Étude de l’expression génique par RT-qPCR

La Reverse Transcription (RT)

C’est une méthode qui permet la production de l’ADN codant (ADNc) à

partir d’une matrice ARN. Cette réaction est catalysée par une
polymérase: la Rétro-transcriptase.

Contrairement à l‘ADN génomique, l’ADNc ne contient que les

séquences codantes des gènes exprimés (absence d’introns).

Les ADNc synthétisés sont ensuite utilisés comme matrice pour réaliser
des PCRs quantitative.
 La Reverse Transcription PCR (RT-PCR)
Comment réaliser une amplification PCR à partir d’un matériel
génique de départ sous forme d’ARN ?

Reverse transcription (RT)

ARNm
5’ AAAAAAAAAA 3’
RTase TTTTTTTTTT 5’

ADNc monobrin
3’ TTTTTTTTTT

PCR sur le produit de la RT

3’ TTTTTTTTTT
Taq
Primer-1

Primer-2

Primer-1
 La Reverse Transcription PCR (RT-PCR)
Choix des primers pour la RT

1- Oligo (dT) primers

5’ AAAAAAAAAA 3’ ARNm
3’ TTTTTTTTTT 5’ ADNc

2- Random primers
5’ AAAAAAAAAA 3’ ARNm
3’ ADNc monobrin

Random Primers

3- Primer spécifique à un gène

5’ AAAAAAAAAA 3’ ARNm
3’ ADNc spécifique d’un gène
Primer
 Rappels sur la PCR semi quantitative
PCR traditionnelle (semi quantitative)

ADN
matrice
Révélation par
cycle1
électrophorèse

2*Qté ADN

cycle2

4*Qté ADN
 Rappels sur la PCR semi quantitative
Les Étapes d’un cycle de PCR classique:

Dénaturation

Hybridation
des primers

Élongation
 La PCR quantitative (PCR à temps réel)

PCR traditionnelle L’analyse du produit d’amplification se fait à la

fin de la réaction PCR

La PCR classique est limitée en terme de quantification des produits

d’amplification (manque de précision).

Analyse des produits

PCR sur gel d’agarose

En 1992 : Développement de la PCR quantitative (PCR à temps réel)

 La PCR quantitative (PCR à temps réel)

La quantification des produits PCR se fait par le suivi de la cinétique de

la fluorescence émise en cours de la synthèse d’ADN double brin.

Suivi de l’accumulation de l’ADN via l’accumulation du signal de

fluorescence.

Fluorescence émise Qté ADN double brin Nombre de cycles PCR

Technique très sensible, ellei permet de déterminer la quantité de

matériel de départ utilisée pour la réaction même dans les cas les plus
extrêmes, cas des ARNm rare.
 La PCR quantitative (PCR à temps réel)

PCR traditionnelle L’analyse du produit d’amplification se fait à la fin

de la réaction PCR.

PCR à temps réel Explorer la réaction d’amplification à temps réel.

La PCR quantitative est réalisée avec un appareillage permettant de

suivre en continue l’apparition des produits d’amplification provenant
de l’émission d’une quantité de fluorescence qui est proportionnelle à la
quantité des produits PCR néo-formés.
 La PCR quantitative (PCR à temps réel)
L’analyse de l’expression génique consiste à la détermination de la
quantité de signal initial, qui représente la quantité d’ADNc présente au
départ de l’amplification.

La quantité d’ADNc de départ de la Q-PCR reflète le taux d’ARNm

présent dans un système cellulaire donné.

Analyse des ARNm, revient à l’étude de l’expression génique d’un

système cellulaire.

Comparable au cas de la PCR classique, l’amplification d’un fragment

d’ADN par Q-PCR se fait par utilisation de 2 primers délimitant
l’amplicon.

Remarque: la taille de l’amplicon en Q-PCR varie de 75 à 300 pb

 La PCR quantitative (PCR à temps réel)
Exemple d’appareil Q-PCR: Light Cycler 480 (Roche)
 La PCR quantitative (PCR à temps réel)

Courbe d’amplification de PCR quantitative

Bruit de fond

seuil

Ct: nombre de cycles PCR correspondant à l‘intersection de la courbe de

fluorescence avec la valeur seuil fixée au départ (dépend du bruit de
fond). Ct: appelé cycle seuil.
 La PCR quantitative (PCR à temps réel)
Exemple de résultats Q-PCR effectué sur 3 échantillons
Courbe d’amplification de PCR
quantitative
ADN

seuil

Ct1 Ct2 Ct3

 La PCR quantitative (PCR à temps réel)
Exemple de sortie de Résultats de Q-PCR en pratique

14
 La PCR quantitative (PCR à temps réel)
La PCR à temps réel est basée sur le révélation de la fluorescence de
l’ADN double brin synthétisé.

Les 2 principaux marqueurs fluorescent d’ADN utilisés:

SYBR Green: agent fluorescent intercalant de l’ADN. Marque

exclusivement l’ADN double brin.

Taqman: repose sur le principe d’hybridation de la sonde suivi de son

hydrolyse qui émet le signal de Fluorescence.

Il existe d’autres marqueurs fluorescents utilisés en Q-PCR: real-time

LUX probes, amplifluor …etc.
 Utilisation du SYBR Green pour PCR quantitative
La PCR quantitative basée sur le marqueur SYBR Green (molecular
probes).

Le SYBR Green est un marqueur capable de se lier à l’ADN double brin.

Cette liaison à l’ADN double brin lui procure une émission de la
fluorescence verte à 530 nm de longueur d’onde.

Lors de la réaction Q-PCR, l’accumulation des produits PCR (sous forme

d’ADN double brin) entraine l’augmentation de la quantité de SYBR
Green liant l’ADN double brin

augmentation de la quantité de fluorescence émise.

 Utilisation du SYBR Green pour PCR quantitative
ADNc issus de la RT 5’ 3’
Premier cycle d’amplification

Deuxième cycle d’amplification

Taq

Taq

2*Quantité
ADN

4*Quantité
ADN

.... 30-40 cycles

 Utilisation du SYBR Green pour PCR quantitative
Composition du milieu réactionnel: ADNc, tampon PCR, Primers, MgCl2,
ADN-polymerase + SYBR Green.
Avantages d’utilisation de SYBR Green:

Économique, facile à utiliser et bonne sensibilité.

Inconvénients:

Génération de résultats non-spécifiques dans le cas de dimérisation des

primers de faible qualité.

Nécessite prudence dans le design des primers (éviter les primers

capables de former des dimères).

Sensibilité aux contaminations par de l’ADN génomique.

Construire des primers situés au niveau des jonctions exon-exon.

 Utilisation des sondes Taqman pour PCR quantitative
La méthode Taqman (ou 5’ nucléase) (Applied Bioscience)
1- La sonde Taqman:
Sonde

R: reporter (fluorescent)
Q: quencher (extinction de la fluorescence)

R: 6-carboxyfluorescéine: FAM, tétrachlorofluorescéine (TET)

Q: tétraméthylrhodamine (TAMRA)

A l’état non-hybridé de départ , la sonde Taqman n’est pas fluorescente,

pour cause de la proximité existante entre la partie fluorescente (R) et
la partie quencher (Q).
 Utilisation des sondes Taqman pour PCR quantitative
2- Hybridation de la sonde Taqman sur la séquence complémentaire
de l’ADN matrice:

ADN matrice

La séquence nucléotidique de la sonde Taqman est construite de telle

sorte à ce qu’elle s’hybride sur une séquence complémentaire
spécifique située sur l’ADN matrice.
 Utilisation des sondes Taqman pour PCR quantitative
3- Extension du nouveau brin synthétisé et hydrolyse de la sonde
Taqman par la Taq polymérase lors de l’étape d’élongation:

Nucléotides (dNTPs) issus de la

dégradation de la sonde Taqman
Brin complémentaire néo-
synthétisé

ADN matrice

L’activité exonucléasique 5’ 3’ de Taq polymérase permet la

dégradation de la sonde Taqman. La partie (R) devient libre et distante de
(Q), ce qui permet l’émission de la fluorescence.
 Utilisation des sondes Taqman pour PCR quantitative
Le suivi de l’augmentation de la fluorescence suite à la libération de la
partie R de la sonde en cours de l’étape d’élongation, reflète la quantité
des produits PCR néo-synthétisée.

La quantité de sonde Taqman clivée = quantité d’ADN synthétisée

Composition du milieu réactionnel: ADNc, tampon PCR, Primers,

MgCl2, ADN polymerase + sonde Taqman (marquée R/Q) de séquence
spécifique à l’amplicon.
 Utilisation des sondes Taqman pour PCR quantitative
Critère de choix de la sonde Taqman

La taille de la sonde doit avoir entre 18-22 nucléotides.

Tm de la sonde doit être comprise 58-60 °C.

Tm de la sonde doit être supérieur de 10°C ou plus par rapport à Tm des primers.

L’amplicon ne doit pas dépasser 400 pb, la taille idéale est entre 50-150.

Le % GC situé entre 30-80 %.

 Quantification des résultats de Q-PCR
Comparaison des Ct:

Etape 1: normalisation par rapport à un contrôle endogène (gène GAPDH ou actine)

Ct gène cible – Ct contrôle endogène = Ct

Etape 2: normalisation par rapport au standard:

Ct échantillon - Ct standard = Ct

Etape 3: détermination de la variation du nombre de copie du gène cible/standard:

2-Ct
 Exemple de Quantification des résultats de Q-PCR

Contrôle endogène (actine) Gène cible

Pro-B Pre-B

Fluo
Fluo

Ct=16 Ct=32 Cycle Ct=16 Ct=26 Cycle

Immature-B Mature-B

Fluo Fluo

Ct=12 Ct=22 Cycle Ct=15 Ct=31 Cycle

 Exemple de Quantification des résultats de Q-PCR
Etape 1: normalisation par rapport au contrôle endogène (actine):
Ct proB = 32-16 = 16
Ct preB = 26-16 = 10
Ct immature = 22-12 = 10
Ct mature = 31-15 = 16

Etape 2: normalisation par rapport au gène standard (Pré-B):

Ct proB/PreB = 16-10 = 6

Ct immature/PreB = 10-10 =0

Ct mature/PreB = 16-10 = 6

Ct preB/PreB = 10-10 = 0

 Exemple de Quantification des résultats de Q-PCR
% d’expression du gène dans ProB/preB= 2-Ct *(100)= 2-6 *(100) = 1.56 %

% d’expression du gène dans immatureB/preB= 2-Ct = 2-0 *(100) =100 %

% d’expression du gène dans matureB/preB= 2-Ct = 2-6 *(100) =1.56 %

% d’expression du gène dans Pre-B/preB= 2-Ct = 2-0 *(100) =100 %

120

100

80
% /PreB

60

40

20

0
Pro-B Pre-B immature B mature B
 Exo d’application de Q-PCR

CT LLC-B1 LLC-B2 LLC-B3 contrôle

test1 test2 test1 test2 test1 test2 test1 test2

ORAI1 37,81 36,45 41,7 42,35 35,28 35,04 25,18 25,07

GAPDH 27,85 27,02 24,72 24,55 25,67 25,07 21,11 21,36

Faire une comparaison entre les niveaux d’expression du gène Orai1

chez 3 patients atteints de leucémie lymphoïde chronique (LLC-B) et un
individu normal. Représenter les résultats sous forme d’histogramme
indiquant la variation d’expression du gène sous forme de % en rapport
à l’expression du gène Orai-1 chez le contrôle.