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Document TP 2ème année (2020) E.N.S.A EL-HARRACH

T.P 1 :
II) Les milieux de culture et les techniques d’ensemencement

2.1) Les milieux de culture :


2.1.1) Les milieux de culture peuvent être classés selon leur consistance en:
- Les milieux de culture liquide (Ex : eau peptonnée, VBL, bouillon nutritif…)
- Les milieux de culture semi solide (Ex : Milieu Mannitol mobilité).
- Les milieux de culture solide (Ex : P.C.A, gélose nutritive, V.R.B.G,
O.G.A., ….).

Un milieu de culture liquide peut être rendue solide en lui additionnant de la


gélose ou agar-agar.

2.1.2) Leur Composition ; sur cette base on distingue :

2.1.2.1) Milieux synthétiques:


Ce sont des milieux de composition chimique bien définie c’est à dire les
substances chimiques qui les composent et indispensables à la vie des
microorganismes sont exactement connues. Ces milieux permettent l'étude de
besoins nutritifs des bactéries.
Ex : Citrate de Simmons, Urée-Indole …

2.1.2.2) Les milieux semi-synthétiques : Ce sont des mélanges de composés


chimiques purs et de substances naturelles empiriques (milieu de Chapman par
exemple, qui est également sélectif pour les Staphylocoques).

2.1.2.3) Les milieux empiriques ou complexes


Ce sont des milieux qui contiennent des ingrédients de composition
chimique indéterminée ; ils contiennent des composants comme les peptones,
les extraits de viande, les extraits de levures,...indispensables à la croissance
des microorganismes mais dont on ne connaît pas leur composition exacte
(exemple : bouillon nutritif,….

a) Milieux usuels : composition et préparation simple, peu coûteux et convenant


à un grand nombre de germes (Gélose nutritive ordinaire, eau peptonnée,
bouillon nutritif, …).
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b) Milieux enrichis :

Ils sont utilisés pour la culture des espèces exigeantes sur le plan
nutritionnel. Ils sont enrichis par l’adjonction de sang (cheval ou mouton),
d’extraits de levures, de viandes … Exemple : Gélose au sang

c) Milieux sélectifs :

Ces milieux contiennent des composés qui inhibent ou empêchent la


croissance de certains micro-organismes et stimulent celles des bactéries
qu’on cherche à isoler à partir de produits poly-microbiens. La sélectivité de
ces milieux peut être due :
- à la forte teneur en NaCl (cas du milieu de Chapman) ;
- à la présence de sels biliaires et cristal violet qui inhibent les GRAM +
(milieu Mac Conkey pour la recherche d’E. coli ; VRBG pour le
dénombrement des entérobactéries par exemple),
- à l’addition d’antibiotiques tels que la gélose à l’oxytétracycline (milieu
O.G.A pour les levures et moisissures) ….

d) Milieux d'orientation et d'identification ou milieux différentiels :

Ces milieux contiennent des éléments permettant de mettre en évidence


des caractères biochimiques en vue d'une orientation du diagnostic.
La lecture de ces milieux peut se faire :
- soit directement par virage d'un indicateur de pH (rouge de phénol qui vire
au jaune en cas de fermentation du mannitol du milieu de Chapman pour les
Staphylococcus par exemple ...), production d'H2S révélé par l’apparition
d'un précipité noir (milieu Hajna-Kligler, gélose Hektoën,...).
- soit après addition de réactifs par exemple addition de perchlorure de fer
pour révéler la présence d’un tryptophane désaminase en milieu Urée-
Indole ...

Chaque milieu de culture porte un nom ; ce nom peut être en rapport avec
les initiales qui rappellent sa composition (Ex : O.G.A. ; V.R.B.G…) ou
l’auteur ayant proposé sa composition (Ex : Milieu de CHAPMANN, Milieu
de BAIRD PARKER…ou rappelle sa sélectivité (milieu SS…).

2.1.2.4) Les micro-méthodes ou galeries miniaturisées

La multiplication des analyses bactériologiques, a été à l’origine du


développement de systèmes permettant d'associer rapidité, reproductibilité
et faible coût : les macro-galeries classiques ont été progressivement
miniaturisées.
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Il s’agit surtout de systèmes type API qui est un assemblage de micro tubes
avec cupules contenant des substrats déshydratés qui sont régénérés avec la
suspension de la bactérie à étudier.

Ex : Galeries API, RAPIDEC Staph, RapiD 20 E et RAPID ID 32 E…

2.2) Les milieux de culture et ensemencement

2.2.1) Les milieux de culture solide


Les milieux solides sont obtenus à partir de milieux liquides, auxquels on
ajoute un agent gélifiant : le plus souvent de la gélose ou de l’agar-agar.
Ces milieux, sont coulés en boîtes de Pétri ou en tubes et ont des teneurs en
gélose de 10 à 20 grammes/litres (gélose nutritive, P.C.A, O.G.A….) alors que
les géloses molles ou semi-solides, ont des teneurs de 3 à 5 g/l et présentent
des consistances intermédiaires (mannitol mobilité par exemple).
Les différents types d’ensemencements
2.2.1.1) Ensemencements sur milieux solides
 Ensemencement sur boites de pétri :
- Ensemencement en stries serrées (milieu Hectoen, … par exemple)

- Ensemencement en stries dans les techniques d’isolement par épuisement


(milieu E.M.B, V.R.B.G….)

- Ensemencement par une seule strie (Gélose à l’A.D.N)

- Ensemencement en surface et étalement avec un râteau d’un volume défini


(généralement 0,1 ml) pour un dénombrement en surface (milieu O.G.A,
gélose SABOURAUD pour les levures …).

- Ensemencement en masse : généralement un volume de 1 ml du produit à


analyser est déposé au fond d’une boite de pétri ; puis on coule 15 à 20 ml du
milieu de culture gélosé fondu et refroidi au environ de 50°C.

Après homogénéisation convenable pour répartir de façon uniforme ce


volume de dépôt dans tout le volume du milieu de culture, on laisse solidifier
le milieu de culture puis on incube (boite de pétri retournée = couvercle en
bas) à l’étuve réglée à une température convenable avant de faire le
dénombrement (= dénombrement en profondeur des microorganismes)
[milieu P.C.A, V.R.B.G. …].
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- Ensemencement en tapis : inondation de la surface de la gélose par la


suspension du microorganisme, puis aspiration de l’excès du liquide avec une
pipette pasteur et dépôt de disque d’antibiotique (gélose MULLER –
HINTON pour antibiogramme par exemple).

 Ensemencement en tube
- La plupart des ensemencements en tubes de milieu solides, se font par des
stries en surface de la gélose (cas de la gélose nutritive inclinée).

- ou par une seule strie longitudinale comme c’est le cas du milieu citrate de
Simmons, pour d’autres milieux soit il suffit juste d’une piqûre centrale
(cas du milieu Mannitol mobilité), ou en plus des stries en surface, il faut
ajouter une piqûre centrale pour compléter l’ensemencement comme c’est
le cas du milieu Kligler-Hajna.

2.2.1.2) Ensemencements de milieux liquides


Il existe deux types d'ensemencement en milieu liquide :

- Soit on réalise d'abord une suspension, c'est à dire que l'on prélève une
colonie sur une gélose que l'on met dans 0,5 à 1 ml d’eau physiologique ou de
diluant TSE (Tryptone-Sel - Eau) puis on prend quelques gouttes de cette
suspension que l'on met dans le milieu à ensemencer à l'aide d'une pipette
pasteur , soit on prend un fragment de colonie que l’on met directement en
suspension dans le milieu à ensemencer (UREE-INDOLE, CLARCK et
LUBS …)

- Soit on dispose d’une culture en bouillon nutritif ordinaire, ou dans un


milieu de culture liquide comme l’eau peptonnée, milieu VBL + cloches de
DURHAM … contenant le microorganisme à ensemencer et cette fois -ci il
suffit de prélever quelques gouttes de culture soit avec la boucle de l’anse, ou
avec une pipette pasteur que l'on met dans le milieu liquide à ensemencer.

Travail à faire en T.P:


Ensemencement sur boites de pétri :
- Ensemencement en profondeur (en masse) du milieu P.C.A (plate count
agar) par 1 ml de lait (dilution 10-3)
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- Ensemencement en surface du milieu O.G.A (oxytétracycline glucose agar)


par 0,1 ml de lait (dilution 10-2).
Ensemencement en tubes
- ensemencement du milieu V.B.L + cloches de Durham par 1 ml de lait
fermenté (dilution 10-2).
- Ensemencement du milieu Mannitol mobilité, du bouillon Clarck et Lubs,
du milieu de citrate de Simmons, du milieu V.B.L + cloches de Durham, du
milieu eau peptonnée exempt d’indole et bouillon nutritif à partir d’une
colonie d’entérobactérie isolée sur milieu V.R.B.G.
Lecture résultats T.P 1 :
Lectures des ensemencements sur P.C.A et O.G.A :
P.C.A :
Le milieu PCA est utilisé pour le dénombrement des germes aérobies totaux
mésophiles ; prendre la boite de pétri ensemencée par la dilution 10-3 lait, compter
le nombre de colonies ou le nombre d’U.F.C (il doit être supérieur à 30 et inférieur
à 300 colonies ; chaque colonie est supposée issue d’un seul germe) le multiplier
par l’inverse de la dilution c’est-à-dire 103 pour trouver le nombre de
microorganismes initialement présent dans 1 ml de lait.
Le nombre de germes / ml de lait = N x taux de dilution (avec N le nombre de
colonies comptées).
Exemple : si N= 65, Le nombre de germes / ml de lait sera égale à 65x103 = 65000
ou 65.103 germes ou microorganismes par ml de lait.
ou 65 colonies dans la dilution 1/1000 ml de lait, donc 1ml de lait contient 65 x
1000
O.G.A :
Le milieu O.G.A est utilisé pour le dénombrement des levures et moisissures ;
prendre la boite de pétri ensemencée par la dilution 10-2 L’ben (lait fermenté),
compter le nombre de colonies ou le nombre d’U.F.C (il doit être supérieur à 30
et inférieur à 300 colonies ; chaque colonie est supposée issue d’un seul germe)
le multiplier par l’inverse de la dilution c’est-à-dire 102 puis par 10 pour trouver
le nombre de microorganismes initialement présent dans 1 ml de L’ben.
Le nombre de levures et moisissures / ml de l’ben = N x taux de dilution x 10
(avec N = le nombre de colonies comptées).
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Exemple : si N= 35, Le nombre de levures et moisissures / ml de l’ben sera égale


à 35x102 x10 = 35000 ou 35.103 levures et moisissures par ml de l’ben.
V.B.L + cloches de DURHAM : Ce milieu est utilisé pour rechercher ou
dénombrer les coliformes totaux si l’incubation est faite à 37°C ou les coliformes
fécaux si l’incubation est faite à 44°C.
Sur ce milieu, notez la présence de gaz dans la cloche ; si le volume de gaz occupe
au moins 1/10 du volume de la cloche, le test est considéré comme positif, c’est-
à-dire il y a eu fermentation du lactose avec production de gaz donc présence de
coliformes dans la dilution 10-2 du l’ben donc il y a au moins 100 coliformes/ ml
de l’ben.
Lecture des résultats sur le milieu mannitol-mobilité : la fermentation du
mannitol se traduit par un virage au jaune du milieu (acidification) [l’indicateur
du pH le rouge de phénol est jaune à pH acide], si le germe est mobile il diffuse
à partir de la strie d’ensemencement.
a) Test IMVIC

- Recherche d’indole (I) : ce test se fait en eau peptonnée exempte d’indole.


Le tube d’eau peptonnée exempte d’indole est ensemencé avec la souche
d’entérobactérie, après incubation à 37°C pendant 24 heures, l’indole est mis en
évidence par ajout de 2 à 3 gouttes de réactifs de KOVACS, agiter et laisser
reposer ; la présence d’indole se manifeste par l’apparition d’un anneau rouge en
surface.

- Test de rouge de méthyle (M) et Réaction de Voges-Proskauer (VP)


Ces deux tests se font avec le bouillon Clark et Lubs, qui permet de rechercher les
voies fermentaires des entérobactéries.
Ensemencer le bouillon Clark et Lubs avec la souche à étudier ; incuber à 37°c
pendant 24 heures. Partager le bouillon en deux parties approximativement
égales, sur l’une effectuer le test de rouge de méthyle, sur l’autre la recherche
d’acétoine.

* Test du rouge de méthyle (Test RM) :


A 1 ou 2 ml de culture, ajouter quelques gouttes de rouge de méthyle à 0,5%,
une teinte rouge indique une réaction positive (pH ˂ 4,5), teinte jaune réaction
négative. Les espèces d’entérobactéries RM+, VP- sont à fermentation acide
mixte ; dans cette voie il y’a production importantes d’acides à chaines courtes
(acide formique, acide acétique, d'acide lactique, succinique….).

* Réaction de Voges-Proskauer (Test VP) : Mise en évidence de l’acétyl


méthyl carbinol
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Certaines bactéries dites VP +, RM- produisent l’acétoine et du 2-3 butylène


glycol à partir de l’acide pyruvique comme produit intermédiaire de la
fermentation butane diolique, métabolites révélés par la réaction de Voges-
Proskauer.
A 1 ou 2 ml de culture, ajouter 0,5 ml d’α naphtol à 6% et 1 ml de soude caustique
à 16 % ; agiter, laisser reposer 10 minutes. La présence d’acétoine se manifeste
par l’apparition d’une teinte rouge ou rose limitée en surface ou généralisée.
En présence d'oxygène (agitation) et d'une base forte, l'acétoïne est oxydée en
diacétyle qui forme un complexe coloré en rose en réagissant avec une fonction
amine d'un groupement guanidyle des protéines.
La réaction est plus sensible et plus rapide en présence d'alpha-naphtol.

* Citrate de Simmons
Certaines bactéries sont capables d'assimiler le citrate comme unique source de
carbone et d'énergie et donc capables de croître sur un milieu synthétique tel le
milieu de citrate de Simmons, dont l'unique source de carbone est le citrate de
sodium. Ce milieu contient comme indicateur de pH le bleu de bromothymol de
teinte verte à pH 7,0.

A l’aide d’un fil droit ou l’effilure d’une pipette pasteur, effleurer une colonie
isolée sur milieu solide et faire un ensemencement par une strie centrale et incuber
à 37°C pendant 1 à 10 jours en observant les résultats chaque jour.

L’utilisation du citrate produit une alcalinisation du milieu qui fait virer


l’indicateur du pH (bleu de bromothymol) au bleu, en cas de non utilisation du
citrate le milieu reste vert.
Si présence d'une coloration bleue (même localisée uniquement en surface) :
réaction positive.
Si le milieu a conservé la coloration verte : réaction négative (même en présence
d'une culture.
Lecture résultat sur bouillon nutritif : la croissance se traduit par un trouble du
milieu.
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T.P N° 2
III) Isolement et repiquage des microorganismes
3.1 Techniques d’isolement

3.1.1 Techniques d’isolement sur boites par étalement en surface :


Etalement en surface d’un petit volume d’un mélange poly-microbiens dilué
contenant 100 à 200 cellules qui est transféré au centre d’une boite de gélose et
étalé avec un râteau ; chaque cellule donne une colonie isolée.

3.1.2 Techniques d’isolement sur boites par étalement en profondeur :

L’échantillon de départ est dilué plusieurs fois de suite (10 -1 à 10-4) de


manière à réduire suffisamment la population microbienne et obtenir des colonies
séparées.
Pour ce faire, de petits volumes de chacun des échantillons dilués sont alors
mélangés avec le milieu de culture gélosé liquide, refroidi au environ de 45 - 50°C
et immédiatement versées dans des boites de pétri stériles, après solidification
de la gélose, chaque cellule est immobilisée et va former une colonie après
incubation. Les colonies poussant en surface peuvent être inoculées dans un
milieu frais pour préparer des cultures pures.
3.1.3 Isolement par la méthode des stries par épuisement (voir démonstration
des différentes techniques de cette méthode en T.P)

(1)
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F1

2
3

F2
(2) Technique à 2 flambages

F1

2
3

(3) Technique à 1 flambage


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3.2 Repiquage des microorganismes

Le repiquage consiste à prélever un fragment d'une colonie ou une colonie


bactérienne bien isolée et pure, puis de la repiquer sur un milieu neuf où
elle continuera à croître.

Le repiquage permet l’obtention de souches pures et permet aussi de constituer


une collection de microorganismes identiques en vue de leur identification ou de
leur conservation.
Les repiquages successifs et réguliers (avant perte de viabilité) permettent de
conserver les souches.
Le repiquage peut se faire en tubes de milieu solide incliné (gélose nutritive
inclinée par exemple) ; une fois ensemencés, les tubes sont placés à l'étuve pour
que la croissance débute puis, avant qu'elle ne soit trop abondante, les tubes sont
placés dans un réfrigérateur à 4°C ou parfois laissés à température ambiante .

La vitalité de la souche se maintient pendant des durées variables, selon la


température et l'espèce microbienne. Au bout de ce délai, un nouveau
repiquage est réalisé.

Les levures et champignons se conservent très bien au réfrigérateur pendant


3 à 6 mois ; les bactéries se conservent assez facilement à température
ambiante mais demandent des repiquages plus fréquents ou 2 à 3 semaines au
réfrigérateur à 4°C.

Le repiquage peut se faire sur boites de pétri (voir isolement en strie) ou sur
gélose inclinée.

Technique de repiquage : dans des conditions stériles, prélever une colonie bien
isolée et représentative de la souche à l’aide d’une anse ou pipette pasteur, étaler
en stries sur une nouvelle boite de milieu de culture, incuber à 25°C (température
ambiante) pendant 72 heures pour les levures et 24 heures à 30 ou 37 °C pour les
bactéries.

Pour les repiquages en tubes, prélever une colonie isolée et représentative de la


souche à l’aide d’une anse ou pipette pasteur, ensemencer la tranche en stries
serrées ; incuber à température convenable pendant le temps nécessaire (par
exemple 24 heures à 37 °C pour certaines bactéries pathogènes ou 48 heures à
30°C (germes aérobies totaux mésophiles) ou 48 à 72 heures à 25°C ….) pour les
levures et moisissures….

Lecture des résultats des isolements :


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La lecture des résultats des isolements se fait après incubation des boites de pétri
pendant 18 à 24 heures à la température optimale de croissance du germe à isoler
(dans le cas du TP on a incubé à 37°C puisqu’il s’agissait de coliformes et
d’entérobactéries.
Sur le milieu V.R.B.G (violet cristal rouge neutre bile glucose) : les
entérobactéries donnent des colonies rouges-violettes.
Sur milieu E.MB. (Éosine bleu de méthylène) :
 Escherichia coli donne des colonies sombres à reflet vert métallisé (« dos
de scarabée »)
 Les espèces des genres Klebsiella et Enterobacter donnent des colonies
muqueuses bombées, avec centre bleuté entouré d’une zone blanchâtre ;
elles sont dites « œil de poissons »
 Les espèces du genre Citrobacter donnent des colonies violet-pale à reflet
métallique très peu marqué

 Sur P.C.A (Plate Count Agar) : Noter la couleur des colonies, leur
aspect (plates, bombées…), leur contour (régulier ou irrégulier …),
leur diamètre pour les colonies bien isolées, partie de la boite ou elles
sont bien isolées …