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Dif :

Laboratoire est un Lieu d'exercice de chercheurs où sont réalisées des observations ou


des expériences, ainsi que toute autre activité scientifique.
 Il peut s'agir de prélèvement de sang, de peaux, d'urines, de selles ou
de muqueuses.
La microbiologie est une branche spécialisée de la biologie, la science qui étudie les organismes microscopiques,
les micro-organismes, donc des êtres vivants qui ne peuvent être reconnus à l'oeil nu souvent
pour déterminer un germe ou une bactérie, un virus, etc. La microbiologie s'intéresse
aux cellules, unicellulaires (cellule unique), multicellulaires (colonie de cellules), ou acellulaires (dépourvue de
cellule). Cette science englobe de nombreuses sous-disciplines, y compris
la virologie, mycologie, parasitologie et bactériologie.

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Le Laboratoire de Microbiologie étudie les processus régissant l’organisation,
l’évolution des bactéries et des bactériophages,
Les bactéries et les phages que nous étudions sont des organismes modèles intéressants aussi bien pour la
recherche fondamentale que pour les applications dans les domaines des biotechnologies, de l’industrie
alimentaire et de la santé.

La microbiologie s'intéresse à l'étude des microorganismes, qu'il s'agisse des bactéries, des


champignons, des protozoaires ou des virus. Une connaissance approfondie de leur
physiologie, de leur génétique et des interactions entre eux facilite notre compréhension du
monde vivant à l'échelle microscopique

Défèrent type des labo

GROUPE 1 (P1) : « … n’est pas susceptible de provoquer une maladie chez l’homme »

 Place de travail tenue propre et en ordre.


 Ports de gants uniquement dans les laboratoires.
 Lavage des mains avant et après manipulation.

GROUPE 2 (P2): « …peut provoquer une maladie chez l'homme et constituer un danger pour les
travailleurs; sa propagation dans la collectivité est improbable; il existe généralement une
prophylaxie ou un traitement efficace »

*Porte et fenêtres fermées pendant la manipulation

 Port de blouse uniquement dans les zones confinées

 Éviter les plus possible la création d’aérosols, centrifugeuses fermées

 Désinfection régulière, et en fin d’activité, des plans de travail avec alcool 70%, désinfectant, etc…

 Liste des personnes autorisées sur la porte, supervisées par le responsable de projet
GROUPE 3 (P3) : « …peut provoquer une maladie grave chez l'homme et constituer un danger
sérieux pour les travailleurs; il peut présenter un risque de propagation dans la collectivité, mais il
existe généralement une prophylaxie ou un traitement efficace »

 Toutes les surfaces doivent être lisses et faciles à nettoyer

 Aucun raccordement avec l’extérieur

 Tout matériel contaminé doit être autoclavé dans le laboratoire avant de sortir

 Uniquement des vêtements destinés au P3 sont portés et ne sortiront pas du laboratoire sans être
préalablement autoclavés

GROUPE 4 (P4) : « …provoque des maladies graves chez l'homme et constitue un danger sérieux pour
les travailleurs; il peut présenter un risque élevé de propagation dans la collectivité; il n'existe
généralement pas de prophylaxie ni de traitement efficace »

Les fonctionnement

Les matériels ;

 Pipettes pasteure
 Boite de pétri
 Lames / lamelles
 Bouillon / gélose
 Colorants / réactifs
 Disques d’antibiotiques
 Verrerie
 Microscope
 Pissettes

Equipements ;

 Autoclave : est un récipient dont le couvercle est glissé à l'intérieur de l'enveloppe du


récipient et qui se ferme hermétiquement sous l'effet de la pression intérieure de la vapeur.
 Centrifugeuse : est un appareil destiné à imprimer une accélération,
 Hotte d'aspiration
 Incubateur
 Osmoseur (ou distillateur)
 Réfrigérateur
 Etuve
 Four pasteur
 Bain-marie
Identifiction bacterienne

Dif de ensemecment :

En microbiologie : l’ensemencement est l’étape de transport entre votre milieu ou bactéries


recherchées (repiquage, bouillon, …) et votre milieu de culture. Comme tout transport, une
concurrence est présente pour déposer votre simple milieu mère.

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c'est déposé dans un milieu de culture stérile des germes prélevés à partir d'1 culture mère
ou pure.

Matériel :

Boite de pétri : , elle est utilisée en microbiologie pour la mise en culture de micro-


organismes

Gélose nutritive : est un milieu d'isolement non-sélectif.

Pipette pasteur ( ou écouvillon stérile)  : sont des tubes fins généralement en verre dont
l'extrémité a été effilée .

Technique ens.
L’ensemencement, c’est-à-dire le transport des bactéries dans un milieu de culture neuf, doit
être fait dans des conditions d’asepsie totale. Les cultures sont faites en milieux liquides ou
en milieux solides.
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La technique d'ensemencement : Stériliser l'instrument servant à prendre la souche
bactérienne d'origine (pipette dans le cas de bouillon, anse dans le cas d'une colonie)
Prélever la souche à ensemencer. Stériliser l'ouverture du flacon de bouillon stérile.

Etude macroscopique :

La forme
L’evation
La taille
Chromogénése
Opacité
Consistance
Surface
Odeur
Examan d’etat frais

defi
C’est l’examen microscopique de bactéries vivantes, en milieu liquide. Il permet
d’apprécier leur mobilité (ou immobilité) et leur morphologie. :
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permet d’examiner la mobilité des bactéries et d’en déceler la forme, bien que ce
renseignement soit plus accessible sur des frottis colorés. Si la bactérie est sporulée,
l’état frais permet également de mettre ce phénomène en évidence. Pour observer la
mobilité, on doit prendre garde à ne pas détruire les flagelles bactériens lors du
prélèvement et de la préparation de la lame.

Techenique :

1. A partir d’une culture en milieu liquide :


Déposer sur une lame propre soit le contenu d’une « anse de platine » soit « une
petite goutte » à l’aide d’une pipette Pasteur. Recouvrir la goutte d’une lamelle.
2. A partir d’une culture sur milieu solide :
Déposer une gouttelette de liquide (milieu liquide ou eau) sur la lame. Prélever une
trace de culture à l’anse de platine et l’émulsionner dans le liquide.
Recouvrir d’une lamelle.

3. Observer rapidement à l’objectif 40 en mettant la lumière au maximum mais en fermant le


diaphragme

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*Déposer une petite goutte d’eau stérile sur la lame.

*Prélever une fraction de colonies sur gélose.

*Recouvrir d’une lamelle en évitant d’enfermer des bulles d’air. Le liquide ne doit pas déborder

*Observer rapidement à l’objectif 40 en mettant la lumière au maximum mais en fermant le


diaphragme

Coloration de gram :

Coloration de Gram :
C’est la coloration de base en pratique bactériologique. Elle permet de reconnaitre les
bactéries présentes et leur caractère « Gram-positif » ou « Gram-négatif » selon qu’elles ont
gardé la coloration violette ou non.
- Préparer et fixer une suspension de la souche bactérienne.
- Recouvrir le frottis d’une solution de violet de gentiane ; laisser agir une minute.
- Entrainer le violet par la solution de lugol. Recouvrir la lame de lugol et laisser agir 1minute
sans laver à l’eau.
- Décolorer aussitôt par l’alcool acétone ; pour cela, verser l’alcool à la surface de la
préparation placée obliquement et observer sa couleur en s’écoulant, il est d’abord violet
puis bleuté et enfin incolore ; arrêter à ce stade.
- laver rapidement à l’eau courante (eau distillée).
- Recouvrir la lame de solution de fuchsine et laisser agir 20 à 30 secondes.
- Laver et sécher entre deux feuilles de papier filtre.
- Observer en immersion. Les Gram+ (Gram positifs) apparaissent en violet-noir, les Gram-
(Gram négatif) apparaissent en rose.

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1- La coloration de Gram

A- Principe

La coloration de Gram est la base de l’identification d’une souche bactérienne. Elle doit être parfaitement
maîtrisée car c’est le point de départ du choix des examens complémentaires à effectuer, des milieux à
ensemencer etc…

La coloration de Gram est une coloration qui teste l’alcoolo résistance d’une souche bactérienne. En effet, les
différences de coloration des bactéries reposent sur des différences de constitution de la paroi :
Au terme du processus de coloration, les bactéries dites « Gram Négatives » apparaissent roses tandis que les
bactéries dites « Gram Positives » sont colorés en bleu foncé/violet

Les bactéries Gram négatives ont une paroi plus fine que celles à Gram positives. De plus, cette paroi est très
riche en lipides (membrane externe de la paroi) dans laquelle l’éthanol est fortement soluble…

Techniques de coloration :
2- Technique générale d’une coloration

Toutes les colorations en bactériologie suivent un même principe qui peut se définir en 3 (éventuellement 4)
étapes qui sont :

- Etape de COLORATION (c’est le colorant qui donnera un résultat positif à la fin)


- Une éventuelle étape de mordançage ou d’intensification de la coloration
- Une étape de décoloration ou EPREUVE (c’est le caractère que l’ont cherche à mettre en évidence)
- Une étape de CONTRE COLORATION qui permet d’observer les germes décolorés précédemment
(donc c’est le colorant donnant un résultat négatif)

Coloration au bleu de méthylene :


Le bleu de méthylène est un colorant souvent utilisé en biologie. Il peut servir
à colorer des bactéries pour les visualiser au microscope. Quand il entre dans le
cytoplasme d'une cellule vivante, le bleu de méthylène est réduit car c'est un
environnement réducteur : les cellules vivantes paraissent incolores
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Introduction

A l’inverse du Gram ou du Ziehl, elle n’apporte aucune information sur la nature des bactéries.
La raison de cette utilisation est que c’est une coloration :
 très simple et rapide à effectuer,
 qu’elle colore toutes les bactéries à l’exception des mycobactéries,
 qu’elle respecte mieux la structure des cellules que le Gram.
On l’utilisera donc lorsqu’on veut seulement et rapidement :
 s’assurer qu’il y a bien des bactéries visibles dans le prélèvement,
 voir leurs formes,
 voir leurs groupements,
 voir leurs rapports avec les cellules (dans/sur des cellules)
 bien voir les cellules présentes.