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Faculté de médecine -Alger

Département de pharmacie
Laboratoire d’Hydrologie Bromatologie

Cours de 3ème année résidanat :

Analyse microbiologique des


aliments

Année 2016

PLAN :
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1 - Introduction

2 - Origine des microorganismes dans les aliments:

1- Contamination initiale de la matière première

A- Contamination des aliments par les microorganismes de l’eau

B- Contamination des aliments par les microorganismes du sol

C- Contamination des aliments par les microorganismes de l’air

D- contamination par les microorganismes présents sur les produits eux-mêmes

 les microorganismes de surface

 les microorganismes du tube digestif des animaux.

2- Contamination des aliments par l’usine et son environnement

A - Contamination par l’eau

B- Contamination par l’air

C- Contamination par les machines et ustensiles

D- Contamination par le personnel

. 3- Additions volontaires 

3 - Les conditions de multiplication des microorganismes dans les aliments :

I) Facteurs intrinsèques :

a) Structures biologiques 

b) Composition chimique de l’aliment 

c ) pH 

d)potentiel d’oxydo-réduction :

e) activité de l’eau
f ) Les substances inhibitrices
II ) Facteurs Extrinsèques liés à l’environnement de l’aliment :

a) Température

b) Humidité relative 
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c) Présence et concentration de gaz 

4- Types des Microorganismes rencontrés dans les aliments

 Les bactéries

 Les moisissures

 Les levures

 Les parasites

 Les virus recherche particulière

5 – l’analyse microbiologique des aliments :

a) But de l’analyse alimentaire


b) Prélèvement :

1. Conditions générales

2. Techniques de prélèvement :

A. Collecte de denrées alimentaires :

B . Prélèvement de denrées alimentaires :

C . Fiche de renseignement ou de demande d’analyses alimentaires 

D . Transport et conservation 

C ) Analyse proprement dite :

1) Préparation des suspensions des échantillons

2 ) Milieux de culture utilisés

3) Recherche et dénombrement des germes :

 Recherche et dénombrement de la flore mésophile aérophile revivifiable


(germes totaux)
 Recherche et dénombrement des coliformes totaux et fécaux
 Recherche et dénombrement des streptocoques fécaux
 Recherche et dénombrement des Clostridium sulfitoreducteurs
 Recherche des staphylocoques
 Recherche des salmonelles
 Recherche et dénombrement de listeria
 Recherche et dénombrement des levures et moisissures

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 D) Interprétation de l’analyse microbiologique de quelques produits alimentaires :

E ) conclusion

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1 - Introduction : (peut être utiliser pour les altération)

 Les microorganismes sont présents dans les écosystèmes naturels


comme l’air, le sol et l’eau. Ils sont également présents sur l’homme lui-
même et sur tous les êtres vivants animaux et végétaux. De ce fait, tous
produit alimentaire transformé ou non peut être contaminé par des
microorganismes.
 Un des effets les mieux connus des microorganismes contaminants de
nos aliments est la dégradation de la qualité. Définie de 2 façons :
La qualité marchande : concerne essentiellement les caractéristiques
organoleptiques et se traduit par un attrait ou une répugnance par les
consommateurs.
La qualité hygiénique : lorsque l’aliment est contaminé par un germe
pathogène peut être à l’origine d’une altération biologique (risque pour la
santé) ; et parfois la cause d’intoxications ou toxi-infections graves.
 Contrairement aux autres agents de contamination chimiques ou
Particulaires, les micro-organismes ont la propriété d’auto amplification.
D’où la maîtrise des risques d’altérations et d’intoxications est nécessaire
tout au long des filières de production, de transformation, de distribution et
sur le produit fini en respectant les règles d’hygiène.

2 - Origine des microorganismes dans les aliments:

les microorganismes d'importance alimentaire sont ceux qui sont:

• soit naturellement présents sur un produit,


• soit apportés par des contaminations,
• soit introduits volontairement
plusieurs origines :

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1- Contamination initiale de la matière première

• La contamination initiale de la matière première alimentaire se fait par:

 L’environnement duquel elle provient, à savoir l’eau, le sol, et l’air.

 Le produit lui-même

A- Contamination des aliments par les microorganismes de l’eau

• L’eau contient en suspension une charge microbienne diverse.

Les germes hydriques sont surtout: (à retirer du cour microbiologie des eaux

 bactéries du sol (Micrococcus, Pseudomonas, ...)

des matières fécales humaine ou animale (Entérobactéries,Entérocoques,

des germes d’altération et parfois pathogènes pour l’homme


(Salmonelles, Shigelles, …).

 moisissures : Aspergillus, Penicillium, Fusarium,

des germes d’altération des aliments.

 levures: rarement rencontrées dans l’eau et interviennent peu dans la


contamination des aliments .

 Les aliments d’origine maritime peuvent être contaminés par les germes de
l’eau de mer (Aeromonas, Bacillus, …).

B- Contamination des aliments par les microorganismes du sol


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• On retrouve les microorganismes de l’eau (interaction eau - sol) .

• Clostridium (anaérobie spécifique des sols)

• Les produits d’origine végétale (fruits, légumes, etc.) sont les plus exposés aux
contaminations par les microorganismes du sol.

• Les contaminants peuvent être véhiculés par l’eau d’irrigation, le vent, les
insectes et les oiseaux.

C- Contamination des aliments par les microorganismes de l’air

• Des bactéries: les Micrococcus et les bactéries sporulantes

• Parfois des moisissures (Aspergillus, Alternaria, Penicillium, …)

• Rarement des levures.

• Contamination des aliments les plus en contact direct avec l’air comme les
fruits, légumes, viandes, etc.

D- contamination par les microorganismes présents sur les produits eux-mêmes

 les microorganismes de surface

 les microorganismes du tube digestif des animaux.

Microorganismes de surface des aliments

Role de barriere contre les germes ex : peau des animaux ,enveloppes des
végétaux , coquilles d’œufs.

Lors des dégradations chimiques, enzymatiques ou mécaniques : les aliments


peuvent être contaminés par les microorganismes se trouvant sur leur surface.

• Ce sont donc:

des bactéries (Micrococcus, Enterobacter, …),

des moisissures (Aspergillus, Penicillium, Fusarium,…)

des levures (Saccharomyces, …)

exemple :

Le lait peut être souillé par les microorganismes se trouvant sur les

mamelles.

les fruits et légumes endommagés suite aux opérations de cueillette sont

contaminés par les germes se trouvant naturellement sur leur surface.


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Microorganismes du tube digestif des animaux

• des bactéries telles que les Entérobactéries (Salmonella, Escherichia, Shigella, …),


les Entérocoques (Streptococcus, …) et divers autres (Staphylococcus,
Lactobacillus, …).

• Les moisissures sont peu représentées

• parmi les levures, le genre Candida est le plus fréquent

2- Contamination des aliments par l’usine et son environnement

A- Contamination par l’eau

• Ingrédient nécessaire dans la préparation des aliments, Lavage, fluide de transport,

refroidissement, nettoyage et désinfection, etc.

L’eau de refroidissement, par exemple, est le responsable majeure de la

contamination des boites de conserves stérilisées.

B- Contamination par l’air

• source importante de contamination des aliments, La filtration de l’air et le


travail sous atmosphère contrôlé est nécessaire .EX de germe comme avant .

C- Contamination par les machines et ustensiles

• Les germes véhiculés par les équipements et les ustensiles sont généralement
les contaminants divers des aliments.

• les plans de nettoyage et désinfection doivent prévoir aussi le démontage des

machines et le nettoyage des pièces avec une fréquence suffisante.

D- Contamination par le personnel

• le personnel peut être une source importante de contaminants fécaux


(Escherichia,  Staphylococcus, …).ou ceux qui existent naturellement sur le corps
humain. Respecter les bonnes pratiques d’hygiène corporelle

. 3- Additions volontaires  : Certains aliments, comme les yaourts sont ensemencés


par des ferments, le plus souvent des bactéries lactiques.

3 - Les conditions de multiplication des microorganismes dans les aliments :

• Un aliment constitue un "milieu" qui est un support de cellules microbiennes.

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• Le développement microbien est affecté par des facteurs :

• Intrinseques liés au milieu :

 La structure biologique ainsi que la composition générale du milieu qui en


relation directe avec certains paramètres: le pH, le potentiel
d’oxydoréduction, l’activité de l’eau

• Extrinseques liés à l’environement de l’aliment :

 L’environnement du produit : l’oxygène de l’air les teneurs en tel ou tel gaz

(C02, N2, ...), la température, l'humidité relative ou la présence de certains

inhibiteurs d'origine exogène.

II) Facteurs intrinsèques :

a ) Structures biologiques :

La présence d’enveloppes, coques, peaux etc. confère à certains aliments une


excellente protection contre la prolifération microbienne (testas des graines,
enveloppes des fruits, coquilles des noix, des oeufs, peau des animaux, etc.)

L’altération de ces protections naturelles se traduit souvent par une contamination /


prolifération. Les emballages ont pour but principal de protéger l’aliment stabilisé ou
non de la contamination .Il faut signaler qu’il existe des emballages comestibles

• Composition chimique de l’aliment :

• Les microorganismes exigent pour leur développement:

l'eau,

une source d'énergie,

l'azote,

Des sels minéraux

de l'oxygène

et/ou des facteurs de croissance

on observe un effet sélectif sur la flore microbienne du a la diversité de la


composition des produits alimentaires.

• Aliments riches en hydrates de carbone (pain, confiture, fruits…)

→ favorables aux champignons (peu d’odeurs en général)

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• Aliments riches en protéines et/ou graisses (viande, beurre…)

→ favorables aux bactéries

• Ainsi, la composition d'un produit détermine son pH et dans une certaine

mesure son potentiel d'oxydoréduction.

Exemple:

la teneur en sucres libres d'un jus de fruit permet la croissance exubérante

des levures,

c ) pH :

• le pH joue un rôle déterminant dans la spécifité  de la flore microbienne


de chaque produit. Les microorganismes peuvent se développer sur une large
gamme de pH de 2 à 11. En fonction de leur pH optimale de croissance, on classe
les microorganismes en trois groupes :

Par rapport au pH de l’aliment , il est habituel de considérer deux groupes


d’aliments : ceux dont le pH est inférieur à 4,5 et ceux dont le pH est supérieur à
4,5.
• Dans la première catégorie : les microorganismes dangereux (pathogenes) ne
se multiplient généralement pas et Clostridium botulinum n’élabore pas sa
toxine.
 L’acidophilie est une propriété rencontrée surtout chez les levures, les
moisissures et chez certaines bactéries qui sont classées en fonction de la
nature de l’acide qu’elles produisent (bactéries acétiques, lactiques,
propioniques, ...)

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Dans les aliments dont le pH est compris entre 4,5 et 9,5, de nombreuses altérations
sont susceptibles de se produire et la plupart des bactéries pathogènes cultivent
dans ces conditions.
 Donc la stabilisation des produits acides ne nécessite qu’un faible
traitement
Thermique, contrairement aux produits alimentaires faiblement acides qui
nécessitent un traitement de stérilisation pour les débarrasser des Germes
pathogènes et d’altération, y compris les spores bactériennes.
 Le pH des aliments dépend des quantités de substances acides ou
basiques
présentes, mais aussi de l’effet tampon du produit, lequel est surtout lié à la
teneur en protéines.
• Les produits d’origine végétale sont souvent acides (pH de 2 à 5) favorable au
levures et moisissures .
• Les produits d’origine animale ont généralement un pH proche de la
neutralité (6 à 7). Favorable au bactéries pathogènes (salmonelles)

d ) potentiel d’oxydo-réduction :
• Le potentiel d’oxydoréduction (Eh exprimé en volt) mesure la facilité
avec laquelle un milieu perd ou gagne des électrons.
Un milieu Oxydant capte des électrons Eh > 0
Réducteur perd des électrons Eh < 0
• Les produits alimentaires sont généralement des milieux réducteurs:
(présence des substances fortement hydrogénées, des radicaux –SH, des
sucres réducteurs, ou d’autres composés tels que de l’acide ascorbique
(vit C)ou des tocophérols (vit E).
• L’effet oxydant d’un aliment est dû essentiellement à la présence de
 l’oxygène atmosphérique, soit en surface (viandes) ; La viande en morceau
possède un E voisin de - 200 mV, la viande hachée de + 200 mV. Après
l’abattage la viande a un E de l’ordre de + 250 mV qui après 30 heures devient
égal à -150 mV.

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ou dans la masse (végétaux : grâce aux parenchymes lacuneux et aux stomates).
Les jus de plantes ont des valeurs de E comprises entre +300 et +400 mV tres
oxydé
 E Positif = produit oxydé . Les fromages ont un E compris entre - 20 et - 200
mV

Les Clostridium ne se développent qu’en dessous de -36 mV.


• En fonction de leurs exigences en oxygène (mode de respiration), on classe les
microorganismes en quatre catégories :
 Les aérobies stricts  (Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus) :
les microorganismes qui ne peuvent se développer qu’en présence de
l’oxygène.
 Les aérobies facultatifs (Entérobactéries, Staphylococcus) :
les microorganismes qui peuvent se développer en présence et en absence
d’oxygène.
 Les anaérobies stricts (Clostridium, Bactéroïdes, ...) :
les microorganismes qui ne peuvent pas se développer en présence de
l’oxygène.
 Les micro-aérophiles (Lactobacillus, Streptococcus, ...) :
les microorganismes qui ne peuvent se développer qu’en présence de
quantité faible d’oxygène.
E ) activité de l’eau :
 indique la disponibilité de l'eau d'un milieu pour des réactions chimiques,
biochimiques, . correspond au rapport de pression partielle de l’eau dans
l’aliment à celle de l’eau pure à la même température : aeau = Peau aliment / Peau pure
L’aeau varie entre 0 et 1.

Pour aw < 0,65 aucun microorganisme ne peut cultiver (ils peuvent survivre).

Pour aw <0,85 aucun microorganisme pathogène ne peut cultiver exception faite de


certaines moisissures excrétrices de mycotoxines.

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• Les bactéries ne peuvent se développer sur les produits alimentaires ayant
une aw inférieure à 0,90.
Exemple :

F ) Les substances inhibitrices


• Les inhibiteurs de la croissance des microorganismes sont des molécules

antimicrobiennes qui:

 se trouvent naturellement dans certains aliments (végétaux, animaux),

 produites par certains microorganismes

 ajoutées volontairement par l’homme pour la conservation des aliments les


additifs.

• Certaines substances antimicrobienne ont une actions spécifiques sur certains

microorganismes (bactéricides, fongicides), alors que d’autres ont un spectre


d’action beaucoup plus large.

• Le lysozyme (se trouve naturellement dans les œufs et le lait) activité


antibactérienne.

• le gossypol (antioxydant présent dans les graines de coton) et les huiles


essentielles activité antibactérienne et antifongique

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• Parmi les produits de la fermentation microbienne, on trouve l’acide lactique
et l’acide acétique qui ont une activité antibactérienne assez large. Ces
substances sont aussi produites par synthèse chimique et sont utilisées comme
additifs. La gamme des substances utilisées comme additifs est très variée, de
compositions chimiques et de modes d’action hétérogènes:

Exemple: Les nitrates et nitrites de sodium et de potassium (NaNO3, KNO3,


NaNO2,KNO2) qui sont connues pour leur action inhibitrice sur le
Clostridium 

II ) Facteurs Extrinseques liés à l’environement de l’aliment :

A ) Température :

• La température est l’un des facteurs les plus importants qui agissent sur la

croissance des microorganismes.

• la température augmente la vitesse de l’ensemble des réactions ; on observe


donc une augmentation de la vitesse de croissance . Cependant, quand la
température augmente, la dénaturation des protéines bactériennes (enzymes
en particulier) augmente. Quand toutes les proteines à activité métabolique
sont dénaturées, et ses enzymes sont inactivées le germe a une vitesse de
croissance nulle .(mort de la bacterie)

• Chaque microorganisme a un domaine de température optimale favorisant


son développement. Des températures situées en dehors de ce domaine
gênent sa croissance.

Les microorganismes sont classés en trois principales catégories :

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o Thermophiles : microorganismes capables de se multiplier en dessus de
45°C et parfois pour certains jusqu’à 80°C. Certains thermophiles
obligatoires ne peuvent se multiplier qu’en dessus de 37°C (Lactobacillus,
Propionibacterium shermanii, Clostridium thermosaccharolyticum, Bacillus
stearothermophilus).
Il ne faut pas confondre thermophilie et thermorésistance qui est l’aptitude à
résister à un traitement thermique donné.

o Mésophiles : qui comprennent la majorité des microorganismes se


développent entre 15 et 45°C. La plupart des germes pathogènes font
partie de cette catégorie.

o Cryophiles : ou psychrophiles : température optimale voisine de 15°C. Les


cryophiles obligatoires ne se développent pas en dessus de 20°C. De
nombreuses bactéries saprophytes appartiennent à ce groupe
(Achromobacter, Flavobacterium, Pseudomonas) ainsi que des moisissures
(Cladosporium, Sporotrichum, etc.). Ces germes sont aussi qualifiés de
psychrophiles ou psychrotrophes.
Parmi les germes dangereux en microbiologie alimentaire capables de cultiver
entre 0 et 10°C il faut citer : Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum,
Bacillus cereus, Yersinia enterocolytica, Vibrio parahaemolyticus, Aeromonas
hydrophila, Plesiomonas shigelloïdes et même E. coli entéropathogène.

La température la plus basse à laquelle un microorganisme a pu être observé en


croissance est de - 24°C et la plus haute de 90°C.
• Les spores bactériennes et certaines moisissures sont les plus résistantes
(supportent des traitements de plusieurs heures à des températures supérieures à
+ 100°c)
• La thermoresistance ≠ thermophilie:
moisissures mésophiles : (Aspergillus...)
bactéries sporulées mésophiles (Bacillus cereus, Bacillus subtilis...).
.

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B ) Humidité relative :
• Elle est directement liée à l’activité de l’eau aw
HR% = aw . 100 Si aw = 0.95 alors HR = 95%.
• Une atmosphère ambiante très humide entraine une prolifération de
microorganisme à la surface des aliments.
• Par contre un endroit sec sèche la surface du produit alimentaire.

• Présence et concentration de gaz :


- Une augmentation de la teneur en CO2 et une diminution de la teneur en
oxygène permettent une meilleure conservation des fruits et légumes en
retardant le développement de certains microorganismes et plus
particulièrement des moisissures.
- Une atmosphère d’azote ou un conditionnement sous vide permet d’éviter des
contaminations par des microorganismes aérobies.

Il est utile de considérer l’effet combiné de l’ensemble des paramètres sur le


développement des microorganismes car dans un milieu complexe comme les aliments, la
croissance des microorganismes n’est pas soumise à un seul facteur mais plutôt à l’ensemble
de ces paramètres endogènes (pH, aw, présence des inhibiteurs, facteurs de croissance, etc.)
et exogènes (température, humidité, etc.)

4- Types des Microorganismes dans les aliments cités des plus rencontrés et
recherchés dans les denrées alimentaires au moins (rencontrés et recherchés)

Les bactéries
Les moisissures
Les levures
Les parasites
Les virus recherche particulière

 Les bactéries

3 groupes de germes

1_ Groupe de germes indicateurs de l’hygiène général  : Microflore aérobie mésophile totale  :


température optimale de croissance ( 25 et 40°C)

• ils peuvent donner naissance à des colonies visibles après trois jours à 30°C

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sur gélose pour dénombrement.

• une flore mésophile nombreuse indique une mauvaise hygiène et le début du


processus d’altération.

2_ Microflore de contamination fécale  :

• Ce sont des microorganismes vivants normalement dans l’intestin de

l’homme et des animaux leur présence dans un aliment

• traduit une contamination fécale et un risque de présence de germes

pathogènes.

• ce sont les coliformes, E coli et les entérobactéries dans leur ensemble,

mais aussi les streptocoques fécaux et les clostridium sulfito réducteurs.

• Parmi les coliformes totaux il existe un sous groupe de bactéries, les

« coliformes fécaux » dont E coli, signe de présence potentielle de pathogènes

entériques dans l’aliment (Salmonelle, Calcivirus)

3_ La flore pathogène  :

C’est l’ensemble de microorganismes pathogènes pouvant être

introduits dans l’alimentation causant des toxi-infections alimentaires Salmonella ,Listeria


monocytogenes

principales bactéries pathogènes rencontrées dans les aliments : (il faut apprendre les
noms de tous les pathogènes écrits correctement origine pas très important)

Souche Origine Caractéristique

Salmonella Viande et lait cru, œufs Morbidité faible

Listeria monocytogenes Viandes, produits laitiers, Mortalité importante (22%), se


légumes, fruits de mer multiplie à 4°C

Campylobacter jejuni Volailles, œufs, viande, lait cru Difficilement cultivable par les
techniques classiques

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Bacillus cereus Produits secs, légumes Spores thermorésistantes, toxine
thermostable.

Staphylococcus aureus Produits réfrigérés, produits Toxine thermorésistant très active


laitiers. (1ng/g)

Souche Origine Caractéristique

Clostridium botulinum. Légumes, viandes Spores thermorésistantes,


toxine particulièrement
active.

Clostridium perfringens Viandes, volailles, produits Toxine thermolabile


secs

Eshcerichia coli Associé aux bovins : viande, Responsable du syndrome


lait cru. urémique hémolytique
Entéro hémorragique
mortel chez l’enfant.

Yersinia enterolytica Viande crue, volailles, Psychrotrophes


légumes.

Quelques caracteres à connaitre des germes rencontres dans les denrées


alimentaires : ( à connaitre important lors de l’analyse )

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 Les moisissures: Les moisissures sont présentes sur la plupart des autres produits
alimentaires :
• appartiennent aux Fungi imperfecti, aux Zygomycotines et aux Ascomycotines.
• Les genres les plus fréquents sont Botrytis, Aspergillus ++, Penicillium ++.

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• On les rencontre principalement dans : (ou trouvent les conditions favorables)
les céréales et leurs dérives,
les produits laitiers,
les viandes et charcuteries,
les fruits et légumes,
les fruits secs, les confitures et les boissons.(contact avec ces produits dans la
nature)
• Toxinogéne ( penicillium +++) ou bien par les aflatoxines (revoir toxi infections)
.
 Les levures les Levures sont : des ascomycètes , des Basidiomycètes ,champignons
imparfaits.
• Leur présence dans les aliments est relativement liée à la nature du produit
rencontrés surtout dans les produits acides, sucrés( ‫ ) خميرالخبز‬salés ou riches en
matières grasses .
• La plus part des levures ne sont pas pathogènes . ex : saccharomycetaceae : Fruits,
légumes, bissons, œufs.

 Les virus: présents aussi sur de nombreux produits alimentaires mais pas tres
recherchés
• On distingue 2 types : les virus spécifiques des bactéries (Bactériophages) et les
virus infectieux spécifiques des cellules animales.
• On peut mentionner le virus de la polyomyelite, le virus de l'hépatite, les
Adénovirus, les Echovirus…

 Les parasites  : recherchés en cas d’épidémie ou suspicion de parasitose alimentaire

Les parasites d’origine alimentaire : protozoaires, vers, arthropodes


Plathelminthes : Taenia saginata, Taenia solium, Fasciola hepatica
Nématodes : Ascaris lumbricoides, Trichinella spiralis
Protozoaires : Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii
Les aliments concernés : Téniasis (viande de bœuf mal cuite), Cysticercose (Ténia, aliments
souillés par les œufs du parasite), Distomatose à petite douve (aliments crus non lavés),
Amibiase (fruits et
L'oxyuriose (aliment cru contaminé), Toxoplasmose (viande saignante)

5 – l’analyse microbiologique des aliments :

A° But de l’analyse des produits alimentaires

Vérifier le respect de la qualité sanitaire et commerciale :

• Absence de germes pathogènes et de leurs toxines

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• Limitation de la flore globale et des flores indicatrices (en cas de produits fermentés,
la flore globale n'est pas considérée).

• Les résultats sont comparés à des normes établis par AFNOR, la CEE, l’OMS, ISO ;
Les normes varient en fonction des produits et des risques encourus ; En Algérie :
IPA , CACQE et les autres laboratoires de contrôle suivent la norme du journal
officiel algérien : N°35 arrêté interministériel du 23 juillet 1994 relatif aux
spécifications microbiologiques de certaines denrées alimentaires

.B ° prélèvement :

1 Conditions générales

Les conditions essentielles à respecter pour le prélèvement sont d’abord le respect des
règles d’asepsie et la non modification de la flore présente dans le produit. Les
manipulations effectuées au cours du prélèvement ne doivent en aucun cas être à
l’origine d’une contamination.

Dans la mesure du possible, les échantillons du produit à analyser doivent être


amenés au laboratoire dans leur conditionnement d’origine ce qui évite certaines
contaminations.

Si le produit se présente sous forme de grands volumes (réservoirs à lait...) s’assurer


de la bonne homogénéité de la répartition des micro-organismes en prélevant
stérilement une partie représentative du produit.

Le prélèvement d’un produit non emballé doit être réalisé dans la zone de stérilité
d’un bec bunsen ou d’un système équivalent.

Donc assurer : l’asepsie rigoureuse , pas de contamination , l’homogénéité , la


représentativité , l’intégrité du prélèvement depuis sa réalisation jusqu’à l’analyse .

2 . Techniques de prélèvement :

A. Collecte de denrées alimentaires  :

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Lorsque les denrées (solides ou liquides) sont conditionnées sous vide,
emballées ou en barquette de petite portion, le prélèvement est assimilé à une
simple collecte (5 unités généralement) . Pour cela, il convient uniquement
d'identifier et de placer le prélèvement dans la glacière de transfert avec blocs
réfrigérants.

- dénomination de la denrée,

- sa composition,

- son état (cru, cuit, fumé…),

- son type d'emballage,

- sa température au moment de la collecte si possible, sinon la température


environnante,

- ses dates de fabrication, cuisson, emballage, tranchage, DLC…

- les problèmes éventuels rencontrés (emballage percé, quantité insuffisante,

températures de conservation trop élevées…).

B . Prélèvement de denrées alimentaires :

Se laver ou se désinfecter les mains.

- Identifier l'échantillon sur le pot ou le sachet (dénomination, client, N°


identification...).

- Prendre la température de l’aliment avec un thermomètre désinfecté au


préalable.

- Prélever avec des couverts propres et stériles ou désinfectés, à un endroit


différent de la piqûre du thermomètre, une quantité suffisante pour la prise
d’essai destinée aux analyses (environ 100g) et la placer dans un sachet ou un
pot stérile hermétique avec annotations concernant le produit (dénomination,
référence, lot…) à cette étape on peut distinguer deux cas de figure :

Prélèvement de produits liquides :

La technique varie avec le produit, le volume et la forme du contenant. Il faut


néanmoins toujours s’assurer de la parfaite homogénéisation du liquide
(agitateurs) avant de prélever à la pipette le volume nécessaire à l’analyse.

Prélèvement de produits solides :

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Selon le produit, le prélèvement sera effectué au scalpel, à la sonde (fromages
et produits mous) ou à la pipette harpon.

La surface est souvent éliminée avant de procéder au prélèvement.

Si le produit est hétérogène (plats cuisinés et conserves) il faut s’assurer de la


bonne représentativité du prélèvement.

- Éviter tout contact avec les mains.

- Placer l'échantillon dans la glacière de transfert avec blocs réfrigérants.

- Renseigner la Fiche de demande d’analyse alimentaire.

NB :

Le prélèvement doit être représentatif de la denrée à analyser (ex. : un


échantillon de couscous doit contenir aussi bien des légumes que de la
semoule et de la viande).

La prise d’essai destinée à la préparation de la suspension mère et de ses


dilutions doit correspondre aux parties superficielles et profondes notamment
pour les produits en tranche, hachés, divisés et les plats cuisinés.

Il est parfois nécessaire de réaliser des prélèvements à divers niveaux de


l’aliment (surface, profondeur d’un aliment solide) ou après broyage et
homogénéisation.

Pour les produits liquides la prise d’essai est effectuée sur le produit “homogénéisé”
ou sur les parties superficielles et profondes.

Nombre des prélèvements :

La taille de l’échantillon d’un produit de même nature réparti en portions


unitaires doit être au moins de 5 unités du même lot.

Pour les prélèvements à partir de masse ou de volume importants d’un


produit alimentaire : prélever au moins 5 fois :

100 g de différentes parties si l’aliment est solide (500g).

100 ml après avoir homogénéisé le contenu du réservoir (500ml).

C . Fiche de renseignement ou de demande d’analyses alimentaires  :

Pour chaque prélèvement pour analyse alimentaire, un document doit être


renseigné avec les informations suivantes :

- dénomination de la denrée,

23
- sa composition,

- son état (cru, cuit, fumé…),

- son type d'emballage,

- sa température au moment de la collecte si possible, sinon la température


environnante,

- ses dates de fabrication, cuisson, emballage, tranchage, DLC…

- les problèmes éventuels rencontrés (emballage percé, quantité insuffisante,


températures de conservation trop élevées…).

D . Transport et conservation :

1. Transport

Arrivé au véhicule, transférer le ou les échantillon(s) dans la glacière de


transport.

Les échantillons chauds et froids doivent être dans des compartiments de la


glacière différents.

Si d’autres denrées d’un second client doivent être analysées, utiliser la


glacière de transfert vide. A l’arrivée chez chaque client, la glacière de
transport doit être obligatoirement vide (hormis le matériel nécessaire au
prélèvement).

Le ou les prélèvement(s) ainsi réalisé(s) doi(ven)t être acheminé(s) au


laboratoire dans les plus brefs délais.

Durant le transport, l’(es) échantillon(s) est (sont) conservé(s) dans une


enceinte réfrigérée maintenue entre 1°C à 8°C. Cette température est mesurée
et inscrite, à l’arrivée au laboratoire, sur la fiche de demande d'analyse.

NB : les échantillons prélevés chauds doivent être ramenés à température de


transport le plus rapidement possible.

2. Conservation :

Arrivés au laboratoire et dans l’attente d’analyses, les échantillons


alimentaires sont conservés au réfrigérateur selon les indications précisées
dans chaque méthode d’analyse.

24
Du début à la fin de l’analyse, les échantillons sont remis en enceinte
réfrigérée (avec pain de glace) puis de nouveau stockés au réfrigérateur et
ainsi conservés jusqu’au rendu des résultats au client.

NB :

 Pour un produit congelé s’assurer qu’il n’y ait pas de décongélation pendant
le transport, ce produit peur être gardé pendant 1 mois avant d’être analysé.

La congélation d’un produit provoque une diminution plus ou moins


importante du nombre de germes qu’il contient.

Il faut veiller à ce que la température du produit prélevé soit au moins égale à


-18°C, Transporter le produit à cette température et décongeler à l’air ambiant
à température voisine de 20°C pendant un temps inférieur à 3 heures, temps
suffisant pour atteindre une texture qui permet le prélèvement.

C ) Analyse proprement dite :

1 Préparation des suspensions des échantillons

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28
2 Milieux de culture utilisés

Milieu de culture Germes recherchés

Désoxycholate  Pour la recherche et le dénombrement


des coliformes totaux et fécaux dans les
divers produits alimentaires (à
l’exception des produits laitiers )
VRBL  Pour la recherche et le dénombrement
des coliformes totaux et fécaux dans les
produits laitiers
PCA  Milieu peptone-extrait de levure
Pour la recherche et le dénombrement
des germes totaux GAMT

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Viande foie (VF) Pour la recherche et le dénombrement
des anaérobies sulfitoreducteurs (ASR)
Giolitti cantoni  Pour la recherche et le dénombrement
du Staphylocoque sp
Sabouraud  Un milieu d’isolement des levures et de
moisissures

3 Recherche et dénombrement des germes :

Principales techniques de numération

• Méthodes générales directes :


 Comptage direct
 Détermination du poids sec ou dosage des protéines microbiennes ou dosage
des acides nucléiques
 Néphélométrie
 Système luciférine /luciférase
• Méthodes générales indirectes :
 Dosage d’un métabolite primaire synthétisé ou de la quantité d’une substance
consommée
 Réduction d’un colorant
 Dilution et culture :
1. Numération à partir d’un milieu solide :
Technique de numération dans la masse de la gélose
Technique de numération en surface de la gélose
2. Numération en milieu liquide :
Fractionnement de grands volumes liquides
Méthode de Mac Grady (nombre le plus probable )
Numération par filtration
Les numérations à partir d’un milieu solide sont les plus utilisées et choisies par la norme

1 Technique de numération dans la masse de la gélose (en profondeur) 

Principe 

Les milieux gélosés sont liquéfiés au bain-marie bouillant, puis maintenus en surfusion à 45
±1°C. 1 ml de l’inoculum ; dans lequel on veut connaître le nombre de micro-organismes ; est
réparti en gouttes sur le fond d’une boîte de pétri posée bien à plat dans la zone de
protection du bec Bunsen.

On procède de la même façon pour chaque dilution(10ˉ³,10ˉ²,10ˉ ¹) en réalisant, dans la


mesure du possible, 2 essais par dilution. Le milieu gélosé en surfusion dans lequel

30
l’inoculum sera incorporé doit être à 45°C±1°C. Si sa température est supérieure à cette
valeur il se produira une destruction partielle de la flore ; au contraire, si sa température
est inférieure à 45°C le milieu se solidifiera irrégulièrement et ne se mélangera pas de
façon homogène avec l’inoculum.

Avantages
Dispersion homogène dans la gélose et donc une distribution homogène des
colonies.
Inconvénients
• Les bactéries aérobies strictes se développent mal dans la masse de la gélose, tandis
que les bactéries anaérobies strictes ne s’y développeront que dans des conditions
d’incubation appropriées (jarre anaérobie par exemple).
• Il peut aussi exister certains antagonismes bactériens (bactériocines etc...).
• Si la température du milieu gélosé mélangé à l’inoculum est supérieure à 45 - 47°C,
il peut y avoir inactivation de microorganismes.
2 Technique de numération en surface de la gélose (Méthode par étalement)

Principe

100 à 500 microlitres du milieu à analyser sont déposés à la surface de la gélose et


immédiatement répartis de façon uniforme à la surface du milieu au moyen d’un
ensemenceur stérile du type pipette râteau.

La pipette râteau est “stérilisée” entre deux étalements par immersion dans de l’éthanol

Avantages

• Cette méthode donne de bons résultats avec les germes aérobies et aéro-anaérobies.

Inconvénients

• L’opération d’étalement au râteau reste à maîtriser (adsorption de germes sur le


râteau) et le volume d’inoculum déposé ne peut en aucun cas excéder 0,5 ml avec des
boîtes de 9 cm de diamètre (des volumes supérieurs ne sont pas absorbés par le gel
d’agar et l’eau qui reste en surface rend impossible toute numération en raison de la
formation d’une nappe).

1- DENOMBREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES


A 30°C

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Mode opératoire :

 Préparation de la suspension mère et des dilutions successives dans le milieu


d’enrichissement TSE (comme décrit en dessus)
 Utilisation du milieu de culture PCA : Plate Count Agar (PCA) * Milieu peptone-
extrait de levure
 Les étapes de la mise en gélose sont mises en titre dans chaque figures et expliquer
dans ce cadran (apprendre seulement les titres)

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2-Recherche et dénombrement des coliformes totaux et fécaux

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Mode opératoire : (retenir les titres)

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3-Recherche et dénombrement des streptocoques du groupe D ou streptocoques
fécaux : cette recherche n’est pas règlementée ni par la loi algérienne ni par la loi ISO

MAIS voici la technique si analyse sur l’aliment est faite

Test de présomption :

Utiliser 3 tubes par dilution contenant le milieu sélectif de Rothe S/C à partir des
dilutions décimales, porter aseptiquement 1 ml dans chacun des 3 tubes
correspondant à chaque dilution.

- mélanger bien l’inoculum dans le milieu.

- incuber à 37°C pendant 24h.

- lecture : sont positifs les tubes présentant un trouble microbien.

Aucun dénombrement ne se fait à ce stade, les tubes positifs feront l’objet d’un
repiquage.

Test de confirmation :

Chaque tube Roth positif fera l’objet d’un repiquage à l’aide d’une anse bouclée sur
tube contenant le milieu d’Evalytski.

- Bien mélanger l’inoculum.

- Incuber à 37°C pendant 24h.

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- Lecture : sont positifs, les tubes d’Eva présentant à la fois un trouble microbien et
une pastille blanchâtre ou violette au fond du tube.

- le nombre de streptocoques fécaux est exprimé par le NPP selon la table de Mac
Grady.

- Pour avoir quelques indications sur les espèces du streptocoque du groupe D, on


isole les tubes d’Evalitsky (+) sur milieu de Barnes et incubation à 37°C pendant 24h
on note alors l’aspect des colonies :

Colonies à centre rouge avec liseré blanc : Streptococcus faecalis.

Grosses colonies blanches ou faiblement rosées : Streptococcus durans.

Petites colonies blanches ou roses : Streptococcus bovis.

Colonies de couleur rouge foncée : Streptococcus lactiques..

4. RECHERCHE ET DÉNOMBREMENT DES ANAÉROBIES SULFITO


RÉDUCTEURS A 46°C

Methode de routine adaptée à pasteur

NFV08-061/1996

Norme marocaine

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5. Recherche et dénombrement des Staphylococcus aureus :

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FIGURE 4

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6 ) recherche des salmonelles :

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Lecture

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7 ) Recherche de Listeria monocytogenes

Milieux utilisés :
• Bouillon Fraser :  
Milieu pour l’enrichissement sélectif en deux étapes pour Listeria.
 
• Gélose Palcam :  
Milieu sélectif utilisé pour la différenciation et l’isolement de Listeria monocytogenes.
Le supplément Palcam contient du Sulfate de polymyxine B de la Ceftazidine et de
l’Acriflavine.
• Comme pour la recherche des salmonelles, la recherche de Listeria se fait en
plusieurs étapes :
• 1ère étape  d’enrichissement primaire : 25 gr ou 25 ml du produit à analyser est dilué
dans 225 ml de bouillon Fraser et incubé à 30°C pendant 18 à 24h.
• 2ème étape d’enrichissement  secondaire et un 1er isolement sur Palcam:
à partir du pré-enrichissement :
• Introduire 0,1 ml du bouillon Frazer dans un tube bouillon Frazer, incuber 24h à
37°C.
• Faire un isolement à partir du bouillon pré-enrichi sur gélose palcam1
• incuber 24-48h à 37°C.
• 3ème étape : second isolement sur gélose palcam 2 et lecture de la boite palcam1 : 
• À partir de l’enrichissement secondaire ,effectuer un isolement sur palcam 2.
• Lecture du palcam1 : les colonies caractéristiques de Listeria monocytogenes sont de
couleur grise-vertes avec halo brun-noir.

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8 ) Recherche et dénombrement des levures et moisissures

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D) Interprétation de l’analyse microbiologique de quelques produits alimentaires :

Selon l’Arrêté du 8 Rabei Ethani 1415 correspondant au 14 septenbre 1994 relatif à


l’interprétation des résultats d’analyse microbiologiques des denrées alimentaires.

On définit les paramètres :

n : nombre d'unité d'échantillonnage du produit examiné ;

m : nombre de germes présents dans un gramme ou un millilitre de produit analysé

(25 grammes pour les salmonelles); c'est le seuil en dessous duquel le produit est
considéré comme étant de qualité satisfaisante;

M : nombre de germes présents dans un gramme ou un millilitre de produit analysé

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(25 grammes pour les salmonelles) il correspond a la valeur au-dessus de laquelle la
qualité du produit est considéré comme inacceptable;

c : nombre maximale d'unités d'échantillonnage de produit analysé qui peut dépasser

"m" tout en étant inferieur a "M" sans que le lot ne soit rejeté.

En matière d'échantillonnage et d'interprétation des résultats d'analyse, on distingue :

1. Plan à trois classes :

Ce plan est ainsi désigné parce que les résultats des examens interprétés sur cette base,
permettent de fixer trois classes de contamination, à savoir :

celle inferieure ou égale au critère "m";

celle comprise entre le critère "m" et le seuil "M";

celle supérieure au seuil "M".

Les critères qualificatifs "m" et "M" expriment le nombre de germes présents dans un
gramme (g) ou un millilitre (ml) d'aliment et dans 25 grammes d'aliment pour les
Salmonella.

m : le seuil au-dessous duquel le produit est considéré comme étant de qualité


satisfaisante.

Tous les résultats égaux ou inferieurs à ce critère sont considérés comme satisfaisants;

M : seuil limite d'acceptabilité, au-delà duquel les résultats ne sont plus considérés
comme satisfaisants, sans pour autant que le produit soit considéré comme toxique.

Application pratique : la qualité microbiologique du lot est considérée:

Comme satisfaisante lorsque les résultats obtenus sont inferieurs ou égaux a "m";

Comme acceptable lorsque les résultats obtenus sont compris entre "m'"et "M".

Comme non satisfaisante dans tous les cas ou les résultats obtenus sont supérieurs à
M.

Toutefois, le produit doit être considéré comme toxique ou corrompu lorsque la


contamination atteint une valeur microbienne limite "S" qui est fixée dans le cas général à : S
= m.l03

Dans le cas des Staphylococcus aureus, la valeur "S" ne doit jamais excéder 5.104
germes par gramme de produit.

2. Plan à deux classes :

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Ce plan est ainsi désigné car les résultats des examens interprétés sur cette base
permettent de déterminer deux classes de contamination.

Ce type de plan qui n'accepte aucune tolérance, même de caractère analytique,


correspondant souvent aux expressions :

« Absence dans »:le résultat est considéré comme satisfaisant;

« Présence dans »:le résultat est considéré comme non satisfaisant; dans ce cas, le
produit est déclaré impropre à la consommation.

Le plan a deux classes repartit les unités d'échantillon en deux catégories :

Catégorie satisfaisante si le résultat d'analyse est inferieur à "m"; le produit est propre
à la consommation;

Catégorie non satisfaisante lorsque le résultat d'analyse est supérieur a "m"; le produit
est déclaré impropre a la consommation.

Remarque : Ce plan est applicable aux contaminations par les salmonella en particulier.

Le tableau N°1 énumère les qualités bactériologiques requises pour certaines denrées
alimentaires ; selon l’arrêté du 14 Safar correspondant au 23 Juillet 1994 relatif aux
spécifications microbiologiques de certaines denrées alimantaires.

Tableau N°1 : Qualité requise pour certaines denrées alimentaires :

Produits m M
n C
Lait
Germes aérobies à 105 2.106
30° 1 - Abse Absen
Germes nce ce
pathogènes, 1 - Abse Absenc
Antibiotiques nce e
1 -
Fromages frais
Coliformes 10 102
Coliformes fécaux 5 2 10 30
Staphylococcus 10 2.102
aureus 5 2 absen Absenc
Salmonella ce e
5 2

5 0
Glaces et crèmes
glacées

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Germes aérobies à 2.104 3.10
5
30° C 5 2 10
Coliformes fécaux 10 30
Staphylococcus 5 2 absenc 102
aureus e Absen
Salmonella 5 2 ce

10 0

Viandes hachées
Germes aérobies à 5.105 5. 106
30° C 5 2 102 103
Coliformes fécaux 102 103
Staphylococcus 5 2 30 102
aureus absenc Absen
ASR à 46°C 5 2 e ce
Salmonella
5 2

5 0
Beurre pasteurisée
Germes aérobies à 102 104
30° C 5 2 0 10
Coliformes fécaux 10 102
Levure 5 2 0 10
Moisissures 10 102
Staphylococcus 2 absenc Absen
5
aureus e ce
Salmonella.
5 2

5 2

5 0

E) . Conclusion

De très nombreuses enquêtes ont été réalisées pour déterminer les causes des maladies
microbiennes liées à la consommation d’aliments, mais aussi pour connaître leur importance
et leur coût dans une Société.

Les causes de ces maladies peuvent résulter :

1 - Des risques liés à la préparation des produits alimentaires.

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A ce niveau il faut signaler que les produits d’origine industrielle qui représentent
actuellement la plus grande partie de notre alimentation ne sont que rarement impliqués. Ce
sont surtout la restauration et la cuisine familiale qui sont les plus souvent à l’origine de ces
maladies. Dans ces conditions, il apparaît que ce sont dans l’ordre : une réfrigération
insuffisante, une préparation trop à l’avance, une cuisson insuffisante, des manipulations
non hygiéniques par des personnes malades ou porteuses de germes, un réchauffage
inadéquat, la présence de produits crus contaminés dans des plats non cuits. et le nettoyage
insuffisant qui sont responsables de la présence et/ou de la prolifération des
microorganismes. Au niveau industriel, la plupart des toxi-infections résultent de la
contamination des matières premières ou de défauts de traitements et d’emballage.

2 - Des risques liés à la conservation et à l’entreposage.

Parmi les nombreux facteurs qui sont à prendre en considération au cours de cette
opération (durée, nature de l’aliment, type de traitement technologique de conservation,
activité de l’eau, pH, nature de l’emballage, nature et nombre de microorganismes
contaminant), c’est la température qui joue le rôle le plus important. Ainsi, il faut que les
produits alimentaires au sein desquels des microorganismes sont susceptibles de se
développer soient conservés à des températures pour lesquelles ce développement est
ralenti, voire impossible, c’est-à-dire moins de 2°C ou à plus de 60°C. Dans ce dernier cas, il
ne peut être envisagé de conservation de longue durée en raison de contraintes
technologiques mais aussi en raison de modifications physico-chimiques rapides (réaction de
Maillard par exemple) que subit le produit. Quoi qu’il en soit, ces deux températures doivent
être appliquées le plus rapidement possible au produit alimentaire qui vient d’être préparé.

Rappelons ici, que parmi les bactéries responsables de toxi-infections, certaines sont
capables de se développer à des températures voisines de 10°C, voire de 3 à 4°C (Yersinia,
Listeria). Par ailleurs, dans ces conditions d’autres germes peuvent être à l’origine
d’altérations diverses (Alcaligenes, Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium ).

L’activité de l’eau de certains types d’aliments, comme les produits déshydratés, leur
confère une grande stabilité microbiologique. Il est alors nécessaire d’éviter la réhydratation
de ces produits car certains microorganismes pourraient cultiver et dans le cas où il s’agit de
levures et moisissures les risques d’apparition de mycotoxines deviennent prépondérants. Il
faut enfin signaler que des innovations technologiques comme les emballages sous vide ou
de la cuisine sous vide peuvent contribuer, si par exemple les conditions requises de
température d’entreposage ne sont pas respectées, à l’augmentation de fréquence d’un type
donné de maladie microbienne.

3 - Des nouvelles habitudes alimentaires.

Ces nouvelles habitudes font appel à la cuisine collective, à la consommation de


produits crus ou mal cuits, à la consommation de produits « «bio », à l’utilisation de plats
pré-cuisinés, etc…

Il importe donc que nos aliments tendent de plus en plus vers une excellente qualité
microbiologique et plus particulièrement vers une qualité hygiénique irréprochable. Pour ce
faire il existe, en plus de l’éducation nécessaire des “cuisiniers domestiques et industriels”

75
mais aussi des consommateurs, des moyens technologiques nombreux et variés : traitements
thermiques (pasteurisation, stérilisation), radiations ionisantes, abaissement de l’activité de
l’eau, réfrigération, congélation, mode de conditionnement, produits chimiques souvent
qualifiés de conservateurs (nitrites, sorbate, acides divers, etc). Par ailleurs, il existe des
méthodes d’analyses microbiologiques qui permettent aux industriels de se conformer à la
réglementation, d’éviter la contre publicité en cas d’accident, de gérer la qualité en cours de
fabrication et enfin de prévenir les intoxications alimentaires. Enfin, il faut signaler que des
concepts récents, comme celui du contrôle des points critique ou de l’analyse du risque
tendent vers des réalisations de produits alimentaires avec “zéro défaut”.

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