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Techniques immunologiques

CP-2e année-Module immunologie

Dr LAALA Samia
Définition d’un antigène
Un antigène est une somme de déterminants antigéniques (« épitopes »)
qui sont autant de sites de liaisons spécifiques à des anticorps paratope
Propriété de la réaction Ag/Ac
REACTION REVERSIBLE

Liaisons faibles

(électrostatiques, H, Hydrophobe, Van der Waals)

Ag + Ac Ag-Ac

Liaisons rompues en variant les paramètres physico-chimiques


(pH, t¡ ,force ionique)

RELATION SPÉCIFIQUE

Spécificité stéréochimique entre paratope et épitope


Ac polyclonaux
REACTION SPECIFIQUE

Spécificité stéréochimique entre paratope et épitope

Les anticorps polyclonaux sont un mélange


d'anticorps reconnaissant différents épitopes sur
un antigène donné, chaque Ac étant sécrété par
un clone de plasmocyte différent.
Réponse polyclonale

production d’AC spécifiques


Georges Köhler et César Milstein., 1975
Situation Polyclonale: Situation Monoclonale:
plusieurs épitopes sont reconnus par un seul épitope est reconnu par un seul type
plusieurs types d’anticorps spécifiques d4anticorps spécifique
Spécificité et réaction croisées
Techniques
immunologiques
BUT:
-Détection d’un antigène ou un anticorps dans un milieu : méthode qualitative
-Dosage d’un antigène ou d’un anticorps dans un milieu : méthode quantitative

Méthodes:

-Détection d’un signal visible directement : méthodes de précipitation et


agglutination

-Détection d’un signal visible indirectement :


-marqueur radio-isotypique
- marqueur enzymatique
- marqueur fluorescent
Méthodes d’immunoprécipitation

Il existe une concentration optimale en Ag pour laquelle la précipitation est


maximale.
La courbe passe par un maximum puis redescend jusqu’à ce qu’on ne puisse plus
observer de précipité, or les Ac sont à la même concentration dans tous les tubes

Réversibilité de la liaison Ag-Ac


Méthodes d’immunoprécipitation

Excès d’Ac Zone d’équivalence Excès d’Ag


Méthodes d’agglutination

L'agglutination = Attachement ou réunion en amas, de particules


support d'un Ag sous l'action d’Ac spécifiques.

Si présence Ag et Ac correspondant : réaction d’agglutination

En présence d’Ac correspondant aux Ag à la surface des GR, ces


derniers au lieu de rester séparés dans le plasma, s'aggrègent les
uns aux autres et forment des agglutinats visibles à l'œil nu.
Méthodes d’agglutination
Méthodes d’agglutination

Erwinia amylovora
Méthodes d’agglutination

Réaction (+)

Réaction (-)
Réaction (-) Réaction (+)

Clavibacter michiganensis sepidonicus Pseudomonas seringae pv pisi


Méthodes d’immunomarquage
L’utilisation des anticorps pour le diagnostic des maladies phytopathigènes
représente une méthode spécifique et rapide. Au Laboratoire de diagnostic en
phytoprotection, les tests sérologiques sont utilisés pour détecter une
phytopathogènes directement dans les tissus végétaux ou pour identifier une
espéces bactérienne isoler sur milieu de culture gélosés.

Technique puissante couramment utilisée en recherche et en diagnostic


Basée sur la très grande spécificité des anticorps pour leurs antigènes
Méthodes d’immunomarquage

Exp
Méthodes d’immunomarquage

Les fluorophores
Principalement en microscopie (rhodamine, l’isothiocyanate de fluorescéine)
Principe de la technique ELISA

La technique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) est une


technique immuno-enzymatique qui permet de visualiser une réaction
antigène-anticorps grâce à une réaction colorée produite par l'action sur
un substrat d'une enzyme préalablement fixée à l'anticorps.

Détection des virus dans un végétal

Détection des bactéries à partir du végétal ou bien isolées


sur un milieu de culture
ELISA

ELISA Sandwich
Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)

Méthode directe: DAS-ELISA (Double antibody sandwich)

Sensibilisation des cupules


1ére étape d’une plaque en polystyrène
par les anticorps spécifiques

2 éme étape Dépôt de l’échantillon à


tester (antigène)

Dépôt du conjugué : anticorps spécifique


3éme étape couplé à un marqueur (enzyme : ‘Phosphatase
alcaline)

Dépôt du substrat P-nitrophénol qui est


4éme étape un composé jaune
P-nitrophényl phosphate
Méthode directe: DAS-ELISA (Double antibody sandwich)

Détection par spectrophotométrie à 405 nm

Lecteur de plaque ou
spectrophotomètre

Plaque de microtitration en polystyrène

L’activité enzymatique est proportionnelle au titre de l’Ag.

(Nolasco et al., 2002)


Méthode directe: DAS-ELISA (Double antibody sandwich)

Détection de soja OGM dans des échantillons alimentaires et quantification


(Ghazi, 2007)

Avantages
La technique d'immuno-empreinte (Direct Tissue Blot
Immuno Assay)

La technique d'immuno-empreinte (Direct Tissue Blot Immuno Assay) est une


technique sérologique qui présente de nombreux avantages pour la réalisation
des enquêtes épidémiologiques. Elle sera présentée, ainsi que les résultats
obtenus sur la situation des vergers d'agrumes
La technique d'immuno-empreinte (Direct Tissue Blot
Immuno Assay)

Sur champs En laboratoire


Méthodes d’immunomarquage-ELISA

detection of C.m. ssp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum


Méthodes d’immunomarquage-ELISA
Méthodes d’immunomarquage-ELISA
Méthodes d’immunomarquage-ELISA

Détection de soja OGM dans des échantillons alimentaires et quantification


(Ghazi, 2007)
Technique d’immunofluorescence
IMMUNOFLUORESCENCE
L’immunofluorescence est utilisée pour la détection des bactéries phytopathogènes
exp : Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus dans les tiges ou les tubercules
de pomme de terre.

L’utilisation d’un composé fluorescent (isothiocyanate de fluorescéine) conjugué


àun anticorps constitue la base de cette technique.
C’est grâce à l’observation microscopique sous une lumière ultraviolet qu’il est
possible de visualiser les bactéries.

les cellules bactériennes émettent une fluorescence vert brillant grâce à


L’isothiocyanate de fluorescine.
Technique d’immunofluorescence
Technique d’immunofluorescence
Immunofluorescence

microscope à immunofluorescence

Réaction (-) Réaction (+)


Méthodes d’immunomarquage-Western Blot

Méthodes d’immunomarquage-Western Blot


Méthodes d’immunomarquage-Western Blot
Méthodes d’immunomarquage-Western Blot
Méthodes d’immunomarquage-Western Blot
Méthodes d’immunomarquage-Western Blot
Maladies virales des agrumes
CTV : Citrus Tristeza Virus
Maladies virales de la vigne

Grapevine rupestris stem pitting virus Grapevine Chlosterovirus


Maladies virales des rosacées à noyaux
La Sharka (PPV)
Tumeur bactérienne

Sintomi prodotti da altri patogeni e da altre


cause
Galle di Meloidogine sp. su pesco
e calli cicatriziali
Bacteries des rosacées à noyaux
Bacterial dieback of Peach
Causal agent: Pseudomonas syringae pv. persicae
Host: Peach
EPPO A” quarantine disease

http://www.atlasplantpathogenicbacteria.it

Temperature 15-28°C
Bacteries des rosacées à noyaux
Bacterial leaf spot, shot hole, black spot
Causal agent: Xanthomonas arboricola pv. pruni

Main Hosts
Peach
Japanese bush cherry
Plum
Apricot
Prunus spp.

http://www.atlasplantpathogenicbacteria.it

EPPO A2 alert list,


Phytophthora ssp
Root rot (pourriture des racinaire)

Symptômescausés parPhytophthora spp.

Dépérissement rapide des arbres


L’oeil de Paon
SpilocaeaoleaginaTavelure de l’olivier
(Lopset al., 1993),

Défoliation prématurée (automne d'été-début)


La chute des fruits après l'attaque des pédoncules provoque une
réduction de la photosynthèse
Réduction des fleurs et avortement des bourgeons
Réduction de la productivité
Une éventuelle infection par P. savastanoi.
Verticillium dahliae
Agent causal du dépérissement de l’olivier(Tjamos, 1993);

C’est l'une des maladies les plus importants qui affectent la culture de l'olivier
dans les vergers commerciaux, et niveau des pépinières Il provoque le
dépérissement puis la mort de l’arbre
Tuberculose de l’olivier
Pseudomonassavastanoipvsavastanoi (Varvaro&Martella,
1993);
Symptômetypiquesur les différentes parties de la plante

Jeunes tumeurs de couleur crème blanchâtre Tronc principal Sur branches


dans une jeune plantation (3-5 mm) devient plus sombres et plus sillonnées
(plus de 2,5 cm)

Contrôle en jauge Tige Feuilles Fruits


Maladies virales

Maladie virale causée par


Strawberry latent ringspot sadwavirus (SLRSV)
Fruits bosselés
Xylella fastidiosa
Xylella fastidiosa

Sur olivier
Sur agrumes
Xylella fastidiosa dissémination
Pourriture brune : Ralstonia solanacearum;

Diagnostic sur champs ou contrôle en végétation

Le premier stade de l’infection dans le champ se traduit par un flétrissement des feuilles du
haut de la plante à température élevée pendant la journée et un retour à l’aspect normal
pendant la nuit.
Au cours des premiers stades du flétrissement, les feuilles restent vertes, mais plus tard, un
jaunissement et une nécrose brune se développent. .
Le flétrissement d’une pousse ou de plants entiers devient rapidement irréversible et se
termine par l’effondrement et la mort de la plante 56
Pourriture brune : Ralstonia solanacearum;

Les vaisseaux sont touchés.


nous constatons des filets de vaisseaux très bruns. un exsudat bactérien laiteux
La moelle est humide et brunâtre par endroits. apparaît à la surface

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Pourriture brune : Ralstonia solanacearum;

talon (stolon) Contrôle sur lots de semences En stockage

Evolution des symptômes


Les premiers symptômes sont, surtout près du talon,
•1er stade un aspect légèrement vitreux ou translucide du tissu d’ une coloration jaune de
l’anneau vasculaire
• la décoloration vasculaire devient plus nettement brune et nécrosée.
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PLRV PVY

Myzus persicae Myzus persicae


Barley yellow dwarf virus, Genus Luteovirus
Cereal yellow dwarf virus, Genus Polerovirus
Family Luteoviridae

5-25% de perte

Rhopalosiphum padi

Croatia

● Albania
● ● ●

● Cyprus ●
● ●
Malta
Lebanon

●●Jordan

● ●
Bean leafroll virus
Genus Luteovirus
Family Luteoviridae

Affects fève, lentille et le pois chiche

Acyrthosiphon pisum
Croatia

Albania

● ●
● Cyprus●
● ●
Malta
●●
Lebanon

Jordan

Contrôle et Certification des
Semences et Plants
POURQUOI LE CONTROLE ET LA
CERTIFICATION

• Conditions de réussite d’une plantation


– Conditions pédoclimatiques
– Choix de l’espèce et de la variété
• Avoir des garanties sur les plants à utiliser
– État phytosanitaire
– Authenticité variétale

- Différentes catégories de matériel végétal


- Matériel végétal de départ et prébase
- Matériel végétal de base
- Matériel végétal certifié
- Matériel végétal standard
POURQUOI LE CONTROLE ET LA
CERTIFICATION

- Contrôle du matériel végétal de multiplication


- A l’installation
- En production
Contrôles en pépinières
- A l’installation
- En production
Contrôles au laboratoire
Virologiques,
bactériologiques,
nématologiques et
mycologiques
Certification d’un plant de pomme de terre
LA PYRAMIDE DE MULTIPLICATION

Plant candidat

Production de vitro plants

Production de mini
Tubercules
Pré base G0 G1—G2

Base SE - E

Certifiées A et B
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