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Méthodes d’analyse de l’interaction des protéines et

acides nucléiques
Introduction

ARN
A
Polymérase

répresseur

Opérateur Séquence protéique


Promoteur

B
Inducteur
répresseur

ARN

Polymérase
Opérateur Séquence protéique
Promoteur
Introduction

Les régions régulatrices de l’activation des gènes: l’expression des


gènes est régulée par un ensemble de facteurs activateurs et inhibiteurs
de la transcription.
L’interaction de ces facteurs (protéines) avec l’ADN est site spécifique.

Objectif: Présentation de quelques techniques permettant l’étude des


interactions entre protéines et ADNs.
Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)

Cette technique sert à l’identification des sites de liaison des protéines


régulatrices sur la molécule d’ADN génomique.

Permet de déterminer les positions exactes de liaison des protéines à


l’ADN génomique.
Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)
Etapes de la méthode Protéines liant l’ADN

ADN

1 Crosslink (1% paraformaldehyde)

xxx xxx xxx


xxx

2 Fragmentation de l’ADN par sonication

xxx xxx xxx


xxx
Fragments ~200 nucléotides
Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)
Etapes de la méthode
Fragments ~200 nucléotides
xxx xxx xxx
xxx

Précipitation de l’ADN liant la protéine


3
d’intérêt avec un anticorps spécifique

xxx xxx xxx


xxx

4 Reverse cross-link (incubation O.N. à 65°C)

xxx xxx

5 Purification des fragments d’ADN


xxx xxx
PCR, séquençage des fragments
La technique des gènes rapporteurs

Gènes rapporteurs:

C’est une technique qui permet la détection ou la mesure de l’intensité


de l’expression d’un gène.

Consiste à construire un vecteur rapporteur contenant un gène


rapporteur sous la dépendance d’un promoteur constitué d’une
séquence régulatrice.

Les gènes rapporteurs peuvent correspondre à des protéines


fluorescentes ou bien des enzymes capable de convertir des substrats
invisibles vers des produits luninescents ou bien colorés.
La technique des gènes rapporteurs
Principe:

Transfection de cellules

Promoteur Analyse de l’expression du


gène rapporteur
Vecteur rapporteur (fluorescence, luninescence…)
La technique des gènes rapporteurs

Le gène rapporteur:

Le gène rapporteur est un gène témoin codant pour une protéine

facilement détectable et quantifiable (émission de fluorescence ou de

luminescence). Il est largement utilisé pour étudier et déterminer les

activités des régions promotrices de divers gènes.

Exemple: Luc Luciférase, b-Gal: b Galactosidase, GFP…etc.


La technique des gènes rapporteurs

Le gène rapporteur code pour une protéine révélatrice de la présence


de l’interaction entre une protéine régulatrice avec une ou plusieurs
séquences promotrices étudiées.

Etudier le rôle des interactions protéines ADN dans la régulation


spatio-temporelle de l’expression génique:

Caractériser les séquences régulatrices qui contrôlent l’expression du


gène étudié.

Déterminer le compartiment cellulaire abritant l’expression et


l’activité du gène (noyau, cytosol, surface cellulaire…etc.).
La technique des gènes rapporteurs

Les étapes de la technique:

1- Amplification de la région promotrice à étudiée (région régulatrice).

2- Insertion de la séquence de la région promotrice dans un vecteur


rapporteur contenant le gène rapporteur.

3- Transfection des cellules eucaryotes/procaryotes et expression du


gène rapporteur après induction du promoteur.

4- Mesure et analyse de l’expression du gène rapporteur dépendante du


promoteur.
La technique des gènes rapporteurs
Exemples de gènes rapporteur: Exemple-1 : Le gène Luc codant pour la Luciférase qui
émet de la lumière jaune.
Stimulant
Activation

promoteur Gène de la Luciférase


Séquence étudiée Gène rapporteur

Luciférase

Luciférine + ATP + O2 Oxyluciférine + AMP + PPi + CO2 + Lumière


Mg2+

- Luc + Luc Luciole: firefly


La technique des gènes rapporteurs
Exemple2: Le gène b-Gal codant pour la Galactosidase qui transforme X gal en Galactose et
émission d’une couleur bleue

5-bromo-4-chloro-3-hydorxyindole
Hydrolyse par la b-
galactosidase
+H2O

X-gal
Oxydation et dimérisation
galactose
spontanées

5,5’ –dibromo-4, 4’-dichloro-indigo


(produit insoluble de couleur bleue)
La technique des gènes rapporteurs
Quelques exemples de gènes rapporteur:
Exemple3 : Le gène GFP codant pour la Green fluorescent protéine qui possède une
fluorescence verte.

Méduse

Clones bactériens exprimant la GFP

La création de protéines de fusion par fusion de la séquence du gène


d’intérêt à la séquence de la GFP (ou protéines dérivés) permet
l’étiquetage de la protéine d’intérêt afin d’accéder à sa localisation
instantanée dans les cellules vivantes.
La technique des gènes rapporteurs
Imagerie sur cellules vivantes

mCherry
GFP

Transport antérograde

t=0 s t=7 s t=15 s t=23 s


Méthodes d’analyse de l’interaction des facteurs de transcription avec
l’ADN par la technique : Empreinte à la Dnase I
Empreinte à la Dnase I

L’interaction des facteurs de transcription avec l’ADN est séquence


spécifique.

L’empreinte à la Dnase I est une technique simple, sert à la

détermination des sites de liaison d’une protéine (facteur de

transcription) sur l’ADN.

Permet de déterminer la taille approximative du site d’interaction, de

quantifier le nombre de sites d’interaction entre un fragment ADN avec

une protéine régulatrice.


Empreinte à la Dnase I

Étapes de la méthode:

1- Amplification de la région régulatrice à étudier (100-300 pb).

2- Marquage radioactif p32 sur une extrémité d’un des deux brins ADN.

3- Interaction séquence promotrice et la protéine à analysé.

4- Digestion partielle à la DNase I de telle sorte à avoir 1 site de coupure


par brin.

5- électrophorèse sur gel de poly-acrylamide.

6- Southern Blot et révélation par autoradiographie.


Empreinte à la Dnase I

1 brin marqué au P32


Protéine
Contrôle
(FT)
Digestion Dnase I Digestion Dnase I

Fragments générés Fragments générés


marqués au P32 Gel d’électrophorèse
marqués au P32
Empreinte à la Dnase I
Protéine (µg/ml) 0 2 6 8

Empreinte-1

empreinte

Empreinte-2
Empreinte à la Dnase I
Cas de 2 sites de fixation:

Empreinte-1

Empreinte-2
Empreinte à la Dnase I
Applications:

Détection de protéines fixant l’ADN.

Analyse des séquences d’ADN au niveau des promoteurs et régions régulatrices.

Détection de protéines liant l’ADN à partir des extraits cellulaire.


La technique: Retard sur gel

= Electro Mobility Shift Assay (EMSA)

C’est une technique in vitro qui permet de mettre en évidence la


formation d’un complexe entre une séquence ADN et une protéine.

Elle est basée sur l’électrophorèse de ce complexe sur un gel de poly-


acrylamide dans des conditions non-dénaturante.
La technique : Retard sur gel
Étapes de la méthode:

1- Marquage du fragment d’ADN double brin (appelé sonde). Le


marquage peut être radioactif ou fluorescent.

2- Incubation du fragment ADN avec un extrait de protéines nucléaires.


Pour le contrôle de l’expérience, un fragment d’ADN seul est incubé
dans le tampon.

3- électrophorèse sur gel de poly-acrylamide avec conditions non-


dénaturantes.

4- Southern Blot et révélation par autoradiographie, ou bien lecture du


gel avec un lecteur de fluorescence.
La technique : Retard sur gel
Exemple de Résultat :

Extraits nucléaires des Extraits nucléaires des cellules


cellules non-activées - activées
+

Sonde + NF-B

Sonde seule
La technique : Retard sur gel

Extraits nucléaires des Extraits nucléaires des cellules


cellules non-activées activées (expression génique)
- +

Sonde + NF-B ?

Sonde seule

La liaison du facteur de transcription à la séquence ADN induit un retard dans la


migration de la bande d’ADN pendant l’électrophorèse.
La technique : super Retard sur gel

Extraits nucléaires Extraits nucléaires Extraits nucléaire des


des cellules non- des cellules activées cellules activées
activées + un anticorps anti-FT

- + +

Sonde + NF-B + anti NF-B

Sonde + NF-B

Sonde seule