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Coupes Histologiques

1. Fixation

Les parties prélevées sont fixées dans du FAA pendant 24h.


(FAA : 90 ml éthanol 70% / 5ml acide acétique glacial / 5 ml formaldéhyde 35 %.)
Les objets sont ensuite rincés dans de l’alcool 70 % et y sont conservés jusqu’à
inclusion dans la paraffine.

2. Inclusion dans la paraffine


2.1. Déshydratation
Ethanol 70° 2 heures
Ethanol 80° 2 heures
Ethanol 96° 2 heures
Ethanol 96° : butanol (2/3 : 1/3) 2 heures
Ethanol 96° : butanol (1/3 : 2/3) 2 heures
Butanol + quelques gouttes d’érythrosine 12 heures
Butanol ( 5 minutes

2.2. Infiltration
Butanol + quelques pastilles de paraffine :
Etuve 37° 12 heures
Etuve 60° 12 heures

2.3. Enrobage
De la paraffine fondue est versée dans des nacelles en porcelaine préalablement
enduites de glycérine. Les objets y sont déposés. Lorsque la paraffine est
partiellement solidifiée, les nacelles sont plongées dans de l’eau froide pour
faciliter le démoulage des blocs.

3. Coupes
Les blocs de paraffine sont fragmentés afin d’isoler les objets. Le bloc contenant
un objet est taillé de façon à former un parallélépipède (les surfaces planes
doivent être parallèles pour que les rubans de paraffine soient réguliers) et fixé
sur un support en bois. Celui-ci est ensuite placé sur le microtome dont le
couteau est incliné d’un angle de 8° par rapport à la verticale. L’épaisseur des
sections réalisées est de 5 µ m.
Les rubans de sections sériées sont déposés sur une lame porte-objet
préalablement enduite d’une solution de Haupt (10g de gélatine, 15ml de
glycérine , 2g de phénol pour 100 ml d’eau) pour augmenter leur adhésion. Une
goutte d’eau formolée 4% facilite l’étalement du ruban de paraffine. Les lames
sont ensuite séchées sur une plaque chauffante (40°C).

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4. Coloration
Les coupes sont colorées à l’hématoxyline et au Fast Green. L’hématoxyline
colore la chromatine en noir. Le Fast Green colore les parois cellulosiques et le
cytoplasme en bleu turquoise.
Histoclear I 30 minutes
Histoclear II 30 minutes
Histoclear / butanol 10 minutes
Butanol 10 minutes
Butanol / éthanol 96° 10 minutes
Ethanol 96° 10 minutes
Ethanol 70° 10 minutes
Ethanol 50° 10 minutes
Ethanol 30° 10 minutes
Eau distillée 10 minutes
Alun ferrique 6 à 12 heures (mordançage)
Eau distillée rinçage
Hématoxyline 6 à 12 heures
Eau distillée rinçage
Alun ferrique 2 à 5 minutes (à surveiller)
(dédifférenciation)
Eau distillée rinçage
Ethanol 30° 5 minutes
Ethanol 50° 5 minutes
Ethanol 70° 5 minutes
Ethanol 96° 5 minutes
Ethanol 96° / butanol 5 minutes
Butanol 5 minutes
Fast Green 5 minutes
Butanol I 5 minutes (dédifférenciation)
Butanol II 5 minutes (dédifférenciation)
Butanol / histoclear 5 minutes
Histoclear II 5 minutes

Après coloration, les lames sont montées dans du baume de Canada. Les coupes
sèchent plusieurs jours avant d’être nettoyées à l’acétone et observées au
microscope optique.

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