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Méthodes d’extraction et purification

des acides nucléiques


Méthodes d’extraction et purification des acides nucléiques

La manipulation de gènes in vitro nécessite la présence d’ une source en

acides nucléiques isolée qui peut être sous forme de molécules d’ADNs

ou d’ARNs.

Les méthodes d’extraction et purification des acides nucléiques

permettent d’isoler les molécules d’ADN ou d’ARNs à partir de sources

diverses (tissus, cellules, bactéries, virus, plantes …etc.).


Méthodes d’extraction et purification des acides nucléiques

L’extraction et la purification des acides nucléiques se fait en 3 grandes


étapes successives:

1- Lyse de la paroi bactérienne ou bien de la membrane cellulaire.

2- Séparation des acides nucléiques des autres composants cellulaires


(tel que les protéines, les lipides…etc.).

3- Elimination des impuretés et re-suspension des acides nucléiques


dans une solution (eau stérile ‘nucléase free’ ou autre tampon
approprié).
Purification des acides nucléiques

Il existe plusieurs méthodes propres à la purification des ADNs


génomique, ADNs plasmidique et des ARNm.

De nos jours plusieurs kits sont commercialisés spécifiques à chaque


type de purification.

Plusieurs compagnies se sont spécialisés dans le développement de


produits de purification des acides nucléiques (Qiagen, Promega,
stratagene …etc.).
Extraction et purification des acides nucléiques
Extraction et purification de l’ADN génomique
Définition

Singulier Global

gène génome: totalité des gènes appartenant à un organisme

ADN génomique = ADN chromosomique, code pour les différentes


fonctions essentielles (vitales) des cellules.

L’ADN génomique est extrait à partir d’origine diverse: organisme animal


ou végétale, tissus, cellules, micro-organisme.
Extraction et purification de l’ADN génomique
Extraits d’ADNs génomique Amplification par PCR, Digestion
enzymatique, Séquençage, Clonage d’un gène, …etc.

Les différentes méthodes d’isolation de l’ADN génomiques obéissent à


un même principe d’isolation qui passe par:

-Lyse des cellules (rupture de la paroi bactérienne et/ou membrane).

- Séparation de l’ADN génomique des autres composants cellulaires


(protéines, organites, débris de membranes …etc.).

- Elimination des ARNs à l’aide de l’ARNase-A.

- Elimination des impuretés et concentration de l’ADN génomique par la


méthode de précipitation à l’éthanol.
Extraction et purification de l’ADN génomique

Pour se faire, différents protocoles sont utilisés:

- Extraction phénol/chloroforme, peu couteuse, donne de l’ADN de


qualité très pure.

- kits commerciaux de purification: méthodes rapides, se fait à l’aide de


réactifs commerciaux prêt à emploi.
Étapes d’extraction de l’ADN génomique (phénol/chloroforme)

1- Lyse des tissus ou des cellules dans des tampons contenant des
agents dénaturant comme le sodium dodecyl sulfate (SDS), ou bien des
détergents tel que le Triton:

* Rupture de la membrane plasmique.

* Dénaturation des protéines de la chromatine associées à l’ADN.

2- Élimination des ARNs par traitement à l’ARNase-A.


Étapes d’extraction de l’ADN génomique (phénol/chloroforme)

3- Ajout de phénol/chloroforme (solvants organiques) et séparation de


l’ADN génomique des autres composants cellulaires :

* les protéines cellulaires à l’état dénaturées se retrouvent à


l’interface phénol/eau.
* les lipides se localisent dans la phase organique.
* les ADNs restent dans la phase aqueuse.

4- Récupérer la phase aqueuse contenant l’ADN et précipitation à


l’éthanol ou à l’isopropanol:

* éliminer les impuretés (reste de phénol, protéines …etc.).


* concentration et re-suspension dans de l’eau pure ou dans un
tampon approprié (Tris-EDTA).
Étapes d’extraction de l’ADN génomique (phénol/chloroforme)
Précipitation à l’éthanol:

à la fin de l’extraction, pour obtenir un ADN génomique pure, on


procède à la précipitation éthanol:

- À 1 volume d’ADN, on rajoute 2x volume d’éthanol 100% froid, et 1/10


de volume de solution de sel d’Acétate de Sodium 3M (NaAc).

-Incuber à -20°C pendant 1 heure.

-Centrifigation à 13000 rpm 15 min à 4°C.

- récupérer le culot d’ADN et ajouter 600 µl d’éthanol 70% pour éliminer


le sel (NaAc).
Étapes d’extraction de l’ADN génomique (phénol/chloroforme)

- mettre à -20°C pendant 30 min.

- Centrifugation 13000 rpm pendant 10 min.

- Récupérer le culot d’ADN et sécher sous vide pendant 15 min.

-Resuspendre l’ADN dans l’eau pure (nucléase free) ou tampon


approprié.

Au final: l’ADN génomique purifié est pure prêt pour utilisation


ultérieure.
Purification de l’ADN plasmidique

ADN génomique
(fonctions cellulaires)

Bactérie
Généralités sur les plasmides
Réplication autonome (indépendamment des chromosomes), Taille : 2-5
Kbp .

Code pour des gènes non-essentiels aux fonctions vitales des cellules.

Permet le processus de sélection via les gènes de résistance aux


antibiotiques.

La structure de l’ADN double brin se présente sous 3 à 4 formes


possible: linéaire, coupé, super-enroulé et circulaire.
Généralités sur les plasmides
Les différentes formes de l’ADN plasmidique analysé par électrophorèse
sur gel d’agarose.

Coupé

Migration Linéaire

Super-enroulés

Intérêt: utilisation comme vecteur des ADNs recombinants, d’où vient


l’importance de la purification de l’ADN plasmidique.
Purification de l’ADN plasmidique

Il existe plusieurs kits commerciaux qui permettent de purifier l’ADN

plasmidique à partir des bactéries, elles sont communément appelées :

Miniprep, Midiprep ou maxiprep.

Cette dénomination corrèle avec la quantité de bactéries utilisée, mais

aussi à la quantité d’ADN purifiée à la fin du protocole. Ces Kits

permettent de purifier l’ADN plasmidique et d’éliminer l’ADN

génomique.
Purification de l’ADN plasmidique

Les Kits commerciaux fonctionnent à base de colonnes échangeuses

d’ions permettant la purification de l’ADN plasmidique.

Ces protocoles correspondent à des techniques basique très simple

couramment utilisées dans les laboratoires.


Etapes de purification de l’ADN plasmidique (Kit Qiagen)

•Lyse des bactéries basée sur l’action d’agents dénaturant (SDS) et


provoque la dénaturation de l’ADN total.

•Neutralisation rapide par ajout d’acétate de potassium qui permet la


renaturation rapide de l’ADN plasmidique alors que l’ADN génomique
demeure à l’état dénaturé.

•Centrifugation et récupération du surnageant contenant l’ADN


plasmidique et l’ADN génomique précipité dans le culot est éliminé.
•Dépôt du surnageant sur une colonne composé de résine échangeuse
d’ions.
Etapes de purification de l’ADN plasmidique (Kit Qiagen)

•Lavage de la colonne pour l’élimination des impuretés.

• concentration de l’ADN plasmidique sur la colonne par précipitation à


l’isopropanol.

•Lavage avec éthanol 70%.

•Élution avec de l’eau ou autre tampon d’élution.

•Les ARNs sont éliminés dès le début du procédé par ajout de l’ARNase-
A au tampon de re-suspension des bactéries.
Protocole Qiagen Miniprep: page 20-21 du guide Qiagen

Ce protocole est construit pour la purification d'environ 20 µg d'ADN


plasmidique à partir de 1-5 ml de culture en suspension de E. coli dans
le milieu Luria Bertani (LB). Toutes les étapes de la purification sont
réalisées à température ambiante (15-25 °C).

1- Re-suspendre le culot bactérien dans 250 µl de tampon P1 (tampon de


re-suspension) suivi d'un transfert vers un tube de centrifugation. Au
préalable, il faut s'assurer que l' ARNase-A a été bien rajouter au tampon
de re-suspension de bactéries P1.

2- Ajouter 250 µl de tampon P2 (tampon de lyse), mixer délicatement en


renversant les tubes 4-6 fois.
Protocole Qiagen Miniprep: page 20-21 du guide Qiagen

3- Ajouter 350 µl de tampon N3 (tampon de neutralisation), mixer


délicatement en renversant les tubes 4-6 fois.

4- Centrifuger pendant 10 min à 13000 rpm. A la fin de cette étape, un


culot de couleur blanchâtre doit être obtenu.

5- Pipeter le surnageant sur une colonne QIAprep 2.0 et centrifuger


pendant 1 min à 13000 rpm.
Protocole Qiagen Miniprep: page 20-21 du guide Qiagen

6- Laver la colonne QIAprep 2.0 avec 0.5 ml de tampon PB.


7- Ajouter 0,75 ml de tampon PE et centrifuger à 13000 rpm pendant 1
min.

8- Centrifuger la colonne pendant 1 minute supplémentaire afin


d'éliminer la totalité du tampon de lavage résiduel sur la colonne.
9- Eluer l'ADN plasmidique de la colonne avec 50 µl de H2O nucléase
free, puis incuber pendant 1 minute et enfin centrifuger 1 minute à 13000
rpm.

10- Stockage de l'ADN plasmidique purifié à -20°C jusqu'à utilisation


ultérieure.
Les différents types d’ARNs

ARNr: ARN ribosomique, forment avec les protéines ribosomiques


le ribosome. Organite consituant le site de synthèse des protéines.

Les ARNt: ARN de transfert. Ont pour rôle le transfert des acides
aminés lors de la synthèse protéique dans les ribosomes.

ARNsn: ARN small nuclear, ils sont présents uniquement dans le noyau,
participe dans la régulation post-transcriptionnelle de la synthèse
protéique.

ARNm: ARN messager. Contient l’information génétique provenant de


l’ADN et se dirige vers les ribosomes pour la traduction de l’information
en forme de protéine.
Méthodes de Purification des ARNs
Les ARNs sont isolés à partir de cellules, de tissus ou de micro-organismes.

Les extraits d’ARNs hybridation Northern Blot, banques ADNc, RT-PCR

…etc.

Extraction et purification des ARNs en pratique

Avant de commencer la purification:

Les ARNases: sont des enzymes qui dégradent les ARNs. Elles sont très
abondantes sur toutes les surfaces de travail. Lors de la purification des
ARNs, on procède:

À la décontamination du milieu de travail à l’aide DEPC (Diéthyl


pyrocarbonate), qui dégrade les ARNases.
Extraction des ARNs totaux (méthode Trizol)
Lyse/Broyage/homogénéisation des tissus

Séparation des ARN totaux avec du Trizol

Précipitation éthanol

Re-suspansion de l’ARN dans l’eau pure ARNase free

Traitement avec la ADNase I

Précipitation éthanol

Re-suspansion de l’ARN dans l’eau pure ARNase free


Protocole de Qiagen RNeasy mini kit: page 29-33 du guide
Purification des ARNm
Protocole de Qiagen RNeasy mini kit: page 29-33 du guide
Protocole de Qiagen RNeasy mini kit: page 29-33 du guide

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Protocole de Qiagen RNeasy mini kit: page 29-33 du guide

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