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CPA-PME/UNOP

VALIDATION
DES PROCÉDURES ANALYTIQUES

Introduction

1
Introduction

Qu’est-ce que la validation ?

Pourquoi est-il nécessaire de valider ?

Que valide-t-on ?

Quand est-il nécessaire de valider ?

La validation est-elle systématique ?

Est-il nécessaire de revalider une méthode pharmacopée ?


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Introduction

La validation d’une méthode analytique est une composante essentielle


qu’un laboratoire doit mettre en œuvre pour produire des données
analytiques fiables.

En industrie pharmaceutique la validation des méthodes analytiques fait


partie du système d’assurance qualité.

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Introduction

Direction Générale
Affaires juridiques Affaires
et administratives règlementaires

Production Assurance Qualité

Technique Documentation Validation


Packaging Déviation
Formation
Fabrication Contrôle Qualité

Vente
Contrôle de changement
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Introduction

L’activité validation se trouve sous la responsabilité du département


Assurance Qualité lui-même représenté à la Direction Générale du site
de fabrication.

La coopération du service Validation avec les services suivants est


nécessaire:
 Technique
 Production
 Contrôle Qualité
 Documentation

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Introduction

POURQUOI EST-IL NÉCESSAIRE DE VALIDER ?

Exigence pour les entreprises pharmaceutiques produisant des


principes actifs et des médicaments, de satisfaire les requis des
réglementations nationales et internationales.

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Introduction

QU’EST-CE QUE LA VALIDATION ?

Au sens le plus général :

« l’établissement de la preuve documentée qui démontre la forte


probabilité qu’un équipement, un process, et une procédure donnés
produiront constamment un produit conforme à des Standards de
Qualité spécifiés prédéterminés et à ses attributs
de qualité »
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Introduction

QU’EST-CE QU’ON VALIDE ?

L’assurance qualité implique la validation:

 Des Procédés de fabrication


 Des équipements de fabrication et des instruments analytiques
 Des logiciels
 Des procédures analytiques

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VALIDATION
DES PROCÉDURES ANALYTIQUES

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Introduction

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VALIDATION
DES PROCÉDURES ANALYTIQUES

Exigences réglementaires

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Composantes principales d’une analyse de qualité

QUALIFICATION DE L’INSTRUMENT ANALYTIQUE :


Collecte des preuves documentées que l’instrument
analytique est bien adapté à son application.
QC – QI – QO - QP

VALIDATION DE LA PROCÉDURE ANALYTIQUE :


Collecte des preuves documentées que la procédure
analytique convient pour son application.
Exactitude - Précision (Répétabilité et Précision intermédiaire)
– Spécificité - Limite de détection - Limite de dosage –
Linéarité - Domaine d’utilisation

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Composantes principales d’une analyse de qualité

TESTS DE CONFORMITÉ DU SYSTÈME :


Les essais de conformité du système font partie
intégrante de la méthode et visent à vérifier les critères
d’aptitude du système au moment de l’analyse.

ÉCHANTILLONS DE CONTRÔLE QUALITÉ :


Il s’agit de substances de référence ou d’étalons
permettant de s’assurer des performances du système
avant et pendant l’analyse de l’échantillon.

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Qualification VS Validation

QUALIFICATION
Instruments analytiques
Équipement de production
VALIDATION
Procédés de fabrication
Procédures analytiques Protocole expérimental du dosage de la proline :
1. Préparation des échantillons :
Deux semaines après la dernière pulvérisation à l’alginate irradié, les
- Réactif à la ninhydrine :


1g de ninhydrine
40 mL d’eau distillée

Procédures logicielles
60 mL d’acide acétique
feuilles étendards de blé dur ont été prélevées, étiquetées et
séchées à l’étuve jusqu’à ce que leurs masses atteignent une valeur - Homogénéiser le mélange et placer le tube au bain-marie à 95°C
constante. pendant 30 minutes.
On procédait au prélèvement de trois échantillons par zone soit au Il se forme un complexe à l’origine de la couleur rouge de la solution.
total 81 échantillons.
4. Extraction du complexe formé :
Les feuilles ainsi séchées, sont broyées et conservées dans un
dessiccateur à l’abri de l’humidité. - Ajouter 03 mL de toluène et agiter au vortex.

2. Solubilisation de la proline : Deux phases non miscibles se développent.

La proline est solubilisée dans de l’eau distillée à 90°C : - Récupérer la phase supérieure qui est la phase organique contenant le
complexe.
- Dans un tube Eppendorf, mettre 10 mg de matière végétale sèche
avec 1,5 mL d’eau distillée. 5. Dosage spectrophotométrique :

- Placer le tube dans un bain-marie à 90°C pendant 30 minutes. - Mesurer l’absorbance de la phase organique à 520 nm.

- Centrifuger le tube 15 min à 4000 tours/minute. - Préparer un blanc en parallèle.

- Récupérer le surnageant. - Le blanc :

3. Réaction à la ninhydrine :  01 mL d’eau distillée


 02 mL de réactif à la ninhydrine
- Mettre dans un tube à essai : 100 µL d’extrait + 900 µL d’eau
distillée + 2 mL de réactif à la ninhydrine.  03 mL de toluène

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Protocole expérimental du dosage de la proline : - Réactif à la ninhydrine :
1. Préparation des échantillons :  1g de ninhydrine
 40 mL d’eau distillée
Deux semaines après la dernière pulvérisation à l’alginate irradié, les
 60 mL d’acide acétique
feuilles étendards de blé dur ont été prélevées, étiquetées et
séchées à l’étuve jusqu’à ce que leurs masses atteignent une valeur - Homogénéiser le mélange et placer le tube au bain-marie à 95°C
constante. pendant 30 minutes.
On procédait au prélèvement de trois échantillons par zone soit au Il se forme un complexe à l’origine de la couleur rouge de la solution.
total 81 échantillons.
4. Extraction du complexe formé :
Les feuilles ainsi séchées, sont broyées et conservées dans un
dessiccateur à l’abri de l’humidité. - Ajouter 03 mL de toluène et agiter au vortex.

2. Solubilisation de la proline : Deux phases non miscibles se développent.

La proline est solubilisée dans de l’eau distillée à 90°C : - Récupérer la phase supérieure qui est la phase organique contenant le
complexe.
- Dans un tube Eppendorf, mettre 10 mg de matière végétale sèche
avec 1,5 mL d’eau distillée. 5. Dosage spectrophotométrique :

- Placer le tube dans un bain-marie à 90°C pendant 30 minutes. - Mesurer l’absorbance de la phase organique à 520 nm.

- Centrifuger le tube 15 min à 4000 tours/minute. - Préparer un blanc en parallèle.

- Récupérer le surnageant. - Le blanc :

3. Réaction à la ninhydrine :  01 mL d’eau distillée


 02 mL de réactif à la ninhydrine
- Mettre dans un tube à essai : 100 µL d’extrait + 900 µL d’eau
distillée + 2 mL de réactif à la ninhydrine.  03 mL de toluène

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Qualification VS Validation

Quelles procédures analytiques valider ?

 Tests d’identification
 Essais des impuretés (essai limite ou teneur)
 Dosages (teneur ou dissolution)

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Matières premières Produits finis

Essais des impuretés

Dosages
Tests d’identification
(teneur et dissolution)

Quelles procédures
analytiques valider

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Qualification VS Validation

Quels sont les critères à valider ?

 Exactitude
 Fidélité (répétabilité et précision intermédiaire)
 Spécificité
 Limite de détection
 Limite de quantification
 Linéarité
 Intervalle de dosage
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Est-il nécessaire de valider
tous les critères pour chaque procédure analytique ?

 Exactitude
 Tests d’identification  Fidélité (répétabilité et précision intermédiaire)
 Essais des impuretés  Spécificité
(essai limite ou teneur)  Limite de détection
 Dosages  Limite de quantification
(teneur ou dissolution)  Linéarité
 Intervalle de dosage

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Validation des procédures analytiques et organismes règlementaires

17025 5725

Ces directives complètent les directives Q2 (R1) Validation des procédures analytiques:
Texte et méthodologie (Q2 (R1)) de la Conférence internationale sur l'harmonisation
(ICH) pour l'élaboration et la validation de méthodes analytiques.

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17025

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5725

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En vertu des BPF, les fabricants sont tenus de définir le travail de validation à
effectuer en vue de démontrer qu’ils contrôlent les aspects critiques de leurs
opérations spécifiques. Les changements importants apportés aux installations,
équipements et procédés susceptibles d’influencer la qualité du produit, doivent
être validés.

PLANIFICATION DE LA VALIDATION

Toutes les activités de validation doivent être planifiées. Les éléments clés d’un
programme de validation doivent être clairement définis et documentés dans un
plan directeur de validation (PDV) ou documents équivalents.

Le PDV doit être un document bref, clair et concis.


Le PDV doit comporter au minimum les données suivantes :
a) Politique de validation ;
b) Structure organisationnelle des activités de validation ;
c) Relevé des installations, systèmes, équipements et procédés à valider ;
d) Format de la documentation : format à utiliser pour les protocoles et les rapports ;
e) Planification et programmation ;
f) Maîtrise des changements ;
g) Référence aux documents existants.

DOCUMENTATION

Il convient d’établir un protocole écrit précisant les modalités de mise en œuvre des
activités de qualification et validation. Le protocole doit être revu et approuvé. Il doit définir
les étapes critiques et les critères d’acceptation.
Un rapport renvoyant au protocole de qualification et/ou de validation doit être élaboré.
Celui-ci doit résumer les résultats obtenus, formuler des commentaires sur toute déviation
observée et tirer les conclusions nécessaires, y compris sur les changements recommandés
en vue de remédier aux lacunes constatées. Toute modification du plan tel que défini dans le
protocole doit être dûment justifiée et documentée.
Après réalisation d’une qualification satisfaisante, il doit être procédé à une libération
officielle sous forme d’autorisation écrite en vue de la prochaine étape de qualification et de
validation.
Ces directives complètent les directives Q2 (R1) Validation des procédures analytiques:
Texte et méthodologie (Q2 (R1)) de la Conférence internationale sur l'harmonisation (ICH)
pour l'élaboration et la validation de méthodes analytiques.
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Validation des procédures analytiques et organismes règlementaires

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Validation des procédures analytiques et organismes règlementaires

A partir de 1991 un cycle de conférences ayant pour but


l’harmonisation des réglementations a été conjointement initié
et organisé par les autorités d’enregistrement américaines,
japonaises et européennes :

International Conference on Harmaonization


of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals
for Human Use
(ICH)

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A partir de 1991 un cycle de conférences ayant pour but
l’harmonisation des réglementations a été conjointement initié
et organisé par les autorités d’enregistrement américaines,
japonaises et européennes :

International Conference on Harmaonization


of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals
for Human Use
(ICH)

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Qualité Multidisciplinaire

Sécurité Efficacité

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Les guidelines évoluent sur un parcours balisé par 6 étapes (6 Steps)

 Étape 0: document conceptuel pour justifier le sujet


 Étape 1 : version préliminaire établie par un groupe d’experts scientifiques
 Étape 2: document de consensus qui est transmis aux autorités
réglementaires des trois régions pour consultation
 Étape 3: recueil des commentaires, modification du texte qui est transmis
de nouveau au groupe d’experts
 Étape 4: signature du document final par les autorités réglementaires Ceci
correspond à un engagement de mise en application
 Étape 5: les recommandations sont transposées dans les réglementations
nationales.

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Les conférences
internationales
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Les conférences
internationales
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Validation des procédures analytiques et organismes règlementaires

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Validation des procédures analytiques et CTD

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VALIDATION
DES PROCÉDURES ANALYTIQUES

Terminologie

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CEI 99:2007
VIM
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Validation d’une procédure analytique

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L’objectif de la validation d’une procédure analytique est de démontrer qu’elle est appropriée
à l’usage auquel elle est destinée.
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Terminologie de quelques termes utilisés par la suite

Procédure analytique Vs Méthode analytique

Il est plus opportun d’utiliser le terme « procédure » plutôt que « méthode ».


Les expressions « méthode de dosage » et « méthode de détermination » sont parfois employés
comme synonymes de l’expression « méthode d’analyse ». Ces deux expressions ne
doivent pas être employées dans ce sens car elles sont plus limitatives.
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Terminologie de quelques termes utilisés par la suite

Mesurage – Mesure et Mesurande


CEI 99:2007
VIM

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Terminologie de quelques termes utilisés par la suite

Anlalyte - Matrice - Blanc

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Critères de validation d’une procédure analytique

Equivalence des termes selon SFSTP Référentiels


Anglais Français OMS USP ISO ICH
Selectiviy / Specificiy Spécificité Confondues (+) (+) (+)
Sélectivité (+) (-) (+) (-)
Sensitivity Sensibilité (+) (-) (+) (-)
Accuracy Exactitude (+) (+) (+) (+)
Trueness Justesse (-) (-) (+) (-)
Precision Précision (fidélité) (+) (-) (+) (+)
Reproducibility Reproductibilité (+) (+) (+) (+)
Répetabilité (+) (+) (+) (+)
Robustness / Ruggedness Robustesse / Rigidité (+) (+) (+) (+)
Limite of detection Seuil de détection
(LOD) (limite de détection) (+) (+) (+) (+)
Limite of quantification Seuil de quantification
(LOQ) (Limite de quantification) (+) (+) (+) (+)
Linearity Linéarité (+) (+) (+) (+)
Range Intervalle de dosage
(Intervalle de mesure) (+) (+) (+) (+) 77
Terminologie des critères de validation

Spécificité

CEI 99:2007

CEI 99:2007

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CEI 99:2007

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Terminologie des critères de validation

Justesse Précision Exactitude

Erreur systématique Erreur aléatoire Erreur totale


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Terminologie des critères de validation

Justesse

CEI 99:2007

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CEI 99:2007

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Terminologie des critères de validation

Justesse Précision Exactitude

Erreur systématique Erreur aléatoire Erreur totale


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Terminologie des critères de validation

Précision

CEI 99:2007

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CEI 99:2007

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CEI 99:2007

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CEI 99:2007

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Terminologie des critères de validation

Justesse Précision Exactitude

Erreur systématique Erreur aléatoire Erreur totale


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Terminologie des critères de validation

Précision

CEI 99:2007

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Terminologie des critères de validation

Exactitude

CEI 99:2007

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CEI 99:2007

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Terminologie des critères de validation

Justesse Précision Exactitude

Erreur systématique Erreur aléatoire Erreur totale


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Terminologie des critères de validation
Erreurs systématique - aléatoire et totale

Justesse Précision Exactitude

Erreur systématique Erreur aléatoire Erreur totale


Erreur systématique liée à la méthode Erreur aléatoire liée aux conditions
expérimentales. Instabilité, irrégularité, Erreur totale somme des erreurs
analytique. Erreur constante, nécessite
limite, manipulation, incertitude systématique et aléatoire104
une correction
Terminologie des critères de validation

Linéarité

CEI 99:2007

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CEI 99:2007

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Terminologie des critères de validation

Limite de détection

CEI 99:2007

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CEI 99:2007

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Terminologie des critères de validation

Limite de quantification

CEI 99:2007

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CEI 99:2007

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Terminologie des critères de validation

Sensibilité

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Terminologie des critères de validation

Domaine d’utilisation

CEI 99:2007

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CEI 99:2007

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Terminologie des critères de validation

Robustesse

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Terminologie des critères de validation

Robustesse VS Rigidité

ROBUSTESSE
Intra-laboratoire

RIGIDITÉ
Inter-laboratoire

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Terminologie des critères de validation

Stabilité

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Revalidation d’une procédure analytique

Une revalidation peut être nécessaire dans certaines circonstances :


 Modification de la voie de synthèse de la substance pharmaceutique.
 Modification de la composition du produit fini.
 Modification de la procédure analytique
Le degré de revalidation requis dépend de la nature de la modification. Certaines
modifications peuvent nécessiter une validation.

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Transfert analytique

Transfert d’une procédure analytique d’un site à un autre.

126
Cycle de vie d’une procédure analytique

Une phase de sélection qui permet de définir les objectifs


et les conditions opératoires initiales ;

Une phase de développement, avec ou sans optimisation


au moyen de plans d’expériences (optimisation robuste) ;

Une phase de validation précédée, selon les cas, d’une


phase de prévalidation ;

Une phase d’application en routine, incluant le plus


souvent une validation en routine et parfois une validation
partielle.

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Prévalidation VS Validation

PRÉVALIDATION
Spécificité
Stabilité des solutions
Validation du rendement d’extraction
Validation de l’effet de la dilution VALIDATION
L’étude de l’effet de la matrice Justesse
Fidélité
Exactitude
Linéarité
Intervalle de dosage
Limite de détection
Limite de quantification

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Est-il nécessaire de valider
tous les critères pour chaque
procédure analytique ?

NON

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VALIDATION
DES PROCÉDURES ANALYTIQUES

Textes réglementaires

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Ces directives complètent les directives Q2 (R1) Validation des procédures analytiques:
Texte et méthodologie (Q2 (R1)) de la Conférence internationale sur l'harmonisation
(ICH) pour l'élaboration et la validation de méthodes analytiques.

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Ces directives complètent les directives Q2 (R1) Validation des procédures analytiques:
Texte et méthodologie (Q2 (R1)) de la Conférence internationale sur l'harmonisation (ICH)
pour l'élaboration et la validation de méthodes analytiques.
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Méthode non Pharmacopée => Validation

Méthode Pharmacopée => Conformité du système

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Revalidation

Lorsqu'une modification est apportée à une procédure analytique (par exemple,


une modification d'un équipement ou d'un réactif ou en raison d'un changement
dans le procédé de fabrication ou la formulation), il faut envisager une
revalidation de tout ou partie de la procédure analytique.

La revalidation de la méthode analytique peut également être justifiée en raison


de modifications du procédé de fabrication, telles qu'une altération du procédé
de fabrication de la substance médicamenteuse qui pourrait avoir une incidence
sur la performance du procédé (par exemple, la voie de synthèse, la fermentation)
ou l'introduction d'une nouvelle formulation de produit fini.

Vous devriez revalider pour vous assurer que la procédure analytique conserve
ses caractéristiques critiques de performance (par exemple, spécificité, précision,
précision). Le degré de revalidation dépend de la nature du changement.
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Méthodes alternatives

La nouvelle méthode est équivalente ou supérieure à la méthode originale pour le


but visé.

La nouvelle procédure analytique n'est pas plus sensible aux effets matriciels que
la procédure initiale.

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Transfert analytique

Les études comparatives sont effectuées pour évaluer l'exactitude et la précision,


en particulier en ce qui concerne l'évaluation de la variabilité entre laboratoires.

Revoie au chapitre général USP <1224>.

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Transfert d’une méthode

Méthode Pharmacopée

SUBSTANCE ACTIVE PRODUIT FINI


IDENTIFICATION / /
ESSAI D’IMPURETÉS / Spécificité – Limite de quantification au moins
DOSAGE / Spécificité – Exactitude – Précision (répétabilité) – Linéarité

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Transfert d’une méthode

Méthode d’un fabricant


- Procédure analytique complètement validée -

SUBSTANCE ACTIVE PRODUIT FINI


IDENTIFICATION / /
ESSAI D’IMPURETÉS / Spécificité – Limite de quantification au moins
DOSAGE / Spécificité – Exactitude – Précision (répétabilité) – Linéarité

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Transfert d’une méthode

Méthode interne publiée

IDENTIFICATION /
ESSAI D’IMPURETÉS Spécificité – Limite de quantification – Précision / Exactitude
DOSAGE Spécificité – Exactitude – Précision (répétabilité) – Linéarité

144
Transfert d’une méthode

Méthode d’un premier fabricant à utiliser pour un second fabricant

SUBSTANCE PRODUIT FINI


ACTIVE Matrices comparables Matrices identiques
IDENTIFICATION / / /
ESSAI Spécificité Spécificité – Limite de quantification – Spécificité – Limite de quantification
D’IMPURETÉS Précision / Exactitude au moins
DOSAGE / Spécificité – Exactitude – Précision Spécificité – Exactitude – Précision
(répétabilité) – Linéarité (répétabilité) – Linéarité

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Transfert d’une méthode

Méthode pour une substance active à utiliser pour le produit fini

IDENTIFICATION /
ESSAI D’IMPURETÉS Spécificité – Limite de quantification – Précision / Exactitude
DOSAGE Spécificité – Exactitude – Précision (répétabilité) – Linéarité

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Transfert d’une méthode

Validation incomplète – ou – Développement d’une nouvelle méthode

ICH Q2(R1)

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VALIDATION
DES PROCÉDURES ANALYTIQUES

Textes réglementaires
- Méthodologie -
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17025

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Méthodologie – Statistiques

Moyenne – Écart type/Variance – coefficient de variation

Écart type relatif – Sans unité


Permet de mieux juger la dispersion

µ σ CV (%)
0,1 1 1000 %
100 1 1%

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Méthodologie – Statistiques

Droite de régression linéaire – Coefficient de corrélation R et Coefficient de détermination R²

R≈1
R≈0
R ≈ -1 151
Méthodologie – Statistiques

Tests statistiques

Student Fisher Cochran

 Test l’égalité de deux variances  Teste l’homogénéité des variances


 Comparaison de moyennes

 Test de nullité d’un coefficient


d’une régression linéaire

152
Méthodologie – Les solutions

Série de principe actif seul – Série de la forme pharmaceutique reconstituée


Standards d’étalonnage – Standards de validation

SFSTP 1992 et ICH SFSTP 2003/2006

Série de principe actif seul Standards d’étalonnage

Principe actif sans excipients

Série de la forme pharmaceutique reconstituée Standards de validation

Principe actif avec les excipients

153
Méthodologie – ICH Q2(R1)

Spécificité

Test d’identification:
 Par comparaison avec une substance chimique de référence
 Comparaison avec des substance chimiquement semblables ou proches
(en fournissant des justifications scientifiques fondées sur le choix de ces substances)
 Associer plusieurs méthodes analytiques.

Dosage :
 Spectrophotométrie UV-Visible (Blanc matrice – SCR – produit fini - Solvant de dissolution)
 Chromatographiques: (Blanc matrice – SCR – produit fini - Solvant de dissolution – Phase mobile – Blanc instrument)
 Titrage volumétrique : Ajouter une méthode de dosage appropriée des impuretés
 Ordonnée à l’origine d’une droite de régression égale à zéro

Impuretés :
 Comparer avec les impuretés SCR
 Exposer l’échantillon à des conditions de stress: lumière, chaleur, humidité, hydrolyse acide-base, oxydation
 Utiliser des méthodes analytiques couplées DAD, SM.

154
Méthodologie – ICH Q2(R1)

Intervalle de dosage

- Cas de détermination de la teneur d’un principe actif dans un produit fini :


± 20% de la valeur nominale (100 %) soit de 80 à 120 %

- Cas du test de dissolution d’un produit à libération immédiate :


± 20% de l’intervalle spécifié :
Ex : > 80 % au bout de 45 minutes soit de 60 à 110 %

- Cas du test de dissolution d’un produit à libération prolongée :


Ex : 20 % première heure et 90 % 24e heure soit de 0 à 110 %

155
Méthodologie – ICH Q2(R1)

Linéarité

Protocole :
La linéarité doit être étudiée sur cinq niveaux de concentrations dans la
totalité de la plage de validation : 80 – 90 – 100 – 110 et 120 %
La gamme est le principe actif seul

Statistiques :
La régression des moindres carrés : Pente – ordonnée à l’origine – coefficient
de corrélation
Somme carré des résidus
Analyse de l’écart entre les valeurs réelles et la courbe de régression

156
Méthodologie – ICH Q2(R1)

Précision
Protocole :
Répétabilité : La gamme est la forme reconstituée.
La répétabilité doit être étudiée
- Sur la totalité de la plage de validation en utilisant au moins 9 résultats obtenus par l’analyse d’au moins 3 concentrations.
Soit trois échantillons préparés indépendamment pour chacun des niveaux de concentrations : 80 – 100 – 120 %.
- Sur au moins 6 mesures de la concentration nominale
Précision intermédiaire :
Selon les conditions dans lesquelles la méthode sera utilisée, il est à considérer la validation sur différents jour, par différents
analystes ou avec différents appareillages.
Reproductibilité :
Evaluée à partir d’essais inter-laboratoires dans le cadre de la normalisation de la méthode analytique.
NB : Dans le cas où la reproductibilité est validée, il n’est pas nécessaire de valider la précision intermédiaire.

Statistiques :
- Ecart type
- Coefficient de variation
- Intervalle de confiance
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Méthodologie – ICH Q2(R1)

Exactitude

Protocole : La gamme est la forme reconstituée.


 L’exactitude doit être étudiée sur la totalité de la plage de validation en utilisant au moins 9 résultats obtenus par
l’analyse d’au moins 3 concentrations.
 Soit trois échantillons préparés indépendamment pour chacun des niveaux de concentrations : 80 – 100 – 120 %.

Statistiques :
 Calcul du recouvrement et du recouvrement moyen
 Intervalle de confiance

158
Méthodologie – ICH Q2(R1)

Limite de détection Limite de quantification


Visuel

Signal/ bruit 1/3 ou 1/2 1/10

A partir de l’écart type

159
Méthodologie – SFSTP 2003/2006

Justesse + Précision = Exactitude

Erreur systématique + Erreur aléatoire = Erreur totale

Profil d’exactitude

160
Méthodologie – SFSTP 2003/2006

Linéarité

161
Formation UNOP/CAP-PME
La validation Analytique
15-19 Janvier 2017

Les critères de la Validation des procédures analytiques


quantitatives

Pr BOUDIS HAKIM
Département de Pharmacie d’Alger

162
162
Considérations à prendre avant d’entamer
une validation analytique
Qualification des Instruments
• Statuts de Qualification et étalonnage et performances vérifiées (suitability
of instrument)
Qualification du Matériel (matières)
• Statuts des substances de Référence, Réactifs,
Qualification des Analystes
• Statuts des formation et enregistrements de formations
Qualification de la Documentation
• Procédure et protocoles analytiques rédigés et approuvés avec des critères
d’acceptation préétablis
Un échantillon représentatif.

163
CRITERES DE LA VALIDATION
Quelles caractéristiques valider ?

La démarche ″analyste″ pour caractériser les


performances des méthodes d’analyse consiste à
évaluer au travers de travaux expérimentaux
certaines caractéristiques décrites dans de
nombreux ouvrages, dans des documents normatifs
(ISO, NE…) ou réglementaires (Pharmacopée, Notes
Explicatives ainsi que dans des guides (tel que celui
de la SFSTP)

164
LA VALIDATION DES MÉTHODES ANALYTIQUES

DANS LES INDUSTRIES PHARMACEUTIQUES

selon les guidelines ICH Q2(R1) ,

SFSTP 1992

et
SFSTP 2003-2006 (profil d'exactitude)

165
• • Critères usuels
1- Critères fonctionnels (pré-validation)
• – Spécificité-Sélectivité
• - Sensibilité
• – Intervalle de mesure
• - Stabilité des solutions
• – Seuil de quantification
• – Seuil de détection
2- Critères statistiques
• – Fonction de réponse
• – Linéarité
• – Exactitude- justesse
• - Profil d’Exactitude
• – Fidélité (répétabilité, fidélité intermédiaire)
• - Robustesse
166
Critères Fonctionnels
Prè-validation

167
1-Sélectivité & Spécificité
Souvent confondues

•Spécificité :
•Capacité d’une méthode analytique à mesurer un analyte
particulier sans que cette mesure ne soit faussée par d’autres
composants de l’échantillon
•La spécificité mesure le degré d'interférences entre un principe
actif et d'autres composants présents dans l’échantillon
(excipients, produits de dégradation…)
• Sélectivité :
Capacité d’une méthode analytique à déceler sans interférence
plusieurs substances différentes dans un échantillon
Dans le cas des méthodes séparatives, on parle plutôt de sélectivité: capacité à différencier et quantifier l’analyte
cible en présence d’interférents dans l’échantillon.

168
Exemples de vérifications pratiques dans le cas d’une
méthode HPLC:
 Injection:
o du placebo analytique = matrice (dégradée ou
non dégradée)
o composés interférents potentiels: produits de
dégradation, intermédiaires de synthèse

169
 Vérification de l’homogénéité d’un pic chromatographique (barrette de diodes)

170
2- Intervalle de mesure :
c’est selon ICH Q2R1, l’intervalle de concentration (ou
de quantité) de la substance à analyser sur lequel il a
été démontré que la procédure possède une fidélité,
une exactitude et une linéarité approprié.

L’intervalle de mesure spécifié dépend du type


d’application prévu de la procédure analytique.

171
Tableau : Intervalle de mesure
Types d’application Intervalle à considérer

Dosage d’une matière ± 20%


première ou d’un
80-120% de la concentration des échantillon d’essais
produit fini

Dosage d’une
50-120% de la limite spécifiée Ou LOQ* – 120%
impureté

± 30%
Uniformité de teneur 70 – 130% de la concentration d’essais
(sauf pour les inhalateurs doseurs)

Essais de dissolution ± 20% de l’étendue spécifiée

* Limite de Quantification 172


3-STABILITÉ DES SOLUTIONS

Permet d’estimer la validité des solutions étalons

- Injecter les solutions ayant servi à la détermination


de la linéarité à des jours différents

-La stabilité est obtenue en faisant le rapport

résultat moyen du temps t


R = -----------------------------------
résultat moyen du temps to

Normes : R doit être supérieur à 98%


173
4- SENSIBILITE (SENSITIVITY)
Définition :
C’est la capacité d’une méthode à pouvoir faire la discrimination entre deux concentrations très
voisines.
En pratique:
C’est la variation DX que peut différencier une méthode pour une variation minimale
significative DY de la réponse.
Y

DY

X
DX ---- DX -----

Cette valeur DX :
• sera d’autant plus faible que la pente a sera forte.
• sera d’autant plus forte que la dispersion des points autour de la droite sera élevée.

ΔX  2,9SE avec SE  SCE


a N-1
174
5- SEUIL DE DETECTION (DETECTION LIMIT)
Définition :
C’est la plus petite quantité ou concentration d’une substance à analyser qui puisse être
détectée avec une certitude suffisante
En pratique:
La procédure fournit un enregistrement graphique :

-Déterminer la largeur L du pic à mi hauteur de la substance à analyser dans la FR à 100%.


Soit par exemple L = 0,8mn pour une substance dont le Tr = 17 mn.

-Effectuer un enregistrement du blanc de l’analyse en suivant la procédure complète


d’analyse sur un échantillon contenant l’ensemble des constituants à l’exception de la
substance à doser.

-Déterminer l’amplitude maximale Hmax du signal sur une distance égale à 20 fois la
largeur L à mi hauteur
Ici L = 0,8 donc 20*0,8 = 16 mn que l’on répartit de part et d’autre du Tr =17 mn

Hmax = 13 mm
9 17 25
8 mn 8 mn 175
Hi = axi + b = axi
Réponse =
(si b non statistiquement différent de zéro)
Hauteur Hi

3 Hmax

xi

SD = 3(Hmax)/a (pour SFSTP)


SD = 3,3 (Hmax)/a (pour ICH)

176
La procédure ne fournit que des valeurs chiffrées

Effectuer n mesures du blanc d’analyse indépendantes (n 6) en suivant la procédure complète.


Calculer l'écart type sbl du blanc
S = aXi + b = axi
Signal S
(Si a non statistiquement différent de zéro)

3 sbl

Xi

SD = 3sbl/a (pour SFSTP)


SD = 3,3 sbl/a (pour ICH)

REMARQUE: sal n’est pas autre chose que l’écart type de l’ordonnée à l’origine sb

177
6- SEUIL DE QUANTIFICATION
(QUANTIFICATION LIMIT)
Définition :
C’est la plus petite quantité ou concentration d’une substance à analyser qui puisse être dosée avec une
certitude suffisante

En pratique:
Les procédures de détermination sont les mêmes que celles du seuil de détection.
La seule différence est le facteur multiplicatif qui, au lieu d’être égal 3 (ou 3,3 pour ICH), doit ici être
égal à 10.

178
Critères statistiques
« Validation »

179
l’application du protocole de validation :
ICH Q2R(1), SFSTP(2003-2006)

- Détermination de la linéarité.
- Calcul des fonctions de réponse.
- Calcul des prédictions inverses après alignement des réponses.
- Estimation de la justesse.
- Estimation de la fidélité.
-Estimation de l’exactitude.
- Calcul des intervalles de tolérance et du profil d’exactitude.

180
180
1- Fonction de réponse

Après avoir vérifié la spécificité de la méthode d’analyse


on opère sur deux ensembles d’échantillons
• 3 séries de standards d’étalonnage (SE)
• 3 séries de standards de validation (SV)
Les SE peuvent être réalisés sans la matrice (si on démontré
qu’il n’y a pas d’effet matrice) ou avec la matrice.

Les SV doivent toujours être réalisés avec la matrice


(Forme pharmaceutique reconstituée)

SE 1 SE2 SE3

SV 1 SV2 SV3 181


SE : Standard d’Etalonnage

Réponse = Y

A chaque niveau de concentration il


faut faire au minimum 2 répétitions

X = concentration

Le nombre de niveaux de concentration a utiliser est laissé à l’appréciation de


l’analyste .

À Partir des SE on va déterminer les différentes fonctions


de réponse y = f(x) c’est à dire les relations
mathématiques pouvant relier la réponse Y à la quantité ou
à la concentration X de substance à doser.
182
Réponse = Y

X = concentration

Différentes fonctions de réponse Y = f(x) peuvent être testées

y = ax + b [droite ne passant pas par l’origine = linéaire]


y = a1x [droite passant par l’origine prenant en compte l’ensemble des points = linéaire passant
par zéro]
Y = a2x [droite passant par zéro et un point de gamme (en général le 100 %) =
linéaire 0-100%]

Y = axb [exponentielle]
Y = ax2 + bx + C [polynomiale de degré 2]
Etc..
183
l’application du protocole de validation : (2003-2006)

 Détermination de la fonction de réponse :


Y  f X   

cov( X , Y )
rX ,Y =
s XsY

b  Y -aX

 [( X ]
n

i - X )( Yi - Y )
a i 1
n
 (X i - X )2
i 1

184
184 Mardi 24 Juin 2008
Méthodes statistiques pour l’évaluation des résultats analytiques

l’application du protocole de validation : (2003-2006)

 Test de significativité des coefficients :


(Ho) : B = 0
(Ho) : A = 0
contre
contre (H1) : B  0,
H1 : A  0, on utilise la statistique :
on utilise la statistique :
b - E b 
a - E a  t calculé  qui suit une loi Student t n -2 
t calculé  qui suit une loi student t (n-2) V b 
V a 

SCE SCR
R2 = =1- ,
SCT SCT

185
185 Mardi 24 Juin 2008
Alignement des réponses

On démontre que l’alignement des n répétions d’un niveau donné


s’effectue comme suit
YNi = yi + f(xm) – f(xi)
f est la fonction de réponse testée avec les SE

Prédiction inverse
on utilise les fonctions de réponses réciproques pour calculer les
quantités ou concentrations x* des standards de validation à partir
des réponses alignées R de l’appareil de mesure
x* = f-1 ( Y )

186
y

YNij = a x’ig + b1
° yij = axij + b1

y*ij = axij + b

YN*i = aX’ig + b
x

xij

x’ig = moyenne du groupe


des 3 valeurs xi1 ; xi2 ; xi3

yij = axij + b1 b1 = (yij -a xij)


YNij = a x’ig + b1  a x’ig + (yij -a xij)

Soit : YNij = a (x’ig – xij) + yij

187
2-LINÉARITÉ :

Le guide SFSTP 1992, explique la linéarité comme étant la capacité


d’une procédure à fournir une relation linéaire entre les
concentrations X et les réponses Y

Réponse y

y5

y4
y3
y2
y1 Concentration x
x1 x2 x3 x4 x5

188
188
Selon l’ICH Q2 (R1), la linéarité est la capacité d’une procédure à
fournir une relation linéaire entre les concentrations X et les résultats Y

Concentration
calculée *

*
*

*
*
Concentration
introduite

189
linéarité, on détermine :

- l ’ordonnée à l ’origine et la pente, (Y= aX + b )


- le coefficient de régression R²
- coefficient de corrélation R
- l’existence d ’une pente significative
- la compatibilité de l ’origine avec la valeur zéro

190
3-JUSTESSE

• Définition : c’est l’étroitesse de l’écart entre une moyenne d’un


groupe et la valeur de référence
• Elle est estimée par le biais de l’équation du modèle mathématique et
le recouvrement R% (100 ±2%)
Y  f X   

 Estimation de la justesse :
Biais j = x j - u j

xj -uj
Biais % j = 100× .
uj

Recouvrement % j  100 


xj
.
uj
191
4-FIDELITE :

L'ICH définit 3 niveaux de fidélité d'une méthode

Répétabilité Fidélité Reproductibilité


"intermédiaire"
= statistiques sur des = statistiques sur des = statistiques sur des
résultats obtenus dans résultats du laboratoire resultats se référant des
un intervalle de temps en fonction des jours, études de différents
court dans les mêmes de l'équipement, du laboratoires
conditions. manipulateur

192
4-FIDÉLITÉ :

répétabilité:
répétition du traitement d ’une même
solution, le même jour, par le même
opérateur avec le même système = fidélité
dans des conditions identiques

Fidélité intermédiaire
deux opérateurs, deux séries sur deux jours
différents par opérateur, avec
éventuellement deux matériels différents =
fidélité dans des conditions différentes 193
Méthodes statistiques pour l’évaluation des résultats analytiques

l’application du protocole de validation : (2003-2006)

 Estimation de la fidélité :
L’hypothèse à tester est :
H0 : b1 = b2 = …… = bk
Contre
H1 : b1 ≠ b2 ≠……. ≠ bk
 n y 
2
k k -y
k

Fcalculé  K -1
 
qui suit la loi Fisher F (K-1, n-K),
 y kj - y k
2

k j

n-K

194
194 Mardi 24 Juin 2008
Méthodes statistiques pour l’évaluation des résultats analytiques

l’application du protocole de validation : (2003-2006)

 Estimation de la variance intra-groupe :


p nij
( x ijk .cal - x ij .cal ) 2
MSE j   p
i 1 k 1
n
i 1
ij - p

 Estimation de la variance inter-groupe :


1 p
MSM j = 
p - 1 i 1
nij ( x ij.cal - x . j .cal ) 2

 Estimation de la fidélité intermédiaire :


ŝ FI
2
. j  MSE j  MSM j

195
195 Mardi 24 Juin 2008
5-EXACTITUDE

Dans l'analyse d'une substance, la mesure de l’exactitude est


obtenue par comparaison des résultats obtenus avec la méthode
analytique avec ceux correspondants à la substance de référence
ou par comparaison avec les résultats d'une seconde méthode
validée.

 Estimation de l’exactitude :
xi - u j
Exactitude relative = 100
uj

196
LES ERREURS DE MESURES

Erreur Aléatoire = VARIABILITE


= FIDELITE INTERMEDIAIRE
(INTERMEDIATE PRECISION)
+
Erreur Systématique
= BIAIS = JUSTESSE (BIAS = TRUENESS)
V = Masse ||
réelle ERREUR TOTALE (TOTAL ERROR)
« Poids » réel
ERREUR TOTALE =  BIAIS  + FIDELITE INTERMEDIAIRE

L’erreur totale est un bon indicateur de l’aptitude d’une


méthodologie à fournir des résultats exacts.

197
ERREUR TOTALE %
Niveau Y=a2 X
Y=ax+b Y = a1 X
% (100%)
80 0,44 0,43 0,58
90 0,95 0,95 1,11
100 -0,08 -0,08 0,05
110 0,26 0,26 0,42

1,20
ERREUR TOTALE %

1,00
Y=ax+b
0,80
0,60 Y = a1X
0,40
0,20 Y=a2X
0,00 (100%)

-0,20 80 90 100 110 120


NIVEAUX (Concentrations)

L’Erreur totale est un bon indicateur de l’aptitude d’une méthodologie à fournir des résultats exacts.

Cependant ce qui est important dans une validation ce n’est pas de prouver que la méthode
utilisée a généré des résultats exacts mais de pouvoir avoir l’assurance que lorsque l’on utilisera
cette méthode dans le futur (en routine) les résultats trouvés seront toujours proches des valeurs
réelles: C’est le rôle l’intervalle de tolérance et du profil d’exactitude 198
Fidélité (Précision) Exactitude
Valeur à trouver

F faible, E faible

F élevée, E faible

F faible, E élevée

F élevée , E élevée

199
6-Intervalle de tolérance et profil d’exactitude

[C] Vraie
SV1 SV2 SV3
Introduite
1 40 39,94 39,75 40,03
2 40 39,94 40,38 39,93
3 40 40,11 40,25 39,93
4 40 39,98 39,88 39,99
M oyenne 39,99 40,06 39,97

Intervalle de tolérance (%)


||

BIAIS (%)

+ ± t * f(%moyenne des erreurs sur chaque série

+ % erreur sur moyenne des séries)

Valeur lue dans la table de Student qui


dépend du risque que l’on se fixe et du
nombre de valeurs calculées par niveau

200
Intervalle de tolérance et profil d’exactitude
En pratique l’intervalle de tolérance est calculé pour chaque niveau j
de concentration à partir des standards de validation

VAR FI = VARinter + VARintra


VARin ter R 1
Rj  Bj 
j

VARin tra nR J  1

(R  1) 2
υ  Degré de liberté
1 2 1
(R  ) 1- n nombre de répétitions
n  n p nombre de séries
p -1 pn

INTERVALLE DE 1
 BIAIS%  t 1 CVFI
TOLERANCE pnB 2
j

t = variable de student pour un risque a 1-b et ddl = n

Le profil d’exactitude s’obtient en reliant entre elles les bornes


supérieures puis les bornes inférieures de l’intervalle de tolérance 201
Y=ax
Niveaux % Min Biais Max
80 -1,11 0,17 1,13
90 -0,06 0,67 1,41
100 -1,19 -0,38 0,43
110 -0,50 0,05 0,61
120 -2,68 -0,43 1,50

5
4
3
2
% ERREUR

1
0
-1 80 90 100 110 120
-2
-3
-4
-5
Niveaux de concentration en %

On démontre que si le profil d’exactitude est entièrement inclus dans les limites – l %, + l % alors on
peut affirmer que, en routine, le pourcentage de résultats dont la différence entre la valeur
déterminée X et la valeurs vraie V est inférieure , en valeur absolue à l sera au moins égale à b

Prob (|X-V | < l ) ≥ b


202
INTERET DU PROFIL D’EXACTITUDE
Choix d’une fonction de réponse
DROITE ENTRE 0% et 100%

7
6
5
4
3
2
1
0
-1 80 90 100 110 120
-2
-3
-4
-5
-6
-7

FONCTION LINEAIRE Y = aX (tous les points)

7
6
5
4
3
2
1
0
-1 80 90 100 110 120
-2
-3
-4
-5
-6
-7

Seul peut être utilisé le modèle linéaire 203


INTERET DU PROFIL D’EXACTITUDE
Détermination des limites de quantification
Exemple dosage d’une substance dans le sérum
[teneur théorique 225 mg.ml-1 (100 %)]
Limite quantification
Supérieure
Linéaire 0-100%
20
S I
(700mg/ml)
15 25,00 -18,00 -10,00
48,00 -10,00 -5,00
10 437,00 -10,00 10,00
838,00 -8,00 18,00
5

-5
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900

-10

-15

-20

Limite quantification
Inférieure (48 mg/ml)

Si on tolère une l = ± 15% 204


INTERET DU PROFIL D’EXACTITUDE
Détermination de l’intervalle de dosage

Limite quantification
Supérieure
Linéaire 0-100%
20
S I
(700mg/ml)
15 25,00 -18,00 -10,00
48,00 -10,00 -5,00
10 437,00 -10,00 10,00
838,00 -8,00 18,00
5
Intervalle de dosage
0

-5
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900

-10

-15

-20
Limite quantification
Inférieure (48 mg/ml)

205
Donc si on montre grâce au profil d’exactitude que
les résultats sont de qualité alors tous les critères de
performance exigés par les textes réglementaires
seront obligatoirement satisfaits.

206
Rappel Statistique des paramètres
CAP-PME/UNOP
15-19 Janvier 2017
Pr BOUDIS. Hakim

207
1- Paramètres d’un échantillon
1-1 La moyenne (Average, mean): m = X’
Exemple: sachets ASPEGIC 250 mg aspirine/sachet
Xi = 250 248 251 247 252 247 252 249 253

1 i n
m  X'   x i  250mg Dans Excel : MOYENNE (série de valeurs)
n i 1

La moyenne ne suffit pas à décrire un échantillon

Analyse 1 247 248 249 250 251 252 253  m = 250 mg


Analyse 2 248 248 249 250 251 252 253  m = 250 mg
Analyse 3 249 249 249 250 251 251 251  m = 250 mg
208
1-2 La variance (Variance) et écart type (standard deviation)
in
1
VARIANCE  σ 2 
n
 (x
i 1
i - m) 2 ( Dans Excel VAR.P )

Quel est l’inconvénient de la variance ?

in
1
ECART TYPE  σ 
n
 (x
i 1
i - m) 2 ( Dans Excel ECARTYPEP)

Analyse 1 Var = 4 ET = 2
Analyse 2 Var = 2,6 ET = 1,6
Analyse 3 Var = 0,86 ET = 0,93

209
1-3 Le coefficient de variation (relative standard deviation)

Exemple dosage des éléments dans une eau de boisson


Na+ n = 10 m = 5 mg/L s = 1 mg/L
HCO3- n = 10 m = 325 mg/L s = 10 mg/L

σ
CV  100
m

CV (Na+) = 20 % CV (HCO3-) = 2,8 %

210
-2 UTILISATION DES TABLES DE GAUSS ET DE STUDENT
2-1 Notion de variable centrée réduite (VCR)

A1 A2 A3 A4 A5 B1 B2 B3 B4 B5
10 12 15 08 05 11 15 16 18 15

m(A) = 10 s(A) = 3,4 m(B) = 15 s(B) = 2,3

Quel est le meilleur élève ?

(x - m)
t
σ
A1 A2 A3 A4 A5 B1 B2 B3 B4 B5
0 0,6 1,5 -0,6 -1,5 -1,7 0 0,4 1,3 0
211
2-2 utilisation des tables de GAUSS et de STUDENT
On démontre qu’une variable centrée réduite suit:
 t

Si n ≥ 30 une loi de GAUSS g(t) Prob ( - t   t  t )   g(t)dt


-t

t

Si n < 30 une loi de STUDENT s(t)


Prob ( - t   t  t )   s(t)dt
-t
La probabilité dépend aussi du degré
de liberté ddl n = n –1
g(t) ou s(t)

a/2 a/2

t
-t° + t°
Prob ( -t° < t < +t°) + a = 1

212
Exemple
Si n = 50 m = 10 s = 1 calculer Prob ( 9 < x < 11)
n = 50 donc > 30  loi de Gauss
9  t = (9-m)/s = (9 – 10)/1 = -1
11  t = (11-m)/s = (11 – 10)/1 = +1
g(t)

a/2
a/2

F(t) F(t)
t
-1 +1

Remarque
1 – 2F(t) = a
représente la probabilité que x ne soit pas compris entre 9 et 11 c’est à dire
la probabilité que t ne soit pas compris entre -1 et +1

213
Prob ( 9 < x < 11) = Prob ( -1 < t < +1) = 0,68
Prob (–t° <t< t° ) = 0,99 => t° = ? Prob (–t° <t< t° ) = 0,95 => t° = ?
214
S(t) Distribution "t" de Student
seuil de risque alpha
a/2 a/2 nb. DL
1
0,050
12,60
0,010
63,70
0,001
636,00
2 4,30 9,93 31,60
3 3,18 5,84 12,94
4 2,78 4,60 8,61
5 2,57 4,03 6,86
t 6 2,45 3,71 5,96
7 2,37 3,50 5,41
-t° + t° 8 2,31 3,36 5,04
9 2,26 3,25 4,78
Prob (–t° <t< t° ) =0,95 => t° = 10 2,23 3,17 4,59
11 2,20 3,11 4,44
? 12 2,18 3,06 4,32
13 2,16 3,01 4,22
Pour n = 30 ; n = 16 ; n = 5 14
15
2,15
2,13
2,98
2,95
4,14
4,07
16 2,12 2,92 4,02
17 2,11 2,90 3,97
18 2,10 2,88 3,92
19 2,09 2,86 3,88
20 2,09 2,85 3,85
21 2,08 2,83 3,82
22 2,07 2,82 3,79
23 2,07 2,81 3,77
24 2,06 2,80 3,75
25 2,06 2,79 3,73
26 2,06 2,78 3,71
27 2,05 2,77 3,69
28 2,05 2,76 3,67
29 2,05 2,76 3,66
30 2,04 2,75 3,65

Dans EXCELL =LOI.STUDENT.INVERSE(0,05;29) Facteur de risque a et ddl n = n-1


215
3- Problèmes de jugement sur échantillon
3-1 Notion d’espace de population , espace de l’échantillon, espace des moyennes
Échantillon i
taille n
moyenne mi
Population Échantillon j
Distribution des
moyennes
taille n
moyenne mj

Échantillon k
taille n
moyenne mk
Population
Échantillon Ensemble des moyennes de
(Exemple lot industriel de sachets) tous les échantillons
n sachets
VA = moyenne d’un échantillon
VA = mg Aspirine/sachet VA = mg Aspirine/sachet
Moyenne mm
Moyenne mpop Moyenne m ech
Variance s2m
Variance s2 ech
Variance s2 pop Ecart type s m
Ecart type sech
Ecart type s pop
216
Espace Espace Espace des
Moyennes
Population Échantillon
Ensemble des moyennes
(exemple lot industriel de N sachets) n sachets de tous les échantillons
VA = mg Aspirine/sachet VA = mg Aspirine/sachet VA = moyenne d’un
Moyenne mpop Moyenne m échantillon
ech

Variance s2 pop Variance s2 ech Moyenne mm

Ecart type s pop Ecart type sech Variance s2m


Ecart type s m

mpop = µm  mech

n  (Xi - m)  (Xi - m)
2
2 (VAR
n 2
On démontre que : σ 2
 σ ech   dans Excel)
n -1
pop
n -1 n -1 n
σ 2pop σ ech
2
σ 2m  
n n -1 217
3-2 Intervalle de confiance d’une moyenne (petits échantillons
n<30)
Position du problème
Estimer avec un facteur de risque donné l’intervalle dans lequel
doit se situer la moyenne mpop d’une population connaissant la
moyenne mech d’un échantillon, de taille n et d’écart type séch
extrait de cette population.

Solution du problème
VA = moyenne d’un échantillon => on se situe donc dans
l’espace de la distribution des moyennes qui admet:
Comme moyenne mm = mpop
Comme écart type σ ech
σm 
n -1
La VCR est donc : m ech - μ pop m ech - μ pop
t  
σm σ ech
n -1 218
Pour a = 0,05 et n = n-1 on lit la valeur limite t° dans la table de Student


m ech - μ pop
- t° < t < t  t t   t
σ ech
n -1

 σ ech
μ pop appartient donc à l' intervalle m ech  t
n -1

219
Exemple
Les résultats des analyses d’un échantillon de 26 comprimés
sont:
• moyenne en principe actif : 50 mg/cp
• Écart type : 5 mg/cp
Quel est l’intervalle de confiance de la moyenne au risque de
5% ?

Calcul de sm = sech/(26-1) = 5/ (25) = 1


t° ( α = 0,05 n = 25) =LOI.STUDENT.INVERSE(0,05;25) = 2,06
D’où: Intervalle confiance = méch ± t° sm = 50 ± 2,06*1 IC = [47,94 ; 52,06]

EXERCICE N°1
Que devient cet intervalle si les même résultats d’analyse ont été
obtenus sur un lot de 5 comprimés (au lieu de 26) ?

220
Corrigé exercice N°1

  σ ech 
m ech  t 
Intervalle de Confiance IC =

 n -1
échantillon de 26 comprimés échantillon 5 de comprimés

t° (α = 0,05 n = 25) σ ech 4 t° (α = 0,05 n = 4) σ ech 4


 1  = 2,5 (>>1)
= 2,06) n -1 5 -1 = 2,78 ( > 2,06) n -1 5 -1

IC = [47,94 ; 52,06] IC = [43 ; 56,95]


intervalle beaucoup plus large
que [47,94 ; 52,06]

221
3-3 Comparaison d’une moyenne théorique à une moyenne
expérimentale (cas des petits échantillons)

Position du problème
Population Moyenne m pop
Écart type (spop)
Échantillon
Effectif n
Moyenne m ech
Écart type s ech

L’échantillon provient –il de la population au risque α ?

222
Formulation des hypothèses de travail
H° : la différence observée n’est pas statistiquement significative : elle
ne provient que du hasard d’échantillonnage
H1 La différence observée est statistiquement significative: le hasard
seul n’explique pas cette différence

Solution du problème
VA = moyenne d’un échantillon
on se situe donc dans l’espace de la distribution des moyennes qui
admet
Comme moyenne mm = mpop
Comme écart type s pop
Si l’écart type spop de la population est connu (rare)
σm 
n
σ ech
 Si l’écart type de la population n’est pas connu σm 
n -1 223
m ech - μ pop
La VCR est donc : tech 
σm
 Si la distribution de la moyenne suit une loi Normale (même si n < 30)

Pour α = 0,05 on lit la valeur limite t° dans la table de GAUSS t° = 1,96 ≈ 2

 Si la distribution de la moyenne suit une loi de STUDENT ( n < 30)

Pour α = 0,05 on lit la valeur limite t° dans la table de STUDENT


t° ( α = 0,05 n = n-1) =LOI.STUDENT.INVERSE(0,05; n-1)

Si tech ≤ t° : les valeurs de mech et mpop sont statistiquement comparables

Si tech > t° : les valeurs de mech et mpop ne sont pas statistiquement


comparables

224
On peut aussi chercher la « p-value » de tech = probabilité que H° soit juste
S(t)

(P value)/2 (P value)/2
a/2 a/2

t
-t° -t ech + t ech+ t°

p-value > 0,05 (ou 0,1) p-value ≤ 0,05 (ou 0,1)


H° ne peut être rejetée  (H° VRAIE) H° peut être rejetée  (H° FAUSSE)
Les moyennes sont comparables Les moyennes ne sont pas comparables

225
Exercice N°2
Une machine délivre des gélule dosées (en théorie ) à 15 mg de
pa/gélule
On prélève 26 gélules
 mech = 15,3 mg
 sech = 0,5 mg
Au risque de 5% que peut-on en déduire ?

226
Corrigé exercice N°2

15,3 -15 0,3


t ech   3
0,5 0,1
26 -1 tech > t°  la machine est déréglée !

t ( 0,05 , n = 25) = 2,06

227
3-4 Comparaison de deux moyennes (petits échantillons n<30)
Position du problème

Échantillon1 Échantillon2
Moyenne m 1 = 10 Moyenne m 2 = 8
Écart type s 1 = 1 Écart type s 2 = 2
Effectif n1 = 7 Effectif n2 = 9

Les échantillons 1 et 2 proviennent –t-ils d’une même population ?

228
Formulation des hypothèses de travail
H° : la différence observée n’est pas statistiquement significative : elle ne
provient que du hasard d’échantillonnage
H1 La différence observée est statistiquement significative: le hasard seul
n’explique pas cette différence

Solution :
On commence par tester l’égalité des variances par un test F

variance la plus élévée σ 22


Fech   2 4
variance la moins élévée σ1

F[0,05 ; n1(numérateur) = 9-1 =8 ; n2 (dénominateur) = 7-1 = 6] = 4,15

229
F[0,05 ; n1(numérateur) = 9-1 =8 ; n2 (dénominateur) = 7-1 = 6] = 4,15
Distribution "F" de Fisher-Snedecor

(seuil de risque alpha = 0,05)


DL 1 (num)
DL 2
(den) 1 2 3 4 5 6 8 12 24
1 161 199 216 225 230 234 239 244 249
2 18,5 19,0 19,2 19,2 19,3 19,3 19,4 19,4 19,5
3 10,1 9,55 9,28 9,12 9,01 8,94 8,84 8,74 8,64
4 7,71 6,94 6,59 6,39 6,26 6,16 6,04 5,91 5,77
5 6,61 5,79 5,41 5,19 5,05 4,95 4,82 4,68 4,53
6 5,99 5,14 4,76 4,53 4,39 4,28 4,15 4,00 3,84
7 5,59 4,74 4,35 4,12 3,97 3,87 3,73 3,57 3,41
8 5,32 4,46 4,07 3,84 3,69 3,58 3,44 3,28 3,12
9 5,12 4,26 3,86 3,63 3,48 3,37 3,23 3,07 2,90
10 4,96 4,10 3,71 3,48 3,33 3,22 3,07 2,90 2,74
11 4,84 3,98 3,59 3,36 3,20 3,10 2,95 2,79 2,61
12 4,75 3,89 3,49 3,26 3,11 3,00 2,85 2,69 2,51
13 4,67 3,81 3,41 3,18 3,03 2,92 2,77 2,60 2,42
14 4,60 3,74 3,34 3,11 2,96 2,85 2,70 2,53 2,35
15 4,54 3,68 3,29 3,06 2,90 2,79 2,64 2,48 2,29
16 4,50 3,63 3,24 3,01 2,85 2,74 2,59 2,42 2,24
17 4,45 3,59 3,19 2,96 2,81 2,70 2,55 2,38 2,20
18 4,41 3,55 3,16 2,93 2,77 2,66 2,51 2,34 2,15
19 4,38 3,52 3,13 2,90 2,74 2,63 2,48 2,31 2,11

=INVERSE.LOI.F(0,05;8;6)
230
Ici F ech < F°  les variances sont comparables
 on peut comparer les moyennes
Si F ech > F°  les variances ne sont pas comparables
 les échantillons ne proviennent pas de la même population
231
Comparaison des moyennes
VA = différence des moyennes
Cette VA admet
Comme moyenne (mpop – mpop) = 0

1 1
Comme écart type σ d  σ e (  )
n1 n 2
n1σ12  n 2 σ 22
σ 2

n1  n 2 - 2
e

avec ou
(n1 - 1)σ1pop
2
 (n 2 - 1)σ 22pop
σ e2 
n1  n 2 - 2

(m1 - m 2 ) - 0 m1 - m 2 2
t ech     2,40
σd σd 0,83
t  a  0,05 ; n  n1n2-2  14  2,15
232
(m1 - m 2 ) - 0 m1 - m 2 2
t ech     2,40
σd σd 0,83
t  a  0,05 ; n  n1n2-2  14  2,15

Ici t ech > t°


 les moyennes ne sont pas statistiquement égales (H° est
fausse)
 Les deux échantillons ne proviennent pas de la même
population

Si on avait eu tech < t°


 les moyennes auraient été comparables (H° vraie)
 on aurait pu affirmer que les deux échantillons
proviennent de la même population

233
Exercice N°3

Dans un fut de comprimes on prélève


•10 comprimés au niveau supérieur
 m1 = 360 mg s1pop = 5 mg
•16 comprimés au niveau inférieur
 m2 = 365 mg s2pop = 4 mg

Le fut est-il homogène ?

234
Corrigé Exercice N°3

•10 comprimes au niveau supérieur  m1 = 360 mg s1pop = 5 mg


•16 comprimés au niveau inférieur  m2 = 365 mg s2pop = 4 mg
 Comparaison des variances
Fech = 5²/4² = 1,56
Les variances sont comparables
F° = inverse.loi.F (0,05;9;15) = 2,59
 Comparaison des moyennes
(n1 - 1)σ1pop
2
 (n 2 - 1)σ 22pop (10 - 1) * 5 * 5  (16 - 1). * 4. * 4 9 * 25  15 *16
σ 
2
   19,375
n1  n 2 - 2 10  16 - 2
e
24
 σ e  19,375  4,4
1 1 1 1
σd  σe (  )  4,4 *  )  1,77
n1 n2 10 16)

m1 - m 2 5
t ech     2,82 Les moyennes ne sont pas
σd 1,77
comparables
t° = loi.student.inverse(0,05; 24) =2,06
235
3-5 Analyse de la variance : ( ANalyse Of VAriance = AN0VA)
GROUPES
(laboratoires, opérateurs, jours
d'analyses etc..)
<--------------j-(varie de 1 à k)---------------->
L1 L2 L3 L4 Lj Lk

X1 41 36 50 43
X2 46 39 51 53
X3 54 43 51 47
X4 44 38 37 53
X5 42 37 47 53
i (1 à n) X6 45 35 47 50

Xi Xi1 Xi2 Xi3 Xi4 Xij Xik

Xn XnJ

MOYENNE => mj 45,33 38,00 47,17 49,83


VARIANCE => VARj 21,47 8,00 28,17 16,97

Position du problème
Peut-on considérer que les groupes (échantillons) sont comparables ? C’est-à-
dire qu’ils proviennent d’une même population ?
236
Formulation des hypothèses de travail
H° : les différences de moyennes observées ne sont pas statistiquement
significatives : elles ne proviennent que du hasard d’échantillonnage
H1 Les différences observées sont statistiquement significatives: le hasard
seul n’explique pas ces différences

Si H° est vraie et si les variances des groupes sont homogènes alors les
variances de la population estimées à partir:
•des valeurs contenues à •des valeurs des moyennes
l’intérieur de chaque groupe: des échantillons :
S12 = MSE (Mean Square Error) S22 =MSM (Mean Square Model)

* m1 * m3
* * m4 doivent être
m2 statistiquement comparables

237
Il faut commencer par tester l’homogénéité des variances par un test de
COCHRAN

L1 L2 L3 L4

X1 41 36 50 43
X2 46 39 51 53
X3 54 43 51 47
X4 44 38 37 53
X5 42 37 47 53
somme
X6 45 35 47 50 Cech
VAR
VAR 21,47 8,00 28,17 16,97 74,6 0,38

Variance maximale
On compare Cech = = 0,38
 Variances
Avec la valeur C° (0,05; k; n-1) lue dans la table de COCHRAN
K = nombre de groupe (ici 4 ) et n = nombre de répétitions ou d’essais par groupe (ici 6)

238
Table de Cochran
risque 5%
n = n-1==>
n nbr répétitions
ou essais par
groupe 1 2 3 4 5 6 7 8
k=p
(nombre de
groupes)

2 1 0,975 0,939 0,906 0,877 0,853 0,833 0,816
3 0,967 0,871 0,798 0,746 0,707 0,677 0,653 0,633
4 0,906 0,768 0,684 0,629 0,59 0,56 0,537 0,518
5 0,841 0,684 0,598 0,544 0,506 0,478 0,456 0,439
6 0,781 0,616 0,532 0,48 0,445 0,418 0,398 0,382
7 0,727 0,561 0,48 0,431 0,397 0,373 0,354 0,338
8 0,68 0,516 0,438 0,391 0,36 0,336 0,319 0,304
9 0,638 0,478 0,403 0,358 0,329 0,307 0,29 0,277
10 0,602 0,445 0,373 0,331 0,303 0,282 0,267 0,254
11 0,57 0,417 0,348 0,308 0,281
12 0,541 0,392 0,326 0,288 0,262 0,244 0,23 0,219
13 0,515 0,371 0,307 0,271 0,243
14 0,492 0,352 0,291 0,255 0,232
15 0,471 0,335 0,276 0,242 0,22 0,203 0,191 0,182

Cech = 0,38 < C° (=0,59) => Les variances sont homogènes


239
Puisque les variances des groupes sont homogènes on va
comparer les variances de la population estimée:

Si H° est vraie ces deux variances doivent être comparables

240
i n j
1
donné
Pour un groupe Gj σ 2
pop  
n j - 1 i 1
(x ij - m j ) 2

 Pour l’ensemble des Gj j k i n


1 1 j

(en supposant que les k groupes S12    (x - m ) 2

k j1 n j - 1 i1
ij j
comportent le même nombre n de valeurs)

ddl = n = k(n-1) (=4(6-1) = 20 dans l’exemple)


j k I  nj
1 1
σ 2pop  S12    (x - m ) 2
( = 18,65 dans l’exemple)
k j1 n j - 1 i 1
ij j

241
m1 , m2 , … mj, …mk sont les éléments constituant l’échantillon de la
population des moyennes: On peut donc à partir de cet échantillon estimer
1 j k
La moyenne de la population des moyennes μ m  m  
k j1
mj

j k
1
La variance de la population des σ 2m   j
k - 1 j1
(m - m) 2

moyennes
j k
n
s pop
2
 S22  nσ 2m  
k - 1 j1
(m j - m) 2 ( = 154,28 dans
l’exemple)
Avec un ddl n = k- 1 ( = (4-1)= 3 dans l’exemple)

242
Si H° est juste S22 = S12
Les variances estimées S12 et S22 doivent être voisines
MSM = MSE

Si H° est fausse (donc si H1 est juste):

S22 = S12 + n (variance intergroupe)


en effet on démontre
que dans ce cas MSM = MSE + n (variance intergroupe)

243
TEST F
S22 154,28
Fech  2  8,27 F ( a = 0,05 ; n1 = (k-1) = 3 , n2 = (k(n-1) =20 ) =
S1 18,65 3,1

Fech > F° l’hypothèse émise H° est rejetée: Les différences de


moyennes constatées ne proviennent pas uniquement du hasard:
les groupes (ici laboratoires) ne sont pas comparables
Si Fech < Fa on aurait accepté l’hypothèse H°

244
Exemple de calcul avec EXCEL

L1 L2 L3 L4

X1 41 36 50 43
X2 46 39 51 53
X3 54 43 51 47
X4 44 38 37 53
X5 42 37 47 53
X6 45 35 47 50
Var 21,47 8,00 28,17 16,97
moy 45,33 38,00 47,17 49,83

moyenne des variances 2


18,65 S 1

2
6* var(ensemble des moyennes) 154,28 S 2
S 22 154,28
Fech  2   8,27 F° ( α = 0,05 ; 3 , 20 ) = 3,1
S1 18,65

245
Faiblesse du protocole SFSTP
1992
UNOP/CAP-PME
15-19 Janvier 2017
Pr BOUDIS Hakim

246
Substance à analyser à Appareil de Réponse de l’appareil
la concentration x mesure y
Y = f (x )
Résumé du plan expérimental de validation
 Jour 1  Jour 2 jour 3
Réponse y Réponse y

 
     

     
   
 
Concentration x Concentration x
PA FR

Étude de la linéarité et de la spécificité


Étude de l’exactitude
Étude Fidélité :
faite sur 100 % de la FR
3 jours de suite (au moins 6 répétitions par jour)
Ce guide présente cependant un certain nombre de faiblesses 247
-Problèmes pratiques posés par l’application du guideline SFSTP 1992
-1 réponses = résultats ? (étude de la linéarité)
ICH Q2(R1)
La linéarité d’une procédure analytique est sa capacité à fournir des
résultats directement proportionnels à la concentration (quantité) en
substance présente dans l’échantillon
60% de C°: X1 = 0,6 C°  Réponse y1
SFSTP => réaliser une
80% de C°: X2 = 0,8 C°  Réponse y2
gamme étalon de 5
concentrations encadrant la 100% de C°: X3 = 1,0 C°  Réponse y3
concentration théorique C° 120% de C°: X4 = 1,2 C°  Réponse y4
à déterminer
140% de C°: X5 = 1,4 C°  Réponse y5
Y = Réponse Réponses = Résultats ?

y5
y4
Y = aX + b
y3
y2 X = Concentrations
y1
x1 x2 x3 x4 x5
248
-2 Problème posé pour prouver que l’ordonnée à l’origine n’est statistiquement
différente de zéro

Y = ax + b
Puisque la méthode est spécifique quand x = 0 => y = 0
or si Y = ax +b quand X =0 => Y= b
il faut donc prouver que b n’est pas statistiquement différent de zéro
b - 0 b
La valeur tb  
s s
b b

est comparé à la valeur t°(a, n = n-2) lue dans la table de STUDENT

Si tb < t°  L’ordonnée à l’origine est statistiquement égale à zéro


249
3.Problèmes pratiques soulevés par l’application de ce test
b-0 b Comparé à t° (a , n = n-2)
tb  
σb σb
Pour que b soit statistiquement considéré comme non différent de zéro
il faut que tb < t° or sb = f( dispersion des points autour de la droite)

R R
*
*
*
* *
*
*
* *
*
x x

b = 0,1 sb = 0,1 b = 10-5 sb = 10-6

tb = 1 t°(0,05,3) = 3,18 tb = 10 t°(0,05,3) = 3,18

tb < t° => b comparable à 0 tb > t° => b non comparable à 0 !

Plus la dispersion des points autour de la droite est importante plus il est facile de
prouver que b est statistiquement égal à 0 !!!!
250
4- Problème posé pour déterminer l’EXACTITUDE

SFSTP 1992 L’exactitude se détermine en calculant l’intervalle de


confiance de l’index de recouvrement moyen (IRM) calculé pour la
forme reconstituée en se servant de l’équation de régression y = ax + b
obtenue pour le principe actif.

Si l’intervalle de confiance contient la valeur 100 alors la méthode est


déclarée exacte

Méthode « exacte » donc valide

Méthode « inexacte » donc non valide

95 100 105

251
Problèmes pratiques soulevés par l’application de ce Test

Méthode « exacte » donc valide

Méthode « inexacte » donc non valide

95 100 105

Quelle crédibilité donner à ma validation dans la mesure où plus mes données


sont « variables » plus elles ont de chance d’être acceptables

Quelles sont les conséquences si je considère, malgré tout, que la méthode est
exacte?

252
EN RESUME

L’application stricte du guide SFSTP 1992 pose des problèmes d’interprétation lorsque
la variabilité des mesures est très faible.

De plus, souvent, les termes employés pour définir les critères de validation n’ont pas
toujours la même signification selon le texte auquel on se réfère

CONFUSION DANS LE TEXTE ICH Q2(R1) ENTRE LINEARITE ET


FONCTION DE REPONSE

CONFUSION SELON LE TEXTE AUQUEL ON SE REFERE [ICH Q2(R1)


OU LE TEXTE ISO 5725 , 1996] ENTRE JUSTESSE ET EXACTITURE

253
CONFUSION DANS LE TEXTE ICH Q2(R1)
ENTRE LINEARITE ET FONCTION DE REPONSE

ICH Q2(R1)
La linéarité d’une procédure analytique est sa capacité à fournir des résultats
directement proportionnels à la concentration (quantité) en substance présente
dans l’échantillon

Confusion entre
linéarité
et
fonction de réponse

ICH Q2(R1)
La linéarité peut être évaluée par un examen visuel du graphique des réponses en
fonction de la concentration.

254
La linéarité peut être évaluée par un examen visuel du graphiques des réponses
en fonction de la concentration.

L’exigence de la linéarité ne peut pas s’appliquer aux réponses

Réponse = f (c)
f: fonction de réponse

Réponse

*
*
*
* Concentration
introduite
*
f doit simplement être strictement monotone
255
La linéarité d’une procédure analytique est sa capacité à fournir des résultats
directement proportionnels à la concentration (quantité) en substance présente dans
l’échantillon

L’exigence de la linéarité ne peut s’appliquer qu’aux résultats


[concentration calculée] = a [concentration introduite] +b

Concentration
calculée *

*
*

* Concentration
*
introduite

256
La validation selon le protocole
SFSTP 2003-2006
UNOP/CAP-PME
15-19 Janvier 2017

257
Commission SFSTP, propose de revoir les
bases mêmes de la validation analytique pour
une démarche harmonisée, en distinguant
notamment les règles de diagnostic et les
règles de décision.

258
Guide SFSTP 2003-2006

Publication du Guide de validation de (2003-2006)

Revue Française « STP Pharma Pratique »


« Validation Des Procédures Analytiques Quantitatives : Harmonisation Des Démarches »

 Mai/juin 2003 (Généralités)


STP Pharma Pratique, 7, 2003, (101-138)
 Janvier/février 2006 (Statistique)
STP Pharma Pratique, 16,2006, (1-31)
 Mars/Avril 2006 (Exemples)
STP Pharma Pratique, 16,2006, (87-121)
Quel est l’objectif d’une procédure?

L’objectif d’une procédure est de pouvoir déterminer avec le plus d’exactitude


possible chacune des quantités (ou concentrations) inconnues qu’un laboratoire
aura à doser, puis à démontrer que l’écart entre ces concentrations et les
concentrations de références se situent dans les limites d’acceptation
[-l , +l ] fixées à priori pour chaque type d’application.

-l< x-u < +l


l= 2% pour les analyses d’une matière première
l= 5% pour un produit fini
l= 15% en analyse biologique

260
260
Quel est l’objectif de la validation?

C’est de pouvoir donner au laboratoire et aux autorités réglementaires des garanties


que chaque résultat qui sera obtenu dans le futur par cette méthodologie sera
suffisamment proche de la vraie valeur de l’échantillon à doser, c’est-à-dire que la
probabilité que |X-U| < l , doit être supérieure ou égale à une valeur minimale b (par
exemple 90 ou 95 %)

Prob (|X-U | < l ) ≥ b


La probabilité que |X-V| < l doit être supérieure ou égale à une valeur minimale b (par
exemple 90 ou 95 %)
|X-U | = erreur totale = Biais + Écart type

261
261
REGLE DE DIAGNOSTIC & DE DECISION

Méthodologie basée sur l’erreur totale

• Erreur totale = Er. systématique + Er. Aléatoire


• Er. systématique = Biais = Justesse de la méthode
• Er. aléatoire = Variance = Fidélité de la méthode

Outil de décision: Profil d’exactitude

• Evaluer la capacité de la procédure à fournir des résultats dans les limites


d’acceptation: outil visuel de décision.
• Prédire la fiabilité du comportement de la méthode analytique lors de son
utilisation en routine: gestion de risque.

262
Guide SFSTP 2003-2006

l’application du protocole de validation : (2003-2006)

- Calcul des fonctions de réponse.


- Calcul des prédictions inverses après alignement des réponses.
- Estimation de la fidélité.
- Estimation de la justesse.
- Estimation de l’exactitude.
- Calcul des intervalles de tolérance et du profil d’exactitude.
- Détermination de la linéarité.

263
1- détermination pratique du BIAIS de la FIDELITE INTERMEDAIRE et de
l’ERREUR TOTALE

Après avoir vérifié la spécificité de la méthode d’analyse on opère sur deux


ensembles d’échantillons

• 3 séries de standards d’étalonnage (SE)


• 3 séries de standards de validation (SV)

Les SE peuvent être réalisés sans la matrice (si on a démontré qu’il n’y a pas d’effet
matrice) ou avec la matrice.

Les SV doivent toujours être réalisés avec la matrice (Forme pharmaceutique


reconstituée)

SE 1 SE2 SE3

SV 1 SV2 SV3
264
SE : Standards d’Etalonnage

Réponse = Y

A chaque niveau de
concentration il faut faire au
minimum 2 répétitions

X = concentration

Le nombre de niveaux de concentration a utiliser est laissé à


l’appréciation de l’analyste (il peut être de 1, 2 , 3 …)

À Partir des SE on va déterminer les différentes fonctions de réponse y = f(x) c’est à


dire les relations mathématiques pouvant relier la réponse Y à la quantité ou à la
concentration X de substance à doser.

265
Réponse = Y

X = concentration

Différentes fonctions de réponse Y = f(x) peuvent être testées


y = ax + b [droite ne passant pas par l’origine = linéaire]
y = a1x [droite passant par l’origine prenant en compte
l’ensemble des points = linéaire passant par zéro]
Y = axb [puissance]
Y = a2x [droite passant par zéro et un point de gamme (en
général le 100 %) = linéaire 0-100%]

Y = ax2 + bx + C [polynomiale de degré 2] Etc..


266
SV : Standard de Validation
Réponse = Y

A chaque niveau de
concentration il faut faire au
minimum 3 répétitions

X = concentration

Le nombre de niveaux de concentration a utiliser est au moins de 3

et obligatoirement de 5 pour les validations pharmaceutiques


(exigence linéarité ICH) .

267
Si pour un niveau de concentration les quantités introduites ne sont pas identiques pour
toutes les séries il est indispensable de procéder à un alignement des réponses sur la
valeur concentration moyenne( ou la concentration théorique du niveau considéré)

Alignement des réponses des SV

On démontre que l’alignement des n répétitions d’un niveau donné s’effectue comme
suit
YNi = yi + f(xm) – f(xi)
f est la fonction de réponse testée avec les SE

Prédiction inverse

on utilise les fonctions de réponses réciproques pour calculer les quantités ou


concentrations x* des standards de validation à partir des réponses alignées R de
l’appareil de mesure
x* = f-1 ( Y )

268
Exemple : dosage d’un PA dans un soluté
( teneur théorique est de 50 mg.ml-1)

SERIE 1 SERIE 2 SERIE 3


[C] [C] [C] [C]
SE Théorique introduite
Absorbance
introduite
Absorbance
introduite
Absorbance

Niveau 1 40 39,9 0,6 40 0,596 40,2 0,603


80%
40 40,1 0,598 40,1 0,601 39,9 0,597
Niveau 2
45 45 0,68 44,9 0,678 45 0,679
90%
45 44,9 0,675 45,2 0,679 45,1 0,68

Niveau 3 50 50,2 0,75 50 0,748 50,1 0,752


100%
50 49,8 0,748 49,8 0,747 50 0,75

Niveau 4 55 54,8 0,825 55,1 0,827 55 0,825


110%
55 54,9 0,827 54,8 0,826 55,2 0,828

Niveau 5 60 59,8 0,9 60 0,897 60,2 0,903


120%

269
Fonction de réponses testées avec les SE

Y = aX + b Y = a1 X Y = a2 X (100 %)
Série 1 b = -0,00236
(Jour 1) a = 0,01507 a1 = 0,01502 a2 = 0,01498
Série 2 b = -0,00131
(jour 2) a = 0,01503 a1 = 0,01500 a2 =0,01498
Série 3 b = 0,00288
(jour 3) a = 0,01496 a1 = 0,01501 a2 =0,01500
270
SE SE SE
Série 1 Série 2 Série 3

[C] [C] [C] [C]


SV théorique Introduite
ABS
Introduite
ABS
Introduite
ABS

40 40,1 0,601 40 0,596 40,1 0,603


Niveau 1 40 39,9 0,598 39,9 0,604 40 0,6
80% 40 39,8 0,599 39,9 0,602 39,8 0,597
40 40 0,6 40 0,598 40 0,601
45 45 0,68 45,1 0,68 45 0,678
Niveau 2 45 44,9 0,68 45,2 0,68 45,1 0,681
90% 45 45,2 0,681 45 0,682 44,8 0,678
45 45 0,682 44,9 0,679 44,8 0,68
50 50,1 0,75 50,1 0,751 50,2 0,752
Niveau 3 50 50,2 0,748 50,2 0,749 50,1 0,75
100% 50 50,2 0,749 50,2 0,748 50,2 0,749
50 50 0,748 49,9 0,75 50 0,75
55 55 0,825 55,1 0,827 55 0,828
Niveau 4 55 55 0,827 55,1 0,826 55 0,826
110% 55 54,9 0,825 54,9 0,826 54,9 0,827
55 55,1 0,827 54,9 0,825 55,1 0,824
60 61 0,9 59,8 0,9 61 0,897
Niveau 5 60 60 0,89 59,9 0,895 60 0,895
120% 60 60 0,9 60 0,899 60 0,897
60 59,9 0,895 59,9 0,898 59,9 0,9
271
Prédiction inverse après alignement des réponses des SV
X= (Y-b)/a X= Y/a1 100% X = Y/a2
[C] Vraie
S1 S2 S3 S1 S2 S3 S1 S2 S3
(introduite)
40 39,94 39,75 40,03 39,91 39,73 40,07 40,02 39,79 40,09
Niveau 1 40 39,94 40,38 39,93 39,91 40,36 39,97 40,02 40,42 39,99
80% 40 40,11 40,25 39,93 40,07 40,23 39,97 40,19 40,29 39,99
40 39,98 39,88 39,99 39,94 39,86 40,04 40,05 39,92 40,05
45 45,28 45,24 45,14 45,27 45,23 45,16 45,39 45,29 45,18
Niveau 2 45 45,38 45,14 45,24 45,37 45,13 45,26 45,49 45,19 45,28
90% 45 45,15 45,47 45,34 45,13 45,46 45,36 45,26 45,53 45,38
45 45,42 45,37 45,48 45,40 45,36 45,50 45,53 45,43 45,52
50 49,83 49,96 49,89 49,83 49,96 49,89 49,97 50,03 49,92
Niveau 3 50 49,60 49,73 49,86 49,59 49,72 49,86 49,73 49,80 49,88
100% 50 49,66 49,66 49,69 49,66 49,66 49,69 49,80 49,73 49,72
50 49,80 50,09 49,96 49,79 50,09 49,96 49,93 50,17 49,98
55 54,91 55,02 55,17 54,92 55,02 55,16 55,07 55,11 55,18
Niveau 4 55 55,04 54,95 55,04 55,05 54,96 55,02 55,21 55,04 55,05
110% 55 55,01 55,15 55,21 55,02 55,16 55,19 55,17 55,24 55,21
55 54,94 55,08 54,80 54,95 55,09 54,79 55,11 55,17 54,82
60 58,88 60,17 58,79 58,91 60,19 58,75 59,08 60,28 58,78
Niveau 5 60 59,22 59,74 59,65 59,25 59,76 59,62 59,41 59,85 59,65
120% 60 59,88 59,91 59,79 59,91 59,92 59,75 60,08 60,01 59,78
60 59,65 59,94 60,09 59,68 59,96 60,05 59,85 60,05 60,08
272
Calcul du BIAIS , CV Répétabilité, CV Fidélité intermédiaire et Erreur totale
X* = (Y-b)/a
[C] Vraie
S1 S2 S3
Introduite
40 39,94 39,75 40,03 Biais % 0,02
40 39,94 40,38 39,93 recouv % 100,02
40 40,11 40,25 39,93 VARRé (Intra) 0,03
40 39,98 39,88 39,99 VARInte r 0,00
moyenne 39,99 40,06 39,97 VARFi 0,03
Variance 0,01 0,09 0,00 CVRé 0,42
moy géné 40,01 MSM 0,01 CVFi 0,42
v ar géne 0,03 MSE 0,03 Err Totale 0,44
M o y e nne ([C ] d é te rm iné e s ) - [C ] vra ie )
B IA IS %  *100
[C ] vra ie
MSM = n*Variance des Moyennes MSE = Moyenne des Variances
(n = nombre répétitions)
Si MSE < MSM VARintra = MSE et VARinter = (MSM-MSE)/n
SINON VARintra = VAR géné et VARinter = 0
VAR Ré = VARintra C V Ré % 
V A R Ré
*100
mo ye nne gé né ra le

VARFi= VARintra + VARinter V A R FI


C V FI %  *100
mo ye nne gé né ra le
273
CPA-PME/UNOP
VALIDATION
DES PROCÉDURES ANALYTIQUES

Revalidation d’une procédure analytique

274
Limites d’ajustement au-delà desquelles
une revalidation est nécessaire

275
Introduction
Revalidation complète ou partielle (de certains critères) nécessaire si
des modifications significatives dans les cas suivants:

 Substitution de l’un des produit


 Changement de la procédure analytique
 Problème analytique lié à l’équipement par exemple
 Changement des critères d’acceptation
 Transfert à un autre laboratoire
Cas d’une procédure HPLC
pH de la phase mobile : ± 0,2 unité de pH de la valeur ou de la
gamme indiquée

Concentration des sels dans les tampons : ± 10% uniquement si la


variation de pH autorisée est respectée
Cas d’une procédure HPLC
Rapport des composants dans la phase mobile :

 Les limites suivantes s’appliquent aux composants mineurs de la phase mobile


(spécifiés à 50% ou moins)

 Quantités ajustées à ±30% ou ±2% par absolu (c.-à-d. par rapport à toute la phase
mobile

 Cependant le changement d’aucun composant ne peut excéder de ±10% de l’absolu


et la concentration finale de tout composant ne peut être réduite à zéro
Cas d’une procédure HPLC
Exemple d’ajustement pour un mélange binaire :

Composé concerné – 50% Limite composé Limite PM Conclusion


± 30% Ne pas dépasser ±10%
On peut aller à ± 2%
A(50): B(50) A ou B ±30% A ou B ±15% absolu > ±10% A(40): B(60)
Pas plus de ±10% absolu A(60): B(40)
A(95):B(5) B ±30% B ±1,5% absolu <±2% A(97): B(3)
On peut aller à ±2% A(93): B(7)
A(2):B(98) A ±30% A ±0,6% absolu < ±2% A(1,84): B(98,6)
On ne peut pas aller à A(2,6): B(97,4)
±2%
Cas d’une procédure HPLC
Exemple d’ajustement pour un mélange tertiaire :

Composé concerné Limite composé Limite PM Conclusion


– 50% ± 30% Ne pas dépasser ±10%
On peu aller à ± 2%
A(60): B(35): C(5) B ou C ±30% de B ±10,5% absolu > ±10% B[25%-45%]
Pas plus de ±10% absolu
±30% de C ±1,5% absolu < ±2% C[3%-7%]
On peut aller ±2%

Compléter à 100% avec le composé A


Cas d’une procédure HPLC
Longueur d’onde du détecteur UV-Visible: Au plus ±3nm

Longueur de la colonne : ±70%

Diamètre interne de la colonne: ±50%

Débit de la phase mobile : ±50%


Cas d’une procédure HPLC
Volume injecté :
Peut être réduit dans les limite admises de précision et de détection
Peut être augmenté jusqu’à deux fois le volume indiqué s’il n’y a aucune incidence sur
la ligne de base, la forme du pic, la résolution, la linéarité et le temps de rétention.

Dimension des particules : Réduite de 50%

Température de la colonne : ± 20%


Cas d’une procédure CG
Épaisseur du film : -50% et +100%

Température de la colonne : ± 2%

Programme de la température du four : ± 2% pour la température et ± 20%


Pour les temps de maintien ou de changement de température
CPA-PME/UNOP
VALIDATION
DES PROCÉDURES ANALYTIQUES

Proposition
d’un modèle de rapport de validation
284
Rapport de mise au point et validation
d’une procédure analytique

285
Rapport intégrant les renseignements distincts, permettant de
documenter exhaustivement l’ensemble du travail effectué est rédigé
Introduction
Présenter la problématique liée à la mise au point d’une nouvelle
procédure analytique :

- Substance ou produit non monographié


- Procédure alternative pour une simplification dans le cadre d’une
libération en routine par exemple
I. Sélection de la procédure analytique

 Adaptée d’une procédure pharmacopée


 Procédure publiée
 Adaptée d’un procédure publiée ou de fabricant

Justification de chaque paramètre ajusté et de chaque étape adaptée


II. Réactifs – Matériels – Méthodes
 Réactifs: Nom – Laboratoire – Pureté
 Solutions: Concentrations
 Échantillons et substances de références:
Quantité – Mode d’échantillonnage – Lots – Certificats d’analyse …)
II. Réactifs – Matériels – Méthodes
 Matériels :
Statut de qualification, de vérification ou d’étalonnage des équipement ou
des instruments
II. Réactifs – Matériels – Méthodes
 Méthode :
- Préparation des solutions standards et solutions échantillons avec les
potentiels prétraitement (dilutions – extractions …)
- Conditions opératoires liées à l’appareillage
- Plan des expérimentations (N° de lots, nombre d’essais et d’analystes,
critères à varier, séquence d’injections, dates de réalisation des expériences).
- Formules de calculs
III. Prévalidation de la procédure analytique

 Validation de la spécificité de la procédure analytique


 Détermination de sa limite de détection
 Étude de la stabilité des solutions standards et échantillons
 Étude de l’effet de la matrice
 Validation des dilutions
 Validation du rendement de l’extraction
 Seuil de détection
 Seuil de quantification
Objectifs – Méthodologies – Résultats – Interprétations des résultats
III. Prévalidation de la procédure analytique

 Choix du protocole de validation


 Préparation des standards d’étalonnage et de validation
IV. Validation de la procédure analytique

 Plan d’expériences
Données bruts des standards d’étalonnage et de validation
 Fonctions de réponses
 Résultats des prédictions inverses après alignement
IV. Validation de la procédure analytique
Résultats de l’étude statistique

Dans un tableau et pour chaque niveau de concentration et pour chaque


modèle mathématique :

 Biais relatif
 CV de répétabilité et de fidélité intermédiaire
 Erreur totale
 Intervalle de tolérance [min,max]
IV. Validation de la procédure analytique

 Profil d’exactitude de chaque modèle mathématique


 Choix du modèle mathématique
IV. Validation de la procédure analytique

 Estimation de la linéarité

Résultats : Droite de régression – coefficient de détermination


Interprétation des résultats
V. Conclusion

 Procédure mise au point et validée selon la démarche statistique de


la commission SFSTP 2003-2006
 Procédure validée selon les exigences ISO 17025 et ICHQ2(R1)
 Le profil d’exactitude garantie que la méthode restera valide dans le
futur.
VI. Références

 Citer la ou les références de la mise au point de la procédure


analytique
 ICH Q2(R1) 2005
 SFSTP : citer les références et les intitulés des trois articles
VII. Annexes

 Tous les calculs intermédiaires, les chromatogrammes ou les spectres


 Identification des données de sauvegardes informatiques
CPA-PME/UNOP
VALIDATION
DES PROCÉDURES ANALYTIQUES

Proposition
d’un modèle de procédure de validation
301
Procédure de validation d’une procédure
analytique

302
I. Objectif
Décrire la démarche de validation d’une procédure analytique selon
SFSTP 2003-2006 en se conformant aux exigences règlementaires ISO
17025 et ICHQ2(R1)
II. Applications
Validation des procédures analytiques pour:
 Les tests d’identification
 Essais limites ou de teneur en impuretés
 Dosage (teneur ou dissolution)
III. Responsabilités
 Laboratoire
 Personnel
IV. Documents et référentiels
 ICHQ2(R1)
 ISO 17025
 ISO CEI 99:2007
 Les articles SFSTP (Parties I, II, III)
V. Terminologie et abréviations

 Vocabulaire de validation et vocabulaire statistique en plus des critères


de validation
 Développer le glossaire
VI. Critères à valider pour chaque type de
procédure

 Tableau de ICHQ2(R1)
VIII. Formules statistiques

 Toutes les formules de calcul de la démarche statistique SFSTP 2003-


2006.
 Construction du profil d’exactitude
 Droite de régression de l’estimation de la linéarité

Critères d’acceptation