Méthodes d’extraction et purification des acides nucléiques
La manipulation de gènes in vitro nécessite la présence d’ une source en
acides nucléiques isolée qui peut être sous forme de molécules d’ADNs
ou d’ARNs.
Les méthodes d’extraction et purification des acides nucléiques
permettent d’isoler les molécules d’ADN ou d’ARNs à partir de sources
diverses (tissus, cellules, bactéries, virus, plantes …etc.).
Méthodes d’extraction et purification des acides nucléiques
L’extraction et la purification des acides nucléiques se fait en 3 grandes
étapes successives:
1- Lyse de la paroi bactérienne ou bien de la membrane cellulaire.
2- Séparation des acides nucléiques des autres composants cellulaires
(tel que les protéines, les lipides…etc.).
3- Elimination des impuretés et re-suspension des acides nucléiques
dans une solution (eau stérile ‘nucléase free’ ou autre tampon approprié). Purification des acides nucléiques
Il existe plusieurs méthodes propres à la purification des ADNs
génomique, ADNs plasmidique et des ARNm.
De nos jours plusieurs kits sont commercialisés spécifiques à chaque
type de purification.
Plusieurs compagnies se sont spécialisés dans le développement de
produits de purification des acides nucléiques (Qiagen, Promega, stratagene …etc.). Extraction et purification des acides nucléiques Extraction et purification de l’ADN génomique Définition
Singulier Global
gène génome: totalité des gènes appartenant à un organisme
ADN génomique = ADN chromosomique, code pour les différentes
fonctions essentielles (vitales) des cellules.
L’ADN génomique est extrait à partir d’origine diverse: organisme animal
ou végétale, tissus, cellules, micro-organisme. Extraction et purification de l’ADN génomique Extraits d’ADNs génomique Amplification par PCR, Digestion enzymatique, Séquençage, Clonage d’un gène, …etc.
Les différentes méthodes d’isolation de l’ADN génomiques obéissent à
un même principe d’isolation qui passe par:
-Lyse des cellules (rupture de la paroi bactérienne et/ou membrane).
- Séparation de l’ADN génomique des autres composants cellulaires
(protéines, organites, débris de membranes …etc.).
- Elimination des ARNs à l’aide de l’ARNase-A.
- Elimination des impuretés et concentration de l’ADN génomique par la
méthode de précipitation à l’éthanol. Extraction et purification de l’ADN génomique
Pour se faire, différents protocoles sont utilisés:
- Extraction phénol/chloroforme, peu couteuse, donne de l’ADN de
qualité très pure.
- kits commerciaux de purification: méthodes rapides, se fait à l’aide de
réactifs commerciaux prêt à emploi. Étapes d’extraction de l’ADN génomique (phénol/chloroforme)
1- Lyse des tissus ou des cellules dans des tampons contenant des agents dénaturant comme le sodium dodecyl sulfate (SDS), ou bien des détergents tel que le Triton:
* Rupture de la membrane plasmique.
* Dénaturation des protéines de la chromatine associées à l’ADN.
2- Élimination des ARNs par traitement à l’ARNase-A.
Étapes d’extraction de l’ADN génomique (phénol/chloroforme)
3- Ajout de phénol/chloroforme (solvants organiques) et séparation de
l’ADN génomique des autres composants cellulaires :
* les protéines cellulaires à l’état dénaturées se retrouvent à
l’interface phénol/eau. * les lipides se localisent dans la phase organique. * les ADNs restent dans la phase aqueuse.
4- Récupérer la phase aqueuse contenant l’ADN et précipitation à
l’éthanol ou à l’isopropanol:
* éliminer les impuretés (reste de phénol, protéines …etc.).
* concentration et re-suspension dans de l’eau pure ou dans un tampon approprié (Tris-EDTA). Étapes d’extraction de l’ADN génomique (phénol/chloroforme) Précipitation à l’éthanol:
à la fin de l’extraction, pour obtenir un ADN génomique pure, on
procède à la précipitation éthanol:
- À 1 volume d’ADN, on rajoute 2x volume d’éthanol 100% froid, et 1/10
de volume de solution de sel d’Acétate de Sodium 3M (NaAc).
-Incuber à -20°C pendant 1 heure.
-Centrifigation à 13000 rpm 15 min à 4°C.
- récupérer le culot d’ADN et ajouter 600 µl d’éthanol 70% pour éliminer
le sel (NaAc). Étapes d’extraction de l’ADN génomique (phénol/chloroforme)
- mettre à -20°C pendant 30 min.
- Centrifugation 13000 rpm pendant 10 min.
- Récupérer le culot d’ADN et sécher sous vide pendant 15 min.
-Resuspendre l’ADN dans l’eau pure (nucléase free) ou tampon
approprié.
Au final: l’ADN génomique purifié est pure prêt pour utilisation
ultérieure. Purification de l’ADN plasmidique
ADN génomique (fonctions cellulaires)
Bactérie Généralités sur les plasmides Réplication autonome (indépendamment des chromosomes), Taille : 2-5 Kbp .
Code pour des gènes non-essentiels aux fonctions vitales des cellules.
Permet le processus de sélection via les gènes de résistance aux
antibiotiques.
La structure de l’ADN double brin se présente sous 3 à 4 formes
possible: linéaire, coupé, super-enroulé et circulaire. Généralités sur les plasmides Les différentes formes de l’ADN plasmidique analysé par électrophorèse sur gel d’agarose.
Coupé
Migration Linéaire
Super-enroulés
Intérêt: utilisation comme vecteur des ADNs recombinants, d’où vient
l’importance de la purification de l’ADN plasmidique. Purification de l’ADN plasmidique
Il existe plusieurs kits commerciaux qui permettent de purifier l’ADN
plasmidique à partir des bactéries, elles sont communément appelées :
Miniprep, Midiprep ou maxiprep.
Cette dénomination corrèle avec la quantité de bactéries utilisée, mais
aussi à la quantité d’ADN purifiée à la fin du protocole. Ces Kits
permettent de purifier l’ADN plasmidique et d’éliminer l’ADN
génomique. Purification de l’ADN plasmidique
Les Kits commerciaux fonctionnent à base de colonnes échangeuses
d’ions permettant la purification de l’ADN plasmidique.
Ces protocoles correspondent à des techniques basique très simple
couramment utilisées dans les laboratoires.
Etapes de purification de l’ADN plasmidique (Kit Qiagen)
•Lyse des bactéries basée sur l’action d’agents dénaturant (SDS) et
provoque la dénaturation de l’ADN total.
•Neutralisation rapide par ajout d’acétate de potassium qui permet la
renaturation rapide de l’ADN plasmidique alors que l’ADN génomique demeure à l’état dénaturé.
•Centrifugation et récupération du surnageant contenant l’ADN
plasmidique et l’ADN génomique précipité dans le culot est éliminé. •Dépôt du surnageant sur une colonne composé de résine échangeuse d’ions. Etapes de purification de l’ADN plasmidique (Kit Qiagen)
•Lavage de la colonne pour l’élimination des impuretés.
• concentration de l’ADN plasmidique sur la colonne par précipitation à
l’isopropanol.
•Lavage avec éthanol 70%.
•Élution avec de l’eau ou autre tampon d’élution.
•Les ARNs sont éliminés dès le début du procédé par ajout de l’ARNase- A au tampon de re-suspension des bactéries. Protocole Qiagen Miniprep: page 20-21 du guide Qiagen
Ce protocole est construit pour la purification d'environ 20 µg d'ADN
plasmidique à partir de 1-5 ml de culture en suspension de E. coli dans le milieu Luria Bertani (LB). Toutes les étapes de la purification sont réalisées à température ambiante (15-25 °C).
1- Re-suspendre le culot bactérien dans 250 µl de tampon P1 (tampon de
re-suspension) suivi d'un transfert vers un tube de centrifugation. Au préalable, il faut s'assurer que l' ARNase-A a été bien rajouter au tampon de re-suspension de bactéries P1.
2- Ajouter 250 µl de tampon P2 (tampon de lyse), mixer délicatement en
renversant les tubes 4-6 fois. Protocole Qiagen Miniprep: page 20-21 du guide Qiagen
3- Ajouter 350 µl de tampon N3 (tampon de neutralisation), mixer
délicatement en renversant les tubes 4-6 fois.
4- Centrifuger pendant 10 min à 13000 rpm. A la fin de cette étape, un
culot de couleur blanchâtre doit être obtenu.
5- Pipeter le surnageant sur une colonne QIAprep 2.0 et centrifuger
pendant 1 min à 13000 rpm. Protocole Qiagen Miniprep: page 20-21 du guide Qiagen
6- Laver la colonne QIAprep 2.0 avec 0.5 ml de tampon PB.
7- Ajouter 0,75 ml de tampon PE et centrifuger à 13000 rpm pendant 1 min.
8- Centrifuger la colonne pendant 1 minute supplémentaire afin
d'éliminer la totalité du tampon de lavage résiduel sur la colonne. 9- Eluer l'ADN plasmidique de la colonne avec 50 µl de H2O nucléase free, puis incuber pendant 1 minute et enfin centrifuger 1 minute à 13000 rpm.
10- Stockage de l'ADN plasmidique purifié à -20°C jusqu'à utilisation
ultérieure. Les différents types d’ARNs
ARNr: ARN ribosomique, forment avec les protéines ribosomiques
le ribosome. Organite consituant le site de synthèse des protéines.
Les ARNt: ARN de transfert. Ont pour rôle le transfert des acides aminés lors de la synthèse protéique dans les ribosomes.
ARNsn: ARN small nuclear, ils sont présents uniquement dans le noyau, participe dans la régulation post-transcriptionnelle de la synthèse protéique.
ARNm: ARN messager. Contient l’information génétique provenant de
l’ADN et se dirige vers les ribosomes pour la traduction de l’information en forme de protéine. Méthodes de Purification des ARNs Les ARNs sont isolés à partir de cellules, de tissus ou de micro-organismes.
Les extraits d’ARNs hybridation Northern Blot, banques ADNc, RT-PCR
…etc.
Extraction et purification des ARNs en pratique
Avant de commencer la purification:
Les ARNases: sont des enzymes qui dégradent les ARNs. Elles sont très abondantes sur toutes les surfaces de travail. Lors de la purification des ARNs, on procède:
À la décontamination du milieu de travail à l’aide DEPC (Diéthyl
pyrocarbonate), qui dégrade les ARNases. Extraction des ARNs totaux (méthode Trizol) Lyse/Broyage/homogénéisation des tissus
Séparation des ARN totaux avec du Trizol
Précipitation éthanol
Re-suspansion de l’ARN dans l’eau pure ARNase free
Traitement avec la ADNase I
Précipitation éthanol
Re-suspansion de l’ARN dans l’eau pure ARNase free
Protocole de Qiagen RNeasy mini kit: page 29-33 du guide Purification des ARNm Protocole de Qiagen RNeasy mini kit: page 29-33 du guide Protocole de Qiagen RNeasy mini kit: page 29-33 du guide
27 Protocole de Qiagen RNeasy mini kit: page 29-33 du guide
