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Génie Génétique

Objectif de l’enseignement

L’objectif principal de cet enseignement est d’initier l’étudiant aux

principes de bases des diverses méthodes utilisées en Génie Génétique.

La connaissance des différentes notions de Biologie moléculaire est un

pré-requis essentiel afin d’acquérir une meilleure compréhension des

méthodologies pratiquées en Génie Génétique.


Programme
Généralités
Méthodes d’extraction et purification des acides nucléiques

Méthodes d’analyse des acides nucléiques:


Quantification des acides nucléiques
Séparation des acides nucléiques par électrophorèse sur gel
Hybridation moléculaire et marquage des acides nucléiques

Séquençage des acides nucléiques

Outils enzymatique du Génie Génétique

La Polymerase Chain Reaction (PCR)

Étude de l’expression génique par RT qPCR


Programme
Étude de l’expression génique à l’aide des Biopuces
Les banques de gènes

Le séquençage à haut débit

Méthodes d’analyse de l’interaction des protéines avec les séquences


ADNs

Expression et production des protéines recombinantes

Mutagenèse dirigée
Généralités sur le Génie Génétique
Définitions

Biologie moléculaire: c’est la discipline qui étudie la Biologie du

fonctionnement de la cellule à l’échelle moléculaire. Elle comporte

l’étude des macromolécules tel que l’ADN, l’ARN et les protéines. Elle

est apparue après la découverte des chromosomes et de l’ADN comme

étant le support moléculaire de l’information génétique.


Le Dogme central de la Biologie

Transcription Traduction
ADN ARN Protéine
Transcription
inverse
Replication
de l’ADN
Définitions
Quelques dates historique en rapport avec l’évolution de la Biologie moléculaire
1944-détermination de L’ADN comme support du matériel génétique Avery, MacLeod & McCarty
1953-détermination du modèle de la structure d’ADN (double hélice), Watson & Crick et R.
Franklin.
1961-découverte du code génétique (compréhension du language simple de l’ADN).
1970-isolation de la première enzyme de restriction.
1973-développement de la technologie de l’ADN recombinant par Boyer & Cohen.
1976-développement des techniques de séquençage de l’ADN.
1980-légalisation du développement des produits OGMs aux USA.
1988-publication de la méthode PCR: “Polymérase Chain Reaction”
1990-lancement du projet de séquençage du génome humain.
1997-clonage nucléaire chez le mammifère (brebis nommée Dolly).
2001-Séquençage du génome entier de l’homme.
2018-Validation par la FDA "Food and Drug Administration" du premier médicament fait à base
d'ARN d'interférence (gene silencing) dénommé "Patisiran" destiné au traitement de la maladie
génétique rare: Amyloïdose Transthyrétine (hATTR).
Le Génie Génétique

Le génie génétique est un ensemble de techniques de biologie

moléculaire qui permettent d'identifier, d'isoler, et de modifier de

manière contrôlée le matériel génétique d’un organisme (les gènes). Ces

gènes sont ensuite réinsérer vers d’autre cellules ou organismes.


Le Génie Génétique

Le génie génétique intervient dans plusieurs domaines tel que:

L’étude de la structure et fonctions des gènes.

La production des protéines recombinantes.

La génération des organismes transgéniques (animaux ou plantes).

Le diagnostique et traitement des maladies.

Analyse des génomes par séquençage des ADNs.


…etc.
Exemples d’animaux transgéniques exprimant la GFP

GFP: Green Fluorescent Protein


238 acides aminés

Origine de la méduse :
Aequorea victoria
Principe du Génie Génétique

Le génie génétique est basé sur deux principes essentiels :

L'universalité du code génétique: Il est commun à tous les organismes,


des bactéries à l'être humain, de sorte que chaque organisme vivant a la
potentialité de lire, comprendre et réaliser l'information génétique
provenant d'un autre organisme vivant.
2eme base
1ere base 3eme base
(Extrémité 5‘) U C A G (Extrémité 3‘)

U Phe Ser Tyr Cys U


Phe Ser Tyr Cys C
Leu Ser STOP STOP A
Leu Ser STOP Trp G
C
Leu Pro His Arg U
Leu Pro His Arg C
Leu Pro Gln Arg A
Leu Pro Gln Arg G
A Ile Thr Asn Ser U
Ile Thr Asn Ser C
Ile Thr Lys Arg A
Met Thr Lys Arg G
Val Ala Asp Gly U
G
Val Ala Asp Gly C
Val Ala Asp Gly A
Val Ala Asp Gly G
Principe du Génie Génétique

Le clonage d'un gène: consiste à l'isolation et au transfert d’un gène


vers un autre organisme et de le faire multiplier.

Actuellement de nombreux génomes ont été intégralement séquencés


dont fait partie le génome humain. Il est donc désormais très facile
d’isoler une séquence d’ADN codante à une protéine d’intérêt et de la
reproduire.
Principe du Génie Génétique
Le clonage moléculaire

La manipulation du matériel génétique (ADN et ARN) est rendu possible


grâce au développement de la technologie de l’ADN recombinant. Cela
consiste à :

•Effectuer des coupures dans l’ADN et recombinaison entre différents


fragments.

•Amplification des fragments recombinés et transfert vers d’autres


cellules et organismes.
Principe du Génie Génétique

Cellule
recombinante

Analyse
protéique

Cellule
hôte Culture
Les enzymes de restriction
Les enzymes de restriction : sont des endonucléases purifiés à partir

de bactéries qui coupent l'ADN au niveau de séquences spécifiques et

uniques de 4 à 8 nucléotides appelées « site de restriction », produisant

ainsi des fragments d'ADN de tailles strictement définies, désignés sous

le nom de : fragments de restriction.

Les enzymes de restriction constitue un outil important en génie


génétique permettant la production de petits fragments d'ADN
renfermant des gènes particuliers.
Les enzymes de restriction
Sites de reconnaissance de quelques enzymes de restriction

Enzyme Site de reconnaissance


EcoRI G↓A-A-T-T-C
BamHI G↓G-A-T-C-C
PstI C-T-G-C-A↓G
Sau3A1 ↓G-A-T-C

PvuII C-A-G↓C-T-G
HpaI G-T-T↓A-A-C
HaeIII G-G↓C-C
NotI G↓C-G-G-C-C-G-C
Les enzymes de restriction
Une autre propriété des enzymes de restriction, commode pour le clonage des gènes,

est la capacité, pour beaucoup d'entre elles, de provoquer des coupures en « zig-zag »

qui laissent de courtes extrémités monocaténaires aux 2 extrémités du fragment

d'ADN : les extrémités cohésives.

Ces extrémités peuvent former des paires de bases complémentaires avec n'importe

quelle autre extrémité produite par la même enzyme. Ainsi, cela permet de relier 2

fragments d'ADN double hélice provenant de génome différents par appariement de

bases complémentaires
Étapes de clonage d’un fragment d’ADN Coupure de l’ADN par
l’enzyme de restriction
sur le site spécifique

Site de restriction

Extrémité cohésive

Fragment ADN
(insert)

Vecteur
(plasmide)
B Vecteurs (plasmide) Fragments ADN à cloné

Clonage de l’ADN sur le vecteur

Transformation des
bactéries et sélection
avec antibiotiques
La ligation
La ligase, est une enzyme capable de lier de façon covalente deux molécules d’ADN
Permettant de créer la jonction entre 2 fragments d’ADN
ADN-2
ADN-1
La ligation

ADN-2
ADN-1
Les vecteurs de clonage

VECTEURS HOTE Taille de


l’INSERT (Kb)
Plasmide Bactérie 10

Phage lambda Bactérie 25

Cosmide Bactérie 45

BAC (bacterial artificial chromosome) Bactérie 300

YAC (yeast artificial chromosome) Levure 1000


Le plasmide comme vecteur de clonage

Origine de la
réplication

Site de clonage Plasmide: vecteur


(MCS) de clonage

Résistance à l’antibiotique
exemple : Ampicilline
Le plasmide comme vecteur de clonage

Le plasmide est une molécule d’ADN bactérien de forme circulaire, de taille: 2-5 Kpb, capable de

se répliquer de manière autonome.

Confère la résistance à un ou plusieurs antibiotiques, propriété de sélection.

Des gènes étrangers peuvent être y insérer pour former un plasmide recombinant, il peut

accepter jusqu’à 10 Kbp d’insert.

Le plasmide peut servir de vecteur de clonage, donc peut être utiliser comme vecteur pour

transférer des gènes vers d’autres organismes.


Exemple de plasmide de clonage: pUC18/19
L’introduction de l’ADN recombinant dans les cellules hôtes

l’ADN recombinant produit est introduit dans les bactéries le plus


souvent par un choc thermique ou par choc électrique
(électroporation).

Système d’électroporation (choc électrique)


Sélection des cellules hôtes clonées

Vecteurs (plasmide) Fragments ADN à cloné

Clonage de l’ADN sur le vecteur

Transformation des
bactéries et sélection
avec antibiotiques
Sélection des cellules hôtes clonées

Liste d’antibiotiques utilisés pour la sélection des clones

Antibiotiques

Ampicilline (Amp)
Hygromycine B (HygB)
Kanamycine (Kan)
Neomycine (Neo)
Streptomycine (Str)
Tetracycline (Tet)
Les Organismes hôtes

-Bactéries : E. coli
hôte la plus utilisée
adapté pour de nombreux vecteurs plasmidiques

-Levure: Saccharomyces cerevisiae

-Cellules eucaryotes: plusieurs lignées cellulaires utilisées: exemple :


Chinese Hamster Ovary (CHO)

- Modèles animal
Quelques applications du génie génétique
Production de protéines recombinantes d’intérêt thérapeutique

Plusieurs protéines d’intérêt thérapeutique sont produites: pour

exemple, Fabrication de l’insuline, d’Interféron (INFs), d’hormones de

croissances pour le traitement du nanisme, de facteurs de coagulation

du sang pour le traitement de l'hémophilie, érythropoïétine (anémie),

vaccin contre l’hépatite B …etc.


Quelques applications du génie génétique
Analyse du matériel génétique:

Séquençage des génomes, empreintes ADN, étude de l’expression des


gènes (puces ADN) …etc
Quelques applications du génie génétique
Applications agronomiques

Amélioration des espèces végétales cultivées (résistance aux virus,

herbicides, insectes; amélioration de la conservation ou de

l’attractivité…).
Quelques applications du génie génétique
Développement de vaccins

Il existe plusieurs préparation vaccinale obtenues par génie génétique:

1-Toxines bactériennes inactivées par mutations au niveau des gènes


concernées.

2-Construction de vaccins à base de protéines recombinantes associées


à des molécules immunogènes.

3-Développement de vaccins ADN.


Développement de vaccins antiviraux par Génie Génétique
Schéma résumant la stratégie de développement du vaccin sous-unité recombinant anti-
Hépatite-B
ADN
Introduction de l’ADN
recombinant dans des
cellules de levure
Antigène S (Saccharomyces cerevisiae)
Cellule de levure Vaccin anti
recombinante HBV
Clonage du gène
Extraction et
purification du
vaccin anti HBV

Digestion du plasmide ADN recombinant Culture de levures


par des enzymes de recombinantes et
restrictions production de
l’antigène S

ADN génomique
Fermentateur

Plasmide

Antigène S
Bactérie
Quelques applications du génie génétique
La thérapie génique
La thérapie génique c’est une technique thérapeutique qui consiste à faire introduire
des gènes dans les cellules ou les tissus d’un individu pour traiter une maladie qui peut
être d’origine infectieuse, génétique, cancéreuse ou autre.

Exemple : traitement par thérapie génique de


la mucoviscidose par inhalation d’adénovirus
recombinants contenant le gène CFTR
fonctionnel.
Au delà des frontières

Bébés éprouvette, fabrication d’organes, eugénisme génétique …etc.

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