras de
ovino, la carpa herbívora, y el caracol de barro (Sathivel y otros, 2005; Holanda y Netto 2006; Bhaskar
yotros, 2007, 2008; Wasswa y otros, 2007; Xia y otros, 2007). Sin embargo, hay poca información
78 (Adler-Nissen, 1985). Es importante saber cuál de estos factores son críticos, ya que la optimización de
los parámetros de proceso para la hidrólisis enzimática de la carne es esencial para desarrollar un
cualitativamente las experiencias más descriptivas y claras, con el fin de estimar el comportamiento de
84 sistema a diferentes concentraciones tanto de enzima como sustrato y ver posibles situaciones
90 siguiente reacción.
93
96 donde E y S son las enzimas y sustratos libres; ES ES2 son complejos enzima sustrato; P es el producto
Cabe destacar que es una reacción acompetitiva. La reacción correspondiente puede ser
dP
1. V0 = = k2 ES
dt
Al asumir que la reacción se encuentra en estado estacionario, el balance de masa para los
d ES
2. = k1 E S k 1 + k 2 ES k 3 ES S + k 3 ES 2 = 0
dt
d ES 2
3. = k 3 ES S k 3 ES 2 = 0
dt
105 Por lo que la concentración del complejo [ES2 ] se puede definir como usando la ecuación 3:
k3 ES S
4. ES 2 = ES S =
k 3 KI
donde:
k3
108 K1 = (constante de inhibición por sustrato)
k3
111 Por lo que, al utilizar las ecuaciones 2,28 y 2,32, la concentración de enzima libre [E] queda:
5. E = e ES ES 2
6. E = e ES ES 2
114 La concentración del complejo ES se determina utilizando la ecuación 2., usando las ecuaciones
S e
7. ES = 2
S
S + + Km
KI
117 donde:
k 1 + K2
Km = (constante de Michaelis)
k1
donde:
dx
9. r = S0 * = k2 * [ES]
dt
Si se asume estado estacionario y que la cantidad de enzima pre sente (e), se encuentra en forma
126 libre (E) y formando complejos (ES) y (ES 2 ), la ecuación anterior queda:
dx S Vmax
10.r = S0 * = 2
dt S
S + + Km
KI
2
S
129 11. K m + S
KI
La ecuación se reduce a
dx K 2 e0 K I
12. =
dt S0 S
132 Sabiendo que la cantidad de sustrato es igual al sustrato inicial menos el producto generado y
separando variables para su integración podemos obtener una relación algebraica que nos relaciona la
2 S0 P 2
14. S P
0 = K 2 e0 K I t
2
dx d DH
=
dt dt
141 La cantidad de producto obtenido, se puede medir utilizando el grado de hidrólisis (DH), ya que
este representa el porcentaje de péptidos hidrolizados; por lo que la variación del producto durante el
dP d DH
144 = S0
dt dt
Ellas indican que la tasa de reacción r disminuye al aumentar el tiempo de reacción y el grado de
d DH K e K
= 23 0 2 I
dt S0 S0 P
P= S 0 DH
Materia Prima
153 Pechuga de pollo fresca fue adquirida de la empresa Faenadora Súper Pollo (Lo miranda y San
Vicente, Chile) y congelada para su posterior uso. Las características de la carne fue obtenida del
156 tabla 1.
Tabla 1
Característica (%)
Humedad 76,07%
Grasa 1,38%
Cenizas 1,27%
*Corresponde a la media pechuga de pollo. Deshuesada y sin piel. Con hematoma s leves.
162 uso el método de pH stat, descrito por Adler-Nissen (1985). La materia prima fue descongelada y toda
la grasa y nervios visibles fueron extraídos, luego fue molida en un procesador de alimentos y
mezclada con 500- mL de agua destilada. La mezcla fue llevada a temperaturas y pH optimizados por
165 L.E. Kurozawa. K.J. Park, M.D. Hubinger (2008) en valores de 52,5 °C y 8,00 respectivamente. Se
agua destilada y a 52,5 °C. Las pruebas consistieron en mantener constante el pH usando NaoH cada un
168 minuto los primeros 20 minutos y luego cada unos 5 minutos hasta generalmente completar la hora de
171 EL grado de hidrólisis (DH) fue obtenido por el método pH-stat y definido como el porcentaje
del ratio entre los enlaces peptídicos aun disponibles (h) y los enlaces peptídicos iniciales (htotal)(Adler-
h B Nb
174 DH (%) = * 100 = * 100
htotal MP α htotal
177 la proteína del sustrato (7,6 mEq/g); y α es el grado de disociación del grupo α-NH2 que se expresa
como:
1
α=
1+10 pH pK
180 Los valores de pK varían significativamente con la temperatura y pueden ser estimados como a
298 T
pK = 7,8 + * 2400
298 T
Para probar la existencia o inexistencia de inactivación enzimática, se agrego enzima fresca pasados 1
186 hora de reacción y se sigue analizando con el mismo método (añadiendo base).
189 peptídicos hidrolizables que afecta la cinética de la reacción, se añadió sustrato fresco pasados 50
192
195
198
201
Resultado y discusión
Los primeros experimentos fueron realizados con una concentración de enzima de 2,97 [g/L],
Grado de Hidrolisis
Concentracion de sustrato variable e=2,21[g/l]
35,00
30,00
25,00
[S] [g/l] 45,9287848605578
20,00 [S] [g/l] 49,9185137884976
%DH
Figura 1.
210 reacción disminuyen; esto implica que el sustrato ejerce una acción negativa sobre el grado de
Para comprobar esto se realiza un gráfico con las velocidades iniciales de la reacción (figura 2.)
Velocidad Inicial vs Concentración inicial de Sustrato e
0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
V[%/s]
0,04
0,03
0,02
0,01
0
45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
S0 [g/l]
213 Figura 2.
altas como consecuencia de la inhibición por sustrato. La máxima velocidad inicial, se observa a una
realizaron ensayos con concentración de sustrato constante (49,92 g/L) variando la concentración de
Grado de Hidrólisis
Concentración de enzima variable So=49,92 [g/L]
35,0
30,0
2,2175565654749
15,0 [E] [g/l]
2,24497978822644
10,0
5,0
0,0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
tiempo [s]
Figura 3.
222
Para demostrar que existe una dependencia (como se observa en la figura 4.) entre la velocidad
0,05
0,04
0,03 f(x) = 0,18x - 0,31
0,02 R² = 0,98
0,01
0
2 2,05 2,1 2,15 2,2 2,25 2,3
Eo [g/L]
Figura 4.
228 En general, al graficar el grado de hidrólisis versus el tie mpo, se observa que existe una velocidad de
b. Inhibición enzimática
c. Inactivación enzimática
234
Con el fin de estudiar la primera posibilidad, se realizo un experimento en el cual, durante la
237 hidrolizables, se observaría un aumento en el grado de hidrólisis después de la adicionó del sustrato
Grado de hidrolisis
Adición de sustrato
25,00
20,00
15,00
%DH
10,00
5,00
0,00
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
tiempo [s]
240
Figura 5.
243
La inactivación enzimática, hipótesis c, se estudio agregando enzima fresca 1 hora después de
Grado de hidrolisis
Adición de enzima
25,00
20,00
15,00
Columna E
%DH
10,00
5,00
0,00
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
tiempo [s]
246 Figura 6.
249 A partir de cada experiencia realizada se ajusto una curva para predecir su comportamiento y
luego poder comparar con el modelo planteado. Si se despejase el valor del grado de Hidrólisis para el
modelo planteado, en función de las demás variables, se podría obtener un modelo que correlacionara
En la tabla 2 se presentan el Parámetros de Ajuste para cada experiencia, estos debiesen estar en
255 función de las demás variables, vale decir, Eo, So y k 2 y K I (A = 2·k2 ·KI), entregando el valor de R2 .
Esto se realizo asignando un valor A talque genere la menor cantidad de error Cuadrático para los
tiempos medidos.
258 Tabla 2.
Experiencia Eo So A ΣR2 /n
Los bajos valores de la suma de los errores cuadrados llevan a analizar que los ajustes
261 generados dan una buena aproximación de las cinéticas estudiadas. El las figuras 8 y 9 se muestran los
valores teóricos para los casos anteriormente estudiados (a sustrato constante y enzima constante
luego).
264
267
270 Figura 8
Figura 9
273
276 se puede validar estadísticamente con el ajuste planteado, por lo que se debe evaluar otra forma de
ajuste para poder validar el modelo y encontrar el parámetro que relacione correctamente al modelo
planteado.
279
Conclusiones
282 concentración de sustrato, revela una inhibición por sustrato, ya que al estimar las velocidades iniciales
Por otro lado el comportamiento a sustrato constante, muestra que la reacción obedece la
cinética de Michaelis Menten, ya que se muestra una dependencia lineal de la concentración de enzima
288 en función de la velocidad máxima de reacción, situación que sucede en este tipo de cinéticas.
291 que al agregar más sustrato (vale decir más enlaces peptidicos dispuestos a hidrolizarse) cuando la
reacción ya tiende a ser constante hacia un grado de hidrólisis, el sistema muestra una disminución
brusca del pH mostrando una aumento en la velocidad de Hidrólisis a la llevada a ntes de la adición de
294 mas sustrato. Esto indica el aumento de concentración de enlaces posibles de hidrolizar.
enzimática, ya que al agregar más enzima cuando la ciné tica lleva un tiempo donde la velocidad del
297 grado de hidrólisis se torna constante, el comportamiento sigue igual por lo que todavía la enzima está
trabajando con la misma actividad, solo que la disminución del sustrato disponible a hidrolizar genera
300 El ajuste realizado en base al modelo desarrollado, no entrega buenos resultados comparables
con los estudios experimentales, pudiendo implicar un mal desarrollo estadístico del modelo, asignando
parámetros de ajuste inadecuadamente, o que las hipótesis planteadas, para la determinación del
303 modelo no son completamente correctas y es más conveniente desarrollar el modelo con una
306 proteínas, de forma relativamente sencilla y precisa; sin embargo, si no se realiza una mezcla
reproducibilidad de los mismos. Un sistema automático de titulación, permitiría obtener datos más
reacciones en paralelo que involucran inhibición acompetitiva por sustrato. La inhibición por sustrato
312 se presentó a concentraciones superiores a 50 g/L, donde a máxima velocidad alcanzada en este punto
315 que debe ser estudiado para optimizar los costos de operación, ya que la viscosidad de la mezcla
Los hidrolizados obtenidos deben ser analizados para determinar la d istribución de pesos
318 moleculares, y así, poder estimar los parámetros operacionales, que maximicen la producción de
321
324 Referencias
327 • Barbut S. 2002. Poultry products processing. An industry guide. Boca Raton, Fla.: CRC Press.
548 p.
• Bhaskar N, Modi VK, Govindaraju K, Radha C, Lalitha RG. 2007. Utilization of meat industry
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333 • ˇ Sliˇ zyt˙ eR,Daukˇ sas E, Falch E, Storrø I, Rustad T. 2005. Characteristics of protein fractions
336 properties of red salmon (Oncorhynchus nerka) enzymatic hydrolysates. J Food Sci 70:401–6.
• Adler-Nissen J. 1985. Enzymic hydrolysis of food protein. London: Elsevier Applied Science.
427 p.
• Kristinsson HG, Rasco BA. 2000. Kinetics of the hydrolysis of Atlantic salmon (Salmo salar)
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