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L’esprit d’équipe est l’antipode de l’ostracisme ou d’exclusion, du

sectarisme, du corporatisme négatif, des divisions et des oppositions qui


empoisonnent le climat au travail.
7° Le respect du bien commun.
Détruire ou détourner un bien commun, c’est priver toute une
communauté de moyens de sa politique. Le dysfonctionnement qui en
découle est plus grave, car plus étendu.
8° La patience.
C’est à dessein que cette vertu est citée en dernier lieu. En effet, pour
faire œuvre utile et durable, pour réaliser toutes les recommandations ci-
dessus énumérées, il faut s’armer de patience, car rien ne se fait en un jour,
mais au jour le jour ; petit à petit, à l’instar de l’oiseau qui fait son nid.

C’est à ce prix que l’Universitaire, Elite et CADRE développera et


aidera à développer son pays.
Démissionner de ce rôle, par le refuge ou l’exil sous d’autres cieux,
c’est condamner les siens et son propre pays au sous-développement.
A moins d’agir et de s’organiser en une véritable diaspora très active
et responsable, en faveur de sa chère patrie.

Prof. Dr Donatien KAYEMBE NZONGOLA-NKASU


Cours de Biologie Clinique |1

INTRODUCTION GENERALE
1. DEFINITION DE LA BIOLOGIE CLINIQUE

La Biologie Clinique est la branche de la médecine qui sřoccupe de


tous les examens ou analyses de laboratoire qui sont effectués chez lřêtre
humain ou lřhomme tout court. Son application peut se faire aussi chez
lřanimal à titre expérimental ou de recherche.

Ces examens permettent lřidentification ou la quantification des


substances biologiques dont lřabsence ou la présence, dans certaines limites,
traduit dřune manière objective, soit un état normal, soit un état
pathologique.

Cette absence ou cette présence, au delà de certaines limites, signe de


manière objective un état pathologique. Cřest pourquoi aujourdřhui, la
recherche en médecine sřappuie, en grande partie, sur la biologie clinique.

2. LES OBJECTIFS DU COURS

Le but de ce cours est, par conséquent, de familiariser les futurs


praticiens qui auront à travailler dans les conditions de notre pays, aux
analyses les plus courantes, les principes et les techniques de laboratoire
simples pour leur réalisation, ainsi que lřinterprétation des résultats si utiles
pour le diagnostic et le traitement.

Il sřagit pour eux dřen avoir les idées claires, en sachant :


a) procéder très correctement aux prélèvements et à la
conservation des échantillons à analyser ; en effet, lřanalyse commence au
lit du malade (et non au laboratoire) et sa valeur dépend dřun prélèvement
correct. Autrement dit, mauvais prélèvement ou non-conforme égale faux
résultat ;
b) demander les analyses avec discernement, en évitant des
demandes superflues ou trop nombreuses ;
c) orienter les demandes dřanalyses en fonction du diagnostic
de présomption ;
d) interpréter les résultats en fonction des données cliniques,
de la marge des variations physiologiques et des techniques dřanalyses
utilisées, les résultats pouvant différer dřune technique à lřautre ;
e) manipuler ou effectuer les analyses les plus importantes ou
les plus courantes.
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De ce fait, ce cours a des limites, il nřa pas la prétention de présenter
toutes les analyses, tant elles sont innombrables. Seuls donc les examens
courants retiendront notre attention.

3. SUBDIVISION DE LA BIOLOGIE CLINIQUE

Etant donné son spectre dřaction très large, la Biologie Clinique est
subdivisée en plusieurs orientations ou champs dřaction, appelés aussi
spécialités, qui constituent ainsi ses différents domaines dřapplication.

Il sřagit de :
3.1 Anatomie pathologique
3.2Entomologie
3.3 Malacologie
3.4 Microbiologie
3.5 Mycologie
3.6 Parasitologie
3.7 Immunologie
3.8 Immunohématologie (immunogénétique érythrocytaire)
3.9 Hématologie ou Hémo-cytologie et Coagulation sanguine
3.10 Biochimie clinique

Ainsi donc, lřancienne version du cours de « Techniques de


laboratoire » sera revue et enrichie dans les limites ci-dessus, des
connaissances approfondies, nécessaires pour les futurs médecins
généralistes.
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CHAPITRE I : GENERALITES
1.1. L’ORGANISATION DES LABORATOIRES EN RDC

Types : laboratoires cliniques (structures des soins) et laboratoires de


santé publique (surveillance des maladies transmissibles).
Tutelle : Ministère de la Santé.
Administration : Secrétariat Général à la Santé.
Technique : Direction des laboratoires médicaux.

Organisation pyramidale pour répondre aux soins de santé primaires


(SSP) :
- niveau central ;
- niveau intermédiaire ;
- niveau périphérique.
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1.2. ROLE DU LABORATOIRE DE BIOLOGIE CLINIQUE

Réaliser les analyses tant quantitatives que qualitatives des


substances contenues dans les liquides de lřorganisme tels que le sang, le
LCR (Liquide Céphalo-Rachidien), les sécrétions digestives, les larmes, le
sperme, les épanchements aussi bien que des tissus, les selles, les crachats,
les calculs et autres produits pouvant se trouver dans ou sur lřorganisme tels
que les médicaments et les poisons.

Pour ce faire lřusage des techniques aussi performantes que précises


sřavère nécessaire, afin de rendre les résultats les plus utiles pour le
diagnostic, le pronostic, le traitement des maladies.

Le laboratoire doit être ainsi géré par un personnel compétent


constitué de médecins biologistes, et des techniciens de laboratoire capables
dřutiliser parfaitement les appareils de mesure. Les bonnes connaissances
des principes des méthodes et la compréhension des relations entre les
résultats et lřétat physiologique ou pathologique sont indispensables pour
permettre les échanges entre le médecin traitant et le médecin biologiste.

1.3. QUELQUES PRINCIPES GENERAUX DES


ANALYSES DE LABORATOIRE

1. En dépit des meilleures conditions de réalisation, aucun


test nřest parfait.
- Les tests les plus sensibles sont utilisés pour mettre en évidence la
pathologie suspectée, réduisant ainsi le nombre des résultats faussement
négatifs.
- Les tests les plus spécifiques sont utilisés pour confirmer ou
exclure la pathologie suspectée, réduisant ainsi le nombre des résultats
faussement positifs. Dans certains cas spécifiques, le résultat dřun test peut
induire en erreur. La sensibilité et la spécificité dřun test peuvent être
altérées par la coexistence dřune autre pathologie, des complications ou des
séquelles de la pathologie primaire.

2. le choix des analyses à demander doit être orienté par la


plausibilité ou la présomption du diagnostic suspecté. Cette plausibilité est
basée sur lřhistoire, lřexamen physique et la prévalence de la maladie dans
la population. Lřanamnèse et lřexamen physique doivent donc précéder la
demande dřanalyses.

3. lřinterprétation des résultats se fait en fonction des valeurs


de référence. Celles-ci sont déterminées sur base des 95 % des résultats de
lřéchantillon de référence tiré lui même de la population de référence.
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Le laboratoire doit donc déterminer les valeurs de référence des
paramètres biologiques dans sa population pour permettre une interprétation
judicieuse des résultats des analyses. Lřinterprétation doit tenir compte des
variations possibles des valeurs, qui peuvent être dues à certains facteurs
comme lřâge, le sexe, la race, la taille et ou le poids, lřétat physiologique
(grossesse, allaitement, menstruation…).

4. des erreurs analytiques et autres courtes variations


physiologiques peuvent rendre difficiles lřinterprétation de certains résultats,
surtout si les valeurs trouvées sont proches des limites de référence. Dans
certains cas, lřanalyse peut être refaite sur un nouvel échantillon.

5. la répétition des résultats anormaux plus quřun résultat


isolé et/ou le degré élevé dřécart du résultat par rapport aux valeurs de
référence sont généralement plus significatifs de la maladie.

6. des répétitions et ou des multiplications excessives des


analyses sont inutilement cause de perte dřargent, de temps et de distraction
dřesprit. Les demandes dřanalyses et les intervalles de celles-ci doivent être
justifiés, notamment par lřétat du malade, les renseignements attendus,
lřévolution des paramètres biologiques au cours de la maladie.

7. la prise de certains médicaments, repas ou boissons peut


perturber certains paramètres biologiques. Il est donc important dřen tenir
compte lors de lřinterprétation des résultats des analyses.

8. Des erreurs grossières peuvent survenir lors de lřexécution


des procédures analytiques ou de la transcription dřinformation sur le
malade ou le résultat, et ainsi conduire à des conclusions erronées.

9. Dans certains cas, le résultat négatif dřun test nřest pas


nécessairement absence de maladie.

1.4. LES TECHNIQUES GENERALES ET


PROCEDURES EN BIOCHIMIE CLINIQUE

1.4.1. Introduction

Le rôle du laboratoire de biochimie clinique ou chimie clinique est de


réaliser les analyses tant qualitatives que quantitatives des substances
contenues dans les liquides de lřorganisme tels que le sang, lřurine, le
liquide céphalorachidien, les sécrétions digestives, le sperme, les larmes, les
épanchements ; aussi bien des tissus, des selles, des crachats, des calculs et
autres produits pouvant se retrouver dans ou sur lřorganisme tels que les
médicaments et les poisons.
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Cela requiert lřusage des techniques aussi performantes que précises,


afin de rendre les résultats les plus utiles pour le diagnostic et le traitement
des maladies. Aussi, le laboratoire doit-il être géré ou dirigé par un
personnel compétent et qualifié constitué de Médecins Biologistes et des
Techniciens de laboratoire capables dřutiliser parfaitement les appareils de
mesure.

Ceci suppose dřabord de bonnes connaissances des principes des


méthodes, de la disponibilité des solutions et réactifs les plus purs que
possible et enfin la compréhension des relations entre les résultats et lřétat
physiologique ou pathologique, en vue dřéchanges entre le Médecin Traitant
et le Médecin Biologiste.

Cřest ici lřoccasion de situer clairement la place principale du


Biologiste Clinicien dans les soins aux malades. « Si le Médecin Clinicien
est le médecin des malades, le Biologiste Clinicien est le médecin des
médecins : Doctorřs Doctors », comme disent les Anglosaxons. Il confirme
le diagnostic de présomption, aide à une meilleure évolution du cas et atteste
la guérison par la démonstration de la normalité des résultats initialement
pathologiques.

1.4.2. L’eau de laboratoire


Lřeau est le principal liquide utilisé au laboratoire. Elle sert à
nettoyer les ustensiles ou petit matériel de laboratoire. Elle sert aussi à diluer
ou solutionner les réactifs chimiques solides ou liquides. En tant que telle,
lřeau pour usage de laboratoire doit être pure.

Durant plusieurs années, le terme de « distillé » a été utilisé pour dire


de lřeau pure, parce que la distillation avait été la principale procédure
utilisée pour enlever des impuretés que contient naturellement lřeau non
traitée. Actuellement, il y a plusieurs méthodes pour produire lřeau « pure ».
Il sřagit de la filtration, la distillation, la désionisation et de lřosmose. Quelle
que soit la méthode utilisée, le degré de pureté est fonction de soins apportés
à la production dřeau. On classe lřeau en trois types (tableau I).

Type III

Cřest de lřeau propre qui peut être utilisée pour laver de la verrerie de
laboratoire. Elle peut être utilisée aussi pour certaines méthodes dřanalyses
qualitatives telles que les examens dřurines. En réalité, il sřagit de lřeau qui
contient encore assez des microorganismes, des particules de substances
organiques et inorganiques.
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Après lavage des ustensiles, ces derniers doivent inévitablement être
rincés par une autre eau plus pure, de grade II par exemple.

Type II

Il sřagit de lřeau de bonne pureté, utilisée généralement pour la


plupart des analyses qui ne requièrent pas lřeau très pure du type I. Elle
contient le minimum de bactéries et de substances chimiques. Etant donné
quřelle nřest pas aseptique ni stérile, sa conservation doit être limitée.
Tableau I : Les caratéristiques de différents types dřeau, selon le
NCCLS : National Comitee for Clinical Laboratory Standards, 1991.

Type I

Cřest de lřeau extrêmement pure, quřon nřutilise quřen cas de


certaines analyses qui ne tolèrent pas la moindre interférence dans la
réaction ou qui exigent le maximum de précision et dřexactitude. C’est par
exemple la détermination de traces des métaux, la mesure des enzymes, des
électrolytes, et la préparation des solutions de calibration ou des solutions
étalon de référence. Une telle eau doit être utilisée immédiatement après sa
production.

 la concentration des bactéries : nombre des colonies bactériennes


compté après 14h00, à 37ºC
 la résistivité ou résistance spécifique : est la conductivité ou vitesse
de conduction électrique mesurée dřune solution de 1cm³ à une température
donnée. Dans notre cas cřest soit 37ºC, soit 25ºC. Elle est exprimée en
MΩ/cm ou ohm/cm. Plus la résistivité est grande, plus la solution est mieux
purifiée et faible est sa conductivité. Cette dernière étant appelée siemens
ou S.
 les particules des matières : lřeau est considérée débarrassée
dřimpuretés si elle traverse un filtre dont les pores passants mesurent 0,2
µm.
 les matières organiques : quand lřeau traverse une couche de
charbon activée, elle est considérée contenir le minimum de matières
organiques.

1.4.3. Différents procédés de préparation d’eau de


laboratoire

1.4.3.1. Sédimentation
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Cřest le fait de laisser de lřeau séjourner pendant quelques heures
dans un récipient maintenu verticalement.

Procédé :
- remplir une bouteille dřeau transparente ;
- laisser reposer 3 heures ;
- observer le fond de la bouteille. Sřil y a un dépôt, recueillir le
surnageant ou la partie supérieure claire en évitant dřy entraîner le dépôt.
Mieux encore, filtrer ce surnageant pour obtenir lřeau encore plus propre.

1.4.3.2. Filtration

Il existe plusieurs procédés de filtration en fonction de types de filtres


utilisés.
- le premier type comporte des filtres en coton, en microfibres de
verre ou en céramique appelés filtres de Chamberlan. Ces filtres enlèvent
98% ou plus de particules. Cřest un système économique, car ces filtres
peuvent être lavés et réutilisés constamment ;
- le deuxième type de filtration est constitué dřune couche de
charbon activé à travers laquelle passe lřeau à filtrer. Le charbon activé a la
réputation dřenlever une large quantité de substances organiques et le
chlore. On peut aussi utiliser le sable ;
- le troisième type emploie des filtres constitués de trous passants ou
pores de lřordre de micron, lesquels enlèvent toutes les particules ou une
plus large quantité de microorganismes que les filtres précédents ;
- leurs pores mesurent habituellement 0,2 µm.

1.4.3.3. Distillation

Cřest la plus ancienne méthode de purification dřeau. Lřeau passe par


trois phases : liquide - vapeur - liquide. Ainsi, lřeau est chauffée jusqu'à
ébullition. Les vapeurs produites passent à travers une colonne de
refroidissement et sont condensées en gouttelettes qui retombent dans un
récipient sous une forme pure.

En effet, les vapeurs dřeau ne contiennent pas toutes les substances


non volatiles qui restent au fond du récipient chauffant. Elles contiennent
néanmoins certaines substances volatiles. Les gouttelettes dřeau peuvent
attraper une petite quantité de Na, K, Mn, carbonates et sulfates. Pour la
mesure de sa qualité, sa conductivité doit être de 10 MΩ/cm (Mega-
ohm/cm), c'est en fait lřeau de type I, très pure.
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Lřinconvénient de la distillation est son coût : elle exige beaucoup de
consommation dřénergie électrique (ou de braises ou de bois), beaucoup
dřeau et de temps.

Deux types dřappareils sont utilisés : en cuivre (alambics) et en verre.


Dans tous les cas, la vapeur dřeau produite se reforme en eau liquide goutte
à goutte. La production moyenne dřeau distillée est de 1,5 l/h pouvant aller
jusqu'à 3l/h en fonction de la puissance de chauffage. Ainsi, pour produire
une réserve de 20 litres dřeau distillée, il faut laisser couler et chauffer lřeau
pendant environ 10 heures dřaffilée.

1.4.3.4. Désionisation ou Déminéralisation

Il sřagit de lřélimination des sels minéraux contenus dans lřeau par


échange dřions. La poudre ou résine échangeuse dřions est une résine
insoluble constituée dřamines acides et basiques qui captent ou sřéchangent
avec les sels à fonction H+ ou OH-.

Les impuretés acides sont captées par les fonctions OH - de la résine,


tandis que les basiques le sont par les fonctions H+. Il est mieux dřutiliser
des désioniseurs commerciaux que de la résine propre. En effet, les
désioniseurs commerciaux sont bien préparés, ont des concentrations
suffisantes de la résine et sont livrés sous forme de flacons en plastic
dřutilisation facile. La désionisation est réalisée en faisant passer de petites
quantités dřeau à purifier à travers la résine échangeuse dřions H+ ou OH-.

Il y a 3 types dřéchangeurs dřions :

- des échangeurs dřions H+ ;


- des échangeurs dřions OH- ;
- et dřautres, contenant un mélange des deux.

Un désioniseur à deux couches consiste à séparer les ions en deux


étapes. Une première couche pouvant contenir exclusivement les cations-
exchanges, suivie dřune deuxième couche qui contient une résine anions
exchange, ou vice-versa. Il existe aussi des mélanges de deux cations et
anions.
1° Réaction type cation-exchange :
(RSO3)H + Na+ → (RSO3) Na+ + H+
2°Réaction type anion-exchange (résine constituée dřammonium
quartenaire) :
(RNRř3) OH + Cl- → (RNRř3) Cl- + OH-
3° Si lřon utilise une résine contenant seulement un seul type
dřéchangeur dřions, la qualité dřeau obtenue nřest que dřà peine plus de 1
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MΩ/cm de résistance. Par contre, utilisant le mélange de cations et dřanions,
la résistance de lřeau obtenue est supérieure à 10 MΩ/cm, donc de lřeau très
pure.

1.4.3.5. Eau tamponnée

Lřeau distillée est généralement acide ; et lřeau déminéralisée le


devient en contact avec lřair. Pour de nombreux usages au laboratoire
(coloration, etc…). Il est nécessaire de lui donner un pH neutre, aux
environs de 7 et de lřy maintenir, si possible en dissolvant des substances
tampons et ainsi obtenir de lřeau tamponnée.

1.4.3.6. Production d’eau tamponnée

- Dans un ballon jaugé de 1 litre, mettre 3,76g de phosphate


disodique hydraté (Na2HPO42H2O) :
Dissoudre avec environs 500 ml dřeau distillée.
Ajouter 2,1g de phosphate monopotassique anhydre (KH2PO4).
Dissoudre et compléter de lřeau distillée jusqu'à 1 litre.
Tester le pH qui doit se situer aux environs de 7.
Un pH supérieur à 7,2 signifie que lřeau est alcaline.
Un pH inférieur à 6,8 signifie que lřeau est trop acide.
Sřil sřagit dřune coloration dřun frottis sanguin, par exemple à pH
alcalin, la coloration sera plus bleutée et à un pH acide la coloration sera
trop rouge ; tandis quřà un pH neutre de ±7, la coloration sera équilibrée et
les éléments colorés seront bien distincts.

1.4.3.7. L’eau propre de robinet

A généralement un pH neutre de 7 et peut être utilisée à la place de


lřeau tamponnée. Il en est de même de lřeau filtrée.

1.4.3.8. Comment neutraliser de l’eau en l’absence des


substances tampons ?

a) par ébullition : bouillir de lřeau distillée ou de lřeau filtrée


pendant 10 minutes dans un ballon ouvert, pour chasser le gaz carbonique ;
b) par une solution à 0,2% (2g/L) de carbonate de sodium :
cřest dans le cas où malgré lřébullition, lřeau reste acide ;
Ajouter par litre dřeau acide, 5 gouttes de rouge de phénol,
Neutraliser progressivement en ajoutant goutte à goutte de la
solution de carbonate de sodium à 0,2% jusquřau virage de la coloration au
rose.
c) si lřeau est alcaline :
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Ajouter 5 gouttes de rouge de phénol par litre dřeau ;
Neutraliser en ajoutant goutte à goutte une solution dřacide
acétique à 0,55 (5g/L), jusquřau virage de la coloration à lřorange.
d) Empiriquement :
Si lřeau est acide, ajouter de petites quantités de phosphate disodique
pour accroître le pH.
Si lřeau est alcaline, ajouter de petites quantités de phosphate
monopotassique pour diminuer le pH.

1.5. LES REACTIFS DE LABORATOIRE

Il existe des milliers des réactifs de laboratoire. Dřaucuns sont des


réactifs commerciaux, dřautres sont des réactifs-maison, fabriqués par les
laboratoires eux-mêmes. Les réactifs commerciaux à utiliser au laboratoire
doivent être libellés pro-analysis. Ils contiennent une quantité très limitée
dřimpuretés. Il est des analyses qui exigent des réactifs ultrapurs comme le
dosage des traces de métaux. Les réactifs doivent être clairement identifiés,
leur composition, spécification, leur date de fabrication et éventuellement
dřexpiration clairement mentionnées.

1.6. LES INSTRUMENTS ET EQUIPEMENTS DE


LABORATOIRE

Les laboratoires sont équipés en fonction de leur niveau dans la


pyramide et des ressources disponibles : humaines, financières, matérielles,
eau, électricité… Il existe des listes dřéquipements et matériel nécessaires
pour chaque niveau :
- Microscope, généralement à 4 objectifs (10, 20, 40, 100) ;
- Centrifugeur/centrifugeuse, pour tubes à essai ;
- Microcentrifugeuse, pour hématocrite ;
- Photomètre/Spectrophotomètre, pour mesure densitométrique des
réactions des analyses ;
- Bain-marie, avec thermostat, pouvant varier entre 25 et 100°C ;
- Réfrigérateur, pour garder certains réactifs et les échantillons,
généralement entre 4 et 8°C ;
- Balance de précision, pour la préparation des réactifs ;
- Autoclave/Poupinel ou Four Pasteur, pour la stérilisation de
matériel ;
- Distillateur, pour distiller et produire lřeau pure, sans trop
dřimpuretés ;
- Support de Westergreen, pour mesure de vitesse de
sédimentation(VS) ;
- Compteur différentiel des cellules sanguines : GR, GB,
Thrombocytes ;
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- Pipettes, pour aspiration des réactifs et échantillons sanguins et
autres ;
- Matériel de prélèvement : seringues et aiguilles, tubes ;
- Verrerie : tubes à essai, lames et lamelles, burettes, verres à pied,
Erlenmeyers, ballons, flacons, fioles, béchers ;

1.7. LES PRELEVEMENTS AU LABORATOIRE

1.7.1. Introduction

Les analyses au laboratoire servent à poser le diagnostic de maladies,


à avancer un pronostic, à suivre lřévolution des maladies ou lřeffet du
traitement. La perturbation des résultats dřun test peut être vue comme la
conséquence dřun processus pathologique. Et pourtant, plusieurs facteurs
peuvent, en dehors de toute maladie, perturber les résultats dřun test. Ces
facteurs peuvent être pré-analytiques ou analytiques.

Les facteurs pré-analytiques peuvent être biologiques ou non


biologiques. Une bonne préparation du malade avant le prélèvement
contribue à contrôler les facteurs biologiques perturbateurs.

1.7.2. Le prélèvement du sang


Le sang est lřun des liquides biologiques qui servent le plus pour les
analyses au laboratoire. Il peut être prélevé par ponction veineuse, artérielle
ou capillaire. Le sang veineux est utilisé pour la majorité des analyses au
laboratoire. Ainsi, la phlébotomie ou ponction veineuse est le moyen de
prélèvement le plus usité. Les veines du pli du coude sont les plus utilisées
car larges et superficielles. Le garrot est placé entre 10 et 15 cm au dessus
du site choisi et une aiguille de bonne dimension (G19 à 22) est utilisée pour
ponctionner. Présentement, des aiguilles appropriées adaptées aux tubes
vacutainer avec pression négative sont disponibles. Il est déconseillé de
procéder à un prélèvement à partir dřune aiguille posée en permanence pour
un traitement intraveineux répétitif ou une perfusion, de même de laisser un
garrot trop longtemps en place.
Dans certains cas (nouveau-né, nourrissons), ou pour de petits
volumes de sang ou encore pour certaines analyses, par exemple la mesure
des gaz du sang, la ponction capillaire est plus indiquée. Elle peut être faite
à la face latérale de la pulpe du doigt (majeur ou annulaire) ou au lobe de
lřoreille, pour lřadulte et le grand enfant. La face latérale externe ou interne
du talon ou la face plantaire du gros orteil est utilisé pour le nourrisson ou le
nouveau-né. La ponction capillaire peut être faite respectivement au niveau
de lřartère radiale au poignet, de lřartère brachiale au pli du coude ou de
lřartère fémorale au pli inguinale. La ponction doit être faite par un médecin,
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un infirmier ou un technicien de laboratoire suffisamment entraîné. Chez un
nouveau-né, le sang artériel, pour la mesure des gaz du sang, peut être
prélevé au niveau de lřartère ombilical par cathétérisme.

1.7.2.1. Types d’échantillons de sang utilisés au laboratoire


Dans tous les cas, les analyses faites au laboratoire sur le sang, le
sont soit sur le sang total, soit sur le sérum ou sur le plasma. Le sérum est
obtenu en prélevant le sang dans un tube sec sans anticoagulant et en le
laissant se coaguler pendant une vingtaine de minutes. Le processus est
accéléré par la réfrigération à 4°C.
Le sang total est obtenu en prélevant du sang dans un tube avec un
anticoagulant approprié. Ce sang reposé pendant quelques minutes ou
centrifugé, donnera un culot cellulaire et un surnageant qui est le plasma.

1.7.2.2. Les anticoagulants


Plusieurs anticoagulants sont disponibles et peuvent être utilisés
selon les paramètres biologiques à analyser.

1.7.2.2.1. L’héparine

- anticoagulant très utilisé car interfère moins avec les tests ;


- utilisé sous forme de sels de sodium, de potassium, de lithium et
dřammonium ;
- accélère lřaction de lřantithrombine III qui neutralise la thrombine
et prévient la formation de la fibrine à partir du fibrinogène ;
- convient pour la plupart des paramètres ;
- 0,2 mg dřhéparine sont nécessaires pour 1 ml de sang.

1.7.2.2.2. L’EDTA (Ethylen Diamin Tetra-acetic Acid)


- très utilisé pour les analyses hémocytologiques, car préserve les
cellules ;
- chélateur de calcium, disponible sous forme de sels dissodique ou
dipotassique ;
- 1 à 2 mg dřEDTA pour 1 ml de sang.

1.7.2.2.3. Le citrate
- chélateur modéré de calcium, utilisé sous forme de solution de
citrate de sodium à 3,4 ou 3,8 g/dl. Il est essentiellement utilisé pour les tests
de coagulation dans les proportions de 1ml pour 9 ml de sang.

1.7.2.2.4. Les oxalates


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- chélateurs de calcium, utilisés sous forme dřoxalate de sodium, de
potassium, dřammonium, et de lithium ; le plus utilisé étant lřoxalate de
potassium ;
- 1 à 2 mg pour 1 ml de sang.

1.7.2.2.5. Le Fluorure de sodium

- inhibiteur de la glycolyse avec une très faible action anticoagulante,


associé souvent à lřoxalate de potassium : 2 mg pour 1 ml de sang.

1.7.2.2.6. L’iodoacétate

- inhibiteur de la glycolyse, substitut du fluorure de Na, nřa pas


dřaction sur lřuréase, mais inhibe la créatine kinase.

1.7.3. Le prélèvement de l’urine


- Le type dřurine à prélever dépend des analyses à effectuer.
Généralement, les échantillons dřurine sont collectés suivant un intervalle de
temps défini : 1, 2, 4, 6,12 ou 24 heures ;
- Lřurine du matin est généralement plus concentrée et préférée pour
les analyses microbiologiques et la mise en évidence des quantités
anormales de certains constituants (protéines par exemple) ou des
composants inhabituels comme la β-gonadotrophine chorionique ;
- Les dix premiers ml dřurine sont appropriés pour la détection des
urétrites, tandis que lřurine du milieu du jet est préférable pour
lřinvestigation de la vessie ;
- Lřurine est collectée par miction normale ; tandis que le
cathétérisme est pratiqué pour les analyses microbiologiques chez des
patients en état critique ;
- Des instructions claires et précises doivent être données au patient
pour la collecte dřurine. Pour une période donnée, la vessie doit être évacuée
avant le début de la collecte ;
- Lřurine recueillie doit être examinée dans les deux heures, car les
bactéries et les champignons altèrent ses constituants, sauf des électrolytes.
- Si les analyses doivent se faire plus tard, il est bon dřutiliser un
conservateur ou préservatif (antiseptique). Plusieurs préservatifs sont
disponibles selon les analyses à effectuer : réfrigération, lřacide acétique
glacial, lřacide borique, lřacide chlorhydrique concentré, lřacide nitrique, le
toluène, lřéther, etc.

1.7.4. Le prélèvement du liquide céphalorachidien (LCR)

Le LCR est prélevé par ponction lombaire pratiquée par un médecin.


Plus ou moins 20 ml peuvent être recueillis chez un adulte sans danger. La
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ponction est faite généralement au niveau de L4-L5, 1 à 2 ml sont
nécessaires pour la bactériologie, 1 à 2 pour la cytologie et 8 ml pour la
biochimie. Lřexamen devant se faire assez rapidement, aucun préservatif
nřest nécessaire.

1.7.5. Le prélèvement des liquides d’épanchement

Les cavités synoviales, pleurales, péricardiques, et péritonéales sont


normalement virtuelles et ne contiennent juste quřun fluide de lubrification
qui permet le glissement des feuillets sans irritation.
Dans certaines situations, ces cavités accumulent du liquide suite à
une inflammation, une infection ou un traumatisme. Ce liquide est prélevé
par un médecin et examiné pour orienter la démarche diagnostique.

En effet des analyses permettent de distinguer le transsudat de


lřexsudat. Le transsudat résulte du passage du liquide interstitiel ou
vasculaire dans les cavités ou les espaces lacunaires sans inflammation ou
traumatisme, tandis que lřexsudat est lřaccumulation du liquide dans les
cavités suite à un processus inflammatoire ou un traumatique.

1.7.6. Le prélèvement de la salive

Les analyses sur la salive sont plus ou moins limitées au dosage des
médicaments et à la recherche de certains marqueurs. Des écouvillons sont
utilisés dans certains cas.

1.7.7. Le prélèvement des selles

Les selles ou fèces sont fournies au laboratoire dans une boîte de


carton paraffine ou une boîte de Pétri. Les selles sont prélevées après
émission libre, Il nřest pas conseillé de prélever les selles avec un doigt
ganté, surtout quand on recherche une hémorragie occulte.

1.7.8. Le prélèvement du liquide amniotique (amniocentèse)


Le liquide amniotique est prélevé par un médecin entraîné. Des
techniques dřimagerie peuvent faciliter le prélèvement, et le site favorable
est lřespace au regard du cou fœtal, en dessous de la tête ou des espaces non
occupés de la cavité amniotique.
Les analyses possibles portent sur :
- le diagnostic des malformations ;
- lřévaluation de la maturité fœtale ;
- la recherche dřune iso-immunistion Rh ;
- la recherche dřune infection intra-utérine.
Cours de Biologie Clinique | 16

1.8. LES FACTEURS PHYSIOLOGIQUES QUI


AFFECTENT LA COMPOSION DES LIQUIDES
PHYSIOLOGIQUES

La standardisation des pratiques de prélèvement des échantillons


minimise les variations qui causent des changements dans les résultats, dans
la journée ou dřun jour à un autre. Ceci facilite lřinterprétation des résultats.
Cependant, il est important de connaître les facteurs dont certains
sont contrôlables dřautres non, qui ont des effets sur la composition des
liquides corporels.

1.8.1. Les facteurs biologiques contrôlables

1.8.1.1. La position

Chez un adulte, la différence du volume sanguin entre la position


debout et la position recroquevillée est de 600 à 700 ml. Le passage de la
position couchée à la position débout se traduit par une réduction dřenvirons
10% de volume sanguin.

Comme cřest le fluide sans protéines qui passe à travers les


capillaires vers les tissus, la réduction du volume plasmatique est plus
importante que la réduction du volume sanguin. La réduction du fluide
plasmatique sřaccompagne dřune augmentation similaire de la concentration
des protéines plasmatiques.

Ainsi la concentration des protéines, comprise celle des enzymes, des


hormones protéiniques, des médicaments, du calcium et de la bilirubine qui
circulent en partie liés, sont affectées.

Lors du passage de la position debout à la position couchée, le


changement de volume sanguin est complet dans les 30 minutes ; alors que
la baisse du volume est complète dans les 10 minutes, lors du passage de la
position couchée à la position debout.

La variation de la concentration des protéines et des substances liées


est plus importante chez les hypertendus, les personnes avec une
concentration plasmatique des protéines basse et chez les vieillards.
Lřimpact de changement de position est moins important chez des personnes
avec un taux anormalement élevé des protéines, comme dans les gamma-
protéinopathies (myélome multiple).

De manière générale, les constituants libres diffusibles avec un poids


moléculaire inférieur à 5000 Daltons, ne sont pas affectés par le changement
Cours de Biologie Clinique | 17
de posture. Cependant, une augmentation du potassium (0,2 à 0,3mmol/L)
survient dans les 30 minutes quand un individu sřélève.

1.8.1.2. Hospitalisation et immobilisation

Lřalitement prolongé provoque une rétention liquidienne qui peut


baisser la concentration des protéines et de lřalbumine plasmatiques,
respectivement de 5 et 3 g/L, les composantes liées aux protéines subissent
la même baisse. Il en va de même dřune augmentation de lřexcrétion de
lřazote urinaire, du calcium, du sodium, du potassium, des phosphates, et
des sulfates. Au sortir de lřalitement par exemple, lřexcrétion du calcium se
normalise après au moins 3 semaines, et 3 autres semaines sont nécessaires
pour restaurer lřéquilibre calcique.

1.8.1.3. Exercice Physique

Lřinfluence de lřexercice physique sur la composition des liquides


corporels dépend de la durée et de lřintensité de cette activité. Le stress
provoqué par lřexercice augmente la glycémie qui stimule la sécrétion de
lřinsuline. La différence des concentrations du glucose dans les artères et les
veines est augmentée à cause de la forte demande tissulaire. Le métabolisme
musculaire important augmente le taux des pyruvates et lactates
plasmatiques. Le pH et la pCO2 artériels sont réduits par lřexercice, alors
que la créatinine est légèrement augmentée par la réduction du flux sanguin
rénal.

Il est observé une élévation du taux des urates, de même que des
enzymes dřorigine musculaire, comme les transaminases, le lactate
déshydrogénase, la créatine kinase et lřaldolase. Chez les athlètes, le taux
sérique des enzymes musculaires et celui de lřurée, des urates, de la créatine
et de la thyroxine sont généralement élevés. Tandis que le taux des lipides et
du cholestérol et des triglycérides est bas.

1.8.1.4. Variations circadiennes et nycthémérales

Une variation biologique qui se rapporte à une période dřenviron 24


heures est dite circadienne, et celle qui coïncide à une journée ou à une nuit
est dite nycthémérale, soit autrement dite, à un état de veille et à celui de
sommeil.

Beaucoup de constituants des fluides corporels présentent des


variations nycthémérales. Plusieurs facteurs sont cités comme cause de ces
variations notamment la position, lřactivité, lřingestion de repas, le stress, la
lumière ou lřabsence de lumière, lřétat dřéveil ou de sommeil. Certaines
variations circadiennes peuvent être très importantes et poser le problème
Cours de Biologie Clinique | 18
dřinterprétation des résultats, dřoù lřimportance du contrôle strict des
prélèvements. Le fer sérique peut changer de 50% entre 8h00 et 14h00
comme celui du cortisol entre 8h00 et 16h00.
Les hormones subissent aussi des variations biologiques, notamment
la rénine (activité élevée au petit matin), testostérone (taux élevé la nuit),
TSH (taux maximum entre 2h00 et 4h00), GH (maximum au début du
sommeil), insuline (concentration basale maximale le matin).

1.8.1.5. Influence de l’alimentation et des stimulants

1.8.1.5.1. Variation postprandiale ou ingestion récente


d’aliments
La concentration de certaines composantes sanguines est affectée par
lřingestion dřun repas ; une augmentation est plus marquée pour le glucose,
le fer, les lipides totaux et la phosphatase alcaline.
Les repas riches en protéines pris le soir affectent la concentration de
lřurée, des urates et du phosphore. Pris une heure avant, ils affectent le
cholestérol, lřhormone de croissance. La caféine augmente la concentration
des acides gras libres, du cortisol, des catécholamines et du glucose.

1.8.1.5.2. Tabagisme

La nicotine, substance principale des cigarettes, augmente la


concentration du glucose, de lřhormone de croissance, de lřépinéphrine, des
lipoprotéines, du cholestérol et des triglycérides ; de lřurée, de lřalbumine,
des phospholipides, du taux des GR et des GB. La P02 est abaissée alors que
la carboxyhémoglobine est élevée. Ces perturbations sont directement
proportionnelles au nombre de cigarettes fumées.

1.8.1.5.3. Ingestion d’alcool

Lřingestion importante dřalcool peut élever la concentration du


glucose, plus marquée chez les diabétiques. Elle cause aussi une
augmentation des triglycérides plasmatiques, voire des catécholamines.
Lřalcoolisme augmente lřactivité de plusieurs enzymes comme la γ-
glutamyltransférase, lřisocitrate déshydrogénase et lřornitine
carboxyltransférase.

Lřalcool diffuse directement dans le sang à partir déjà de lřestomac,


et atteint vite le cerveau, cřest pourquoi lřon est grisé dès les premiers
instants de sa consommation. Etant la plus petite molécule produite par le
métabolisme cellulaire, elle est préférentiellement catabolisée, tandis que les
graisses sřaccumulent dans le tissu adipeux, dřoù lřobésité alcoolique et
risque de diabète sucré.
Cours de Biologie Clinique | 19
1.8.1.6. Prise des médicaments

Beaucoup des gens, apparemment en bonne santé ou des malades,


prennent continuellement des médicaments : tranquillisants, somnifères,
antalgiques, etc. Administrés en IM, ils augmentent lřactivité des enzymes
tels que la Créatine Kinase, lřaldolase, le lactate déshydrogénase. Les
opiacés, comme la morphine, augmentent lřactivité de certains enzymes
hépatiques tel que lřaspartate aminotransférase. Les diurétiques réduisent la
concentration du potassium, augmentent celle du calcium. Les thiazides
peuvent causer une hyperglycémie.

1.8.1.7. Certains états de maladie

1.8.1.7.1. Fièvre

Augmentation du glucose, de lřinsuline, par un processus réactionnel


dû au cortisol secondaire au stress ; et diminution de la thyroxine et du
cholestérol sanguin, suite à la perturbation métabolique respective de lřiode
plasmatique par lřhyperthermie.

1.8.1.7.2. Choc ou traumatisme

En dehors des causes du choc ou traumatisme, lřaugmentation du


cortisol, de lřaldostérone, du glucagon, de lřinsuline, est due à la sécrétion
élevée des catécholamines induite par lřanxiété et le stress. Le traumatisme
avec perte de sang, appelée déplétion sanguine, provoque une hypovolémie
qui a comme conséquence la diminution du flux rénal et donc de lřexcrétion,
dřoù lřaugmentation de lřurée et autres catabolites des protéines.

1.8.1.8. Autres influences

a) La haute altitude provoque la polycytémie ou nombre


excessif des GR, et concomitamment, du taux de lřhémoglobine.
b) Les changements saisonniers ont une influence minime, à
côté dřautres facteurs comme la position. Les causes en sont : changement
de régime alimentaire, activités physiques, présence ou pas de soleil qui joue
un rôle prépondérant dans le métabolisme du calcium via la vitamine
D(hypocalcémie en hiver et par le port de plus dřhabillement en saison de
froid), trop dřhabillement qui empêche les rayons solaires dřactiver la
vitamine D dřorigine cutanée.
c) Influence du cycle menstruel, qui diminue lřhémoglobine.
d) Variation de différentes hormones qui jouent un rôle de
premier plan dans lřéquilibre métabolique de lřorganisme.
Cours de Biologie Clinique | 20
e) Influence de la diète : végétarisme et donc riche en
vitamines, malnutrition et jeûne qui entraînent lřhypoprotéinémie et
lřacidose métabolique (acétonémie et acétonurie).
f) Influences de la race liées à certains désordres génétiques :
anémie SS, thalassémies, déficit en G-6-PD (Glucose-6-Phosphate
Déshydrogénase), etc.
g) Age :
Nouveau né : à cause du traumatisme de la naissance, de lřimmaturité
de certains organes et de lřeffort dřadaptation, les taux et les types
dřhémoglobine (hémoglobine fœtale), du glucose et des lipides sont très
variables, généralement bas.
h) Sexe :
Avant la puberté : peu de différence.
Après la puberté: activités de quelques enzymes plus élevées chez
lřhomme: phosphatase alcaline, aminotransférases, créatine-kinase,
aldolase ; ainsi que les paramètres tels que lř Hb, Ca, Mg, Albumine, γ-
globulines, fer, ferritine, cholestérol, créatine, urée, acide urique.

1.8.2. Les facteurs biologiques non-contrôlables

1.8.2.1. Race

Différences difficiles à dissocier des celles dues aux conditions


socio-économiques.
-Protéines sériques (γ-globulines), IgG et IgA, activités de la crétine
kinase et le lactate déshydrogénase, plus élevés chez le Noir.
-Albumine, cholestérol et triglycérides plus élevés chez le blanc.

Il faut noter cependant quřil existe notoirement des états de


santé liés aux races, dont il faut tenir compte dans certaines circonstances.
Cřest le cas du stigmate héréditaire hémoglobinique S chez le Noir, de la
thalassémie chez le Nord Africain et lřAsiatique notamment, comme nous
venons de le noter ci-haut.

1.8.2.2. Les facteurs génétiques

On vient dřy faire partiellement allusion au point sur la race. Lřon


pourrait signaler les maladies de stockage lysosomal, telles que la maladie
de Tay-Sachs, maladie de Niemann-Pick (Lipidose sphingomyéline),
maladie de Gaucher (Lipidose glucosylcéramide), etc, dont la cause est un
trouble enzymatique.

1.8.2.3. La pré-puberté
Cours de Biologie Clinique | 21
Age allant jusquřà 13 ans environ, durant lequel les données
biologiques ne se différencient pas entre filles et garçons, du fait de
lřimmaturité sexuelle.

1.9. LES UNITES DU SYSTEME INTERNATIONAL : SI

Avant lřinstauration dřun système des mesures adopté par tous,


pratiquement chaque localité, chaque région, chaque pays utilisait les
mesures qui lui convenaient. Quand on changeait de localité, de région ou
de pays, on devait donc sřadapter au système local ou chercher la
correspondance avec son système. Dřoù le besoin dřavoir un système
uniforme.

Traditionnellement, les mesures étaient exprimées en unités


métriques de longueur, de masse et de temps. Notamment, en mètre,
gramme, seconde (MGS), puis en mètre, kilogramme et seconde (MKS).
Dans le rendu des résultats des analyses quantitatives au laboratoire, la
mesure est exprimée généralement par un chiffre suivi dřune unité de
mesure. Alors que lřunité identifie la dimension, la masse, le volume ou la
concentration, le nombre exprime lřimportance ou la quantité dřunités du
paramètre mesuré.

Le système actuel est dit Système International dřUnités (SI) et est


accepté depuis 1960. Le bureau International des poids et mesures assure la
référence et est lřautorité établie pour sřassurer de lřuniformité des mesures
physiques en matière des unités Internationales.
Le système international a défini des unités de base, à côté de celles-
ci ont été définies des unités dérivées et le 3e groupe est celui des unités
supplémentaires acceptées.
Le SI est cohérent et logique. Les unités de base (7 +1) ont des
multiples et sous-multiples qui ne contiennent pas dřautres facteurs
numériques en dehors de 1.

Les unités dérivées proviennent mathématiquement de 2 ou plus


dřunités de base, et les unités supplémentaires acceptées sont celles qui ne
sont classées ni comme unités de base, ni comme unités dérivées, mais qui
sont conformes au SI (radian pour les angles plats).

Autres unités non SI retenues pour être utilisées :


-Temps : minute (mn), heure (h), jour (j) ;
-Angles plats : degré (° : л/180 rad), minute (ř : л /10800rad),
seconde (řř : л/648000rad) ;
-Volume : litre (L), 1 L : 1dm3 ou 10-3 m3 ;
-Masse : tonne (t), 1t : 1000 kg.

Tableau II : Grandeurs de base et unités de base correspondantes.


Cours de Biologie Clinique | 22

Les habitudes dans certains pays ou corps de métiers font encore


que soient utilisées certaines unités qui ne figurent pas dans le SI. Par
exemple :
-Le mile : 1662 m (anglosaxon), mile marin : 1852 m ;
-La lieue : 4 km ;
-Le pouce : 27,07 mm, ingénieurs (anglosaxon : 25,4 mm) ;
-La livre : 489,5 g (France) ou 453,592 g (anglosaxon) ;
-Lřacre: 40, 47 ares (are : 100 m²) ;
-Lřarpent: 191, 8 pieds (Canada);
-Le gallon : 4,546 L ou Imperial gallon Canada et Angleterre, ou US
gallon 3,78 L (USA) ;
-Parfois, cřest lřexpression des unités qui pose problème : mg/L,
mg/100ml, g/L… ou lřutilisation des symboles :
-micro = µ pour millième (micron), et µ = micromètre, exprimant
deux choses différentes ;
-Millimicron = mµ ou nanomètre = nm, les deux disant la même
chose.

Importantes Unités dérivées des unités de base du SI

Tableau III : Unités dérivées des unités de base du SI.


Cours de Biologie Clinique | 23

Lřavantage du SI est que, les réactions moléculaires se faisant par


rapport moléculaire et non en rapport de masse, on peut ainsi, dans leur
expression, utiliser la grandeur quantité de substance ou mole, chaque fois
que cela est possible, à la place de la grandeur masse ou gramme, et
lřutilisation du litre comme unité de volume principale. Par exemple, la
réaction HCl + NaOH NaCl + H20 se faisant molécule par
molécule, il apparaît donc logique dřexprimer les résultats en mole et sous-
unités de mole ; la mole étant définie comme la masse en g sur le poids
moléculaire en g.

En ce qui concerne les enzymes, une anarchie régnait dans


lřutilisation des unités, souvent cřétait des noms propres comme Somogyi,
Bodansky, Frankel, King-Armstrong, etc. Lřordre y fut mis en définissant
lřUnité Internationale (UI), puis le Katal, grandeur de base de la quantité
catalytique. LřUI est définie comme la quantité dřenzyme (contenu dans un
liquide biologique) qui, à 25°C, transforme une µmol de substrat par minute
dans les conditions optimales de pH et de force ionique. Ainsi, le Katal est
défini comme la quantité dřenzymes par litre de liquide biologique qui, à
25°C, transforme une mole de substrat par seconde.

Comment passer dřun mode dřexpression à lřautre ? Pour passer


de lřexpression des résultats en masse à celle des résultats en quantité de
substance, le calcul est simple. Il faut diviser le résultat exprimé en masse/L
par la masse moléculaire de cette substance.
Exemple : Urée : M.M.=60
Urée sanguine en masse=0,40g/L
0,40
Cours de Biologie Clinique | 24
Urée en mol/L=------=0,0066 mol/L ; soit 6,6mml/L
60
Inversement, pour passer des mol/L aux g/L, il suffit de
multiplier le résultat en mol/L par la masse moléculaire de la substance.
Pour passer des milliéquivalents en millimoles, cřest encore plus
simple, puisquřil suffit de tenir compte de la valence de lřion : pour les ions
monovalents, le facteur de multiplication est 1; pour les ions bivalents, le
facteur de multiplication est 0,5.
Exemple :-K+ : 5mEq/L, mmol=5x1=5mmol/L
-Ca++ : 5mEq/L, mmol=5x0, 5=2,5 mmol/L
N.B : Voir, dans les annexes, les tableaux de conversion des
unités.

1.10. LA BIOSECURITE DANS LES LABORATOIRES DE


BIOLOGIE MEDICALE

1.10.1. Introduction

Les progrès accélérés de la médecine en général et de la biologie


médicale en particulier, posent de graves problèmes de sécurité dans le
milieu hospitalier et son environnement. Le risque au laboratoire peut
provenir des éléments physiques, chimiques et/ou infectieux. Nous allons
insister, dans ce chapitre, sur la biosécurité dans les laboratoires dřanalyses
médicales.

La mise en place des mesures adaptées à la prévention des risques


infectieux liés aux prélèvements nécessite une démarche systématique.
En premier lieu, il sřagit dřévaluer le risque infectieux en fonction
des laboratoires concernés, étape qui passe par la connaissance des
caractéristiques épidémiologiques et microbiologiques des principaux agents
infectieux présentant un risque en pratique de laboratoire.
En deuxième lieu, la mise en œuvre de deux volets qui permettent
alors de définir les méthodes de protection et de prévention les plus
appropriées.

Nous allons donc envisager :


1. les risques infectieux ;
2. les agents infectieux ;
3. les mesures de protection et de prévention.

Mais auparavant, nous devons avoir à lřesprit que les risques


physiques et chimiques restent omniprésents dans un laboratoire, et quřil
faille apprendre à les éviter à tout instant, afin de prévenir de graves
accidents qui peuvent embraser tout lřédifice et compromettre la vie dřun
grand nombre des agents. En effet, les blessures, les fractures, les brûlures,
lřélectrocution, les gelures sont possibles au laboratoire. Uun fil mal
Cours de Biologie Clinique | 25
disposé, un flacon mal placé, un produit corrosif (acide ou base concentré),
de lřeau chaude, un appareil avec un système électrique défectueux sont
susceptibles de provoquer des traumatismes graves pouvant même conduire
à la mort. De même, lřapplication sur le corps, lřingestion ou lřinhalation
dřun produit toxique peut avoir des conséquences graves sur la santé de la
personne qui en est victime. Des extincteurs dřincendie répondant aux
normes établies doivent exister en nombre suffisant.

1.10.2. Risques infectieux ou risques de contamination

Les risques infectieux liés à la réalisation des prélèvements humains


et à la manipulation des échantillons ainsi recueillis concernent, non
seulement les laboratoires de bactériologie et de virologie, mais également
tous les laboratoires de biologie clinique.

1.10.2.1. Les personnes exposées

- les personnes qui effectuent les prélèvements ;


- les personnes qui assurent le transport ou la réception des
échantillons ;
- les personnes qui effectuent les analyses ;
- les personnes chargées de lřentretien du matériel et de nettoyage
des laboratoires ;
- les stagiaires, moins initiés et malhabiles ;
- les intrus ou personnes étrangères au laboratoire.

1.10.2.2. Quels risques au laboratoire

Pike et Sulkin, USA, étude de 1949 à 1979: 5.000 laboratoires, 4079


cas dřinfections acquises à lřoccasion du travail, 168 mortels (4,12%).

1.10.2.3. Fréquence des micro-organismes les plus


communément impliqués dans les infections :
- infections bactériennes : 42,5 % (brucellose, fièvre typhoïde,
tularémie et TBC) ;
- « virales : 26,7 % (essentiellement les hépatites infectieuses et
SIDA) ;
- « à Rickettsies : 14,6 % ;
- « fongiques : 9 % ;
- « à chlamydia : 3,3 % ;
- « parasites.

1.10.2.4. Les laboratoires concernés


Cours de Biologie Clinique | 26
Depuis le laboratoire de bactério-virologie jusquřau laboratoire de
recherche (théoriquement le plus à risque).
- le risque est plus grand pour le laboratoire de bactério-virologie ;
- les laboratoires dřhématologie ou biologie polyvalente : risques
particuliers de contamination par le sang ou ses dérivés (plasma, sérum,
cellules sanguines), par ex. : VIH, VHB, VHC ;
- les laboratoires dřhistologie et dřanatomie pathologique : degré de
risque moindre (grâce au traitement déshydratant). Seules les techniques
cryostatiques ne sont pas protégées et le danger des PRIONS (ou agents
transmissibles non conventionnels : ATNC) demeure.

1.10.2.5. Sources de contamination


- le sang et ses dérivés ;
- les expectorations ;
- les spermes ;
- les sécrétions génitales ;
- les urines ;
- les selles ;
- le LCR.

1.10.2.6. Circonstances de contamination

La contamination est susceptible de se produire chaque fois que les


mesures appropriées de protection et de prévention sont absentes ou
défaillantes. Il sřagit des moments suivants :
- le moment du prélèvement ;
- la réception des échantillons pour analyse ;
- le traitement de lřéchantillon au laboratoire ;
- la manipulation directe ou indirecte du matériel souillé ;
- le contact avec des surfaces souillées (vaisselle, paillasse, poignets
des portes, linges).

A ces temps sřajoutent les facteurs ci-dessous :


- attroupement ou nombreuses personnes au sein du laboratoire ;
- expérimentation sur animaux (risques de se blesser, de sřinoculer
ou dřattraper des éjections animales à la figure) ;
- manipulation des cadavres ;
- multiplicité dřagents infectieux ;
- présence des souches résistantes ;
- présence des spores ;
- présence des souches toxiques ou virulentes ;
- importance dřinoculums ;
- présence dřaérosols ou de courant dřair par :
ouverture immédiate dřun mixeur ;
ouverture dřune culture lyophilisée ;
Cours de Biologie Clinique | 27
chauffage dřune anse avec gros inoculum ;
pipetage à la bouche : plus le volume est petit, plus le danger est
grand ;
éclaboussures sur rotor de centrifugeuse ;
mélange, agitation dřune culture ;
purge dřune seringue, etc...

1.10.2.7. Voies de contamination possibles

- la voie aérienne : lřinhalation dřaérosols microbiens


(essentiellement des micro-organismes : mycobacterium tuberculosis et les
champignons) ;
- la voie conjonctivale : à lřoccasion de projection de gouttes de
culture, dřaérosols ou de contamination des oculaires de microscope, de
loupe, etc ;
- la voie cutanée : la pénétration par effraction de la barrière
cutanée ; lřinoculation de tous les agents transmissibles par le sang ;
- la voie digestive : elle est toujours le fait de lřinobservance des
règles élémentaires dřhygiène et de sécurité (pipetage oral ou ingestion
associée à la cigarette, à lřalimentation, à lřonychophagie, absence de gants,
port de blouses souillées hors du laboratoire).

1.10.3. Principaux agents infectieux à risques

1.10.3.1. LE VIH

a) Caractéristiques biologiques :
- survie possible pendant quelques heures à quelques jours à lřair et à
la température ambiante, plus longue à 4°C ;
- survie de 1à 7 jours en culture ;
- survie jusquřà 6 jours dans les cadavres ;
- survie jusquřà 15 jours dans le surnageant de culture ;
- le VIH est sensible aux désinfectants suivants :
eau de Javel ;
alcool à 70 degrées ;
formol 2 % ;
glutaraldéhyde à 2 %.
- sa sensibilité à la T° est dépendante du temps dřexposition et du
type de chaleur :
sensible à la T° de 60°C pendant 1 H00 (chaleur sèche : étuve, four
Pasteur) ;
- sa sensibilité à 100°C pendant 30 minutes (chaleur sèche : étuve,
four Pasteur) ;
- sa sensibilité à la chaleur humide à 130°C (autoclave) pendant 15ř.
Cours de Biologie Clinique | 28

b) Le VIH peut-il être considéré comme une maladie


professionnelle ?
Le CDC a enregistré en 1992 : 101 cas de transmission
professionnelle probable / USA.
- infirmières : 25,7 %
- techniciens de labo : 24,8 %
- médecins : 12,8 %
- dentistes : 5,9 %.
c) Liquides biologiques potentiellement infectants :
- le sang et ses dérivés ;
- les autres liquides biologiques hémorragiques ou dřépanchement ;
- le liquide séminal et les sécrétions génitales ;
- le lait de femme ;
- le LCR ;
- le liquide de lavage alvéolaire ;
- les urines ;
- les larmes ;
- le liquide synovial ;
- le crachat.

1.10.3.2. Le VHB

a) Caractéristiques biologiques :
- le VHB résiste bien à la chaleur, au froid, à la dessiccation, aux UV
et à la plupart des antiseptiques ;
- survie possible jusquř à 7 jours dans le sang à 25°C ;
- possibilités de contamination transcutanée indirecte à partir des
surfaces et objets souillés (paillasses, tubes à essai, téléphones) ;
- il est tué à 100°C pendant 30ř à 1 H00 et 125°C pendant 15 à 20ř
(chaleur humide : autoclave).
b) Caractéristiques épidémiologiques :
- dans les pays tempérés, 5 % de la population rencontre le VHB ;
- lřâge électif de contamination : 30 - 40 ans ;
- avant lřintroduction de la vaccination, la contamination par le VHB
était de 2 à 5 fois plus fréquente chez le personnel de santé.
c) Les sources des contaminations :
- le sang et ses dérivés ;
- autres liquides : sperme ; sécrétions vaginales ; sécrétions
nasopharyngées ; sueur ; larmes ; LCR ; urines ; selles ; liquides synovial,
pleural et péritonéal ; salive et lait maternel.
Le risque de contamination des membres du personnel de santé,
techniciens de laboratoire en particulier, est donc très important.
Cours de Biologie Clinique | 29
1.10.3.3. Le VHC

a) Caractéristiques biologiques :
- sa survie dans le milieu extérieur, à température ambiante, serait
faible ;
- le VHC serait fragile, sensible aux antiseptiques et désinfectants
habituellement utilisés.
b) La prévalence :
- en RDC, elle se situe entre 4 et 13% selon diverses études ;
- en France elle est de 0,7 à 0,9% dans la population générale,
0,6 et 1,75 % chez le personnel de santé.
c) Le personnel de santé le plus concerné et à haut risque :
- les dentistes ;
- le personnel de dialyse ;
- le personnel de nettoyage.
d) Sources de contamination :
- sang et ses dérivés ;
- tissus ;
- voie parentérale exclusivement (transfusion sanguine, drogues IV).

1.10.3.4. Autres virus

- Le virus de lřhépatite A ;
- « « « E;
- les autres virus des hépatites ;
- Les HTLV1 et 2 ;
- Les CMV (cytomégalovirus) ;
- Les arbovirus ;
- Les hantavirus ;
- Le virus de la stomatite vésiculeuse (rare).

1.10.3.5. Mycobacterium tuberculosis


a) Le personnel à risque :
- service de pneumologie ou de maladies pulmonaires ;
-« « infectiologie ou maladies infectieuses ;
-« « ORL ou Oto-Rhino-Laryngologie (Oreilles, Nez et
Larynx) ;
-« « gériatrie ou service pour personnes âgées.
b) Les sources de contamination ;
- les prélèvements issus des sujets infectés, surtout dřorigine
respiratoire ;
- les urines, les selles, les tissus infectés (ganglionnaires,
ostéoarticulaires, cancer pulmonaire, prélèvements cutanés).
c) La voie de contamination :
Cours de Biologie Clinique | 30
- la pénétration de BK par aérosols, poussières, gouttelettes de
Flügge.
d) La prévention : repose sur lřutilisation de masques lors de la :
manipulation des prélèvements dřorigine respiratoire ;
mise en route des techniques génératrices dřaérosols.

1.10.3.6. Autres bactéries


- salmonella ;
- shigella.

1.10.3.7. Champignons
- tous sont transmissibles par aérosols.
1.10.3.8. Parasites
- Trypanosomes : transmission par exposition au sang, aux cultures.

1.10.3.9. Les prions


- agents transmissibles non conventionnels (ATNC) de nature
protéique ;
- incubation longue et silencieuse -- 30 ans ;
- résistent aux procédures usuelles de décontamination ;
- méthodes dřinactivation possibles sont : autoclave à 134°C pendant
18 minutes ;
- sources de contamination : le LCR, le cerveau, lřhypophyse, la
moelle épinière, la dure-mère et lřœil.
- Précautions :
port de lunettes ;
jet de tout le matériel utilisé ;
incinération des déchets (LCR, placentas, tissus).
Le laboratoire à haut risque : Laboratoire dřAnatomie Pathologique.

1.11. MESURES DE PREVENTION ET DE PROTECTION

1.11.1. Les locaux des laboratoires

- 9 m2 de surface par personne ;


- nettoyage facile, conduites et tuyaux apparents ;
- paillasses imperméables, en faïence, résistantes à la chaleur, aux
acides et alcalis, aux solvants ;
- un poste de lavage des mains par pièce ;
- des poubelles appropriées pour les objets tranchants et piquants
souillés et pour les autres déchets, de préférence à pédale ;
- un incinérateur fonctionnel où jeter et incinérer tous objets souillés.

1.11.2. Des règles d’hygiène


Cours de Biologie Clinique | 31
Ces mesures tiennent compte à la fois des règles dřhygiène
élémentaires, et des précautions universelles pour manipuler les
prélèvements :
- lřaccès au laboratoire doit être contrôlé ;
- la décontamination des paillasses doit être au minimum
quotidienne ;
- une décontamination sera faite chaque fois que du matériel
biologique aura été renversé ;
- les éponges sont à proscrire ;
- le balayage humide, sans soulever de la poussière ;
- le matériel de laboratoire doit être décontaminé régulièrement ;
- les déchets contaminés seront décontaminés avant lřélimination,
dans des solutions antiseptiques ;
- le matériel plastique jetable doit être préféré à la verrerie ;
- le pipetage à la bouche est formellement proscrit ;
- toutes les précautions permettant de réduire la formation dřaérosols
doivent être mises en œuvre (pas de ventilateur, de souffleur) ;
- ne pas fumer, ne pas boire, ne pas manger, ne pas se maquiller
ailleurs que dans la salle de repos ;
- ne pas stocker dřaliments dans la zone de travail ;
- se laver les mains après toute manipulation de matériel biologique ;
- ne pas toucher les poignets des portes avec les gants.

1.11.3. De la protection spéciale

Une tenue de travail spécifique sera utilisée pendant le travail :


- elle sera changée si possible tous les jours, au minimum deux fois
par semaine et à chaque fois quřune éclaboussure se produit ;
- la tenue de ville doit être proscrite dans les zones techniques ;
- la tenue de travail devra être quittée dans les zones réservées au
repos et au repas.
Les tabliers en plastique :
- à usage unique sont très utiles pour protéger la tenue de travail lors
des gestes particulièrement contaminants ou générateurs dřéclaboussures ;
- cette tenue peut être complétée par le port de bottes en caoutchouc,
lorsquřil y a risque de souillure important du sol.
Les gants :
- sont des éléments de la tenue de protection dřun personnel exposé
aux contaminations par des produits biologiques ;
- le port de gants ne dispense pas du lavage des mains, et ne jamais
remettre une paire de gants déjà utilisée, sauf si une autoclavation est
possible ;
- des gants à usage unique doivent être employés chaque fois quřil
existe un risque prévisible dřexposition au sang, en cas de lésions cutanées
ou lors de manipulation des cultures microbiennes ;
Cours de Biologie Clinique | 32
- les gants doivent être ôtés dès que le port nřest plus justifié ;
- si lřorganisation nécessite des allers-retours répétés, outre les tâches
susceptibles dřêtre contaminantes, et par exemple la frappe au clavier dřun
ordinateur, il convient de protéger le clavier par un film plastique
transparent qui sera régulièrement changé et considéré, dans lřintervalle,
comme souillé ;
- le port de gants est obligatoire en Biochimie, Hématologie,
Biologie moléculaire, dès quřil y a manipulation des produits biologiques
humains ;
- les gants doivent être utilisés avec discernement car :
 leur coût est élevé ;
 ils sont générateurs de fausse sécurité : des transmissions
manuportées « manugantées » peuvent se produire (poignets....) ;
 le risque dřallergie existe pour certaines personnes prédisposées ;
 ils peuvent être dangereux en Microbiologie (inflammables) ;
paires de lunettes anti-projections, couvrant entièrement les yeux.
- pour des personnes devant accomplir des tâches à haut risque de
projections ;
- ces lunettes seront systématiquement décontaminées après
utilisation ;
- leur port est recommandé lors des manipulations de LCR provenant
des malades à risques de transmission de prions.
Les masques :
- devraient être utilisés chaque fois quřil y a manipulation des
produits biologiques à haut risque, de présence dřagents transmissibles par
voie aérienne.

1.11.4. Autres moyens de prévention

- utilisation de la hote ;
- utilisation de robot.
Cours de Biologie Clinique | 33

CHAPITRE II : BIOCHIMIE CLINIQUE


2.1. RAPPEL SOMMAIRE

La biochimie clinique ou chimie pathologique ou chimie clinique est


le domaine de la biologie médicale qui est en général concerné par lřanalyse
des molécules contenues dans les fluides et matières corporels (sang, liquide
céphalo-rachidien, urines, selles, sécrétions diverses, spermes, etc…) et
lřinterprétation des résultats de ces analyses par un Biologiste Clinicien,
dans le but de caractériser lřorigine physiopathologique dřune maladie.

La biochimie clinique se cantonne donc à la recherche ou au dosage


des molécules pouvant être impliquées dans une pathologie.

2.2. QUELQUES TECHNIQUES ANALYTIQUES

2.2.1. Colorimétrie

2.2.1.1. Définition

La colorimétrie est lřensemble des méthodes de dosage basées sur


lřévaluation de la teinte dřune solution colorée par elle-même ou susceptible
de se colorer sous lřinfluence dřun réactif quřon y ajoute. Lřintensité de la
teinte est proportionnelle à la concentration de la solution.
Réactions chimiques chromogène ou chromophore
(teinte) :
Quantité proportionnelle à la substance dissoute de départ.
Deux lois sont à la base des méthodes qui exploitent la colorimétrie :

1ère loi
Deux solutions dřun même corps dans un même solvant, examinées
sous la même épaisseur, les autres conditions étant identiques (température,
éclairage…), et présentant la même intensité de teinte, ont le même titre.

2.2.1.2. Quelques procédés colorimétriques

2.2.1.2.1 Procédés par échelle colorimétrique : il sřagit dřune


méthode simple, ne nécessitant pas dřappareillage coûteux.

Exemple 1 : dans 5 tubes, on place respectivement 1, 2, 3, 4, et 5 ml


de solution dřun même produit à concentration connue et lřon complète les 4
premiers tubes par de lřeau jusquřà 5 ml : on vient de créer ainsi une échelle
colorimétrique de mesure. Dans un sixième tube, on place la solution à
analyser. On ajoute la même quantité des réactifs à chaque tube. Par
Cours de Biologie Clinique | 34
comparaison des teintes et par extrapolation par rapport aux valeurs limites
entre lesquelles lřéchantillon se situe, on détermine la valeur de celui-ci.
Exemple 2 : Dosage de lřhémoglobine par échelle colorimétrique.

2.2.1.2.2. Procédés par dilution

Dans deux éprouvettes graduées de même section, on place dřune


part une solution de concentration connue, et de lřautre la solution à doser.
On dilue la solution la plus colorée jusquřà ce que, examinées suivant la
section, les solutions présentent la même coloration. On lit les volumes
respectifs et on déduit la concentration de la solution à doser par simple
règle de trois : CV = C'V'
C'V'
C = ------
V
Exemple 1 : on met dans une éprouvette 50 ml dřune solution
standard contenant 1 mg de produit ; dans une deuxième éprouvette ayant
les mêmes caractéristiques, on met aussi 50 ml de la solution test. Dřautre
part, il faut diluer jusquřà 80 ml la solution standard pour obtenir la même
teinte que la solution test. Ainsi lřéquation est :
1 x 80 = 50 x Y 1 x 80
Y = ------- = 1,6 mg
50

Exemple 2 : dosage de lřhémoglobine par la méthode de Sahli ou à


lřhématine acide (20 µl de sang sont dilués dans lřacide chlorhydrique 0,1
N).

2.2.1.2.3. Procédés par titration

Dans deux récipients de même forme et de même capacité, on place


dřune part un volume déterminé de solution colorée à doser (produit +
réactif), de lřautre on place le réactif et on complète au même volume avec
le solvant utilisé. On ajoute simultanément au moyen dřune burette les
mêmes volumes, dřune part de solvant et de lřautre part de solution à titre
connu de produit. Le vase témoin va se colorer jusquřà ce que sa coloration
soit égale à celle du vase test. On lit le volume type ajouté et lřon connaît
dès lors la quantité du produit ajouté.
Exemple : Le dosage des ions bicarbonates ou des chlorures par
titration.

2e loi
Deux solutions dřun même corps dans un même solvant, et
présentant la même intensité de teinte sous des épaisseurs différentes, ont
des concentrations inversement proportionnelles aux épaisseurs sous
lesquelles on les examine. C: concentration, S: épaisseur:
Cours de Biologie Clinique | 35
C1 S2 C1 x S1
---- = ----- → C2 = -------
C2 S1 S2
Cette loi est un corollaire de la loi de Lambert-Beer que nous
développerons plus loin, et cřest sur cette loi quřest basée lřutilisation du
cylindre de Hehner et du colorimètre de Dubosq, procédés anciens, non
actuellement en usage.

2.2.2. Photométrie et Spectrophotométrie

La photométrie peut être définie comme la mesure de la


concentration dřune substance dans une solution par lřévaluation de la
diminution ou absorption de lřintensité du flux lumineux traversant cette
solution. En biochimie clinique, la substance contenue dans un milieu
biologique est soumise à un certain nombre de réactions chimiques qui
aboutissent à la formation dřun chromogène ou chromophore, substance
colorée en quantité proportionnelle à celle de la substance de départ. Le
chromogène est alors dosé par la mesure de la diminution du flux lumineux
qui traverse une solution limpide de ce chromogène. Et le photomètre est
lřinstrument de mesure de la diminution dudit flux lumineux.

2.2.2.1. Nature de la lumière

La lumière est un rayonnement électromagnétique se déplaçant dans


lřespace avec une composante électrique et une composante magnétique
sous forme dřonde. Le terme lumière est surtout utilisée pour les longueurs
dřonde qui sont visibles à lřœil humain et celles qui leur sont proches.

Chaque rayonnement lumineux est caractérisé par la distance qui


sépare deux ondes correspondantes que lřon appelle la longueur dřonde.
Cette distance désignée par λ, est exprimée en nanomètres (nm) pour les
longueurs dřondes utilisées en photométrie. Angstrom et Millimicrons
utilisés autrefois sont obsolètes.1 nm = 1 mµ = 10 Å = 10-9 m.

Si lřœil humain peut percevoir les longueurs dřondes comprises entre


380 et 750 nm, les appareils modernes de mesure permettent dřenregistrer
en plus les portions ultraviolettes et infrarouges du spectre.

La lumière solaire et celle émise par le filament de tungstène sont un


ensemble des rayonnements de différentes longueurs dřonde perçus par lřœil
comme le blanc.
Des longueurs dřondes comprises dans une bande (région) sont
perçues sous forme des couleurs.
Cours de Biologie Clinique | 36
Elle est désignée par λ et exprimée suivant son ordre de grandeur en
Angstrm (A), millimμ (mμ) ou mμ (μ).
1
1 Ä = ──────= 10-4 µ
10.000µ

1
mμ = ──────── = 10-3µ
10.000μ λ

Ä = 10-4 μ
Figure 1 : Caractéristiques dřun rayonnement lumineux.
On peut également caractériser un rayonnement par sa fréquence qui est
égale à
C
V = ---
µ

(c = vitesse du rayonnement dans le vide) et exprimée en sec-1.

cm 1
(c = cm/sec. λ= ------- = ---)
sec.cm sec
Une autre caractéristique est le nombre d'ondes :
1
V = --- exprimée en cm-1. L'organe qui nous permet d'enregistrer
µ
les ondes lumineuses est l'oeil. L'oeil nous fournit grossomodo la
grandeur de la longueur d'onde de la lumière par une sensation que nous
appelons couleur.

Si λ est court, soit aux environs de 400 nm, nous disons que c'est du
violet. Si au contraire λ est grand, vers 650 nm, la lumière nous paraît rouge.
Entre ces deux limites sont situés le bleu, le vert, le jaune et l'orange. Les
longueurs d'ondes susceptibles d'être perçues par notre oeil sont donc
comprises entre 400 et 700 nm.

La lumière blanche est un mélange de toutes ces radiations. L'eau


distillée nous apparaît incolore, c'est-à-dire que la lumière blanche qui traverse
reste blanche.
Une solution est rouge-violet parce qu'elle ne laisse passer, en nous
limitant aux trois couleurs fondamentales, que les composantes bleues et
rouges du spectre visible.
Cours de Biologie Clinique | 37
Supposons une lumière comprenant 3 radiations monochromatiques,
Rouge, Vert et Orange ; qui traverse une solution possédant une bande
d'absorption dans le rouge, comme lřillustre la figure 2.

Rouge Io It
Vert Ioř Itř
Orange Iořř Itřř

Figure 2 : Loi de Lambert-Beer

A supposer que l'intensité de la lumière incidente soit égale sur les 3


bandes et qu'on constate une lumière émergente de 1/4 seulement dans le vert.
Lumière incidente = 3 Io.

It = 3 - 1/4 = 9/4 ou 2 1/4.


L'absorption ou la diminution est de 3 - 9/4 = 3/4.

Si par un moyen quelconque, nous éliminons Io et I"o à l'incidence tout


en conservant Iřo, nous voyons que nous retrouverons après passage de I'o dans
la solution que 1/4 de l'intensité incidente.

La différence d'énergie entre le rayon incident et celui ayant traversé la


solution est donc plus considérable et l'essai plus sensible.

En outre, suivant la nature du composé, celui-ci est susceptible de


produire un travail avec consommation d'énergie empruntée au rayonnement
qui le frappe. Cette consommation d'énergie ou absorption est, pour une
substance donnée, sélective d'un rayonnement déterminé. En travaillant donc
avec une couleur sélectionnée, en d'autres termes en lumière
monochromatique, l'essai aura gagné en spécificité, et lřon parle alors de la
spectrophométrie. Enfin, les lois que nous verrons plus loin ne sont applicables
qu'en lumière monochromatique.

On aura donc tout intérêt à faire les mesures en lumière


monochromatique et à partir de ce moment, puisqu'il n'est plus question de
changement de couleur, mais de variation d'intensité, on ne parle plus de
colorimétrie, mais de photométrie et de spectrophotométrie.

Jusqu'à présent nous n'avons parlé que de lumière blanche perçue par
lřœil, comprise ente 400 et 700 nm.

Les rayonnements électromagnétiques s'étendent cependant bien en-


deçà et au-delà de ces valeurs. Lřœil humain n'étant plus capable de percevoir
ces rayonnements, il faudra employer d'autres détecteurs que nous décrirons
plus loin. Ces rayonnements se comportent, en passant par des composés ou à
travers des solutions de ces composés, exactement comme la lumière visible,
Cours de Biologie Clinique | 38
c'est-à-dire que des rayonnements sont absorbés par les substances, d'autres les
traversent sans perdre de leur intensité. L'intensité des absorptions et les
longueurs d'ondes absorbées sont chaque fois caractéristiques de la substance
traversée.

Longueurs dřonde (nm) Régions Couleurs observées


< 380 ultraviolet non visible
380-440 visible violet
440-500 visible bleu
500-580 visible vert
580-600 visible jaune
600-620 visible orange
620-750 visible rouge
750-2000 infrarouge non visible

Les rayonnements électromagnétiques non visibles à lřœil nu, en


traversant des solutions ou des composés, se comportent de la même
manière que la lumière visible. Les rayonnements sont absorbés par les
substances et dřautres les traversent sans perdre de leur intensité. Lřintensité
des absorptions et les longueurs dřondes absorbées sont chaque fois,
caractéristiques de la substance traversée.

En pratique, on utilise une couleur sélectionnée ou une lumière


monochromatique (longueur dřonde bien définie), pour plus de spécificité.

A partir de toutes ces considérations, des lois dřabsorption ont été


définies.

2.2.2.2. Loi de Lambert

Quand un rayon lumineux monochromatique dřintensité (Io) passe


dans une certaine couche (dl) dřune substance pure qui lřabsorbe dans une
certaine mesure, lřintensité transmise (It) est proportionnelle à lřintensité de
la lumière incidente Io, et le travail effectué par la substance est
proportionnel à lřénergie mise à sa disposition.
Cours de Biologie Clinique | 39

Une augmentation dl de la couche amène une diminution Ŕdl de la


lumière transmise.

Ainsi la loi de Lambert dit : la diminution de lřintensité par rapport à


lřintensité préexistante est directement proportionnelle à lřaugmentation de
couche. Ceci peut sřécrire :
-dI -dI
------ = k.I ou ----- = k. dl
dl I

2.2.2.3. Loi de Lambert-Beer

Un flux lumineux monochromatique dřintensité Io traverse à angle


droit une solution limpide dřune substance de concentration c dans une
cuvette à faces parallèles sur un trajet optique constant l. Le flux transmis en
sortie de cuve a une intensité I telle que lřillustre la figure ci-dessous.

Absorbance ou densité optique DO, coefficient dřextinction molaire à


la longueur dřonde choisie :
Io : intensité incidente, It : intensité transmise, c : concentration, l :
longueur de la cuvette ;
I décroît exponentiellement par rapport à Io ;
DO est une fonction linéaire de c.
Toutes les mesures photométriques reposent sur cette linéarité qui
nřest respectée que sous certaines conditions :
- faisceau lumineux monochromatique : car ε varie en fonction de la
longueur dřonde ;
- concentration c comprise dans certaines limites ;
- solution parfaitement limpide, non fluorescente, à pH constant ;
- température de la solution du chromogène maintenue constante.

DO D0=ĩ
Cours de Biologie Clinique | 40

Concentrations croissantes de lřétalon© ©


Figure 3 : Courbe dřétalonnage selon la loi de Lambert-Beer :
DO=f©proportionnelles aux C.

2.2.3. Les appareils utilisés en photométrie et en


spectrophotométrie

Les appareils qui permettent lřévaluation de lřintensité transmise sont


composés de trois parties essentielles : une source de lumière, un système de
sélection des longueurs dřondes et un système de détection des radiations
(amplification du signal).
- Source de lumière : lampe à filament de tungstène, lampe à vapeur
de mercure ou à deutérium, le laser. Lřalimentation électrique doit être
stabilisée et protégée, pour cela, les dispositifs suivants doivent être
installés : §un disjoncteur, qui interrompt le courant si celui-ci venait à
connaître une chute ou une surtension, ainsi lřappareil est protégé ;
§un onduleur, qui accumule et stabilise la charge électrique.
- Système de sélection des longueurs dřondes : système à filtres
(verres colorés, filtres interférentiels), les monochromateurs qui permettent,
sur un même appareil, de dérouler le spectre visible et souvent de le
prolonger dans lřUV : spectrophotomètres (prismes en verre ou en quartz,
réseaux des dioptres) ;
- Système de détection des radiations : transformation du flux
lumineux (photons) en flux électronique proportionnelle facile à amplifier
(photomultiplicateurs).
Cours de Biologie Clinique | 41

Figure 4 : Composantes principales dřun spectrophotomètre.

2.2.3.1. Spectrophotométrie d’absorption moléculaire

La spectrophotométrie est une méthode d'analyse physico-chimique


qui permet de déterminer aussi bien qualitativement que quantitativement
des ions ou des molécules présents dans une solution, sans la modifier ou
l'altérer.

2.2.3.1.1. Redéfinition des concepts déjà évoqués en supra:


lumière et lois de Lambert et Beer

Lumière : est un rayonnement électromagnétique se déplaçant dans


lřespace, avec une composante électrique et une composante magnétique,
sous forme dřondes.
Onde : est un phénomène physique se propageant et qui se
reproduit, identique à lui-même, un peu plus tard dans le temps et un peu
plus loin dans lřespace.
Longueur dřonde : est la plus courte distance séparant deux points
de lřonde strictement identique à un instant donné.
Diffraction : cřest la modification du trajet dřune onde lumineuse
lorsquřelle passe par une petite ouverture ou autour dřun petit obstacle. Plus
la dimension dřun obstacle ou de lřouverture est petite, plus la tache de
diffraction est grande.
Réflexion : est le changement de direction des rayons lumineux
heurtant une surface. Le changement dépend de lřangle avec lequel il frappe
la surface et sera dřautant plus grand quřil frappe une surface le plus
perpendiculairement possible.
Réfraction : cřest la déviation des rayons lumineux qui a lieu
lorsquřils passent dřun milieu transparent à un autre.
Absorption : cřest un transfert dřénergie lumineuse a une surface
Dispersion : la variation de lřindice de réfraction de la substance en
fonction de la longueur dřonde.
Spectre : est lřimage obtenue lors de la décomposition de la
lumière.
Spectre dřabsorption : est un spectre produit par un objet non
lumineux éclairé par une autre source lumineuse.
Cours de Biologie Clinique | 42
Spectre électromagnétique : est la décomposition du rayonnement
électromagnétique en fonction de la longueur dřonde ou de la fréquence de
celui-ci ou de lřénergie de ses photons.
Absorbance ou densité optique : mesure la capacité dřun milieu à
absorber la lumière qui le traverse.
Transmittance : est la fraction de lřintensité lumineuse traversant un
matériau ou un filtre.

2.2.3.1.2. Dispositifs fondamentaux

Comme nous venons de le voir, dans un spectrophotomètre, il y a


toujours quatre dispositifs fondamentaux : la source de lumière, le
monochromateur, la cuve porte-échantillons et le récepteur.

Figure 5 : Dispositifs fondamentaux qui constituent un


spectrophotomètre.

a. La source de lumière : Pour analyser le comportement


de substances partiellement transparentes, soumises à des radiations
lumineuses allant du proche ultraviolet au proche infrarouge, la source de
lumière doit délivrer ces radiations lumineuses avec une puissance non
négligeable ; ce sont généralement des sources incandescentes à filament de
tungstène.
b. Le monochromateur : Le monochromateur a pour rôle
de prélever, dans le rayonnement de la source, une bande spectrale très
étroite dont on peut faire varier, manuellement ou automatiquement, la
longueur d'onde nominale. Il comporte un élément dispersif et une fente de
sélection.

c. La cuve porte-échantillon : Elle doit être d'une parfaite


transparence dans la bande de longueur d'onde utilisée et d'une largeur
rigoureusement calibrée, en général 1,00 cm (dimension intérieure de la
cuve) pour l'absorption dans le visible. Il existe des appareils à double
Cours de Biologie Clinique | 43
faisceau, l'un orienté vers l'échantillon coloré, l'autre vers une solution de
référence, en général le solvant. Les deux cuves utilisées doivent être
parfaitement semblables.

d. Le récepteur : C'est l'élément qui reçoit le flux lumineux


émergeant de la cuve et le convertit en courant électrique.

2.2.3.1.3. Principe

Un spectrophotomètre mesure lřabsorbance dřune solution à une


longueur dřonde donnée. Un dispositif monochromateur permet de générer,
à partir dřune source de lumière visible ou ultraviolette, une lumière
monochromatique, dont la longueur dřonde est choisie par lřutilisateur. La
lumière monochromatique incidente traverse alors une cuve contenant la
solution étudiée, et lřappareil mesure lřintensité de la lumière transmise. La
valeur affichée par le spectrophotomètre est lřabsorbance à la longueur
dřonde étudiée. Le spectrophotomètre peut être utilisé pour mesurer de
manière instantanée une absorbance à une longueur dřonde donnée, ou pour
produire un spectre dřabsorbance (spectrophotomètre à balayage). Dans ce
dernier cas, le dispositif monochromateur décrit en un temps court
lřensemble des longueurs dřonde comprises entre deux valeurs choisies par
lřopérateur.

Conditions de validité de la relation :


La lumière utilisée doit être monochromatique.
La solution doit être peu concentrée et limpide.
Aucun équilibre chimique de dissociation ou d'association ne doit
être induit par la dilution. La dilution modifie, par exemple, le rapport des
concentrations de la forme basique et la forme acide d'un indicateur coloré
par modification du pH.
Les solutions doivent être stables pendant la durée de la mesure.
La température doit être maintenue constante car elle influe sur le
coefficient d'absorption molaire.
La cuve de solution et la cuve du solvant doivent être
rigoureusement identiques, utilisées toujours avec la même face d'entrée et
débarrassées des bulles d'air qui se fixent sur les parois aux changements des
solutions.
Le « blanc » doit être régulièrement refait pour pallier les dérives
électroniques de la source et du récepteur.
Les fluctuations de luminosité de la source (bruit de fond de la
source) ou de réponse du récepteur (bruit de fond du récepteur), limitent les
performances de l'appareil.

2.2.3.2. Spectrophotométrie d’émission atomique


Cours de Biologie Clinique | 44
2.2.3.2.1. Introduction

La spectrophotométrie dřémission atomique tient aujourd'hui une


place de premier rang parmi les méthodes physicochimiques d'analyse. Les
nombreux travaux publiés, ces dernières années, en sont la preuve : ils
ouvrent de nouveaux champs d'applications, sans négliger l'amélioration des
techniques existantes ni les perfectionnements matériels. Cette méthode qui
nécessitait, il y a peu de temps encore, l'élaboration d'un appareillage
compliqué et coûteux, seul utilisable par un personnel spécialisé, sera
rapidement à la portée des laboratoires de recherches et de contrôle où se
pose le problème du dosage rapide et précis d'éléments tels que les métaux
alcalins et alcalino-terreux.

Elle mesure lřémission dřun rayonnement électromagnétique UV ou


visible due à la désexcitation dřatomes qui ont été excités par lřénergie
apportée par le transfert à une température très élevée (introduction de
lřéchantillon dans une flamme ou un plasma), et ce, à une longueur dřonde
donnée, caractéristique de lřélément à doser. Cette émission est
proportionnelle à la concentration de lřélément excité.

2.2.3.2.2. Principe

La mise de la solution sous effet des températures élevées va


conduire à une excitation des atomes c.à.d. passage des électrons de sous-
couches périphériques à des niveaux énergétiques supérieurs. Comme ces
niveaux sont instables, le retour au niveau fondamental dřénergie minimale
conduira à une libération dřénergie sous forme dřun rayonnement (émission
de lumière) électromagnétique de longueur dřonde caractéristique de
lřatome qui se désexcite.
Ces transitions ne se font pas de façon anarchique, mais obéissent
aux lois de la mécanique quantique : pour un atome donné, la fréquence du
rayonnement émis est parfaitement définie.

Figure 6 : Représentation de la loi de la mécanique quantique.

2.2.3.2.3. Appareillage
Cours de Biologie Clinique | 45

Les spectromètres dřémission atomique sřarticulent autour de 3


parties principales :
1° Le brûleur pulvérisateur ;
2° Le système optique ;
3° La mesure du signal.

La différence principale entre les différents types de


spectrophotomètre dřémission, réside essentiellement dans les dispositifs
chargés de porter lřéchantillon à une température donnée. Ainsi on
distingue :
Le spectrophotomètre à flamme ;
Le spectrophotomètre à plasma par couplage inductif ;
Le spectrophotomètre à laser.
Cours de Biologie Clinique | 46

Figure 7 : Parties principales dřémission atomique.

Figure 8 : Photomètre à flamme usuel et son fonctionnement.

1° Pulvérisateur et brûleur : générateurs dřatomes


a.Pulvérisateur ou nébuliseur ;
Son rôle est la production dřaérosol.

La solution à doser est pulvérisée à lřaide dřun apport dřair comprimé


(air + gaz) dans une chambre de nébulisation, de telle sorte que les grosses
gouttelettes sont éliminées et les fines gouttelettes sont acheminées vers le
brûleur. Le débit doit être stable et reproductible.

b. Brûleur
Cours de Biologie Clinique | 47

Son rôle est la libération et lřexcitation des atomes.


Les fines gouttelettes de la solution à doser arrivent dans le brûleur.
Sous lřeffet de la chaleur de la flamme, alimentée par un mélange gazeux
(air-acétylène ou air-butane), les fines gouttelettes sont transformées en
vapeur monoatomique, puis ces atomes sont excités.
Le retour à lřétat fondamental va provoquer le processus dřémission
atomique.

2° Système optique

On distingue :
les systèmes à filtres ;
les monochromateurs : permettent sur un même appareil, de
dérouler le spectre visible et souvent de le prolonger dans lřultraviolet ; ce
photomètre prend alors le nom de spectrophotomètre. Il existe deux types de
monochromateurs : les prismes et les réseaux.

Pour le photomètre à flamme usuel, les filtres interférentiels


suffisent. Son rôle est la sélection de la raie dřémission.
Il existe autant de filtres que dřéléments à doser.

3° Mesure du signal

Son rôle est la transformation de lřintensité du rayonnement émis en


signal électrique et assure le confort de lecture.
La lumière est ensuite envoyée sur une cellule photoélectrique
sensible à lřélément étudié, et qui transforme le rayonnement en un signal
électrique, ce signal est ensuite amplifié.

Lřamplificateur étant relié à un galvanomètre, lřaffichage numérique


donne une valeur proportionnelle à la concentration de la solution analysée.

Autres techniques dřexcitation pouvant être utilisées pour la


spectrophotométrie dřémission atomique :

1. ICP-AES : Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission


Spectrometry ou spectromètre dřémission atomique à plasma par couplage
inductif.
Cřest de plus en plus utilisé de nos jours. La torche à plasma utilisée
par ce type de spectrophotomètre est un dispositif simple dřutilisation,
permettant dřatteindre des températures proche de 8000°C ; à cette
température, tout type dřélément devient émissif.

2. lřarc et le laser
Cours de Biologie Clinique | 48

Ils sont moins fréquents que lřICP-AES.


NB : Arc : lampe à arc utilisée dans certaines soudures, produisant
une forte chaleur et un intense éclat ou une intense lumière.
Laser : un rayon lumineux monochromatique et cohérent. En effet,
lřénergie fournie par les électrons dřun courant électrique stimule les atomes
du gaz qui émet alors des photons dřénergie et de longueur dřonde
identiques.

Les photons se réfléchissent sur les miroirs situés aux extrémités du


tube, qui constituent une cavité résonnante, ce qui permet au processus de
sřamplifier peu à peu.

Lorsque le faisceau devient assez puissant pour traverser le miroir


semi transparent, il se forme un rayon lumineux mono chromatique et
cohérent : le rayon laser.

Figure 9 : Structure et fonctionnement dřun laser.

2.2.3.2.4. Applications analytiques

Les applications essentielles de la spectrophotométrie à flamme


concernent le dosage des métaux alcalins, principalement le Sodium (Na +),
le Potassium (K+) et rarement le lithium (Li+) et le rubidium (Rb+), et les
métaux alcalino-terreux, principalement le Calcium (Ca++).
Ces dosages peuvent se faire sur les eaux (eaux de ville, eaux de mer,
eaux minérales…) ; sur certains liquides alimentaires (lait, jus de fruits,
vins…) ; les végétaux ; sur le sang et sur les autres liquides biologiques.

Intérêt biologique :
La photométrie dřémission atomique est essentiellement utilisée en
biochimie médicale et sert à doser le Na+, K+, Ca++ dans le plasma et les
Cours de Biologie Clinique | 49
+
urines, elle sert plus rarement à doser le Li dans le cadre de la surveillance
du traitement psychologique de la psychose maniaco-dépressive.

2.2.3.2.5. Technique d’analyse

La technique dřanalyse par photométrie à flamme procède par


comparaison avec une série de quelques solutions étalons dont les propriétés
sont analogues aux solutions inconnues ou échantillons à analyser.
On prépare un standard dont la concentration est maximale par
rapport à celles contenues dans les solutions à analyser.

2.2.3.2.5.1. Matériel

Echantillons à analyser ;
Eau distillée, mieux, bidistillée ;
Tubes à essai bien rincés à lřeau distillée, sans traces dřéléments ;
Portoir ;
Etalons : 280mEq/L pour le Na+, 10mEq/L pour le K+ et 5mEq/pour
++
le Ca ;
Solution de compensation pour le Ca++. Il sřagit dřune solution de
NaCl ;
Micropipettes graduées ;
Allumette.

2.2.3.2.5.2. Mode opératoire

1. Dilution : A fortes concentrations, les métaux donnent des


bandes dřémission très larges, il faut donc utiliser des solutions diluées,
Ex : 1/200 pour le Na+ et le K+
1/16 pour le Ca++ ;
2. Allumer le spectrophotomètre, placer lřindicateur du gaz à
0,5 et lřindicateur de la pression dřair à 0,7 ;
3. Et régler la flamme tout en observant à travers la fenêtre
optique la coloration du cône (bleuâtre) ;
Pour les éléments les plus fréquemment dosés, on utilise les
longueurs dřondes suivantes :
Sodium : raie de résonance à 589 nm ;
Potassium : raie de résonance à 767 nm ;
Lithium : raie de résonance à 671 nm ;
Calcium : raie de résonance à 622 nm.

2.2.3.2.5.2.1. Pour le Na+ et le K+

1. Avec le bouton « coarse », amener lřaiguille à 0% en


pipetant lřeau distillée ;
Cours de Biologie Clinique | 50
2. Très rapidement, aspirer lřétalon, avec le bouton 100,
ajuster lřaiguille à 100% ;
3. Stabiliser le calibrage ou lřétalonnage en ramenant
rapidement lřaiguille à 0% avec lřeau distillée comme en 1 ;
4. Ramener rapidement lřétalon à 100% avec le bouton 100,
en utilisant lřétalon ;
5. Reprendre les 3è et 4è étapes jusquřà ce que le calibrage
soit stable ;
6. Puis, lire les échantillons rapidement sans trop attendre
entre leur pipetage, car lřadmission dřair dans lřappareil déstabilise le
calibrage. Après avoir pipeté 4 à 5 échantillons dřaffilée, recalibrer de
nouveau lřappareil comme en 5 ;
7. Avant dřéteindre lřappareil, ramener lřaiguille à environs
45% avec lřétalon, rincer abondamment lřappareil à lřeau distillée sans
toucher à aucun bouton ;
8. Eteindre lřappareil sans toucher à aucun bouton, surtout
pas le coarse (0).

2.2.3.2.5.2.2. Pour le Ca++

La particularité consiste à ramener le bouton « coarse » à 0%, en


pipetant la solution de compensation.

2.2.3.2.5.2.3. Résultats en mm/L ou mEq/L

Pour le Na+, concentration=Transmittance X 0,1 ;

Pour le K+, concentration =Transmittance ;


10
Pour le Ca++, concentration =Transmittance.
2

Valeurs normales : Na+ : 135-145 mmol/L


K+ : 3,5 -5 mmol/L
Ca++ : 4,5 Ŕ 5,5 mEq/L

2.2.3.3. La spectrophotométrie d’absorption atomique

2.2.3.3.1. Définition et principe

La spectrophotométrie dřabsorption atomique est une méthode de


dosage des éléments minéraux et de nombreux oligo-éléments, par
utilisation de leurs spectres de raie.
Son principe repose sur la loi de Kirchhoff, laquelle stipule quřun
atome est capable dřabsorber les radiations quřil est lui-même susceptible
dřémettre.
Cours de Biologie Clinique | 51
Par un apport énergétique, un atome à lřétat fondamental est
susceptible de passer à un état excité. Le retour à lřétat stable ou
fondamental sřaccompagne dřune libération de lřénergie absorbée au départ
sous forme de rayonnements de fréquence , caractéristiques de lřatome.
Ainsi, la spectrophotométrie dřabsorption atomique implique deux
étapes :
1. Production dřune vapeur atomique de lřélément à doser.
Le passage de lřélément à doser à lřétat atomique est assuré soit par
nébulisation de la solution à doser dans une flamme à très haute
température, soit par électrothermie. On obtient alors un nombre Nf
dřatomes de lřélément à doser à lřétat fondamental. Et ces atomes libres sous
forme de vapeur atomique sont susceptibles dřabsorber des radiations
spécifiques de fréquence .

2. Production par une source appropriée du même


rayonnement de fréquence qui traverse ensemble Nf (Nombre dřatomes à
lřétat fondamental) avec une intensité incidente Io. Comme source de
rayonnement, on utilise généralement une lampe à cathode creuse de même
nature que lřélément à doser.

Selon la loi de Lambert-Beer, la diminution de lřintensité I du


rayonnement émergeant est proportionnelle à Nf :
I=I0. e-K. Ƴ .Nf;
Log I = log I0 Ŕ K. . Nf ;
Log I0 / I = K. . Nf ;
Io : intensité de la lumière incidente ;
I : intensité de la lumière transmise ;
K : coefficient dřabsorption atomique ;
Nf : nombre dřatomes à lřétat fondamental.
K et étant constants, ainsi que I0 pendant la durée de lřanalyse, la
mesure de I permet dřobtenir la valeur de Nf. Ainsi, il sřagit dřobtenir
dřabord des atomes à lřétat fondamental, relier lřabsorption causée par ces
atomes à leur nombre, et ensuite ce nombre à leur concentration dans la
solution à doser.

2.2.3.3.2. Appareillage

Le spectrophotomètre dřabsorption atomique peut être schématisé de


la manière ci-dessous (fgure 10), comprenant les éléments suivants :

a) Une source de lumière ou source de spectre de raies,


pouvant être une lampe à cathode creuse ou une lampe à décharge sans
électrodes. La lampe à cathode creuse consiste en une anode en tungstène ou
en nickel et une cathode creuse de forme cylindrique de même nature que
Cours de Biologie Clinique | 52
lřélément à doser. Anode et cathode sont scellées dans un tube de verre qui
contient un gaz inerte (argon ou néon) à une pression de 1 à 5 Torr.

b) Un générateur dřatomes ou atomiseur. Pour obtenir des

atomes libres à partir dřun échantillon (atomisation), on a recours à


différentes méthodes : atomisation par flamme ou par électrothermie.

Figure 10 : Schéma dřun spectrophotomètre dřabsorption atomique.

Source : Spectroscopie atomique.

Figure 11 : Description de la lampe à cathode creuse.

c) Un sélecteur des longueurs dřondes. Le rayonnement utile


est trié à partir dřun système séparateur des rayonnements appelé
monochromateur.
d) Dispositif de détection des radiations et dřamplification du
signal.
Le détecteur le plus utilisé est le photomultiplicateur

Fonctionnement
Cours de Biologie Clinique | 53

2.2.3.3.2.1. Source de spectres de raies

La source de lumière doit produire une radiation lumineuse à la

longueur dřonde caractéristique de lřélément à doser (raie dřémission). Les


photons émis à cette longueur dřonde caractéristique pourront être absorbés
dans lřatomiseur par la raie dřabsorption.

Figure 12 : Phénomènes intervenant dans la lampe à cathode creuse.

Dans la lampe à cathode creuse, lřapplication dřun potentiel


dřenviron 300 volts entre les électrodes provoque lřionisation du gaz rare et
lřapparition dřun courant de 5 à 10mA lié au déplacement des cations du gaz
rare vers la cathode et des électrons vers lřanode. Si le potentiel est assez
élevé, les cations du gaz rare frappent la cathode avec une énergie suffisante
pour arracher les atomes métalliques et produire une vapeur atomique.
Certains atomes métalliques arrachés à la cathode passent à lřétat excité puis
en revenant à lřétat fondamental, émettent des raies de résonance à des
longueurs dřonde caractéristiques. Notons que les atomes qui émettent les
raies dřémission dans la lampe sont à une température plus basse que les
atomes dřéchantillon dans la flamme. Les raies dřémission de la lampe sont
donc moins larges que les pics dřabsorption de la flamme.
Lřintensité du rayonnement émis est proportionnelle à lřintensité du
courant appliqué.
A lřémergence de la lampe, un modulateur alternatif ajuste la
fréquence du rayonnement avant son passage dans la flamme, afin
dřéliminer de la mesure lřémission lumineuse de la flamme elle-même.

2.2.3.3.2.2. Méthodes d’atomisation / Générateur


d’atomes

Dans lřatomisation par flamme, lřaérosol mélangé au comburant


traverse une série de dispositifs qui ne laissent passer que les gouttelettes les
plus fines. La plus grande partie de lřéchantillon sřécoule au fond de la
chambre de mélange et est évacuée.
Lřaérosol, le comburant et le combustible, pénètrent alors dans un
brûleur à fente qui donne une flamme large de 5 à 10 cm.

2.2.3.3.2.3. Réception et séparation des rayonnements


Cours de Biologie Clinique | 54

Le rôle du monochromateur est dřéliminer toute lumière quelle que


soit son origine, ayant une longueur dřonde différente de celle à laquelle on
travaille.

2.2.3.3.2.4. Détection du rayonnement et traitement du


signal

Le photomultiplicateur est plus utilisé en spectrophotométrie


dřabsorption atomique, où il transforme en énergie électrique, tous les
photons reçus : ceux de la lampe à cathode creuse, ceux de la flamme et
ceux du laboratoire ; alors que seuls les photons issus de la cathode creuse
sont importants.
Pour ce faire, un cache tournant est placé à la sortie de la lampe, pour
moduler le faisceau lumineux à la sortie de cette dernière. On peut
également alimenter la lampe en courant alternatif. Un amplificateur sélectif
ne transmettra au système de lecture de lřabsorption que le signal venant de
la lampe, éliminant ainsi toute lumière parasite.

2.2.3.3.2.5. Applications

La spectrophotométrie dřabsorption atomique est une méthode très


sensible, qui permet des dosages de lřordre de 1 à 5 pmol de métal /L, et
aussi une méthode spécifique car cřest la raie de résonance du métal
concerné qui est utilisée pour son dosage.
En biochimie clinique, elle demeure une technique très utile, où elle
sert au dosage non seulement de tous les éléments métalliques, mais aussi de
nombreux oligo-éléments sur lesquels les recherches sont en pleine
expansion.

2.2.4. Photométrie des milieux troubles

On distingue 3 méthodes différentes :

1. Lřopacimétrie : qui mesure la lumière ayant traversé le


milieu étudié dans la direction même de la lumière incidente ;
2. La néphélémétrie : qui mesure la lumière ayant traversé le
milieu étudié 90° par rapport à la direction de la lumière incidente ;
3. La turbidimétrie : qui mesure la concentration ou
lřépaisseur dřun milieu trouble empêchant la vision nette dřun test optique
placé derrière ce milieu.

2.2.4.1. Principe des méthodes

Les paramètres à étudier dans les milieux troubles :


- La nature du liquide dans lequel les particules sont en suspension ;
Cours de Biologie Clinique | 55
- La taille des particules ;
- Leur incidence de réfraction qui dépend de la constitution chimique
des particules ;
- Lřintensité de réflexion qui dépend de la nature de la surface.
Lřabsorption lumineuse des milieux troubles obéit à la loi de
RAYLEIGH :
I0 = I absorbée +I transmise + I diffuse
La diffusion de la lumière dépend de la taille des particules,
diminuant avec leur diamètre.

2.2.4.1.1. Opacimétrie

La loi de Lambert-Beer peut sřappliquer aux milieux troubles dans


certaines conditions, notamment : taille des particules faible et voisine de la
longueur dřonde de la lumière incidente, concentration faible des particules.
Lřopacimétrie utilise un spectrophotomètre avec une longueur dřonde
comprise entre 620 et 670 nm. A ces longueurs dřonde, la taille des
particules modifie assez peu la lumière transmise.
Lřopacimétrie est utilisée pour mesurer les concentrations de
suspensions cellulaires. Elle est très utilisée en microbiologie

2.2.4.1.2. Néphélémétrie

Elle mesure la lumière diffusée et nécessite lřemploi dřun


fluorimètre. Les longueurs dřondes utilisées varient entre 250 et 350 nm.
Les monochromateurs primaires et secondaires sont réglés à la même
longueur dřonde.
Il existe actuellement les néphélémètres à laser.
La néphélémétrie est utilisée pour mesurer les concentrations de
certaines protéines sériques.

2.2.4.1.3. Turbidimétrie

Elle consiste à apprécier visuellement un trouble par comparaison


avec celui des solutions étalons. Cette méthode est utilisée pour le dosage
des protéines.

2.2.5. La fluorimétrie ou fluorescimétrie

2.2.5.1. Définition et principe


Cours de Biologie Clinique | 56
La fluorimétrie est un procédé de dosage de minimes quantités de
substances, fondé sur la mesure de la longueur dřonde de la lumière quřelles
émettent lorsquřelles sont rendues fluorescentes.

On appelle fluorescence, lřémission lumineuse secondaire due à la


désexcitation spontanée dřatomes ou des molécules excitées par un
rayonnement incident électromagnétique ou corpusculaire ionisant (électron,
proton).

Lorsquřune molécule est excitée par des photons possédant une


énergie E, elle peut passer dřun état stable N à un état excité E puis revenir à
son état stable en restituant une énergie Eř inférieure à E, en raison des
pertes énergétiques survenant pendant le retour à lřétat stable. Cette énergie
Eř est libérée sous forme dřune émission lumineuse dont la longueur dřonde
est supérieure à celle de la lumière excitatrice ; ce principe correspond à
lřénoncé de la loi de Stokes. Parfois, lřexcitation ne permet que le passage à
lřétat métastable P. Le retour vers lřétat stable sřaccompagne dřune émission
de lumière. La transition réversible N↔F définit la fluorescence.

2.2.5.2. Appareillage

Il est possible dřutiliser un spectrofluorimètre ou un fluorimètre. La


différence entre ces deux types dřappareils réside dans la possibilité avec un
spectrofluorimètre, dřexplorer tout le domaine spectral (ultra violet ou
visible) et dřenregistrer les spectres dřexcitation et de fluorescence en
fonction des longueurs dřonde. Les simples fluorimètres utilisent des filtres
colorés ou interférentiels et permettent seulement de travailler à la longueur
dřonde fixe dřexcitation ou de fluorescence.
Lřappareillage est composé des éléments suivants :
1. Une source lumineuse, de type lampe à vapeur de mercure
ou une lampe au xénon ;
2. Un monochromateur dit dřexcitation ou primaire, qui
fournit une lumière monochromatique ;
3. Une cuve, de taille variable et dont lřépaisseur ne
détermine nullement la sensibilité ;
4. Un monochromateur dřanalyse ou secondaire, pouvant être
identique ou différent du monochromateur dřexcitation ;
5. Un photomultiplicateur, un amplificateur, un galvanomètre
et un enregistreur.
Cours de Biologie Clinique | 57

Figure 13 : Schéma dřun fluorimètre ou dřun spectrofluorimètre.

2.2.5.3. Applications

La fluorimétrie permet des dosages mille fois plus sensibles que la


spectrophotométrie. Toutefois, cette méthode ne sřapplique que pour des
molécules fluorescentes par elles-mêmes ou après réaction avec un
fluorochrome tel que la rhodamine, la fluorescéine et lřorange dřacridine.

Cřest en hormonologie que la mesure de la fluorescence trouvait hier


ses principales applications en biochimie clinique. Mais de nos jours, le
domaine dřapplication est pratiquement illimité : dosage des marqueurs
tumoraux, des médicaments, de la bilirubine, des catécholamines, …. Les
modifications de fluorescence des coenzymes NAD et NADH sont utilisées
en enzymologie. En plus, le signal de fluorescence obtenu à partir de
différentes marques permet la détection et / ou la quantification des
antigènes (ou haptènes) et des anticorps ; cřest lřimmunofluorescence.
En biologie moléculaire, le cryptate trisbipyridine dřeuropium est un
composé fluorescent utilisé pour révéler lřADN après polymerase chain
reaction (PCR). Cřest le cas de la détection fluorimétrique de lřADN du
Papillomavirus après PCR.

2.2.6. Réflectrométrie et Impédance


Cours de Biologie Clinique | 58
2.2.6.1. Réflectrométrie

2.2.6.1.1. Définition

La réflectométrie est une méthode optique qui consiste en la mesure


de la lumière réfléchie par un support solide contenant des réactifs
nécessaires à une transformation chimique, en sachant que le flux de lumière
incident est, en partie, absorbée au niveau du support solide et par le produit
de la réaction.

2.2.6.1.2. Principe

Un signal de sonde est envoyé dans le système ou le milieu à


diagnostiquer, ce signal se propage selon les lois de propagation du milieu
étudié et lorsquřil rencontre une discontinuité, une partie de son énergie est
renvoyée vers le point dřinjection. Lřanalyse du signal réfléchi permet de
déduire des informations sur le système ou le milieu considéré.
Le principe est basé sur la réflexion de la lumière en mesurant la
réflectance.

La réflexion de la lumière peut être spéculaire ou diffuse, suivant la


nature de lřinterface.
Les lois géométriques de la réflexion ne sřappliquent quřà la
réflexion spéculaire :

Le rayon lumineux est dit incident avant dřavoir rencontré la surface


réfléchissante.
Le rayon lumineux est dit réfléchi après.
Le point de rencontre du rayon incident et de la surface réfléchissante
est appelé plan dřincidence.
On appelle angle dřincidence : lřangle orienté Q1 pris entre la
normale au point dřincidence et le rayon incident.
On appelle angle de réflexion : lřangle orienté Q2 pris entre la
normale au point dřincidence et le rayon réfléchi.

La réflexion diffuse intervient sur les interfaces irrégulières, la


lumière est réfléchie dans un grand nombre de directions et lřénergie du
rayon incident est redistribuée dans une multitude de rayons réfléchis.
Cours de Biologie Clinique | 59

Figure 14 : Réflexion diffuse des rayonnements.


La réflexion est dite spéculaire lorsque le rayon incident donne
naissance à un rayon réfléchi unique. Idéalement, lřénergie de rayon
incident se retrouve totalement dans le rayon réfléchi. En pratique, une
partie de lřénergie peut être absorbée au niveau de lřinterface. La qualité de
la réflexion dépend de la qualité de lřinterface.

Figure 15 : Réflexion spéculaire des rayonnements.

2.2.6.1.3. Application : Reflotron

Le Reflotron Plus est un réflectomètre qui permet, dans le cadre dřun


diagnostic in vitro, la détermination quantitative de différents paramètres de
chimie clinique, à lřaide dřune bandelette réactive reflotron.

Paramètres mesurés : glucose, créatinine, transaminases,


hémoglobine,…

2.2.6.2. Impédance

2.2.6.2.1. Défintion

Lřimpédance se mesure en ohms et peut être définie comme la


vitesse et la résistance auxquelles un signal électrique traverse un corps. Ce
dernier contient de grandes quantités dřeau et dřélectrolytes et constitue
ainsi un bon conducteur pour les signaux électriques.
Cours de Biologie Clinique | 60
2.2.6.2.2. Principe

Le passage des cellules en suspension dans un liquide conducteur à


travers un orifice modifie la résistance électrique entre deux électrodes. Ces
modifications sont enregistrées sous forme dřimpulsions dont le nombre
correspond à celui des cellules et, est proportionnel au volume des cellules
détectées.

Figure 16 : Passage des cellules en suspension dans un liquide


conducteur à travers un orifice.

2.2.6.2.3. Application : Coulter

Lřautomate le plus utilisé est le « Coulter » mis au point par Wallace


Coulter et Jo, qui sřappuit sur une mesure par variation dřimpédance.

Paramètres mesurés : hémoglobine, hématocrite, constantes


globulaires, cellules sanguines, formule leucocytaire, indice de distribution
de la taille des G.R.,…

2.2.7. L’électrophorèse

Lřélectrophorèse est un phénomène physique désignant le


déplacement dřions ou des particules chargées en solution ou en suspension,
sous lřinfluence dřun champ électrique.
La technique de lřélectrophorèse trouve un intérêt particulier dans
lřétude des protéines. En effet, les protéines sont des molécules comportant
de nombreux radicaux dont lřionisation varie en fonction du milieu ambiant.
Pour chaque protéine, il existe un pH (point isoélectrique) pour
lequel le nombre des radicaux chargés positivement est égal au nombre des
radicaux chargés négativement. La charge globale est alors nulle.
Lřélectrophorèse des protéines dřun milieu biologique correspond au
déplacement des macromolécules en pseudosolution colloïdale. Ce
Cours de Biologie Clinique | 61
déplacement est exprimé en fonction de la mobilité des protéines, sous
lřinfluence dřun champ électrique.
V
Par définition, la mobilité est formulée comme suit : u = -----
H
V : vitesse (cm/sec), H : champ électrique (volt/cm), u : mobilité
(cm2 sec-1vol-1)
En milieu alcalin (pH : 8,6 ou 9,0), toutes les protéines dřun sérum
humain présentent une charge globale négative. Placées dans un champ
électrique, elles se déplacent vers lřanode, et ceci dřautant plus vite quřelles
se trouvent à pH éloigné de leur point isoélectrique (p I).
Le sérum albumine, par exemple se déplace plus rapidement à pH 8,6
que les Immunoglobulines : Albumine a un p I = 4,8 ; tandis que les
Immunoglobulines ayant un pI= 7 plus près de pH 8,6, se déplaceront
lentement.
Cours de Biologie Clinique | 62

Figure 17 : Dispositifs d'électrophorèse : Cuves pour électrophorèse


des protéines, quřon remplit de solutions tampon dans lesquelles on plonge
les supports dřéchantillons (papier filtre ou membrane).

2.2.7.1. Types d’électrophorèse

Il existe plusieurs types dřélectrophorèse :


- Électrophorèse de zone ;
- Électrophorèse de frontière ;
- Électrophorèse en gradient de densité ;
- Électrophorèse en gradient de pH ;
- Électrophorèse contre un gradient de porosité.
Lřélectrophorèse de zone représente un intérêt particulier en pratique
courante.
Cours de Biologie Clinique | 63

Electrophorèse de zone sur acétate de cellulose


Figure 18 : Electrophorèse de zone sur acétate de cellulose ou sur gel
(voir commentaires ci-dessous).

2.2.7.1.1. Électrophorèse de zone

La phase liquide (sérum ou un hémolysat des globules rouges) est


stabilisée dans un milieu poreux (papier, acétate de cellulose, gel dřamidon
ou dřagar bactériologique) imprégné de solution tampon (pH alcalin pour les
protéines sériques et les hémolysats). Lřéchantillon est déposé sur un point
du support (côté cathode ou pôle négatif) ; en faisant passer un courant
continu sur ce support, les protéines, qui possèdent une charge gobale
négative à un pH alcalin, migrent vers lřanode ou pôle positif, plus ou moins
rapidement, en fonction de leurs charges ou points isoélectriques (pI),
sřarrêtant dans telle ou telle zone (électrophorèse de zone) pour constituer
plusieurs bandes (fractionnements électrophorétiques) qui, après fixation et
coloration, deviennent aisément repérables et dosables par densitométrie.
Plus un pI se situe loin du pH 8 à 9 du tampon, plus sa vitesse de migration
vers le pôle positif est rapide (cas de lřalbumine avec un p I ou pH 4,8).

Plusieurs types de support peuvent être utilisés notamment le papier,


le gel dřagar, lřacétate de cellulose, qui permettent classiquement dřobtenir
5 fractions pour le sérum : albumine, α1, α2, β et γ-globulines.

En utilisant les supports comme le gel dřamidon, le gel de


polyacrylamide, le gel de polyvinylpyralidone, lřacétate de cellulose RS
(marque spéciale), on obtient un plus grand nombre de fractions.

La fixation des protéines sur le support se fait soit par


thermocoagulation, soit par trempage dans lřalcool, lřacide acétique, le
chlorure mercurique…
La révélation se fait par combinaison avec des colorants acides (bleu
de bromophénol, noir amidé 10 B, bleu de Coomasie, vert de Lissamine,
rouge ponceau), qui se fixent sur les fonctions basiques des protéines.
Cours de Biologie Clinique | 64
La quantification des fractions peut se faire par densitométrie (pour
les supports rendus transparents), par réflectométrie (pour les supports
opaques), par mesure de lřabsorbance des solutions colorées obtenues après
découpage des différentes bandes découpées et dissoutes dans un solvant
approprié ou par élution du colorant en milieu alcalin) La fixation des
protéines sur le support se fait soit par thérmocoagulation, soit par trempage
dans lřalcool, lřacide acétique, le chlorure mercurique…

Tabeau IV : Valeurs normales des protéines par électrophorèse en


cellogel (A) et en acétate de cellulose (B).

2.2.7.1.2. Valeurs normales

A) En cellogel standard

B) En acétate de cellulose microzone

2.2.7.1.3. Variations pathologiques

1- Hypoprotéinémie de la malnutrition
- albumine diminuée ;
- α1, α2, β et γ-globulines sont dans les limites ou légèrement
augmentées.

2- Hypoprotéinémie du syndrome néphrotique


- albumine toujours abaissée ;
- α1-globulines dans les limites ou peu augmentées ;
- α2-globulines sont majorées, car élévation de lřα2-macroglobuline
et des lipoprotéines LDL ;
Cours de Biologie Clinique | 65
- dans le syndrome néphrotique chronique, il y a aussi diminution
des globulines.

3- Hépatite aiguë
- albumine diminuée de manière importante dans les cas sévères ;
- les α1, α2, β Ŕglobulines peuvent augmenter, mais les α2 ont
tendance à baisser (surtout haptoglobine).

4- Cirrhose du foie
- lřalbumine et les α1, α2, β-globulines diminuent ;
- les γ-globulines augmentent uniformément avec augmentation
relativement importante des IgA, formant ainsi un bloc β-γ caractéristique
de la cirrhose.

5- Inflammation
- la concentration des protéines du sérum nřest pas modifiée ;
- dans lřinflammation aiguë, les α1et α2-globulines augmentent
nettement ;
- dans lřinflammation chronique, à coté des α1et α2-globulines, il y a
une augmentation uniforme de γ globulines ;
- lřalbumine peut diminuer, masquant ainsi une hyperprotidémie
réactionnelle.

6- Hypergammaglobulinémies polyclonales
Dans certaines affections, la concentration des protéines totales nřest
pas modifiée, mais la présence de nombreux clones lymphocytaires
produisent un groupe hétérogène dřIg, en réponse à une stimulation
antigénique ou à une multiplication incontrôlée de plusieurs clones de
cellules productrices dřIg.
Exemple dřaffections :
maladies infectieuses : bronchite ; maladies fongiques :
aspergillose pulmonaire ;
maladies parasitaires : trypanosomiase, malaria ;
maladies virales : mononucléose infectieuse, rubéole, maladies
inflammmatoires : RAA (Rhumatisme Articulaire Aiguë) ;
maladies auto-immunes : LED (Lupus Erythémateux Disséminé) ;
maladies tumorales : maladie de Hodgkin.

7- Hypergammaglobulinémies monoclonales
Un seul clone de lymphocytes produit une bande étroite et intense, se
localisant entre les α2 et les γ-globulines. Cette bande étroite de protéines
est appelé protéine M (maligne).
Exemples dřaffections malignes :
- maladie de Kahler ou myélome multiple (75%), surtout lřIg,
quelquefois IgA, IgD et IgE ;
Cours de Biologie Clinique | 66
- macroglobulinémie de Waldenstöm (10%) : Ig M ;
- infection à VIH.
Cours de Biologie Clinique | 67
Cours de Biologie Clinique | 68

Figures 19 : Profils électrophorétiques normal et de différentes


pathologies.

2.2.8. Chromatograpie

2.2.8.1. Introduction

La première expérience de chromatographie a été réalisée vers 1900


par Tsweet, pour la séparation des pigments chlorophylliens. Et à cause des
zones colorées qui se formaient au cours de la séparation, la méthode
sřappela CHROMATOGRAPHIE.

Lřexpérience fondamentale peut être représentée par lřopération


suivante, représentée par la figure 20. Dans un verre, on dispose de
lřalumine (Al2O3) qui est retenue par une partie filtrante vers le fond du
tube. Après avoir imbibé lřalumine dřun solvant, dans ce cas dřun mélange
benzène-pétroléine, nous faisons arriver au sommet une certaine quantité de
Rouge soudan et de Jaune soudan dissous dans le même solvant (a). Au fur
et à mesure que le liquide sřécoule, les colorants se fixent sur lřalumine. Si
après ce stade, nous faisons passer encore du solvant sur lřalumine, nous
observons dřabord un élargissement de la zone colorée qui commence à
descendre dans la colonne (b), puis cette zone se sépare progressivement en
deux zones colorées, lřune jaune (J), progressant plus vite (C), lřautre rouge
(R) accusant un certain retard (c). Enfin, la fraction jaune atteint le bas de la
colonne et colore en jaune le solvant qui sřen écoule (d).
Cours de Biologie Clinique | 69

Figure 20 : Premières expériences chromatographiques réalisées par


Tsweet(1900).

Cette technique que nous venons de décrire a subi cependant de


nombreuses modifications, aussi bien au point de vue de lřappareillage mis
en œuvre quřau point de vue de principe qui est la base de la séparation.

2.2.8.2. Définition

La chromatographie est une méthode physique de séparation basée


sur les différences d'affinités des substances à analyser à l'égard de deux
phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile.
Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des
composants entraînés par la phase mobile résulte soit de leur adsorption et
de leur désorption successive sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité
différente dans chaque phase.

2.2.8.3. Généralités

Il convient de préciser ici certains termes qui sont couramment


utilisés en chromatographie.
Supposons que lřon effectue telle quřelle est décrite plus haut, cřest-
à-dire dans le récipient cylindrique. Au dessus de la partie filtrante, de A
jusquřà B, se trouve la phase stationnaire (par exemple Al2o3).
Cours de Biologie Clinique | 70

Figure 21 : Ilustration des termes techniques utilisés en


chromatographie.

La partie comprise entre A et B sřappelle la colonne


chromatographique. On peut diviser cette colonne en plusieurs
compartiments fictifs ou réels, chaque compartiment étant considéré comme
une unité de distribution. Un tel compartiment est appelé plateau.

La quantité de la phase mobile susceptible dřêtre en équilibre avec la


quantité de la phase stationnaire contenue dans un plateau est désignée
comme un volume libre dřun plateau.
La somme des volumes libres de lřensemble des plateaux constitue le
volume libre de la colonne (VL).
On désigne par transfert, le passage du volume libre dřun plateau au
plateau qui lui fait suite dans le système. On appelle bande ou spot
chromatographique, le plateau ou lřensemble des plateaux qui contient la
majeure partie du produit mis en œuvre dans lřopération de distribution. Le
plateau le plus avancé occupé par la phase mobile lors de transfert constitue
le front de solvant.
La position de la bande ou du spot sur le chromatogramme est
caractérisée à tout instant par le rapport :

Ce rapport, appelé Facteur de rétention, est désigné par le symbole


Rf.
Le développement dřun chromatogramme consiste en une
multiplication des transferts, de façon à faire progresser une bande ou spot
chromatographique dans le système jusquřà lřélution des substances de la
colonne par la phase mobile. Cřest lřélution, et la substance qui sřécoule
étant lřéluat.

Le volume de la phase mobile nécessaire pour lřélution dřune bande


Cours de Biologie Clinique | 71
est dénommé volume de rétention (Vr). Le volume de rétention est égal au
volume libre dřun plateau multiplié par le nombre des transferts nécessaires.
Si le débit de la phase mobile est constant, cette caractéristique peut être
exprimée comme temps de rétention (Tr). Si lřon veut connaître la position
des bandes ou des spots sur le chromatogramme avant lřélution, on utilise la
lumière de WOOD en UV ou on utilise un réactif approprié. Cette
opération sřappelle révélation d’un chromatogramme.

La distribution des substances chromatographiées entre les deux


phases est caractérisée, toutes les conditions étant égales, par la constante de
distribution K.

Le K est fonction de la t°, des quantités respectives des deux phases,


de la pression de la phase mobilisée sur la phase stationnaire, etc.….
Nous pouvons schématiquement faire les mêmes raisonnements en
chromatographie quřen extraction à contre-courant. Dans les cas les plus
simples, où lřisotherme de distribution est linéaire, nous nous trouverons
donc également en présence dřune répartition binomiale, et nous pouvons
calculer très simplement que dans ce cas :

2.2.8.4. Classification des techniques chromatographiques

On peut classer les techniques chromatographiques en se basant soit


sur la nature des phases mises en œuvre, soit sur le phénomène physico-
chimique en action, tels que le résume le tableau ci-dessous.

Tableau V : Classement des techniques chromatographiques selon les


phénomènes physico-chimiques.

PHASES PHENOMENES
Ph. stat+ Ph. Adsorption Partage ou Echanges
Mobile répartition ioniques
Solide+ liquide + +
Cours de Biologie Clinique | 72
Liquide+liquide +
Solide+liquide +
Liquide+gaz +
Solide+gaz + +

Ainsi, nous adopterons la classification basée sur les phénomènes mis en


œuvre qui sont :
- la chromatographie dřadsorption ;
- la chromatographie de partage ;
- la chromatographie par échange ionique.

Ce classement nřa rien dřabsolu car, lors des phénomènes


dřadsorption, les échanges ioniques peuvent intervenir dans une certaine
proportion et inversement dans les échanges ioniques, lřadsorption peut
lřêtre aussi. Etant donné que lors des chromatographies liquide-liquide et
liquide-gaz, on utilise souvent un support inerte pour tenir la phase
stationnaire en place, les phénomènes secondaires dřadsorption peuvent
intervenir entre phase mobile et support. Il sřagit de ce que nous
expliquerons plus loin par Řřpolarité des phases.řř

2.2.8.5. Nature des phases

2.2.8.5.1. Phase fixe

La phase fixe peut être solide ou liquide. Les solides, silice ou


alumine traitées, permettent la séparation des composants des mélanges
grâce à leurs propriétés adsorbantes. Ils peuvent être employés comme
remplissage d'une colonne (chromatographie par gravité et chromatographie
à haute performance ou HPLC) ou étalés en couche mince sur une plaque de
verre, d'aluminium ou sur une feuille de matière plastique (chromatographie
sur couche mince ou CCM). La phase fixe peut aussi être constituée par un
liquide imprégnant un support solide ou encore par une chaîne carbonée
fixée sur un support (phase greffée). Ainsi, en chromatographie sur papier,
la phase fixe est formée par l'eau que les molécules de cellulose du papier
adsorbent, alors qu'en chromatographie en phase gazeuse, elle est constituée
d'un liquide peu volatil et thermiquement stable imprégnant un granulé
poreux.

2.2.8.5.2. Phase mobile

La phase mobile est :


- soit un gaz (ex : chromatographie en phase gazeuse) : la phase
mobile est appelée gaz ou vecteur porteur ;
Cours de Biologie Clinique | 73
- soit un liquide (ex : chromatographie sur couche mince, papier ou
colonne) : la phase mobile est appelée éluant.

2.2.8.6. Techniques proprement dites

2.2.8.6.1. Chromatographie d’adsorption

Elle est illustrée par la séparation chromatographique classique, sur


colonne remplie ou sur couche mince, des composés moléculaires. La phase
stationnaire est constituée par un solide, insoluble dans la phase mobile,
capable dřadsorber à sa surface, dřune façon plus ou moins sélective, les
produits dissous dans la phase mobile mise à son contact. Lřadsorption est
un phénomène de surface et la distribution est déterminée par des lois
physico-chimiques.

La Figure 22 : Montre clairement que lřabsorption nřest pas de la


chromatographie.
L'adsorption est un phénomène d'interface à la différence de
l'absorption. Lorsquřà la surface du gel de silice on greffe une monocouche
d'hydrocarbure, les molécules, qui présentent une partie lipophile et l'autre
hydrophile, s'orientent à l'interface comme en témoigne l'exemple de
l'orangé d'acridine en phase aqueuse.
Cours de Biologie Clinique | 74

Figure 23 : phénomènes dřadsorption et de partage.

En voici la description détaillée :

1°Opération en colonne

Il sřagit notamment de la technique classique de Tsweet décrite plus


haut. Les séparations sont basées sur le principe de polarité, c'est-à-dire,
l'existence des dipôles.

2°Phase mobile

Le pouvoir éluant d'un liquide dépend de sa propre polarité. Les


liquides classés ci-dessous le sont par polarité croissante. On obtient ainsi
une série éluotropique :
• éther de pétrole ;
• cyclohexane ;
• Tétrachlorométhane ;
• Trichloréthène ;
• Toluène ;
• Benzène ;
• Dichlorométhane ;
• Ether diéthylique ;
• Trichlorométhane ;
Cours de Biologie Clinique | 75
• Ethanoate d'éthyle ;
• Pyridine ;
• Propanone ;
• Propan-1-ol ;
• Ethanol ;
• Méthanol ;
• Eau ;
• Acide éthanoïque.

3°Phase solide

Les adsorbants figurant dans la liste ci-dessous sont classés selon


l'ordre croissant de leurs forces d'interactions avec des composés polaires,
comme phase solide :
• Papier, cellulose ;
• Kieselguhr, terre de diatomées ;
• Amidon ;
• Sucres ;
• Talc ;
• Carbonate de sodium ;
• Oxyde de magnésium ;
• Gel de silice ;
• Alumine ;
• Charbon activé.
Le gel de silice et l'alumine sont les adsorbants les plus utilisés. En
général, plus un adsorbant est actif, plus il retient fortement les composés
polaires. Il est cependant possible de traiter un adsorbant pour modifier ses
capacités d'adsorption et ses propriétés : plus la teneur en eau d'un adsorbant
est faible, ce qui a pour conséquence la présence d'un plus grand nombre de
sites d'adsorption pour le soluté, plus il est polaire ou actif.

2.2.8.6.2. Chromatographie de partage

Elle est fondée sur la différence de solubilité des substances à séparer


dans deux fluides parfaitement miscibles. Elle est mise en pratique en
chromatographie sur papier.

2.2.8.6.3. Chromatographie ionique

La séparation repose sur les coefficients de distribution ionique entre


la phase mobile qui est une solution tampon aqueuse et la phase fixe qui est
faite de polystyrène, en abrégé PS (matière thermoplastique obtenue par
polymérisation du styrène).
NB : Le styrène ou styrolène est un hydrocarbure benzénique
C6H5CH=CH2, servant de monomère pour de nombreux polymères ou
Cours de Biologie Clinique | 76
substances chimiques plus complexes.

2.2.8.6.4. Chromatographie d'exclusion

On réalise une sorte de tamis à l'échelle moléculaire, dit à


perméabilité sélective ou propriétés des membranes biologiques de ne
laisser passer que certaines bubstances. La séparation est donc réalisée par le
fait que les solutés sont élués dans l'ordre inverse des masses molaires : les
grosses molécules passeront difficilement ou pas, que les petites qui
passeront facilement.

2.2.8.7. Quelques applications manuelles et faciles de la


chromatographie

 chromatographie sur couche mince (CCM) : contrôle de


la pureté dřun composant organique, suivi de la progression dřune réaction,
recherche du meilleur solvant.
 Chromatographie sur papier : analyse des composés
polaires (acides aminés, sucres,…), séparation des cations métalliques.
Cours de Biologie Clinique | 77

Figure 24 : Chromatographie sur couche mince ou sur papier : la


flèche indique le mouvement du liquide (phase mobile) contenu dans un bac
(petit rectangle) et qui entraîne par polarités les 3 produits analysés (cercles)
à travers les pores du papier ou du gel (phases solides).

2.2.8.7.1. Chromatographie sur papier

2.2.8.7.1.1. Principe de la technique et applications

La technique ressemble à celle de la CCM, mais le principe repose


sur des phénomènes de partage. La phase mobile est le plus souvent un
solvant organique et l'eau ; la phase stationnaire est constituée par l'eau elle-
même adsorbée sur la cellulose du papier ou liée chimiquement à elle.
Comme en chromatographie sur couche mince, l'échantillon mis en solution
est déposé en un point repère du papier, et le solvant qui se déplace par
capillarité fait migrer les composants de l'échantillon à des vitesses variables
selon leur solubilité. Généralement, les composés les plus solubles dans
l'eau ou ceux qui forment facilement des associations par liaisons hydrogène
sont fortement retenus par la phase stationnaire et migrent donc lentement.
Lorsque l'eau est un des solvants de la phase mobile, le ou les solvants
organiques doivent y être assez solubles. Des produits comme l'acide
éthanoïque, le propanol, le phénol ou la pyridine sont les solvants les plus
fréquemment utilisés en mélange avec de l'eau pour développer un
chromatogramme. La chromatographie sur papier est employée
principalement pour l'analyse des composés très polaires, tels les acides
aminés, les sucres et les composés polyfonctionnels. Ses plus grands
inconvénients par rapport à la CCM sont :
- une durée de développement beaucoup plus longue ;
- une séparation généralement moins bonne.
Cours de Biologie Clinique | 78

Méthode descendante (1) Méthode


ascendante (2)

Figure 25 : Illustrations de différentes techniques sur papier.

Sans ouvrir le dispositif, afin de ne pas provoquer une désaturation,


on introduit la phase mobile au contact du papier, et on effectue le
développement soit par méthode descendante (1), soit par méthode
ascendante (2).

On peut utiliser du papier filtre ordinaire, mais il est préférable de se


procurer du papier conçu pour cet usage, ayant un faible taux d'impuretés et
dont les caractéristiques sont uniformes. Les marques principales sont
Whatman, Schleicher et Schüll, Durieux, Arches. Il existe huit catégories de
papier Whatman, classeés selon leur épaisseur, la texture de leur surface et
la vitesse avec laquelle l'eau y diffuse. Par exemple le papier Whatman n° 1
est le plus utilisé, mais si on désire une grande vitesse d'écoulement, on
emploiera le n° 4; le papier n° 20 est très lent, mais il permet une meilleure
séparation, donnant des taches très denses et uniformes. La description de
l'analyse par chromatographie sur papier est identique à celle sur couche
mince.

2.2.8.7.2. Chromatographie sur colonne

Alors que les autres méthodes chromatographiques sont


habituellement employées pour l'analyse et la séparation de très faibles
quantités de produits, la chromatographie sur colonne peut être une méthode
préparative ; elle permet en effet la séparation des constituants d'un mélange
et leur isolement, à partir d'échantillons dont la masse peut atteindre
plusieurs grammes. Elle présente cependant plusieurs inconvénients :
• de grandes quantités de solvant sont nécessaires à l'élution ;
• la durée de l'élution est généralement très grande ;
Cours de Biologie Clinique | 79
• la détection des composés exige une attention constante ;
• elle est adaptée à la purification de faibles quantités de produit,
lorsque les conditions opératoires sont au point. Cependant, la méthode étant
très empirique, sa mise au point nécessite souvent de nombreux essais.

2.2.8.7.2.1. Description et principe

C'est une technique basée sur des phénomènes d'adsorption. La phase


solide, le plus souvent l'alumine ou la silice, remplit une colonne de
longueur et de section variables ; l'échantillon, en solution concentrée, est
déposé en haut de la colonne et la séparation des composants résulte de
l'écoulement continu d'un éluant, traversant la colonne par gravité ou sous
l'effet d'une faible pression. On peut utiliser comme éluant un solvant unique
ou bien accroître progressivement la polarité de l'éluant de façon à accélérer
le déplacement des composés. Les molécules sont entraînées vers le bas à
des vitesses variables selon leur affinité pour l'adsorbant et leur solubilité
dans l'éluant. Le chromatogramme se développe en formant une succession
de zones cylindriques qui se séparent en migrant vers le bas. A mesure que
chaque zone s'écoule de la colonne, on la recueille.

2.2.8.7.2.2. Facteurs dont dépend la séparation

Quatre facteurs interviennent :


- l'adsorbant ;
- l'éluant ;
- la dimension de la colonne ;
- la vitesse d'élution.

 Adsorbant : Le plus utilisé est l'alumine, cependant, on la


limitera aux composés organiques stables car, sous sa forme basique, elle
peut provoquer la déshydratation des esters par exemple. Le gel de silice est
également fréquemment utilisé pour la séparation des composés qui n'ont
pas une stabilité suffisante pour être traités par l'alumine. La granulométrie
de l'adsorbant doit être supérieure à celle des adsorbants utilisés en CCM.
Leur taille est habituellement comprise entre 50 et 200 µm. La quantité
d'adsorbant dépend de la difficulté de la séparation et de la masse
d'échantillon. On peut considérer que pour chaque gramme d'échantillon, il
faut 30 à 50 g d'adsorbant si la polarité des composants à séparer est très
différente et jusqu'à 200 g si la séparation est difficile.

 Eluant : L'éluant est en général un mélange de deux


solvants. Au début de l'élution, on commence par le solvant le moins polaire
qui entraîne les substances les moins retenues par l'adsorbant (les moins
polaires). Ensuite on fait varier la composition de l'éluant en additionnant
graduellement le solvant le plus polaire. Ainsi les composés les plus
polaires, retenus sur l'adsorbant, ne migreront que graduellement vers le bas
Cours de Biologie Clinique | 80
de la colonne.

 Dimension de la colonne : Les colonnes spécialement


conçues pour cet usage ont à leur base une plaque de verre fritté ou de
porcelaine qui permet l'écoulement libre de l'éluant, tout en empêchant le
passage de l'adsorbant. On peut aussi utiliser une burette, au fond de laquelle
on place un tampon de laine de verre et du sable. La quantité d'adsorbant est
telle qu'il occupe une hauteur égale à environ 10 fois le diamètre de la
colonne. Il faut également prévoir un espace de 10 cm environ au-dessus de
l'adsorbant pour placer le solvant.

 Vitesse d'élution : Elle doit être la plus constante


possible. Il faut qu'elle soit suffisamment lente pour que le soluté soit au
plus près de l'équilibre entre les phases liquide et adsorbée. Elle ne doit pas
être trop lente car sinon les substances diffusent dans le solvant et on obtient
des bandes de plus en plus larges et une séparation médiocre.

2.2.8.8. Composition d’un chromatographe à haute pression


liquide(HPCL)

Un chromatographe à haute pression est constitué,


approximativement, de trois organes essentiels :
injecteur ;
manodétendeur ;
colonne à produit liquide ;
four à haute température thermostatisée ;
détecteur des subsances vaporisées ;
ordinateur intégrateur ;
enregistreur.

Figure 26 : Description dřun chromatographe liquide à haute pression


(HPLC) : le produit à analyser est injecté dans lřappareil, refoulé et aspiré
sous haute pression (gaz comprimé) dans la colonne contenu dans un four à
Cours de Biologie Clinique | 81
très haute température thermostatisée par un ventilateur. Le produit ainsi
vaporisé, toujours sous haute pression, passe dřabord par un détecteur-
débimètre des substances, puis dans lřordinateur intégrateur qui, après
analyse, envoie les résultats sur un enregistreur.

2.3. LES ANALYSES COURAMMENT PRATIQUEES


EN BIOCHIMIE

2.3.1. La détermination du glucose

Le glucose sanguin (glycémie) et urinaire (glycosurie) figure


parmi les paramètres les plus demandés en urgence et en routine, associé
très souvent à lřurée sanguine, à la créatinine, à lřionogramme et aux
paramètres de lřéquilibre acide-base.
La glycémie et la glycosurie constituent des paramètres
essentiels pour le diagnostic, le pronostic et le suivi du traitement de diabète.
Il existe plusieurs méthodes de dosage du glucose dans le milieu
biologique (sang total, plasma, sérum, urines, LCR) : méthodes
réductimétriques, méthodes furfuraliques et méthodes enzymatiques.

2.3.1.1. Prélèvement et conservation des échantillons

La détermination de la glycémie et de la glycosurie doit être


considérée comme une urgence technique, de suite de la présence dans le
milieu biologique des enzymes glycolytiques qui peuvent dégrader le
glucose et donner un taux bas par rapport au taux initial. Cřest pourquoi, les
précautions suivantes doivent être prises :

- échantillon pour la glycémie : sérum, plasma ou sang complet


(capillaire) ;
- conservation dřéchantillon sans conservateur : durée maximum
1heure ;
- échantillon prélevé sur fluorure de sodium + oxalate de potassium
peut être conservé pendant 6 heures ;
- le sujet doit être complètement à jeun depuis 10 heures :
prélèvement fait le matin après une nuit de sommeil.

2.3.1.2. Causes d’erreur

conservation sans préservatif pendant plus dřune heure ;


perfusion de sérum glucosé.

2.3.1.3. Différentes méthodes

1- Méthodes réductimétriques
Cours de Biologie Clinique | 82

Les techniques réductimétriques visent à doser le glucose par la


mesure de son pouvoir réducteur dû à la présence du groupement pseudo-
aldéhydique sur C1. Ces techniques sont effectuées en milieu alcalin, le
glucose sous forme dřénolate étant plus facilement oxydé que sous forme
cétonique. Ces méthodes sont peu spécifiques, car elles mesurent aussi les
autres glucides réducteurs et les réducteurs non glucidiques, tels que lřacide
ascorbique, lřacide urique, le glutathion, la créatinine, certains acides
aminés, etc. Il sřagit de :
méthodes au ferricyanure (Hagedorn-Jensen, Hoffman, Folin) ;
méthodes à lřiodomercurate (Baudoin-Lewin) ;
méthodes aux ions cuivriques (Folin-Wu, Nelson-Smogyi, Brown) ;
méthodes propres pour lřurine : Fehling, Nylander, Clinitest, Tes
tape, Glukotest.
NB : Enolate=Anion provenant de lřarrachement irréversible dřun
proton par une base à un énol ; un énol étant un composé qui possède une
liaison éthylénique porteuse dřune fonction alcool en équilibre avec la
cétone correspondante.

2- Méthodes enzymatiques

Les méthodes enzymatiques sont les plus fiables du fait de la


spécificité des enzymes pour un substrat donné, cas du glucose notamment.
Nous parlerons brièvement des méthodes les plus courantes, à la glucose-
oxydase, à la glucose-déshydrogénase et à lřhexokinase.

1 - Méthode à la glucose-oxydase

La réaction se fait en deux :


1° En solution aqueuse et en présence de glucose-oxydase, il y a
production de lřacide gluconique (glucono-lactone) et du peroxyde
dřhydrogène ou eau oxygénée (H2O2) ;
2° En présence dřun chromogène (aminophénazone) et de
peroxydase, le peroxyde dřhydrogène se transforme en 2H 2O et le
chromogène se colore en rouge dont lřintensité est mesurée par
spectrophotométrie à la longueur dřonde caractéristique de 525 nm.
Cours de Biologie Clinique | 83
2 - Méthode à la glucose- déshydrogénase (Banaush)

La formation de NADH,H+ est proportionnelle à la quantité de


glucose. Elle est mesurée à 340 nm, par spectrophotométrie directe, sans
passer par lřétape dřune coloration. La spécificité de cette méthode est très
améliorée.

3 -Méthode à l’hexokinase (Schmidt)

Après lřatteinte de lřéquilibre par les réactions, la mesure de


lřabsorbance à 340 nm rend compte de la quantité de glucose présent dans
lřéchantillon.
Lřhexokinase étant une enzyme très spécifique du glucose, cette
méthode est lřune des rares méthodes considérées comme méthodes de
référence en biologie clinique.

2.3.1.4. Variations physiologiques de la glycémie et de la


glycosurie

2.3.1.4.1. Glycémie

La remarquable stabilité de la glycémie est due à une régulation


neuro-hormonale complexe : illustration du principe dřhoméostasie. Ainsi,
chez un sujet ayant normalement une alimentation équilibrée en glucides,
250 à 300 g/j et qui est à jeun depuis 10 heures, la glycémie se situe entre
3,8 et 5,1 mmol (60Ŕ92 mg%)(70-110mg%). Cřest la glycémie dite de base.

On parle dřhypoglycémie, quand la valeur de la glycémie après


plusieurs examens répétés est inférieure à 2,75 mmol, tandis que
lřhyperglycémie diabétique est évoquée dès quřune valeur de base dépasse 6
mmol (x 0,180g/L). (g/Lx5, 55=mmol/L).
- Après un repas normal, il existe chez le sujet normal un pic
dřhyperglycémie dans lřheure qui suit, ce pic ne doit cependant pas dépasser
6,5 mmol. Quand le pic est compris entre 6,5 et 7,25 mmol, il y a lieu de
craindre un diabète ; dans ce cas, il est alors recommandé de faire une
épreuve dřhyperglycémie provoquée.
Cours de Biologie Clinique | 84
- Une hypoglycémie physiologique existe chez le nouveau-né entre
la 3e et la 8e heure (entre 1,75 et 2,25 mmol) (30-40 mg%). La glycémie
remonte et se stabilise autour de 2,75 mmol, dès la 48e heure, valeur
observée chez le nourrisson pendant la première année.

2.3.1.4.2. Glycosurie

Le glucose qui filtre dans le glomérule rénal est complètement


réabsorbé au niveau tubulaire chez le sujet sain. Cřest donc une substance à
seuil qui nřapparaît pas ou très peu dans lřurine normale.
Chez le diabétique quand la glycémie dépasse 9 mmol, le glucose
passe dans lřurine en quantité significative.

La détermination de la glycémie et de la glycosurie permet de définir


3 types de diabète :
- le diabète sucré, caractérisé cliniquement par la polyurie, la
polydipsie, la polyphagie, et biologiquement par une hyperglycémie et une
glycosurie ;
- le diabète néphrogénique ou diabète rénal, caractérisé par une
glycosurie sans hyperglycémie : abaissement du seuil rénal pour le glucose
en dehors de la grossesse ;
- le diabète insipide, avec présence de polydipsie (soif premanente),
polyurie et absence de glycosurie. De cause liée à une lésion de lřhypophyse
ou de lřhypothalamus, mais souvent dřétiologie obscure.

2.3.1.4.3. Les hypoglycémies

Les hypoglycémies sont soit spontanées, soit provoquées.

2.3.1.4.4. Les hypoglycémies spontanées sont dues à :

- exercices musculaires violents ;


- hypoglycémie réactionnelle ;
- jeûne prolongé ou sous alimentation ;
- hyperactivité pancréatique primitive ;
- hypoglycémies digestives (gastrectomie) ;
- hypoglycémies hépatogènes (glycogénose) et endocriniennes.

2.3.1.4.5. Les hypoglycémies provoquées sont, souvent,


iatrogènes :

- hypoglycémie des diabétiques dont le traitement est mal contrôlé ;


- erreur de traitement ou instabilité glycémique chez lřenfant
diabétique en cours dřéquilibration ;
- lésions encéphaliques irréversibles dans lřhypoglycémie grave
(prématuré, nouveau-né, voire adulte).
Cours de Biologie Clinique | 85

2.3.1.5. Epreuve d’hyperglycémie provoquée par voie orale :


HPVO

Indications : dépistage précoce du diabète sucré et analyses des


hypoglycémies fonctionnelles (grossesse, troubles hormonaux….).
Précautions :
- régime glucidique équilibré les 3 jours qui précèdent lřépreuve ;
- pas des corticoïdes, diurétiques thiazidiques, catécholamines,
oestroprogestatifs ;
- être à jeun depuis 12 heures, et au repos.
Protocole :
- ingestion de 50 g de glucose anhydre dissout dans 250 ml dřeau,
lřOMS préconiserait actuellement 75 g ;
- les variations de la glycémie sont suivies toutes les ½ heures,
pendant 3 à 4 heures voire 5 heures.
Observations :
-chez le sujet normal, la glycosurie est nulle ;
-la glycémie augmente est atteint un pic en 30 à 60 mn, puis
redescend à son niveau initial en un temps variable inférieur à 120 mn ;
-le retour au taux normal est fréquemment suivi par une onde
dřhypoglycémie (captage tissulaire périphérique du glucose).

Figure 27 : Différentes courbes dřhyperglycémie provoquée par voie


orale(HPVO)

2.3.1.6. Hyperglycémie provoquée par voie veineuse(HGPV)

Se fait afin d'éliminer l'influence des barrières digestives et


hépatiques qui peuvent constituer une source d'erreur dans l'interprétation
d'une courbe d'hyperglycémie provoquée par voie orale : diarrhées, cirrhose
du foie…
Cours de Biologie Clinique | 86
Après injection IV rapide, le glucose diffuse d'abord dans le sang et
les liquides extracellulaires (5è à 10è min.) et pénètre ensuite dans les
cellules (10è à 60è min.).
Dans une troisième phase, la glycémie décrit un certain nombre
d'oscillations autour du taux de base qui sont la conséquence du
déclenchement des phénomènes régulateurs secondaires

Figure 28 : Courbes dřhyperglycémie provoquée par voie veineuse :


différentes oscillations de la glycémie en fonction de temps.

2.3.2. Dosage de l’urée dans le sang et dans l’urine

Le dosage de lřurée dans le sang et dans lřurine reste lřanalyse la plus


ancienne en biologie clinique, et les deux produits restent les plus demandés.
Bien dépassé en néphrologie par la clairance de la créatinine, le dosage de
lřurée plasmatique reste, néanmoins, un paramètre très utile en clinique.
Produit final du catabolisme des protéines chez lřhomme, lřurée nřest pas
toxique. Soluble dans lřeau, il sřélimine principalement par les urines et la
sueur.

Dans lřorganisme, le poids de lřurée est directement lié au capital


hydrique. Et dans le néphron, ses mouvements sont passifs, suivant ceux de
lřeau, ainsi la quantité dřurée éliminée est étroitement fonction de la diurèse.

2.3.2.1. Méthodes de dosage

Deux types de méthodes : chimique et enzymatique.


Cours de Biologie Clinique | 87

2.3.2.1.1. Méthode chimique, à la Di-Acétyle Monoxime(DAM)

2.3.2.1.2. Méthode enzymatique, à l’uréase

Une molécule dřurée donne deux molécules dřammonium. Lřion


NH4 est dosé en présence dřα cétoglutarate, de glutamodéshydrogénase et
du système NADH-NAD.

2.3.2.2. Variations physiologiques

Valeurs normales chez sujet avec alimentation normale : sérum ou


plasma : 1,67 Ŕ 7,01 mmol/L soit 10 Ŕ 42 mg/dl ;
Urines : 10 – 15 g/24 h.
Ces valeurs peuvent varier avec :
Cours de Biologie Clinique | 88
- lřâge : à 50 ans, petite augmentation possible ;
- variations de la diurèse ;
- écarts de lřalimentation (apport en protéines).

2.3.2.3. Variations pathologiques

 Diminution du taux de lřurée:


Une chute importante de taux dřurée sanguine, en deçà de la normale,
chez lřadulte, associée à une chute de taux urinaire, signe le stade terminal
dřune insuffisance hépatique.

 ELévation du taux de lřurée:


Un taux élevé dřurée sanguine, associé à des taux variables dřurée
urinaire (voire taux de créatinine) dans le contexte dřun syndrome de
rétention azotée, est signe dřinsuffisance aiguë ou chronique des reins.

2.3.3. Dosage de la créatinine dans le sérum et dans l’urine

La créatinine plasmatique et urinaire est le reflet de la masse


musculaire. En effet, pour un sujet donné, le taux plasmatique et le taux de
la créatinine éliminée dans les urines par jour restent fixes. Ainsi, la
clairance de la créatinine, indépendante de la diurèse et mesurant
directement la filtration glomérulaire, revêt un intérêt capital dans
lřexploration et le suivi dřune insuffisance rénale.
La créatine est générée dans la cellule hépatique à partir de
lřarginine. Dans la cellule musculaire, la créatine-phosphate-créatinine
combinée au système ATP-ADP, sert de réservoir dřénergie utilisée pendant
la contraction. La créatine dans la cellule est spontanément déshydratable en
créatinine qui reflète ainsi la masse musculaire.
UV
Dřoù la formule FP=UV, F = ―
P
F : volume de lřultrafiltrat glomérulaire ;
P : concentration de la créatinine dans le plasma ;
U : concentration urinaire de la créatinine ;
V : volume dřurine définitive ;
F : est donc la clairance par définition et est égale à ~2ml/s chez le
sujet normal (1,72m² de surface corporelle).

2.3.3.1. Méthodes de dosage de la créatinine

Echantillon : sérum, plasma ou urines. Les échantillons peuvent être


conservés plusieurs jours à lřabri de lřévaporation. Deux méthodes sont
faisables : méthode chimique (réaction de Jaffé) et méthode enzymatique
(avec utilisation de la créatininase).
Cours de Biologie Clinique | 89
2.3.3.1.1 La réaction de Jaffé

Peut être réalisée manuellement ou automatisée. Si pour les urines,


lřanalyse peut sřeffectuer directement, sans défécation préalable ; en ce qui
concerne le sérum ou le plasma, la défécation ou déprotéinisation à lřaide de
lřacide trichloracétique en méthode manuelle, ou une dialyse en flux continu
en cas dřautomatisation, est nécessaire.
Le picrate alcalin, de couleur jaune, est utilisé pour produire la
coloration orangée lue à 510 nm.
Interférences :
- méthode manuelle : seuls 90% de créatinine sont mesurés ;
- protéines, glucose, acide ascorbique, corps cétoniques ; interfèrent.

2.3.3.1.2 Méthode enzymatique

2.3.3.2. Variations physiologiques

Valeurs normales :
-créatinine plasmatique : 70-106 µmol chez homme (0,5 Ŕ 2 mg %) ;
44-88 µmol chez femme ;
-valeurs plus basses chez lřenfant de moins de 5 ans et le vieillard ;
-créatinine urinaire : urines de 24 h: 8,85-16mmol chez homme
adulte ; (0,75 - 1,5 g), 7-10,6 mmol chez femme ;
-clairance : 2ml/s

2.3.3.3. Variations pathologiques

Paramètres fondamentaux dřexploration et de suivi des insuffisances


rénales :
-créatinine plasmatique + urinaire + clairance ;
-urée plasmatique + urinaire ;
-ionogramme plasmatique + urinaire.
Cours de Biologie Clinique | 90
2.3.3.4. Clairance de la créatinine : explore le degré de
l’insuffisance rénale

>0,83 ml/s cliniquement muette ;


0,83-0,5 risque modéré, bien compensée ;
0,5-0,17 sévère avec signes dřIR (Insuffisance Rénale);
<0,17 désordres biologiques majeurs.

2.3.4. Dosage de l’acide urique dans le sang et dans l’urine

Lřacide urique ou la 2, 6,8-trihydroxypurique, est chez lřhomme le


produit final du catabolisme purique. Il est très peu soluble dans lřeau, nřest
pas conjugué et est excrété dans lřurine. Dans le plasma, lřacide urique est
sous forme dřurates monosodiques dont la solubilité ne dépasse pas 50 à 80
mg/L.
La solubilité de lřurate de sodium est augmentée en présence des
protéines.
Dans lřurine alcaline, le mélange dřacide urique libre et dřurates
alcalins est maintenu en solution. Ceci, grâce aux facteurs qui alcalinisent
lřurine : taux élevés des phosphates et bases fixes contenus dans les légumes
vertes favorisent la formation dřurates plus solubles.

Au niveau des reins, il y a une filtration glomérulaire de lřacide


urique qui, plus loin, est presque complètement réabsorbé au niveau des
tubes : uricosécrétion.

Lřuricosécrétion est inhibée par lřacide lactique, lřacide β-


hydroxybutyrique et quelques médicaments, ce qui favorise lřélimination
urinaire de lřacide urique : clairance ~10ml/mn (0,166ml/s).

Lřacide urique plasmatique ou sérique fait partie des analyses


demandées dans le bilan de santé de routine réalisé régulièrement après 40
ans, pour apprécier la fonction rénale et le risque athérogène ; les autres
paramètres étant lřurée, la créatinine, le glucose, le cholestérol et les
triglycérides.
Si la clairance de lřacide urique est intéressante en néphrologie, elle
est encore plus importante en rhumatologie.

2.3.5. Le dosage des protéines dans les liquides biologiques

Les milieux biologiques contiennent une diversité des protéines. Une


analyse électrophorétique permet de les étudier séparément. Cependant,
toutes nřont pas le même intérêt dans la pratique médicale.

Comme vu précédemment, les protéines sont généralement divisées


en 2 groupes : le sérum albumine et les globulines (α1, α2, β et γ). Les
Cours de Biologie Clinique | 91
variations du taux des protéines totales présentent une signification
séméiologique tout aussi intéressante que leurs fractions.

2.3.5.1. Méthodes de dosage

Méthodes gravimétriques.
Méthodes densitométriques.
Méthodes basées sur la teneur en Azote.
Méthodes colorimétriques.

2.3.5.1.1. Méthode gravimétrique (Fleury et Courtois)

Méthode précise et de référence, mais pas employée en routine.


Principales étapes :
- coagulation des protéines par ébullition, en présence dřéthanol à
95% ;
- recueil du coagulum, à lřeau courante, sur papier filtre taré ;
- déshydratation par traitement à lřalcool, puis à lřéther pesée.

2.3.5.1.2. Méthodes densitométriques

a) Technique de Philips et Van Slyke :


Basée sur la mesure de la densité des gouttelettes de sérum que lřon
fait tomber dans les solutions de sulfate de cuivre de concentrations
croissantes et donc des densités croissantes (1,008-1,038).

b) Technique de Deprattère, De traverse et Coquelet :


Cette technique utilise un abaque, et est basée sur la comparaison de
la vitesse dřune goutte de liquide biologique (sérum) et celle dřune solution
étalon de K2SO4 au travers dřun tube cylindrique qui contient un liquide non
miscible dans lřeau. Peu précise.

2.3.5.1.3. Méthodes turbidimétriques

Lřaddition de lřacide sulfosalicylique ou lřacide trichloracétique à


une solution des protéines fait apparaître une turbidité ou trouble, qui peut
être appréciée au néphélomètre.

2.3.5.1.4. Méthode colorimétrique au Biuret

Cřest la méthode la plus généralement utilisée pour doser les


protéines.
Cours de Biologie Clinique | 92
Principe : chauffée au delà de son point de fusion, lřurée produite
par chauffage, se transforme par condensation de deux molécules en Biuret,
avec libération de lřammoniac. 2NH26CO-NH2 → 2CO-NH2 + NH3.
En présence de CuSO4, et en milieu alcalin, il y a formation dřun
complexe entre le cuivre et les liaisons peptidiques CO-NH de coloration
rose violet.
Lřintensité de cette coloration est proportionnelle à la quantité des
protéines présentes dans le milieu. La lecture est faite à 545-550 nm.

La zone optimale de concentration se situe entre 2 et 6 g/L. La


réaction de Biuret sřapplique donc difficilement aux solutions diluées des
protéines. Ainsi, dřautres méthodes sont préconisées pour les milieux de
concentration plus faible en protéines.
Le tartrate double de Na et K, en présence de lřiodure de K, stabilise
le réactif de Biuret.

2.3.5.1.5. Valeurs normales des protéines dans le sang :

6,8g à 8,0g/dl, soit 68g à 80g/L

2.3.5.2. Méthodes d’analyse des protéines dans l’urine

Dans lřurine, la recherche des protéines se révèle indispensable pour


le diagnostic de bon nombre de maladies.
En situation normale, la quasi-totalité des protéines qui arrivent, en
24 heures, au niveau de la capsule (18,7g), sont réabsorbées, sauf une petite
quantité de lřordre de 1 à 5 mg%, constituée principalement des
holoprotéines et de glycoprotéines, passe dans lřurine. Cette présence non
détectable par les méthodes usuelles des laboratoires médicaux est qualifiée
dřabsence des protéines.
En cas de mauvaise réabsorption, dřinflammation ou lésions des
voies rénales, la présence des protéines dans lřurine est détectée par les
méthodes usuelles.

2.3.5.2.1. Méthodes qualitatives

Visent à mettre en évidence la présence des protéines dans lřurine. Il


existe des méthodes simples qui peuvent être utilisées dans notre contexte :

a) Chauffage de lřurine ;
Quand lřurine est chauffée, les protéines présentes sont dénaturées et
précipitent, et lřurine devient trouble. Cependant, lřapparition du trouble lors
de lřébullition de lřurine peut aussi être due, à la présence des phosphates ou
des carbonates.

b) Acidification de lřurine ;
Cours de Biologie Clinique | 93
Lřurine est acidifiée par lřajoute de quelques gouttes dřacide acétique
ou trichloracétique. Si le trouble apparu lors de lřébullition disparaît, il était
donc dû aux phosphates ou aux carbonates. Mais, sřil persiste ou
sřintensifie, il était bel et bien dû à la présence des protéines.

2.3.5.2.1.1. Lecture du trouble

Observation Concentration Notation


Aucun trouble <50 mg/L - ou 0
Trouble à peine visible 50-75mg/L traces ou +
Trouble granuleux sans floculation 1g/L ++
Nuage dense, opaque avec floculation 2 à 3g/L +++
Précipité très dense, dřallure solide 5g/L ou plus ++++

Les urines notées +++ au moins, peuvent être raisonnablement


soumises à la méthode quantitative dřEsbach.

2.3.5.2.1.2. Protéine de Bence-Jones

La protéine de Bence-Jones, thermo-soluble, est caractérisée par


lřapparition dřune floculation au chauffage de lřurine à 60°C, alors quřà
lřébullition, la floculation disparaît pour réapparaître pendant le
refroidissement. Une nouvelle ébullition la fait disparaître. Elle est présente
dans le myélome de Kahler et certaines leucémies.

2.3.5.2.2. Méthodes quantitatives d’analyse ou dosage des


protéines dans l’urine

o Méthode turbidimétrique.
o Méthode colorimétrique (bleu de Coomassie, rouge de pyrogallol).
o Méthode dřEsbach.
o Utilisation des bandelettes (Combur-test) : méthode semi-
quantitative.
NB : Se référer aux techniques détaillées dans des fascicules adřhoc.

2.3.5.3. Intérêt de la recherche des protéines dans l’urine

o protéinuries fonctionnelles
- élimination limitée des protéines après un effort physique
important ;
- affection aiguë fébrile ;
- poussée dřinsuffisance cardiaque ;
- péricardite constrictive ;
- polyglobulie.
Cours de Biologie Clinique | 94
o Protéinuries intermittentes de lřadolescent (longiligne et
lordotique) : modérées, elles apparaissent à lřorthostatisme et à lřexercice,
disparaissent au repos total allongé de 12 heures. Ne doit pas persister après
25 ans.
o Protéinuries permanentes

1. Protéinuries pré-rénales : quantité plasmatique importante


des protéines filtrables qui passent dans lřurine, cřest le cas de : myélome,
maladies de Waldenström, écrasement des membres, hémolyse
intravasculaire.
2. Protéinuries glomérulaires : plus fréquentes, dues aux
lésions de la membrane basale (syndrome néphrotique), aux
glomérulonéphrites aigues et aux glomérulonéphrites chroniques.
3. Protéinuries post-glomérulaires :
- Tubulopathies : néphrites aigues, pyélonéphrites aigues et
chroniques, pyélonéphrite gravidique par compression des voies urinaires,
- Protéinuries de cause urologique ou malformative : cas du
transplanté rénal (récidive de la glomérulonéphrite initiale).

2.3.6. Le dosage des lipides dans les milieux biologiques

2.3.6.1. Introduction

Les lipides ont un rôle important dans pratiquement tous les aspects
de la vie biologique, servant comme hormones ou précurseurs d'hormones,
facilitant la digestion, fournissant l'énergie de réserve et les carburants
métaboliques, agissant en tant que composants fonctionnels et structuraux
dans les biomembranes, et formant l'isolation pour permettre la conduction
de nerf et du système nerveux central ou pour empêcher la perte de chaleur.

2.3.6.2. Chimie et biochimie des lipides

Les lipides sont des composés qui sont solubles dans les solvants
organiques et presque insolubles dans l'eau. Chimiquement, les lipides sont
les uns ou les autres des composés qui apportent les acides gras par
l'hydrolyse ou les alcools complexes qui peuvent se combiner avec des
acides gras pour former des esters (Tableau VI).

Tableau VI : Classification des lipides cliniquement importants.


Cours de Biologie Clinique | 95
Dérivés de stérols Esters de glycérol
Cholestérol et cholestéryl esters Triglycérides (triacylglycérols)
Hormones stéroïdes Phosphoglycérides
Acides biliaires
Vitamine D Dérivés de sphingosine
Sphingomyélines
Acides gras Glycosphingolipides
Chaîne courte (2 à carbone 4 atomes
Chaîne médiane (6 à 10 atomes de Terpènes (polymères d'isoprène)
carbone) Vitamine A
Longue chaîne (12 à 26 atomes de Vitamine E
carbone) Vitamine K
Prostaglandines

2.3.6.2.1. Cholestérol

Le cholestérol est un alcool contenant 27 atomes de carbone (Figure


28); il possède le squelette tétracyclique perhydrocyclopentanophénanthrène
(Figure 28). C'est le point de départ de beaucoup de voies métaboliques
(stéroïdes, vitamine D, hormones stéroïdiennes, acides biliaires).

Figure 29 : Structure du cholestérol : squelette tétracyclique


pérhydrocyclopentanophénantrène, 27 atomes de carbone.

2.3.6.2.1.1. Absorption de cholestérol


Cours de Biologie Clinique | 96

Figure 30 : Digestion et absorption des graisses.


Cours de Biologie Clinique | 97

2.3.6.2.1.2. Synthèse de cholestérol

Figure 31 : Voies dřentrée (en gris) et de sortie (en noir) du


cholestérol de lřorganisme.

2.3.6.2.1.3. Catabolisme de cholestérol

Une fois que le cholestérol entre dans la cellule, les esters sont
hydrolysés par les estérases spécifiques (lipases). Approximativement, un
tiers de la production quotidienne du cholestérol est catabolisé en acides
biliaires.

2.3.6.3. Métabolisme des apolipoprotéines et des lipoprotéines

Les lipides sont transportés par une série de micelles appelées


lipoprotéines, qui se composent d'une monocouche externe
d'apolipoprotéines et des lipides polaires (phospholipides et cho-lestérols
non estérifiés), et un noyau intérieur des lipides non polaires (triglycérides et
esters neutres de cholestérol). Le cœur ou le centre neutre des lipides,
essentiellement « passager », est inactif, tandis que les apoprotéines sont
principalement responsables davantage de métabolisme et de catabolisme de
la particule.
Cours de Biologie Clinique | 98

Figure 32 : Diagramme schématique dřune molécule de lipoprotéine,


constituée dřun noyau interne de triglycérides et de cholestérol estérifié
neutres, enveloppé dřune monocouche de protéines appelées appoprotéines,
de cholestérol libre ainsi que de phospholipides ; tous les trois polaires, qui
rendent les lipides hydrosolubles et transportables vers leurs sites dřaction.

La classification initiale a divisé les lipoprotéines en cinq principales


classes : chylomicrons, lipoprotéines de très basse densité(VLDL),
lipoprotéines de densité intermédiaire(IDL), lipoprotéines de basse
densité(LDL), et lipoprotéines de haute densité(HDL). Liées à ces
lipoprotéines, au moins cinq principales apolipoprotéines (étiquetées de A à
E) et un certain nombre de sous-groupes ont été différenciés (Tableau VII).

Les principaux groupes et leurs sous-groupes diffèrent dans leurs


structures primaires, secondaires et tertiaires ; dans leur comportement
physico-chimique, leur fonction et leur distribution dans les diverses espèces
des lipoprotéines, et dans leur taux plasmatique.
Cours de Biologie Clinique | 99

2.3.6.3.1. Les apolipoprotéines

Tableau VII : Apolipoprotéines majeures et mineures

Apolipoprotéines Fonction Poids moléculaire Site de synthèse


A-I Activation de LCAT ; efflux de 28.300 Foie, intestin
cholestérol

A-II Inhibition de LCAT ; transport des 17000 Foie, intestin


lipides

A-IV Transport des chylomicrons Intestin

B-100 Transport des lipides et clairance 8000-275000 Foie, Intestin

B-48 Transport des chylomicrons Foie

C-I ? Activation de LCAT 6331 Foie

C-II Activation de la lipoprotéine lipase 8837 Foie

C-III ? Inhibition de la lipoprotéine 8764 Foie


lipase

D Activation de la lipoprotéine lipase; 22100 ?


transfert des lipides

E-II ? 38000 Foie

E-III Clairance de lřIDL 38000 Foie

E-IV Clairance de lřIDL 39500 Foie

2.3.6.3.2. Les lipoprotéines


Cours de Biologie Clinique | 100
Les propriétés physiques et chimiques diverses de la lipoprotéine
permettent des définitions opérationnelles basées sur leurs tailles, leurs
densités, et leurs mobilités électrophorétiques (Tableau VIII).

Les fonctions physiologiques de la lipoprotéine impliquent une série


de processus métaboliques complexes dans lesquels les échanges se
produisent sans interruption entre les diverses lipoprotéines. Ceci est
désigné sous la dénomination de cascade des lipoprotéines.

Tableau VIII : Classification et composition des lipoprotéines


humaines de sérum.

Paramètres Chylomicron VLDL IDL LDL HDL


Densité hydratée (g/ml) 0,93 0,97 1,003 1,034 1,121

densité dissolvante pour <1,006 <1,006 1,006-1,019 1,019-1,063 1,063-1,21


l'isolement (g/ml)

Poids moléculaire (0,4-30) x109 (5-10) x106 (3,9-4,8) x106 2,75 x 106 (3,6-1,75) x105

Diamètre (nm) >70,0 25,0-70,0 22,0-24,0 19,6-22,7 4-10

Mobilité Origine Pré-β Broad β(between β ά


électrophorétique (papier, Β and pré-β)
Agarose)

Composition (% par 8
poids)

Cholestérol non estérifié 2 5-8 22 13 6


Cholestérol estérifié 25
Phospholipide 5 11-14 30 39 13
Triglycéride 7 20-23 15 17 28
Protéine 84 44-60 11 3
2 4-11 20 50
Apoprotéines (%
apolipoprotéine totale)

A-I 7,4 Trace - - 67

A-II 4,2 Trace - - 22


Cours de Biologie Clinique | 101

B-100 Trace 36,9 50-70 98 Trace

B-48 22,5 Trace Trace - -

C-I,C-II,C-III 66 49,9 5-10 Trace 5-11

E-II, E-III, E-IV - 13,0 10-20 Trace 1-2

D - - - - Trace

Synthèse Intestin Foie, Intestin Intra Intra Intestin


vasculaire vasculaire Foie

Les lipides totaux sériques ont un taux compris entre 5 à 7 g/L.

2.3.6.3.3. Brève synthèse sur les lipoprotéines

Les lipoprotéines sont divisées en :

1. High Density Lipoproteins (HDL) constituées des


protéines (50%) et des lipides (50%) dont les phospholipides (50%), le
cholestérol (plus de 30%) et les triglycérides (moins de 10%).
Ils assurent transport des phospholipides du foie vers les tissus et
constituent le facteur de protection contre lřathérosclérose.

2. Low Density Lipoproteins (LDL) constituées de


protéines (20%) et des lipides (80%) dont le cholestérol libre et estérifié
(60%), phospholipides (20%), triglycérides (20%). Ils assurent le transport
de la plus grande partie du cholestérol et constituent le facteur de risque
élevé dřathérosclérose.

3. Very Low Density Lipoproteins (VLDL) constituées de


protéines et de lipides (90%) dont les triglycérides (plus de 50%).
- Ils assurent le transport des triglycérides ;
- Constituent un facteur de risque athérogène élevé.

4. Intermediary Density Lipoproteins(IDL) : après


lřhydrolyse de VLDL par la LPL, un IDL de courte durée, en partie épuisé
des tryglycérides, est formé. Un IDL contient une quantité égale de
cholestérol et des tryglycérides, et ses principales apoprotéines sont apo B et
E. Apo B détermine le processus catabolique continu (cascade) dřIDL à
LDL pour la prise et la dégradation hépatique, semblable à son rôle en ce
qui concerne des restes de chylomicrons.
Cours de Biologie Clinique | 102

5. Les chylomicrons présents dans le plasma sanguin dans


la période qui suit lřabsorption intestinale des graisses après un repas.

Ils sont constitués de 98% des lipides dont 90% des triglycérides et
10% des phospholipides.
- Transport des triglycérides vers le foie ;
- Risque athérogène faible.

2.3.6.4. Etude des lipoprotéines

Lřétude détaillée des lipoprotéines peut se faire par fractionnement


en deux étapes :
- Précipitations fractionnées (lectines et polyanions) ;
- Electrophorèses.

2.3.6.4.1. Précipitations fractionnées (lectines et polyanions)

- Précipitation des fractions VLDL + LDL par la concanavaline, une


lectine (protéine) qui fixe spécifiquement la copule glucidique du bloc
VLDL + LDL, à lřexclusion des HDL.
- Précipitation spécifique du bloc VLDL + LDL par les polyanions
(polyéthylène-glycol-héparine + MnCl2-sulfate de dextran + MnCl2 ;
phosphotungstate + MgCl2).
Après dosage du cholestérol total et de la fraction cholestérol HDL
resté dans le surnageant, lřon peut estimer la valeur du cholestérol LDL par
la formule de Friedewald suivante :
Cholestérol LDL = cholestérol tot Ŕ triglycérides Ŕ cholestérol HDL
5
2.3.6.4.2. Electrophorèses de zone

Pratiquées au cas par cas, dès lors que les taux sériques de cholestérol
total ou triglycérides sont anormaux et quřil est nécessaire dřélucider
certaines situations complexes.
- Acétate de cellulose (classique, pas très précis) ;
- Gel dřagarose (meilleure séparation, plus délicate) ;
- Gel de polyacrylamide (support idéal, technique délicate) ;
- Couplage migration sur acétate de cellulose et révélation.

Le plus important est le rapport cholestérol total/ cholestérol HDL,


qui doit être voisin de 2,3-2,5 à 3 chez le sujet normal. Plus il augmente,
plus le risque dřathérome devient important.
Cours de Biologie Clinique | 103

2.3.6.5. Dosage des triglycérides sériques

Après un repas et absorption intestinale, les triglycérides passent des


entérocytes dans les chylifères, en constituant des chylomicrons qui
apparaissent dans le plasma, leur présence dans le sang rend lactescent le
plsma en post-prandiale ; cette lactescence disparaît dans les 6 heures par
lřaction de la lipoprotéine lipase.

Les triglycérides gagnent ensuite le foie où ils sont réorganisés en


VLDL, LDL et HDL, formes par lesquelles ils sont véhiculés vers les tissus.
Lřéquilibre triglycérides - acides gras dans le plasma sanguin est tributaire
des facteurs suivants :
- Intensité de la lipolyse des triglycérides (adényl-cyclase et de
lřAMP cyclique) ;
- Vitesse de reéstérification de lř α glycérophosphate dans les tissus
adipeux (à partir des glucides) ;
- Vitesse dřoxydation des acides gras au sein des tissus.
Cours de Biologie Clinique | 104

2.3.6.5.1. Intérêt clinique

Le dosage de cholestérol total et des triglycérides sont les principaux


paramètres du bilan lipidique. A pratiquer sur sérum ou plasma, le sujet
étant à jeun depuis au moins 10 heures. Si le taux est hors normes, doser le
cholestérol HDL, et si nécessaire, le LDL et autres fractions. Chez lřhomme
ayant un régime alimentaire équilibré, le taux normal est de 0,8 mmol à 20
ans ; ce taux sřélève lentement jusquřà 1mmol vers 50 ans. Chez la femme
ayant un régime alimentaire équilibré, la valeur normale est de 0,6 mmol à
20 ans, elle sřélève lentement jusquřà 0,8 mmol vers 50 ans.
Cours de Biologie Clinique | 105
Les facteurs suivants influençent la triglycidémie : ethnie ou hérédité
(élévation ou diminution), mode de vie (sédentarité ou exercices physiques),
habitudes alimentaires.

2.3.6.6. Dosage du cholestérol

Le cholestérol est lřun des paramètres les plus anciens dosés en


Biologie Clinique.
- Le cholestérol lié aux HDL est facilement excrété, entretient ainsi
un bon métabolisme, et est facteur de protection contre lřathérosclérose.
- Le cholestérol lié au bloc VLDL- LDL a tendance à stagner au
niveau des tissus et constitue le facteur athérogène majeur.

2.3.6.6.1. Origine du cholestérol plasmatique

- Exogène, provenant de lřalimentation : absorbé au niveau de


lřintestin en présence des glycérides et de sels biliaires ;
- Endogène, par biosynthèse : au niveau des hépatocytes, à partir de
lřacétylcoenzyme A.

2.3.6.6.2. Echantillon : sérum ou plasma

2.3.6.6.3. Valeurs normales

- Adulte, autour de 30 ans : 2,5 à 6,8 mmol, puis monte de 0,04


mmol chaque année dès 40 ans chez lřhomme, et de 0,025 chez la femme.
- Le rapport cholestérol total / cholestérol HDL doit être de 2,5 à 3.
- Facteurs : âge, sexe, régime alimentaire, ethnie.
2.3.6.6.4. Valeurs pathologiques

2.3.6.6.4.1. Hypocholestérolémie : Assez rare. Se rencontre


dans :
Cours de Biologie Clinique | 106
- Maladies métaboliques congénitales (maladie de Tangier : absence
de des α lipoprotéines HDL ou des β lipoprotéines VLDL-LDL) ;
- Grande insuffisance hépatocellulaire.

2.3.6.6.4.2. Hypercholestérolémies

2.3.6.6.4.2.1. Hypercholestérolémies primaires. Sont


congénitales :

-Hyperlipoprotéinémies à sérum clair, avec cholestérolémie élevée ;


-Hyperlipoprotéinémies à sérum lactescent avec triglycérides élevés :
> Rechercher les anomalies de lřéquilibre glycémique et de
lřuricémie ;
> Risque athérogène élevé et précoce, surtout dans le 1er cas.

2.3.6.6.4.2.2. Hypercholestérolémies secondaires

- Diabète sucré
- Myxoedème
- Goutte
- Pancréatites aigues et chroniques
- Néphrose lipoïdique

2.3.7. Dosage des lipides totaux

Le dosage des phospholipides ne constitue pas un examen de routine.


Il est demandé en cas de nécessité. La méthode gravimétrique serait la
meilleure méthode de dosage des lipides totaux, mais elle est longue et
laborieuse. Elle consiste à extraire les lipides du sérum par un solvant
organique, ensuite évaporer ce dernier et peser le résidu.

2.3.8. Dosage des enzymes sériques

2.3.8.1. Généralités sur les enzymes

2.3.8.1.1. Les propriétés enzymatiques et leur mesure

Les enzymes sont des protéines douées dřactivités catalytiques ; cette


propriété leur permet dřaugmenter la vitesse dřune réaction sans en modifier
lřéquilibre final. De plus, comme les catalyseurs métalliques, ils se
retrouvent à la fin de la réaction catalytique dans leur état initial.

Les enzymes étant de nature protéique, sont peu stables, mais ont une
spécificité dřaction du fait de lřaffinité que chaque enzyme a pour son
substrat, contrairement aux catalyseurs qui ne sont pas spécifiques. Cette
affinité conditionne lřévolution de la réaction catalysée par lřenzyme.
Cours de Biologie Clinique | 107

Représentation dřun système réactionnel simple utilisant un seul


substrat :

E : concentration de lřenzyme, S : celle du substrat, ES : celle du


complexe Enzyme-substrat, EP : celle du complexe Enzyme-produit, P :
celle du produit de la réaction ; tandis que K1, K2, K3 : sont des constantes
des diverses étapes de la transformation.

Les enzymes agissent, dans lřorganisme, à des concentrations très


faibles. Ceci rend difficile leur détermination en concentrations de masse ou
en concentrations de substance.

Dřautre part, une protéine enzymatique ne se différencie aisément


des autres protéines que par son activité enzymatique, cřest pourquoi, le
biologiste exprime sa concentration en termes de concentration catalytique.

Une quantité catalytique est en rapport avec K3 et représente la


vitesse de la réaction. Il faudra donc opérer dans les conditions telles que la
vitesse de réaction (mesurable) dépende de la concentration en enzyme (non
mesurable). Plusieurs facteurs sont susceptibles dřinfluencer la vitesse dřune
réaction catalysée par une enzyme, notamment :
- la durée de contact entre E et S ;
- la concentration en S dans le milieu réactionnel ;
- la concentration en E ;
- la T° de la réaction ;
- le pH du milieu ;
- la force ionique ;
- la nature du milieu tamponné.

La vitesse de réaction se mesure en dosant, après un certain temps


dřaction :
- soit le substrat restant ;
- soit lřun des produits de la réaction, et en rapportant le chiffre
trouvé à un certain volume de liquide biologique étudié.

Afin que la vitesse de la réaction ne dépende que de la concentration


en E, il est primordial que tous les facteurs susceptibles dřinfluencer la
vitesse soient strictement codifiés. Ces différents facteurs représentent ce
qui est appelé «la technique utilisée», et définissent lřunité de mesure de
lřactivité enzymatique.
Cours de Biologie Clinique | 108
2.3.8.1.2. Classification des techniques de mesure enzymatique

En général, la vitesse dřune réaction peut être déterminée en


mesurant la consommation du substrat par unité de temps ou encore la
vitesse dřapparition dřun produit de réaction par unité de temps.

1. méthodes basées sur la mesure de la vitesse de disparition


dřun substrat, cřest par exemple : amylases, LDH (lactase déshydrogénase) ;
2. méthodes basées sur la mesure de la vitesse dřapparition
dřun produit.
Dans ce groupe il y a des méthodes directes et indirectes. Elles sont
plus satisfaisantes, car elles mesurent lřapparition dřun produit de réaction.
Les techniques utilisées pour ce faire sont la photométrie, la titrimétrie, la
radioimmunologie, la fluorimétrie.

Exemples dřenzymes : phosphatases, transaminases, créatine-kinase,


ornithine-carbano-1-transférase, lactate déshydrogénase, aldolase, méthodes
cinétiques utilisant les nicotinamides-adénine-dinucléotides réduits ou
oxydés (NAD+, NADH, H+).

Intervention des NAD+, NADH, H+

Les formes réduites de ces co-enzymes des déshydrogénases


présentent un pic dřabsorption à 340 nm. Celui-ci disparaît quand le co-
enzyme est oxydé.
Il est donc facile de suivre la conversion de la forme oxydée en forme
réduite ou vice-versa, par une simple mesure de la variation de lřabsorbance
à 340 nm. Ce principe est utilisé pour la mesure de la LDH qui catalyse la
réaction suivante :

Il est possible de coupler à NAD oxydé ou réduit une réaction


dřoxydo-réduction dite « une réaction indicatrice » pour doser une activité
enzymatique qui ne fait pas intervenir de NAD.
E1 : enzyme dont on veut mesurer lřactivité, E2 : déshydrogénase à
NADH, H+ active sur B :
E1 E2
A< ― > B+NADH, H+ < ―> BH+NAD+

Les avantages des réactions couplées :


Cours de Biologie Clinique | 109
1. lřéquilibre de la première réaction est déplacé en
consommant le produit ;
2. le test peut être étendu à de nombreux cas.
Ainsi le pyruvate kinase, le fructose 1,6-diphosphate aldolase,
lřalanine 2-oxo-glutarate aminotransférase (ALAT), peuvent être dosées par
une réaction couplée à NAD.
L-aspartate + 2-oxo-glutarate < ― > oxalo-acétate + glutamate
Oxalo-acétate + NADH, H+ < ― > L-malate + NAD+
3. Méthode des hydrazones :
La méthode des hydrazones est appliquée aux réactions
enzymatiques au cours desquelles se produit lřapparition ou la disparition
dřun acide α-cétonique (ou les deux à la fois).
La 2,4-dinitrophénylhydrazine se combine avec la fonction cétonique
et bloque la réaction enzymatique. Lřhydrazone formé possède un spectre
dřabsorption caractéristique.
La quantité dřacide α-cétonique disparue ou formée au cours de la
réaction est déduite de la densité optique.

Ac. α-cétonique + 2,4-dinitrophénylhydrazine = hydrazone

Cette réaction est utilisée pour la détermination des transaminases


Un second type de méthodes consiste à transformer, par une réaction
secondaire, généralement enzymatique, lřun des produits de la première
réaction en un constituant possédant une fonction α-cétonique et capable de
donner une hydrazone.

On sřarrange pour que la réaction C en Cřait une vitesse très grande


et que la quantité de Cř formé (mesuré par lřhydrazone) permette de calculer
lřactivité de lřenzyme à doser. Cřest par cette méthode que sont dosées les
aldolases.

2.3.8.1.3. Expression de l’activité enzymatique

Après lřunité internationale (UI), le katal est devenu lřunité des


activités enzymatiques, et a été définie précédemment.

2.3.8.2. Etude particulière des enzymes

2.3.8.2.1. Transaminases ou Aminophérases


Cours de Biologie Clinique | 110
2.3.8.2.1.1. Définition et généralités

Le pocessus combiné de désamination et d'amination dans lequel le


groupe amine d'un acide aminé est transféré d'une façon réversible à un
acide α-cétonique et le groupe α-cétonique à l'acide aminé s'appelle
"TRANSAMINATION". Une enzyme qui catalyse cette réaction est appelée
"TRANSAMINASE" ou "AMINOPHERASE".
Ce type de réaction est connu depuis plusieurs années dans le
métabolisme cellulaire. L'importance clinique n'est connue que depuis 1954
par les travaux de LA DUE, WROBLEWSKI et KARMEN qui avaient
constaté, dans les cas d'occlusion coronarienne, une augmentation de la
transaminase glutamo-oxalo-acétique.
COOH COOH
│ │
CH2 CH2
│ │
CH2 R CH2 R R
│ │ │ Enzyme │ │
C = O + H2 N - H C <══════>H C-NH2 + O=C
│ Amine │ │ │
COOH COOH COOH COOH
Ac. α- céto- glutarique Ac.α-aminé Acide glutamique Acide α- cétonique

Selon l'acide aminé réagissant avec l'acide α-cétoglutarique, on appellera l'enzyme : Alanine-
cétoglutarate transaminase ; Valine-cétoglutamate transaminase, etc...

Cependant, on les nomme encore souvent à l'envers : Glutamate Oxalo-


acétate ouTransaminase (GOT), Glutamate Pyruvate Transaminase (GPT).

Le sérum humain contient différentes sortes de transaminases. Les plus


communément dosées sont la GOT et la GPT qui catalysent les réactions
suivantes :

a) COOH COOH
│ │
CH2 COOH CH2 COOH
│ │ │ │
CH2 CH2 CH2 CH2
│ │ T.G.O │ │
C=O + H2N-C H ---------------->H C-NH2 + C=O
│ │ │ │
COOH COOH COOH COOH
Ac. α-céto glutarique Ac. aspartique Ac. glutamique Ac.oxalo-acétique

Acide aminé utilisé acide cétonique produit.


Cours de Biologie Clinique | 111
b) COOH COOH
│ │
CH2 CH2
│ │
CH2 CH2 CH2 CH3
│ │ T.G.P │ │
C=O + HC-NH2 ─────> HC - NH2 + C
│ │ │ │
COOH COOH COOH COOH
Ac. α-cétoglutarique Alanine Ac. glutamique Ac. Pyruvique

Acide aminé utilisé

Ces deux transaminases ont une significaction particulière en pathologie


hépatique et cardiaque.

2.3.8.2.1.2. Répartition : La GOT est particulièrement abondante


dans le foie, le muscle strié ou cardiaque et le rein. La TGP se retrouve électivement
dans le foie.

2.3.8.2.1.3. Méthodes de dosage

De nombreuses méthodes de dosage ont été proposées. Il est évident


que l'on peut doser l'une des 4 composantes de la réaction. En fait, les
méthodes employées consistent soit à doser l'acide glutamique formé, soit à
évaluer directement ou indirectement l'acide oxalo-acétique ou l'acide
pyruvique.
Les méthodes de dosage de l'acide pyruvique sont colorimétriques, elles
sont délicates et peu utilisées. Les méthodes de détermination des acides
cétoniques sont de deux sortes :
- les méthodes aux hydrazones ;
- les méthodes spectrophotométriques utilisant un nucléotide
pyridinique.

a. Méthode des hydrazones: REITMAN- FRANKEL

E1
- acide aspartique + ac.α-cétoglutarique <════> ac. Glutamique + ac. oxalo-acétique.
E2
COOH COOH
│ │
CH2 CH2
│ │
C-O + H2 N - NH C6 H3 (NO2)2 -------> C = N - NH - C6H3(NO2)2
│ │
Cours de Biologie Clinique | 112
COOH COOH
Ac.oxalo-acétique + 2,4dinitrophénylhydrazine HYDRAZONE del'oxalo- acétate

- alanine + ac.α-cétoglutarique<═══>ac.glutamique + ac. Pyruvique

CH3 CH2
│ │
C=O + H2 N - NH C6 H3 (NO2)2 C = N - NH - C6H3(NO2)2
│ │
COOH COOH
Ac.Oxalo-cétique + 2, 4dinitrophénylhydrazine HYDRAZONE de l'acide pyruvique

L'hydrazone formée est estimée au photomètre à 546 nm. La densité


optique obtenue permet de déduire l'activité enzymatique.
Figures 33, 34, 35, 36 : Structures chimiques des transaminases et
différentes réactions de transamination.

b. Méthode utilisant un nucléotide pyridinique : KARMEN

On étudie les variations de la densité optique à 340 nm soit au cours de


la réduction de l'acide oxalo-acétique par la malicodéshydrogénase(MDH) en
présence de NADH, H+, soit au cours de la réduction de l'acide pyruvique par
la lacticodéshydrogénase(LDH) en présence de NADH, H+.

MDH
Ac. oxalo-acétique + NADH, H+<════════> Ac. malique + NAD+

LDH
Ac. pyruvique + NADH, H+<════════> Ac. lactique + NAD+

2.3.8.2.1.4. Variations physiologiques

Les valeurs normales sont comprises pour la TGO entre 5-28


milliunités/ml, et pour la TGP entre 4-26 milliunités/ml. Dans notre laboratoire,
nous utilisons la méthode de REITMAN-FRANKEL qui a été adaptée par la
firme SIGMA. Et les valeurs considérées comme normales par cette méthode
sont inférieures à 45 USF/ml pour la TGP et inférieures 55 USF/ml pour la
TGO.

N.B. : USF : Unités SIGMA Frankel.

2.3.8.2.1.5. Intérêt clinique

L'intérêt clinique du dosage des transaminases est dominé par le


problème de l'infarctus du myocarde et des affections hépatiques.
Cours de Biologie Clinique | 113

a) Infarctus du myocarde

La lésion tissulaire permet la diffusion des enzymes dans le sang.


L'augmentation de la TGO est très nette dans 90-95 % des cas. Elle débute à la
6è heure, est maximale entre 24è et 48è heure et retourne à la normale en 4 ou
5 jours.

Des études statistiques réalisées chez des sujets décédés à la suite


d'infarctus ont montré que les perturbations de la TGO sont plus fréquentes
(97% des cas) que celles de l'ECG (8% des cas). Il existe une certaine
proportionnalité entre le degré d'augmentation et l'extension des lésions.

Toutefois, il faut savoir que l'augmentation de la TGO n'est pas


spécifique de l'infarctus du myocarde (augmentation modérée au cours des
embolies pulmonaires, des infarctus rénaux, etc...). Au cours des embolies
pulmonaires, les augmentations se rencontrent dans 25 % des cas, débutent
seulement le 3è ou le 4è jour.

Le dosage de la TGO est intéressant pour l'établissement du diagnostic


de l'infarctus du myocarde (augmentation), puisque les taux sont normaux au
cours des phénomènes angineux purs. Il est surtout intéressant de la demander
lorsque les signes électriques sont discrets ou discutables. De plus, la
découverte d'un taux très élevé de TGO chez un malade suspect d'infarctus
permet de situer l'âge de la lésion entre la 6ème et la 48ème heure. Enfin, en
cas de rechute, le taux de TGO s'élève de nouveau.

b) Hépatites aiguës

Dans la majorité des cas d'hépatite, on observe dans la première


semaine, de l'ictère et une augmentation nette des 2 transaminases (TGO et
TGP). Il est important d'établir le rapport TGO/TGP qui, normalement, est égal
à 1,6; s'inverse au cours des hépatites, parce que le taux de la TGP est supérieur
à celui de TGO. Ceci reflète la nécrose de la cellule hépatique et les
modifications de la perméabilité de la membrane cellulaire qui libère son
contenu enzymatique dans la circulation. Le retour à la normale de la TGP se
situe aux environs de la 3è semaine. Dans les formes anictériques, l'élévation
est également notable.

c) Autres affections

-Dans un syndrome de cholostase avec ictère, les transaminases sont


peu modifiées ;
-Dans les cirrhoses décompensées à bilirubinémie exagérée et les
cancers du foie, les transaminases sont modérément augmentées ;
Cours de Biologie Clinique | 114
-Les attritions traumatiques (opération à coeur ouvert, amputations), la
gangrène des membres, entraînent habituellement une augmentation du taux
des transaminases, spécialement la TGO. Le ramollissement cérébral
également ;
-Dans tout infarctus viscéral, rupture d'anévrisme aortique.

2.3.8.2.1.6. Les phosphatases

2.3.8.2.1.6.1. Définition et généralités

On groupe sous le nom de "phosphatases" un certain nombre


d'hydrolases qui libèrent de l'acide phosphorique à partir de divers substrats
phosphoxydés. Dans la plupart des cas, le terme de phosphatases est utilisé
pour désigner des phosphomonoestérases à large spécificité qui hydrolisent les
monoesters de l'acide phosphorique et de polyols (glycérophosphates) ou de
phénols (phénylphosphates).

Les phosphomonoestérases peuvent être divisées en 4 catégories qui


hydrolysent les mêmes substrats ; mais à des pH d'action différents "enzymes
ésodynames" de type I, II, III et IV. Leurs principales propriétés sont
rassemblées dans le tableau IX.

Tableau IX : Principales propriétés de différents types des phosphatases.

TYPES ORIGINES ACTIVATEURS INHIBITEURS ZONE DE pH


PRINCIPALES PRINCIPAUX PRINCIPAUX D'ACTI°
I zone de 7,5 - 9,4
Phosphatases croissance des os,
Alcalines:PAL rein, muqueuse Mg++ CN-
intestinale, foie,
glandes
mammaires,
placenta
Phosph II Prostate, Foie - F- 5,0 - 6,0
-atases III Foie - Mg++ 3,4 - 5,5
Acides Hématies Mg++ Cu++ 5,0 - 6,5
IV plaquettes Formol

Dans le sérum sanguin, on trouve une phosphatase de type I ou


"phosphatase de type II, appelée "phosphatase acide". Des traces de
phosphatase de type IV peuvent provenir des hématies.

2.3.8.2.1.6.2. Répartition
Cours de Biologie Clinique | 115
Les phosphatases de type I existent dans la plupart des cellules et plus
particulièrement dans les zones de croissance de l'os, le foie, la muqueuse
intestinale, la glande mammaire et le placenta. Le sang n'est qu'un lieu de
passage de l'enzyme avant son élimination par le foie dans la bile. Le plasma
normal n'en contient qu'en faible quantité.

Les phosphatases de types II, III et IV sont des phosphatases acides


dont le pH optimum est entre 3 - 6. On les trouve en particulier dans la prostate
et le foie, et on en décèle une faible quantité dans le plasma. L'enzyme
prostatique appartient au type II, tandis que les phosphatases de type IV sont
rencontrées essentiellement dans les hématies et les plaquettes.

a) Phosphatases alcalines ou PAL

Les phosphatases alcalines figurent parmi les premières enzymes dont


l'étude se soit répandue en pratique courante. Les méthodes de dosage sont
nombreuses mais, reposent sur le même principe.

- Principe

Le sérum est mis en présence d'un ester phosphorique dans des


conditions rigoureuses de pH, de temps d'incubation avec le substrat. On dose
ensuite soit
- l'acide phosphorique apparu, soit
- l'ester libéré.
OH
I PAL
R-O R - OH + H3 PO4
" OH
O
Monoester de l'acide phosphorique Ester ac.phosphorique.

Le gros du problème est le choix du substrat.

- Méthode de Bodansky

On dose du phosphate libéré par hydrolyse à 37°C à partir du


glycérophosphate de Na, à pH 8,75. Les résultats sont exprimés en unité
Bodansky = nombre de mg de phosphates inogarniques libérés par 100 ml de
serum, pendant une heure à 37°C.

- Méthode de King et Armstrong


Cours de Biologie Clinique | 116
Dosage du phénol libéré à 37°C et à pH 9,8 à partir du
phénylphosphate. Les résultats sont exprimés en unités King et Armstrong =
nombre de mg de phénol libéré par 100 ml de sérum pendant 30 minutes à
37°C.

- Méthode de Babson

Hydrolyse de l'ester phosphorique de phénolphtaléine et dosage


colorimétrique de la phénolphtaléine, en milieu alcalin.

- Méthode de King et Kind

Le phénol libéré par hydrolyse enzymatique à pH 10,0 à partir du


phénylphosphate disodique est dosé par la 4-amino-antipyrine et le ferricyanure
de K. Il y a formation en milieu alcalin d'une quinone rouge.

- Méthode de Bessey Lowry

L'hydrolyse enzymatique du paranitrophényl phosphate disodique


incolore libère un sel jaune de paranitrophénol. Les résultats sont exprimés en
unités Bessey Lowry ou unités PNP (paranitrophényl phosphate).

- Variations pathologiques

1° Affections hépatiques

Le dosage de la phosphatase alcaline est indispensable dans


l'exploration de la cholostase. Son élévation importante est un excellent signe
en faveur d'une obstruction de la voie biliaire principale. Des augmentations
moins importantes sont également notées au cours de diverses maladies du foie
(cancer, cirrhose, granulomatose, schistosomiase, fibrose hépatique
congénitale, cirrhose biliaire, hépatites, foie cardiaque, etc...).

Si au cours d'un ictère, la phosphatasémie alcaline est normale, il y a


95% de chance pour qu'il soit dû à une cirrhose ou à une hépatite, et moins de
5% pour qu'il soit dû à une origine obstructive. Si la phosphatasémie est
modérément augmentée, cette élévation est peu significative pour le diagnostic
étiologique de l'ictère. Si lřhyperphosphatasémie est supérieure au double de la
valeur normale, il s'agit dans 90% des cas d'une occlusion extrahépatique, dans
7% d'une cirrhose et dans 3% des cas d'une hépatite. Les taux sont normaux
dans les ictères hémolytiques.

Bref, les taux normaux permettent toujours d'exclure l'obstruction, les


taux très élevés sont en faveur de celle-ci. Il n'y a pas de proportionnalité entre
Cours de Biologie Clinique | 117
l'hyperbilirubinémie et phosphatasémie. Par contre, dans les cancers
secondaires du foie, il semble y avoir une certaine proportionnalité entre le taux
des PAL et le volume de la tumeur.

N.B. : PAL (Phosphatase Alcaline) ; PAC (Phosphatase Acide).

- Valeurs normales : méthode de Bessey Lowry.


- Adulte : 1- 3,0 Unités Bessey Lowry ou PNP ;
- Enfants : 2,8 - 6,7 Unités Bessey Lowry ou PNP.

L'unité PNP ou Bessey Lowry correspond à la quantité d'enzyme


contenu dans 1000 ml de sérum, qui libère en une heure et à 37°C une
micromole de paranitrophénol. Cette unité ne correspond nullement à l'unité
internationale. Il s'agit d'une unité conventionnelle.

2° Affections osseuses

- Ostéomalacie (trouble de l'assimilation phosphocalcique) :


hyperphosphatasémie alcaline avec hypocalcémie et hypophosphorémie.
- Ostéoporose (maladie de la trame osseuse) : bilan phosphocalcique
normal.
- Rachitisme par carence en vitamine D : le taux des PAL est souvent
augmenté. L'augmentation n'est toujours pas proportionnelle à la gravité de la
maladie. Dans les cas de rachitisme normocalcémique et
normophosphorémique, la phosphatasémie alcaline peut être abaissée.
- Rachitisme vitamino-résistant idiopathique : les PAL sont augmentées
dans 80% des cas.
- Le syndrome de Toni-Debré-Fanconi et dans l'acidose tubulaire
chronique, le taux est normal ou peu augmenté.
NB : Le syndrome de Toni-Debré-Fanconi est caractérisé par : une
protéinurie non sélective dite tubulaire, une hyperamino-acidurie, une
hypercalciurie et une glycosurie. Il peut être secondaire à une intolérance
héréditaire au fructose, une cystinose, une galactosémie, une glycogénose, une
tyrosinémie.
- Les élévations les plus caractéristiques des PAL s'observent au cours
de la maladie de Paget avec C++ et P4- normaux.
- Maladie de Ricklinghausen (hyperparathyroïdie avec ostéite) : le taux
des PAL est très augmenté.
- Dans les cancers secondaires (ostéolytiques) : les PAL sont nettement
augmentées.

b) Phosphatases acides ou PAC

Le principe de dosage des phosphatases acides est le même que pour les
phosphatases alcalines, à la seule différence que l'on opère en milieu acide.
Cours de Biologie Clinique | 118
Toutes les méthodes citées plus haut peuvent donc être utilisées à condition de
travailler en tampon acide.

-Variations pathologiques

Le dosage de la phosphatasémie acide trouve son intérêt surtout dans


l'exploration des maladies de la prostate. La phosphatase acide dosée au cours
du cancer de la prostate est fortement inhibée par la L-tartrate. Etant donné que
la L-tartrate inhibe l'activité de la phosphatase acide prostatique. On peut faire
le dosage avec et sans L-tartrale ; la différence correspond à l'activité
phosphatasique prostatique.

En l'absence de métastases osseuses, les phosphatases acides totales


sont très souvent normales. Si les métastases existent, l'augmentation est de 5 à
100 fois les valeurs normales.
- Valeurs normales

1° Adultes : 0,13 - 0,63 U Bessey Lowry


2° Enfants: 0,70 - 1,10 U Bessey Lowry

2.3.8.2.2. Amylases

2.3.8.2.2.1. Définition et généralités

Les amylases sont des enzymes qui hydrolysent l'amidon en donnant


naissance à des dextrines, du maltose et finalement du glucose.

On distingue 2 types d'amylases :

1° Les α-amylases ou DEXTRINOGENES AMYLASES ou ENDO-


AMYLASES. Ce type d'enzymes attaque d'abord la chaîne d'amidon vers le
milieu, en libérant des dextrines ; les deux principaux représentants sont
l'amylase salivaire et l'amylase pancréatique. Ces sécrétions peuvent être plus
ou moins abondantes selon l'intégrité des glandes qui les produisent. Une partie
de l'amylase sécrétée passe dans le sang, puis dans les urines. D'où l'intérêt de
son dosage en chimie clinique.

2° Les βamylases ou SACCHAROGENES AMYLASES. Ce type


d'enzymes décrochent dès le début le maltose des extrémités non réductrices ;
la plus importante des -amylases est la diastase ou amylases d'orge germé.
Elles ne représentent d'intérêt que par leur emploi en diététique.
Le dosage des amylases peut s'effectuer de 2 manières :

1) Par disparition de la coloration bleue due à l'iode, donc par


une méthode dérivée de celle de WOHLGEMUTH.
Cours de Biologie Clinique | 119
2) Par dosage des substances réductrices produites, celles-ci
pouvant être appréciées par une technique dérivée de la méthode de FOLIN-
WU ou par une application de la méthode de BAUDOIN et LEWIN.

2.3.8.2.2.2. Principe

Le sérum ou l'urine sont incubés à 37°C en présence d'amidon. La


diminution de la coloration bleue prise par l'amidon au contact d'une solution
d'iode mesure l'activité amylolytique de l'amylase. Cette activité est apprécié à
640 nm.

2.3.8.2.2.3. Valeurs normales

- Sérum: 37,5 - 133 US (Unités Somogyi)


- Urine: 25 - 98,5 US (Unités Somogyi).

2.3.8.2.2.4. Variations pathologiques

a) Pancréatites aiguës hémorragiques

L'hyperamylasémie est très nette au début de la maladie et revient à la


normale en quelques jours (2 à 8 jours).
L'amylasurie est initialement faible et s'élève progressivement et revient
à la normale en 10 à 15 jours.

b) Syndrômes douloureux abdominaux extrapancréatiques

Cholécystites, ulcères gastroduodénaux perforés, occlusions du grêle,


appendicite aiguë, grossesse extra-utérine, rupture de la rate. On observe une
élévation possible de l'amylasémie.

c) Autres affections pancréatiques

Augmentation légère dans 50% des cas de pancréatite chronique, dans


certains cas de cancer du pancréas et de la lithiase pancréatique.
d) Parotidites

L'hyperamylasémie d'origine parotidienne permet le dépistage des


oreillons.

2.3.8.2.3. Les aldolases

2.3.8.2.3.1. Définition et généralités


Cours de Biologie Clinique | 120
Ce sont des enzymes sériques qui interviennent dans la glycolyse ; ils
dégradent en scindant le fructose 1,6 diphosphate en deux trioses phosphate qui
sont le dihydroxyacétone phosphate et le phosphoglycéraldéhyde ;

2.3.8.2.3.2. Variétés et répartitions

Les aldolases ont trois variétés dřisoenzymes selon la région ou lřorgane


où elles sont plus abondantes :
- Lřaldolase musculaire dite A;
- Lřaldolase hépatique dite B;
- Lřaldolase du cerveau dite C.
Il est à noter que la concentration des aldolases étant plus élevée dans
les tissus que dans les sérums, le taux sérique augmente en cas de
destruction tissulaire, surtout musculaire.

2.3.8.2.3.3. Méthodes de dosage

Réaction:

Substrat F-1,6-diP + Sérum du malade contenant aldolase

Aldolase
↓ 3-PdiOH-acétone+NADH2 + glycérol
F-1,6-diP + Sérum → 2 trioses
NAD+glycérophosphate

On évalue lřactivité catalytique de lřenzyme (= reflet de sa


concentration sérique) dans des conditions très précises, en particulier de p H
et de température.
Il existe deux principales méthodes de dosage :
1. Méthode colorimétrique en temps fixé ou à point final ;
2. Méthode cinétique.

Lecture au spectroscope à 240 nm (détection du NAD). La DO est


proportionnelle à la quantité dřaldolase sérique.

Valeurs normales : < 3,1 U/L à 25°C.

2.3.8.2.3.4. Variations pathologiques

Augmentation:
Affections musculaires : Myopathies (de Duchenne), Myosite.
Rarement dans les myasthénies ou les séquelles de la poliomyélite ;
Affections hépatiques : Hépatite aiguë, Hépatome, et rarement dans
la cholestase et la cirrhose de foie ;
Cours de Biologie Clinique | 121
Lřinfarctus du myocarde;
Autres affections : Intolérance au fructose (déficit génétique en
aldolase), Trichinose, Brûlure, Hémolyse, Pancréatite, Leucémies, Cancers.

2.3.8.2.3.5. Intérêt clinique

Le dosage des aldolases ont pour but de diagnostiquer une lésion


tissulaire, en particulier musculaire. Le recours aux isoenzymes permet de
signaler lřorigine de la lésion. De plus, on peut utiliser le profil enzymatique
dřun organe grâce au dosage de plusieurs isoenzymes. Mais il est à noter
que ce dosage nřest pas plus spécifique que celui des CPK (Créatine-
Phospho-Kinase). Et le manque de spécificité et de sensibilité de ce
marqueur en clinique, a limité lřintérêt de son dosage biologique.

2.3.8.2.4. Créatine phosphokinase(CPK)

2.3.8.2.4.1. Définition et généralités

Cřest une enzyme musculaire présente essentiellement dans le


muscle strié, mais aussi dans le cerveau. Elle catalyse la réaction suivante :
CPK
Créatine + ATP → Créatine-Phosphate + ADP

2.3.8.2.4.2. Répartition

Elle est constituée par trois isoenzymes : - MM ou CPK1→ dans le


muscle squelettique ;
- MB ou CPK2→ dans le myocarde ;
- BB ou CPK3→ dans le tissu cérébral.

2.3.8.2.4.3. Méthodes de dosage

Substrat + NADH → Produit + NADPH++


Le dosage global sřest toujours fait par spectrophotométrie à λ= 340
nm, on suit NADPH, dont lřintensité ou la vitesse dřapparition est
proportionnelle à lřactivité CPK initiale.
Pour les isoenzymes, on passe par la neutralisation de lřautre
isoenzyme par un acide spécifique.
Deux méthodes principales de dosage concernant les isoenzymes
sont actuellement utilisées :
- Immuno-inhibition (1)
- Immunométrie (2)

Principes: (1) Immuno-inhibition:


Cours de Biologie Clinique | 122
- inhibition spécifique de la sous-unité M par un anticorps
spécifique ;
- mesure de lřactivité B résiduelle (puisque M est inhibé).
Cette activité est multipliée par 2 pour quantifier la CKMB.
Cette technique est largement utilisée.

(2) Immunométrie :
Elle mesure la CKMB en tant que protéine (et non par le truchement
de son activité). Deux anticorps sont utilisés:
- un anticorps monoclonal anti CKMB fixé sur un support solide, en
ajoutant le sérum malade, des complexes CKMB/antiCKMB se fixent sur le
support ;
- lavage;
- ajout dřun autre anticorps monoclonal spécifique dřun autre
épitope, cet anticorps est marqué à un traceur type fluorescent ;
- lavage;
- mesure du signal lumineux directement proportionnel à la quantité
dřenzyme.
La lecture se fait toujours à 340 nm, et on observe une augmentation
de la DO. La réaction se fait en présence du glutathion qui protège lřenzyme
de sa dégradation.

2.3.8.2.4.4. Valeurs normales : Chez lřhomme : 10 Ŕ 195


U/L
Chez la femme : 10 Ŕ 170 U/L
BB : absente
MB: 0 Ŕ 6%
MM: 97 Ŕ 100%

2.3.8.2.4.5. Variations pathologiques

Augmentation : Infarctus du myocarde, affections musculaires


(myopathie de Duchenne, myosite ou dermatomyosite), hyperthermie
maligne, rupture de la barrière hémato-méningée, syndromes néoplasiques
de nature variée (hépatomes, cancers rectaux, bronchique, pancréatique…).

2.3.8.2.4.6. Intérêt clinique

-Cette enzyme possède un rôle fondamental dans la contraction


musculaire, en constituant des réserves en énergie pouvant être directement
utilisable dans la cellule.
-Elle aide au diagnostic de lřinfarctus du myocarde, et des
myopathies.

2.3.8.2.5. Lactate-Déshydrgénases(LDH)
Cours de Biologie Clinique | 123
2.3.8.2.5.1. Définition et généralités

Ce sont des enzymes cytoplasmiques catalysant les réactions de


réduction céto-acides en acide-alcool, notamment :
CH3-CO-COOH ← LDH →CH3-CHOH-COOH
Pyruvate L-Lactate
Double flèches de Lactate vers les 2 nucléotides
NADH NAD

2.3.8.2.5.2. Répartition

La LDH est présente dans de nombreux tissus, ainsi que chez le


fœtus. Elle nřest pas spécifique. Elle possède 5 isoenzymes dont certaines
sont un peu plus spécifique que dřautres, à dřautres organes. Les organes les
plus riches en LDH sont, par ordre décroissant : les muscles squelettiques, le
foie, les reins, le myocarde, les ganglions lymphatiques, la rate, le cortex
cérébral et cérébelleux, l'estomac, le pancréas, les hématies.
Lřactivité globale de la LDH résulte de la somme des cinq
isoenzymes différentes.

Tableau X : Isoenzymes des LDH et leurs localisations.

Isoenzymes Organes de localisation Proportion


LDH 1 Cœur (surtout), cerveau, 30 Ŕ 35 %
(hydroxybutyrate Rein, Hématies
déshydrogénase)
LDH2 Non spécifique 35 Ŕ 40 %
LDH3 Poumons 17 Ŕ 23%
LDH4 Poumons 0 Ŕ 7%
LDH5 Foie & Muscles 0 Ŕ 9%
squelettiques

2.3.8.2.5.3. Méthodes de dosage

La LDH catalyse la réduction de lřacide pyruvique en présence de


NAD en acide lactique.
Méthode utilisée : Spectrophotométrie : on lit, à 340 nm, la
diminution de la DO.
Valeurs Normales : 210 à 420 U/L à 37°C.
Pour les isoenzymes, cřest la méthode électrophorétique ou la
chromatographie qui est utilisée.

2.3.8.2.5.4. Variations pathologiques


Cours de Biologie Clinique | 124
Augmentation : - Infarctus du Myocarde (surtout les 24 premières
heures, cela, pendant 7-10jrs);
- Affections musculaires;
- Hépatites (90%) et autres pathologies hépatiques ;
- Certaines tumeurs.
Il faut noter que ces valeurs sont naturellement plus élevées chez le
nouveau-né et le jeune enfant.

2.3.8.2.5.5. Intérêt clinique

Compte tenu de l'universalité de la répartition de cette enzyme dans


les tissus de l'organisme, son augmentation ne sert le plus souvent qu'à
indiquer que le patient souffre d'une maladie à évolution active. Le recours
aux isoenzymes est nécessaire pour être sûr de lřorigine de la pathologie.

Dans lřinfarctus du myocarde, LDH1 sřélève jusquřà être supérieur à


LDH2. Elle augmente dans 90% des cas, 12h après le début de la maladie et
atteint son maximum à 2 à 3 jours après le début clinique. Son taux reste
augmenté 12 jours après lřinfarctus. Cřest donc un marqueur clinique de
lřinfarctus.
Dans lřhépatite virale, la LDH5 augmente très fortement et peut
alors représenter 50% de la LDH totale. La LDH4 subit une petite
augmentation. La LDH5 peut rester élevée plusieurs mois après lřatteinte
hépatique. Sa normalisation est signe de guérison.
Augmentation:
- Concomitante des LDH 2, 3,4 : Néoplasies (comme les leucémies et
les lymphomes. Leurs dosages répétés permettent d'avoir une bonne idée de
l'évolution de ces maladies ;
- LDH1, 2 : Biermer, crise hémolytique ;
- LDH 4 : Cancer du sein, des poumons.
Dans les syndromes néphrotiques ou les insuffisances rénales aiguës,
la LDH globale est presque toujours très élevée et, dans les
homotransplantations (greffe rénale), l'élévation de la LDH est d'autant plus
importante que la greffe est mal tolérée. Enfin, de nombreuses autres
affections peuvent augmenter de façon significative la LDH : opérations et
accidents qui détruisent du tissu musculaire, anémie pernicieuse, MNI
(mononucléose infectieuse), et tous les cancers.

2.3.9. Dosage des urates plasmatique et urinaires

2.3.9.1. Echantillons : plasma ou sérum, urines

2.3.9.2. Types de méthodes


Cours de Biologie Clinique | 125
- Chimique manuelle (Caraway) : en milieu alcalin, lřacide urique
réduit le complexe phosphotungstate en phosphotungsteux, complexe bleu
lu à 640 nm ;
- Enzymatique, automatisable en flux continu (uricase)

Lřaction de lřuricase sur lřacide urique produit de lřH2O2 qui est


oxydé en 2H2O en présence de la peroxydase et dřun chromogène qui se
colore.

2.3.9.3. Valeurs de l’uricémie

2.3.9.3.1. Valeurs normales : 2,6 - 7,5mg/dl ou 154,7- 446,3μmol/L

2.3.9.3.2. Variations physiologiques

Uricémie
- après un repas, se produit une élévation transitoire -le taux de
lřacide urique dans le plasma est un peu plus élevé chez lřhomme (300 ± 60
µmol contre 240 ± 60µmol chez la femme) ;

Uricurie
- difficile à définir, car varie avec lřalimentation : valeurs comprises
entre 3,6 et 4,8 mmol.

2.3.9.4. Diagnostic d’une hyperuricémie

Mécanismes

- hyperpurinosynthèse endogène;
- trouble de lřurino-élimination rénale.

2.3.9.5. Types d’hyperuricémie

1-hyperuricémie idiopathique primitive : la goutte primitive,


héréditaire et familiale, touche le sexe masculin à 90%.
Clinique : goutte typique ou atypique
- tophi (dépots uratiques sous-cutanés) ;
- arthropathies;
- complications: *athérosclérose;
Cours de Biologie Clinique | 126
*lithiase rénale +IR (Insufisance Rénale).

2-Encéphalopathie hyperuricémique de Nyhan-Lesch : la goutte


enzymopathique :
- maladie congénitale rare du nourrisson mâle ;
- déficit tissulaire de lřhypoxanthine-guanine-phosphoribosyl-
transférase (HGPT) ;
- hyperuricémie et hyperuricurie très élevées ;
- signes nerveux : retard mental, agitation…;
- complications : goutte, lithiase urique, IR.

Forme clinique de lřadulte jeune :


- déficit incomplet de lřHGPT;
- goutte précoce et sévère;
- hyperuricurie et lithiase rénale;
- troubles nerveux plus ou moins graves.

3-les hyperuricémies secondaires


- Les erreurs alimentaires;
+la suralimentation et lřobésité
+le jeûne, lřéthylisme…
- Insuffisance rénale : de toutes origines surtout par suite dřun
obstacle sur les voies urinaires ;
- Les hémopathies de toute nature : exagération du catabolisme des
nucléoprotéines cellulaires.

4- autres affections :
+Glycogénose hépatique, toxémie gravidique, hypertension artérielle
dřorigine rénale, myxoedème, diabète acido-cétosique…
+Certains agents pharmacologiques : cytolytiques cortisoniques,
acide lactique, corps cétoniques, diurétiques thiazidiques, aspirine…

2.3.10. Dosage des électrolytes

2.3.10.1. Généralités

Avant d'aborder un à un la détermination ou le dosage des ions, il


importe de nous rappeler certaines notions de base que ces substances
évoquent.
1° La première notion est celle de l'équilibre ou de la
constance du milieu, qui est indispensable au maintien de la vie.
Concernant la détermination des ions Na+, K+, Ca++, Cl-, HCO-3, on
s'exprime plus et mieux en termes d'équilibre. Pourquoi ? ... c'est parce que ces
éléments, en solution, sont susceptibles de s'ioniser et quand ils se combinent,
entre eux, ils le font non pas en fonction de leur poids, mais en fonction de leur
Cours de Biologie Clinique | 127
valeur ionique ; en se référant à la charge électrolytique d'un atome-gamme d'H
ou H+. Donc, ils se combinent équivalent par équivalent. C'est autant dire que
ces substances sont dans le milieu biologique en équilibre électrolytique.
2° La deuxième notion est celle de l'expression de leurs
résultats ; non pas en mg ou gr, donc pas en poids, mais mEq/L ou en mmol/L.
Il y a deux grandes raisons :
- En raison de leur faible concentration dans les milieux biologiques,
l'unité utilisée est le mEq/L ou le millième d'Equivalent. Actuellement
l'unité utilisée est la mole.
- Etant donné qu'en solution, les électrolytes ont des fonctions
chimiques et surtout physiques (osmolarité) appréciables de pression
osmotique ou mieux d'osmolarité. D'où l'expression en mEq/L ou en mol/L et
non en mg ou g, pour mieux se rendre compte de cet équilibre.
Prenons le tableau XI qui donne les valeurs normales des concentrations
des électrolytes plasmatiques ou sériques.

Tableau XI : Concentrations normales des électrolytes.

Electrolytes mg % mEq/L mmol/L


Cations

Sodium 326 142 142


Potassium 16 4 4
Calcium 10 5 2,5
Magnésium 2,5 2 1
Total des cations 354,5 153 149,5

Anions
Chlore 362 101 101
Bicarbonate 60 27 27
Phosphate 3,5 2 1
Cours de Biologie Clinique | 128
Sulfate 1,5 1 0,5
(1) acide organique 15 6 ?
(1) Protéines 7000 16 ?

Total des anions 7442 153 150,5

(1) Ne peuvent pas être exprimés en mmol, car leur composition exacte
reste inconnue.
Nous constatons immédiatement le contraste entre l'égalité des
concentrations totales des cations et des anions exprimées en mEq/L ou
mmol/L d'une part, et d'autre part la différence considérable des mêmes
concentrations exprimées en mg %.

Le composant plasmatique, pondéralement le plus important, est


constitué par les protéines dont la valeur anionique est proportionnellement très
faible.
Mais étant donné que la détermination complète des électrolytes est
difficilement réalisable en urgence, on se limite en pratique à l'évaluation des
Na+, K+, Ca++, Cl- et HCO---. Dans ces conditions, la différence des sommes des
cations et anions est, en moyenne, de 22 (15 à 25 avec nos méthodes). C'est ce
qu'on appelle le "TROU ANIONIQUE".
[142(Na+) + 4 (K+) + 5 (Ca++)] - [101(Cl-) + 27 (HCO3-)] = 23

2.3.10.2. Méthode de détermination pour cations (Na+, K+,


++
Ca )

Leur détermination peut sřeffectuer soit avec un photomètre, soit avec


un gazomètre. Tandis que le Ca++ peut, en plus, sřeffectuer par colorimétrie.
NB : le Na+, K+, Cl-, HCO3-, peuvent aussi se déterminer à lřaide du
gazomètre.

Tableau XII : Ionogramme normal du plasma humain(Gamble) en


mEq/L.
HCO3-
27
Na+
Cl-
142
103

Protéines
Mg++ 3 16
Ca++ 5 SO4, HPO4
Ac.organiques
K+ 5
9
Cours de Biologie Clinique | 129

2.3.10.2.1. Etude du Sodium

a) Prélèvement : 4 ml de sang coagulé ou non coagulé. Nous


avons utilisé pendant un temps la détermination sur du sang hépariné ; car ceci
avait comme avantage d'éviter l'hémolyse mécanique due à la manipulation
exercée pour décoller le caillot sanguin adhéré aux parois du tube, en vue
d'obtenir et d'accélérer une rétraction complète du sang. Cette manoeuvre en
effet, entraîne une lyse des globules rouges et une libération concomitante
d'ions intraglobulaires ou intracellulaires.

Actuellement, nous préférons, néanmoins, le sang coagulé au sang


hépariné, pour la simple raison que c'est sur le même échantillon que nous
déterminons la réserve alcaline qui est tributaire des échanges ioniques entre les
globules rouges et le plasma. On sait en effet que sous l'influence des facteurs
qui tendent à modifier le pH sanguin, des échanges d'ions Cl- et HCO3--- se
réalisent au travers de la membrane des globules rouges et tendent à rétablir
l'équilibre en assurant la constance du rapport HCO3-/H2CO3.

Ainsi, un accroissement de la pCO2 du plasma s'accompagne d'une


diffusion de ce gaz dans le globule rouge où, par mécanisme dans lequel
intervient l'anhydrase carbonique, il est hydraté en H2CO3, lequel se dissocie en
H++ et HCO3-.

Il en résulte une augmentation de la concentration en HCO3- dans le


globule rouge ; cet ion diffuse à l'extérieur, tandis que Cl- pénètre dans la
cellule. Ainsi, l'accroissement du pCO2 dans le plasma se trouve compensé par
une augmentation de la teneur en HCO3-.

Ces mécanismes se poursuivent in vitro dans le sang hépariné qui


permet le contact globules rouges/plasma ; ceci pendant un court laps de temps
au bout duquel l'anhydrase est épuisé, d'où augmentation artificielle de pCO2 et
diminution de la réserve alcaline.

Le sang coagulé ne permet pas ces échanges et le HCO3- dosé comme


nous le verrons plus loin, est ACTUEL et stable. En décollant avec prudence le
caillot sanguin adhéré aux parois du tube, on évite l'hémolyse globulaire,
limitant ainsi la libération des ions tels que K+, Cl-.

b) Causes d'erreurs

- Perfusion de liquides (glucose, dextran, macrodex, etc...) ;


- Perfusion de l'eau physiologique ou d'un soluté contenant du sodium
(lactase ou bicarbonate de sodium, etc...) ;
- Seringue souillée des liquides contenant du sodium ;
- L'hémolyse diminue légèrement la valeur du sodium.
Cours de Biologie Clinique | 130

c) Expression des résultats : mEq/L ou mmol/L de sérum ou de


plasma.

d) Valeurs normales : 135 à 145 mEq/L ou mmol/L.

e) Erreur de la méthode : ± 5 mEq/L.

f) Pathologie

- Augmentation

Déshydratation (du secteur extracellulaire ou globale : transpiration,


diarrhée...) ;
Surcharges salines : exsanguino-transfusion ; épuration rénale ;
Insuffisances cardiaques : hyperfonctionnement corticosurrénalien
(maladies de Conn, Cushing...) ;
Drogues : minéralocorticoïdes (hydrocortisone, cortisone);
Phénomènes infectieux (Fièvre : pertes d'eau : déshydratation).

- Diminution
Déperdition saline : diurétiques ;
Insuffisances surrénaliennes (aiguës ou maladie d'Addison) ;
Diminution de pression osmotique du liquide extracellulaire.

2.3.10.2.2. Etude du Potassium

a) Prélèvement : 4 ml de sang coagulé ou hépariné. Ceci suffit


pour une détermination globale des ions. Employer les tubes héparinés fournis
par le laboratoire. Pour des raisons d'échanges ioniques expliquées ci-haut (voir
prélèvement sodium), nous utilisons les mêmes tubes sans héparine.

b) Causes d'erreurs
- Contact prolongé plasma - globules (Banque du Sang) ;
- Perfusion de liquides;
- Hémolyse : libération dans le plasma du K intracellulaire ou
globulaire ;
hémolyse mécanique : forçage brutal du sang à travers l'aiguille pour
vider le sang dans les tubes ;
hémolyse dans les circuits de circulation extra-corporelle (peu
importante normalement) ;
hémolyse chimique : solvants (éther, alcool, acétone, cétavlon) : on
évite ceci par l'emploi de seringue séchée ;
hémolyse de transfusion : les baxters de sang non fraîchement
prélevés ont une augmentation en K : contact prolongé plasma/globules.
Cours de Biologie Clinique | 131
- Perfusion de solutions de KCl ;
- Hémodilution ou hémoconcentration.

c) Expression des résultats : mEq/L ou mmol/L de sérum ou de


plasma.

d) Valeurs normales : 3,5 à 5 mEq/L ou mmol/L.

Erreur de la méthode : ± 0,5

e) Pathologie

- Augmentation
Acidoses;
Etat de choc : brûlure, hémorragie, infarctus, etc...;
Syndrôme hémolytique aigu.

- Diminution
Carence en K : carence alimentaire, vomissements ;
Perte de K : par voie digestive : vomissements, diarrhées ;
par voie rénale : affections rénales ;
Altération du métabolisme du K : alcalose, hypercorticisme ;
Thérapeutique : cortisone, sulfamide, inhibiteur de l'anhydrase
carbonique, diurétiques salurétiques ou mercuriels, etc...

2.3.10.2.3. Etude du Calcium

N.B. : La calcémie représente le calcium total présent dans le sérum ou


le plasma. Toutefois, c'est à la fraction ionisée (± 50 % du calcium total) que
revient l'essentiel de l'activité biologique de l'élément.

a) Prélèvement : 4 ml de sang coagulé ou hépariné.

b) Causes d'erreurs

- Rinçage de la seringue, aiguille ou des tubes à l'eau calcareuse (eau de


robinet, eau insuffisamment distillée) ;
- Perfusion de liquide;
- Prélèvement par cathéter;
- Administration de gluconate calcique ou d'autres sels calciques.

c) Expression des résultats : mEq/L ou mmol/L de sérum ou


de plasma ou en mg%.
Cours de Biologie Clinique | 132
d) Valeurs normales : 4,5 à 5,5 mEq/L, soit 9 à 11 mg ± 0,5%.
ou 2,25 à 2,75 mmol/L.

e) Pathologie

- Augmentation nette : maladie de Rechlinghausen ;


- Augmentation modérée : ostéolyse tumorale ou infectieuse,
hypervitaminose D ;
- L'alcalose augmente l'électronégativité des protéines et donc leur
pouvoir de fixer le Ca++. Le calcium ionisé diminue;
- Diminution:
rachitisme;
hypoparathyroïdie;
néphrite;
états tétaniques;
carences protéiques;
l'acidose diminue l'ionisation des protéines et donc leur pouvoir de
fixation de Ca++.
Carence protéique.

2.3.10.2.4. Etude des chlorures

a) Méthode utilisée au labo :Nous utilisons la titration


mercurimétrique : les ions sont titrés en solution acide par le nitrate de mercure
Hg (NO3)2. Il se forme un sel de mercure non dissocié (HgCl2). La diphényle-
carbazone est utilisée comme indicateur et vire au violet en présence de Hg
(NO3)2 en excès.
NB : on peut aussi utiliser le gazomètre.

b) Prélèvement

4 ml de sang hépariné ou coagulé : employer les tubes héparinés fournis


par le laboratoire. Ce volume suffit pour la détermination simultanée des Na+;
K+, Cl-, Ca++, HCO-3.

c) Causes d'erreurs
- Perfusion de liquides contenant des chlorures ;
- L'hémolyse diminue légèrement le chlore plasmatique

d) Expression des résultats : mEq/L ou mmol/L de sérum ou


de plasma.

e) Valeur normale : 95 à 105 mEq/L ou mmol/L. Erreur de la


méthode : ± 5
Cours de Biologie Clinique | 133

f) Pathologie

- Augmentation:
Déshydratation;
Diabète insipide;
Infection;
Acidose rénale.

- Diminution:
Déperditions salines; vomissements, diarrhées;
Insuffisance surrénalienne chronique;
Régime sans sel et insuffisance rénale.

2.3.10.2.5. Etude des Bicarbonates: HCO-3

a) Généralités

Le pH sanguin fluctue normalement très peu, entre deux limites étroites


: 7,35 à 7,45 dans le sang artériel et 7,28 à 7,38 pour le sang veineux. Cette
stabilité provient :
- de la présence dans le sang de puissants systèmes-tampons
(H2CO3/HCO-3 ; MH2PO4 ; Hémoglobine, Protéines);
- des échanges d'H+ entre le milieu extra-cellulaire et intracellulaire ;
- des régulations physiologiques au niveau pulmonaire et rénal ;
C'est de loin le système H2CO3/HCO-3 qui est le principal tampon ; il est
lié au pH par l'équation de HENDERSON/HASSELBACH :
HCO-3
pH = pK + log ---------
H2CO3

HCO-3
pH = 6,1 + log ---------
pCO2

Le H2CO3 existe dans le sang sous forme de CO2 dissout dans le plasma
en équilibre avec pCO2.

b) Prélèvement : 4 ml sang hépariné. Employer les tubes


héparinés secs fournis par le laboratoire.
c) Méthode : Nous utilisons la méthode titrimétrique selon
VANSLYKE : le plasma est acidifié par HCl qui transforme le bicarbonate en
CO2. On titre ensuite en retour avec une solution de NaOH, on peut aussi
utiliser la gazomètrie.
Cours de Biologie Clinique | 134
d) Causes d'erreurs

La mesure de l'équilibre acide-base est très délicate. Les principales


causes d'erreurs sont :
- Emploi d'oxalate ou de citrate comme anticoagulant (adjonction
acide);
- Garrot trop longtemps maintenu : acidose artificielle ;
- Rentrée d'air au cours du prélèvement ou après : fuite de CO2 et
modification de l'équilibre et donc du pH ;
- Hémolyse par manipulations brutales.
- Perfusion antérieure de bicabornate ou de lactate ou autres ions ;
- mise en contact du prélèvement avec l'air ;
- Divers médicaments (salicylés) qui peuvent entraîner soit une
acidification, soit une alcalinisation du sang.

e) Expression des résultats

- Le pH : représente le cologarithme de la concentration en H+ :


pH = - log (H+).
- La pCO2 "réelle" exprime en mm de Hg ou en mEq/L ou mmol/L de
HCO-3 le CO2 dissout dans le plasma. Elle correspond au dénominateur de
l'équation d'Henderson dans les conditions réelles.
- Les bicarbonates "standards" : c'est la concentration en mEq/L ou
mmol/L des ions HCO-3 plasmatiques, quand le sang total est équilibré à une
pCO2 "standard" de 40 mm de Hg à 38°C et lřhémoglobine totalement
oxygénée.
Dans ces conditions techniques, la teneur en HCO-3 représente une
valeur théorique dans les conditions respiratoires idéales.
- L'excès de base exprime, en mEq/L ou mmol/L, la quantité des bases
ou d'acides fixes supposés envahir le sang lors d'une acidose ou d'une alcalose
métabolique.
- pCO2 : est la pression partielle de gaz carbonique dans le sang artériel.
Cřest le principal indice du fonctionnement du système respiratoire. Dans le
sang artériel, elle est comprise entre 36 et 42 mm de Hg. Dans le sang veineux,
entre 46 et 58 mm de Hg.
- Réserve alcaline : qu'on peut appeler autrement CO2 des
bicarbonates, pouvoir de liaison en CO2 ou capacité en CO2 ; est la
concentration en CO2 du plasma équilibré avec du CO2 sous 40 Torr (ou mm
de Hg) de pression. La Réserve alcaline est définie comme lřensemble des ions
HCO-3 disponibles dans lřorganisme. Elle est une concentration en CO2 du
plasma. On l'exprime, soit en volume %, soit en mEq/L de HCO-3. Le CO2 est
libéré à partir des bicarbonates, par l'adjonction à l'échantillon de sang d'une
quantité déterminée d'acide fort
HCO-3 + HCl ─────────────> H2O + CO2 + Cl-.
Il existe plusieurs méthodes pour la détermination de la Réserve
Alcaline. On peut citer :
Cours de Biologie Clinique | 135
- La titrimétrie selon Van Slyke (CUK).
- La gazométrie qui détermine le pCO2, pO2, HCO-3, pH, lřexcès de
base, etc…

1. Principe de la méthode titrimétrique : Sous lřaction dřun


acide fort (HCl 0,1 N) mis en excès, lřion bicarbonate est déplacé de ses sels et
se transforme immédiatement en CO2.

Lřexcès de lřacide fort nřayant pas réagi avec du bicarbonate sera titré
en retour avec une base forte (NaOH 0,1 N), selon lřéquation suivante :

HCO-3 + HCl H2O + CO2 + Cl-

HCl + NaOH H2O + NaCl

2. Matériel et Réactifs

a.Matériel :
- Tube à essai;
- Pipettes graduées;
- Pipettes pasteur;
- Poire.
b. Réactifs :
- Hydroxyde de sodium (NaOH) 0,1 N;
- Acide chlorhydrique 0,1 N;
- Lřindicateur de pH : mélange de rouge phénol et de bleu de méthylène
ou « Indicateur vert ».

3. Procédure

Dans un tube à essai :


mettre 0,7 ml dřHCl 0,1 N;
ajouter 0,5 ml de serum;
ajouter 2 gouttes de « lřindicateur vert » de pH, tout agitant
doucement le tube ;
titrer avec NaOH 0,1 N, en ajoutant goutte à goutte, tout en agitant le
tube jusquřau virage de la coloration violette pâle persistante. En effet, en
milieu acide, la coloration est verte tandis quřen milieu alcalin la coloration
devient violette. Ceci signe la fin de la titration.
4. Résultat : HCO-3 = (0,7 ml Ŕ vol NaOH) x 200
Cours de Biologie Clinique | 136
5. Valeurs normales = 18 Ŕ 33 mEq/l
Cette mesure ne donne pas d'indications relatives aux variations
respiratoires. Elle ne fournit qu'une indication limitée à l'existence et
l'importance d'une acidose ou d'une alcalose métaboligène. Voir figure 37.

6. Pathologie : Voir figure 34 ci-après.

Figure 37 : Valeurs normales des bicarbonates et du pH sanguin


(Diagramme de Davenport) : indications cliniques en fonction de lřévolution de
lřéquilibre acido-basique données par le diagramme pH-Réserve
alcaline(Biacarbonate). On réalise clairement que toute modification
respiratoire ne se traduit pas par une modificaction du bicarbonate ou réserve
alcaline. En A : Sujet normal. En abcisses=pH sanguin et en ordonnées à
gauche=bicarbonate en mmol/L.

f) Valeurs normales:
Sang artériel Sang veineux
pH 7,25 Ŕ 7,45 7,28 Ŕ 7,35
pCO2 33 Ŕ 45 mmHg 45 Ŕ 60
Sta.bicarbonate 19 -24mEq/L 19 Ŕ 2 mEq/L
Excès-base 3mEq/L 3mEq/L
Réserve alcaline 51 Ŕ 57,7 vol% 44,6 Ŕ 50,4
Vol% Soit 33 à 42 mEq/l 23 à 32 mEq/L
Cours de Biologie Clinique | 137
2.2.11. Métabolisme du fer et son exploration

Le métabolisme du fer ressemble, dans plusieurs aspects, à celui des


éléments traces ou oligoéléments. Normalement, de très petites quantités sont
présentes dans la plupart des cellules de lřorganisme, dans le plasma ou dans
dřautres fluides extracellulaires, et lřorganisme conserve rigoureusement ses
réserves en fer.

2.2.11.1. Compartiments du fer

2.2.11.1.1. Compartiment de transport

Le transport du fer, depuis les entérocytes jusquřaux érythroblastes


médullaires et la récupération du fer après destruction des érythrocytes par le
système macrophagique, est accompli par une protéine plasmatique appelée
apotransferrine, laquelle possède 2 sites de fixation du fer par molécule.
Chaque site peut fixer un Fe3+ ensemble avec un ion HCO3-.
Le complexe apotransferrine-Fe3+ est appelé transferrine ou
sidérophiline. A lřétat physiologique, la transferrine est saturée à 30%.
Normalement, il y a un total dřenviron 2,5mg de fer dans le plasma, soit 0,1%
du fer total.

2.2.11.1.2. Compartiment de réserve

Ce compartiment représente 25% du fer total. La ferritine est le majeur


composé de stockage du fer. Cřest une molécule sphérique consistant en une
coquille apoferritine et un noyau cristallin ferrique oxyhydroxide (FeOOH). La
ferritine est retrouvée dans presque toutes les cellules de lřorganisme.
Dans les hépatocytes et dans les macrophages de la moelle osseuse et
des autres organes, la ferritine constitue une réserve de fer immédiatement
mobilisable pour la formation de lřhémoglobine et dřautres protéines à hème.
De petites quantités de ferritine sont aussi présentes dans le sérum en
concentrations proportionnelles au fer total de réserve de lřorganisme.
Lřhémosidérine, lřautre forme de stockage du fer, est une ferritine
agrégée partiellement déprotéinisée. Contrairement à la ferritine,
lřhémosidérine est insoluble dans des solutions aqueuses et le fer en est
lentement libéré. Mais comme la ferritine, lřhémosidérine, est retrouvée de
manière prédominante dans les hépatocytes, la rate et la moelle osseuse.

2.2.11.1.3. Compartiment fonctionnel

Il représente environ 70% du fer total et est constitué essentiellement


par le fer de lřhémoglobine (10%). Normalement, tout le fer hémoglobinique
est contenu dans les globules rouges ou leurs précurseurs dans la moelle
osseuse.
Cours de Biologie Clinique | 138
De plus faibles quantités de fer (10%) sont contenues dans la
myoglobine et dans certaines enzymes cellulaires qui interviennent dans le
métabolisme oxydatif. Il sřagit de la catalase, des cytochromes et de la
myéloperoxydase.

2.2.11.2. Absorption, transport, excrétion

Lřalimentation moyenne fournit 10 à15 mg de fer par jour, davantage


sous forme dřhémoglobine et de myoglobine, dans la viande. Normalement,
environ 1mg de fer est absorbé chaque jour dans le duodénum.
La ferritine et la transferrine sont présentes dans les cellules
absorbantes de la muqueuse intestinale et régulent ensemble lřabsorption du
fer. Lorsque les réserves en fer sont élevées, le contenu en ferritine de
lřépithélium muqueux est aussi élevé et le contenu en transferrine est bas.
Le fer qui entre dans les cellules muqueuses est piégé dans la ferritine
et est perdu lorsque la cellule muqueuse desquame dans la lumière intestinale.
Ce mécanisme réduit lřabsorption en fer lorsque les réserves en fer de
lřorganisme sont déjà élevées.
Par contre, avec un déficit en fer, le contenu en apoferritine de la
cellule muqueuse est diminué, le contenu en transferrine (et apoferritine) est
augmenté, et par conséquent, lřabsorption du fer est accélérée.
La principale voie du métabolisme du fer est un cycle virtuellement
fermé dans lequel le fer passe de la transferrine plasmatique aux précurseurs
des globules rouges dans la moelle osseuse où il est incorporé dans
lřhémoglobine.
Ces cellules alors entrent dans la circulation comme érythrocytes
matures où elles restent environ 4mois avant de devenir métaboliquement
«épuisés » et sont phagocytés. Le fer est libéré de lřhémoglobine et retourne à
la transferrine plasmatique, donc complétant un cycle et commençant un autre.
Chaque jour 1 à 2 mg de fer absorbé du tractus intestinal entre dans ce
cycle pour compenser les 1 à 2 mg de fer perdu chaque jour par lřorganisme.
Avec chaque cycle menstruel, les femmes perdent environ 40 à 80 ml
de sang, ce qui est lřéquivalent de 20 à 40 mg de fer. Cette perte doit être
compensée par une augmentation de lřabsorption de fer par la muqueuse
intestinale. De même, environ 600 à 900 mg de fer sont perdus comme
conséquence de chaque grossesse.

2.2.11.3. Méthodes d’exploration

2.2.11.3.1. Exploration du fer fonctionnel

Lřexploration biologique du fer fonctionnel consiste en celle du fer


hémoglobinique. Pour ce faire, les paramètres ci-après sont utilisés:
le taux dřhémoglobine;
les indices érythrocytaires.
Cours de Biologie Clinique | 139

Lřintérêt de lřexploration de ces paramètres réside dans le diagnostic de


lřanémie ferriprive hypochrome, où leurs taux sont abaissés.

2.2.11.3.2 Exploration du fer de transport plasmatique et


d’alimentation tissulaire

Quatre paramètres sont utilisés:


le fer sérique;
la transferrine et le coefficient de saturation en fer ;
la ferritine érythrocytaire;
le récepteur soluble de la transferrine.

2.2.11.3.2. 1 Dosage du fer sérique

Le prélèvement doit se faire dans un tube sec, entre 8h et 10h du matin,


à cause du fait que le fer présente dřimportantes variations nycthémérales.
Les techniques courantes de dosage de fer sérique procèdent par
colorimétrie ou par spectrophotométrie dřabsorption atomique. La
concentration sérique du fer se réfère au Fe3+ lié à la transferrine sérique et
nřinclut pas tout autre fer contenu dans le serum, tel que lřhémoglobine libre.
Sauf lorsque la spectrophotométrie par absorption atomique est utilisée,
lřhémolyse a peu dřeffet sur les résultats du dosage du fer sérique. Néanmoins,
les échantillons de sérum avec hémolyse marquée devront être rejetés, car une
petite fraction de fer peut être libérée de lřhémoglobine.
De même, à cause de grandes quantités de fer dans lřenvironnement,
une attention scrupuleuse est nécessaire pour sřassurer que ni la verrerie, ni
lřeau, ni les réactifs ne soient pas contaminés par le fer.
La concentration sérique du fer est diminuée chez plusieurs patients,
mais pas chez tous les patients avec anémie par carence martiale et dans les
affections inflammatoires chroniques, les infections aiguës, lřimmunisation et
lřinfarctus du myocarde.
La concentration sérique du fer diminue fortement chez les patients qui
commencent à répondre à une thérapie hématique spécifique pour anémies
dřautres causes, par exemple, traitement de lřanémie pernicieuse avec la
vitamine B12.
Une hémorragie aiguë ou récente, y compris un don de sang,
occasionne une baisse de la concentration sérique du fer.
La concentration sérique du fer diminue durant les menstruations.
Lřusage de contraceptifs hormonaux augmente cette concentration, mais à
lřarrêt de cette thérapie, la concentration en fer sérique diminue de 30%
concomitamment avec le saignement utérin.
Des concentrations de fer sérique supérieures à la normale apparaissent
dans les affections telles que lřhémochromatose, lřempoisonnement aigu au fer
chez lřenfant, après ingestion orale de fer ou administration parentérale de fer,
Cours de Biologie Clinique | 140
lřhépatite aiguë, chez les femmes sous contraceptif (progestérone ou
apparentés) ou lorsque le contenant de lřéchantillon a été contaminé par le fer.

2.2.11.3.2.2 Dosage de la transferrine et détermination du


coefficient de saturation en fer

La transferrine est dosée par immuno-néphélémétrie ou par immuno-


turbidimétrie. Le coefficient de saturation en fer de la transferrine(CST) est
obtenu par la formule suivante : CST=fer sérique/CTST x100, et sřexprime en
pourcent.
Le CST est un bon indicateur du transport du fer et de son alimentation
tissulaire. Toute diminution traduit une diminution de la livraison du fer à
lřérythropoïèse (anémie ferriprive, anémie inflammatoire) ; et toute
augmentation témoigne dřune hémochromatose.

2.2.11.3.2.3 Dosage de la ferritine érythrocytaire

Ce paramètre reflète lřéquilibre entre les entrées de fer dans la moelle et


les sorties, cřest-à-dire, la synthèse de lřhémoglobine. Toute augmentation des
entrées non justifiée par des besoins accrus (hémochromatose) ou toute
utilisation défaillante (hémoglobinopathies) sans restriction des apports, ont
pour conséquence une augmentation de la concentration érythrocytaire en
ferritine. Par contre, toute carence dřapport en fer ou toute utilisation accélérée
(anémie hémolytique) se traduisent par des valeurs abaissées.

2.2.11.3.2.4 Récepteur soluble de la transferrine

Cřest une molécule dimérique ancrée dans la bicouche lipidique de la


membrane érythrocytaire. Au cours de la maturation érythroblastique, les
remaniements de la structure membranaire font que certaines protéines
intrinsèques sont relarguées.
Ainsi, cřest un mécanisme de clivage protéolytique qui est à lřorigine
des formes solubles du récepteur de la transferrine retrouvées dans le plasma.
Une carence en fer ou une stimulation par lřérythropoïétine entraînent
une augmentation du nombre des récepteurs par cellule, tandis quřune
surcharge en fer exerce lřeffet inverse.

2.2.11.3.2.5 Exploration du fer de réserve

Elle se fait par le dosage de la ferritine sérique et la détermination de la


capacité totale de saturation de la transferrine (CTST).
Le dosage de la ferritine sérique peut se réaliser par différentes
méthodes, telles que le dosage immuno-radiométrique(IRMA) et lřELISA.
La ferritine est présente dans le sang en très petite concentration. Sa
concentration plasmatique est en équilibre avec les réserves de lřorganisme et
reflètent des variations dans la quantité de fer du compartiment de réserve.
Cours de Biologie Clinique | 141
Cette concentration diminue précocement dans le développement dřune
carence martiale, longtemps avant que des changements ne soient observés
dans la concentration en hémoglobine sanguine, dans la taille des érythrocytes
ou dans la concentration sérique du fer. Donc, le dosage de la ferritine sérique
peut servir dřindicateur sensible de carence martiale non compliquée par une
autre maladie concurrente.
Dřautre part, un grand nombre de maladies chroniques résultent en
lřélévation de la ferritine sérique. Ces maladies incluent les infections
chroniques, les inflammations chroniques telles que lřarthrite rhumatoïde ou les
maladies rénales, les affections malignes particulièrement les lymphomes,
leucémies, cancer du sein et neuroblastome. Chez les patients ayant une de ces
affections chroniques associées à une carence martiale, la concentration en
ferritine sérique est très souvent normale.
Une augmentation de la concentration plasmatique de la ferritine
apparait dans les hépatites virales ou après une intoxication hépatique, comme
résultat de libération de ferritine à partir des hépatocytes lésés, et dans la
maladie de Gaucher. La concentration plasmatique de la ferritine est aussi
élevée chez les patients avec hémosidérose ou hémochromatose, bien que
comme test de dépistage pour la détection précoce de surcharge en fer, elle
semble être moins sensible que la mesure de la concentration sérique du fer et
du pourcentage de saturation de la transferrine.
Toute augmentation de la CTST est caractéristique dřune baisse des
réserves en fer. Pour les surcharges, la CTST peut être diminuée ou normale.

2.2.12. Analyse de la bilirubine

2.2.12.1. Introduction

La bilirubine est un produit de catabolisme de l'hémoglobine, mais


l'hémoglobine n'est pas la seule source de bilirubine. Celle-ci peut dériver
également de la myoglobine, cytochromes, catalases et peroxydases qui
sontcomme lřhémoglobine, des pigments respiratoires tétrapyrroliques ; cřest-
à-dire ayant dans leur structure chimique 4 noyaux pyrroles combinés au fer et
aux protéines. Un tel noyau tétrapyrrolique est appelé « Porphyrine ou noyau
porphyrinique ». Cřest pourquoi ces substances sont des porphyrines dont voici
la structure de base et dont nous parlerons dans le chapitre consacré aux urines.
Cours de Biologie Clinique | 142
1 2

δ α
8 3
Noyau porphyrinique:
3)4 noyaux pyrroles; 7 4
4)8 carbones numérotés de 1 à 8;
5)4 ponts méthènes (=H-) : γ β
(α, β, γ, δ )
6 5
Figure 38 : Protoporphyrines (Hémoglobine, myoglobine, cytochromes,
peroxydases, catalases).

Figure 39 : Ouverture du pont méthène en position alpha.

Nous devons noter que la source la plus importante de la bilirubine est


l'hémoglobine, pigment des hématies, qui se trouve à une quantité plus grande
dans l'organisme animal que tous les autres dérivés (par exemple : Hb 35g,
myoglobine, cytochromes, peroxydases, catalases : 1g).
2.2.12.2. Origine et synthèse de la bilirubine
Le GR à maturité, parvenu dans le sang circulant, survit encore 120
jours, pendant lesquels son hémoglobine ne subit pas de modification. Puis, le
pigment des hématies circulantes se dégrade au niveau du SRE (Système
Réticulo-Endothélial) : foie, rate, moelle osseuse ; en se transformant en
bilirubine qui sera excrétée par le foie. Cette dégradation est due à la
sénescence qui consiste en une altération des systèmes enzymatiques du
globule rouge. Rappelons deux points importants:
(1) le catabolisme de lřhémoglobine ne donne pas naissance à
des porphyrines mais aux pigments biliaires, à savoir la biliverdine, bilirubine
et ses dérivés.
(2) toute la bilirubine ne provient pas uniquement des globules
rouges vieillis mais aussi de noyaux dřhème ne provenant pas de
Cours de Biologie Clinique | 143
lřhémoglobine (myoglobine, cytochromes, catalase, tryptophane-pyrrolase) ou
des globules rouges à durée de vie très brève.
Figure 40 : Origine et synthèse de la bilirubine, autrement représentée :
Schéma
M= Méthyle : Ŕ CH 3
V= Vinyle : Ŕ CH= CH 2
P= Propionique: Ŕ CH2 Ŕ CH2 Ŕ COOH

Figure 41 : Indication de trois étapes.

1° étape :
Rupture du cycle par oxydation au
niveau du Cα avant la séparation
du groupement prosthétique.
Cours de Biologie Clinique | 144
Cours de Biologie Clinique | 145
2.2.12.3. Destinées de la biliribine et cycle entéro-hépatique

Figure 42 : Cycle Entéro-hépatique de la bilirubine.


RATE SYSTEME
HEMOGLOBINE RETICULO
ENDOTHELIAL

BILIRUBINE Liée à la sérum-albumine PLASMA

BILIRUBINE Cycle entérohépatique


GLUCURO-CONJUGUEE FOIE

UROBILINOGENE
STERCOBILINOGENE REABSORPTION INTESTIN

UROBILINE
UROBILINOGENE FECES
STERCOBILINE URINES
STERCOBILINOGENE

Figure 43 : Cycle entérohépatique illustré.

Figure 43 : Cycle entérohépatique illustré.


Cours de Biologie Clinique | 146
Le taux normal de bilirubine plasmatique et de 1 à 10 mg/L. Il sřagit
toujours de bilirubine libre (par opposition à la bilirubine conjuguée, dont nous
parlerons plus tard, et qui nřexiste dans le plasma normal quřen faibles
quantités). Cřest un pigment jaune au pH de sang dont lřélévation anormale
entraîne lřapparition dřun ictère. Elle est très peu soluble dans lřeau et au
contraire soluble dans les graisses et les solvants organiques.

La bilirubine libre formée dans les cellules du système réticulo-


endothélial est transportée dans le plasma vers le foie où trois étapes doivent
être considérées.

1° Captation par la cellule hépatique. Ŕ Elle est rapide et la bilirubine


libre est transportée dans le cytoplasme de lřhépatocyte par deux protéines (γ et
ligandine).

2° Glucuronoconjugaison. Ŕ Elle sřeffectue au niveau des microsomes


de lřhépatocyte sous lřinfluence de la glucuronyltransférase selon la réaction :
Bilirubine + 2 UDP Ŕ glucuronate bilirubine
biglucuroconjuguée + 2 UDP.

Mise à part la couleur jaune, les caractères de la bilirubine conjuguée


sřopposent à ceux de la bilirubine libre : elle nřest présente quřà lřétat de traces
dans le plasma normal ; elle est soluble dans lřeau et donc se colore
directement lors du dosage, sans avoir à ajouter de solvant organique, dřoù le
nom de bilirubine directe ; elle nřest pas neurotoxique, ne traverse pas les
barrières méningées, intestinales ou placentaires.

3° Excrétion : la bilirubine conjuguée quitte lřhépatocyte pour les


canalicules biliaires.

Dans la plus grande partie du grêle, la bilirubine reste conjuguée et nřest


donc pas réabsorbée. Dans lřiléon terminal et surtout le côlon, elle peut perdre
ses résidus glucuroniques sous lřaction de la flore bactérienne et être réduite sur
ses résidus latéraux pour donner des composés incolores de la famille des
urobilinogènes. Il sřy associe une réduction de la bilirubine en urobilinogènes
et en stercobilinogènes qui peuvent subir le cycle entérohépatique.
La bilirubine déversée avec la bile dans l'intestin subit l'action des
bactéries qui provoque tout d'abord l'hydrolyse du glucuroconjugué.
Les urobilinogènes et stercobilinogènes formés dans l'intestin sont en
partie réabsorbés par la muqueuse intestinale et retournent au foie qui les
excrète de nouveau dans la bile : il y a donc un cycle entéro-hépatique des
pigments biliaires

2.2.12.4. Pathologie des ictères


Cours de Biologie Clinique | 147
Les déviations pathologiques se traduisent dans tous les cas par une
augmentation de la bilirubine plasmatique réalisant dřabord un ictère
biologique pour des valeurs comprises entre 10 et 20 mg/L, puis un ictère
clinique avec coloration jaune des muqueuses et des téguments visibles à partir
de 20 mg/L. Le foie joue un rôle central dans le métabolisme de la bilirubine ;
on considérera donc deux types dřictères.
Si le trouble siège avant lřétape de glucuroconjugaison, on aura un
ictère à bilirubine libre, avec son risque neurotoxique chez le nouveau-né.
Si le trouble siège après lřétape de glucuroconjugaison, lřictère sera à
bilirubine conjuguée ou mixte avec passage de bilirubine conjuguée dans le
plasma.

2.2.12.4.1. Ictères à Bilirubine non conjuguée

Ils sont tous secondaires à une augmentation du catabolisme de


lřhémoglobine dépassant les capacités métabolisantes du foie, due à une
destruction prématurée des globules rouges : ce sont les ictères hémolytiques.
Ils peuvent se voir au cours de toute anémie hémolytique, que la cause en soit
une anomalie congénitale du globule rouge, ou quřelle soit parasitaire ou
immunologique (incompatibilité Rhésus) ou toxique.
Il nřy a pas signe dřatteinte hépatique et ni une augmentation
dřurobiline et dřurobilinogène dans les selles et les urines.
Chez le nouveau-né, il faut surveiller très attentivement le taux de
bilirubine libre non conjuguée du fait du risque neurotoxique. Ce risque est
particulièrement présent dans le cas dřictère par incompatibilité foeto-
maternelle Rhésus où lřon doit recourir à lřexsanguino-transfusion si le taux de
bilirubine libre dépasse 200-250 mg/l (171 μmol/L). Se dissolvant dans les
lipides du cerveau, il réalise un ictère avec signes neurologiques : cřest lřictère
nucléaire.

2.2.12.4.2. Ictères à Bilirubine conjuguée

Au niveau de lřhépatocyte nous allons considérer 3 étapes :


1° Captation ;
2° Glucuroconjugaison ;
3° Excrétion.
1° Ictère congénital par défaut de la captation : Maladie de Gilbert.
Le trouble siège au niveau de la captation (protéine Y ou Z). Certains
auteurs pensent quřun trouble de la glucuroconjugaison lui est associé. Cřest un
ictère discret, bien toléré, à bilirubine libre.

2° Ictère par défaut en glucuronyl-transférase.


Trois cas sont à considérer : celui de lřictère physiologique du nouveau-
né où le déficit est transitoire et où le pronostic est excellent si on a su éviter les
complications neurologiques possibles, plus fréquentes dans celui du
prématuré, par défaut de maturation du système de glucuronoconjugaison
Cours de Biologie Clinique | 148
(photothérapie indiquée), et le cas où le déficit est permanent : ictère congénital
de Crigler-Najjar, extêmement rare mais dont le pronostic est redoutable. Tous
sont des ictères à bilirubine libre.

3° Ictère par trouble de lřexcrétion de la bilirubine de lřhépatocyte vers


les voies biliaires. Le trouble siège après lřétape de glucuronoconjugaison ; il
sřagira donc de lřictère à bilirubine conjuguée. Il sřagit rarement dřune maladie
congénitale : le syndrome de Dubin Johson. Dans la grande majorité des cas, il
sřagit dřun ictère secondaire à une insuffisance cellulaire hépatique des
hépatites toxiques et surtout virales.

4° Ictère par obstruction des canalicules biliaires intrahépatiques. Il


constitue une cirrhose biliaire primitive, ou secondaire à une hépatite
prolongée. Il réalise un tableau identique aux ictères à bilirubine conjuguée. Le
pronostic est le plus souvent extrêmement réservé.

5° Ictère par obstruction de la voie biliaire, soit par un calcul du


cholédoque, soit par cancer du pancréas ou de lřampoule de Vater. Cřest un
ictère à bilirubine conjuguée, avec augmentation des pigments biliaires dans les
urines et effondrement de lřurobilinogène et lřurobiline fécaux, avec donc des
selles très décolorées. La rétention des sels biliaires provoque un prurit souvent
intense.

Tableau XIII : Différentes dénominations des bilirubines.

3. Dénomination :

Analytique Indirecte Directe


Biochimique Non conjuguée (libre) Conjuguée
Métabolique Préhépatique Posthépatique
Solubilité dans lřeau Insoluble Soluble
% dans le sang > 90% <10%

2.2.12.5. Méthodes de dosage dans le sang

Précautions

2.2.12.5.1. Prélèvement : cřest soit sur le sérum (tube sec), soit sur le
plasma (tube avec anticoagulant), hépariné, jamais sur citrate.

On note lřaspect du sérum : sřil y a hémolyse ou non.


Cours de Biologie Clinique | 149
Dosage : moins de 4 h00 après prélèvement, sinon mettre lřéchantillon à
4°C au frigo pour éviter les rayons U.V. qui dégradent la bilirubine.
N.B : la demande dřanalyse de Pédiatrie est une urgence.
Spectrophotométries directes

2.2.12.5.2. Méthodes

2.2.12.5.3. Méthode de JENDRASSIK, par séparation de la bilirubine


à lřalcool, suivie de la réaction de diazotation de la bilirubine par lřacide
sulfanilique diazoté. La bilirubine glucurono Ŕ conjuguée, hydrosoluble,
développe une coloration rouge directement avec lřacide sulfanilique diazoté.
Avec la bilirubine libre, liposoluble, la coloration ne se développe quřaprès
solubilisation de la bilirubine indirecte par des agents tels que lřalcool, lřurée,
lřacétate de sodium, caféine ou théophylline.

2.2.12.5.3.1. Autres méthodes

- Méthodes dřoxydation
- Méthode fluorimétrique
- Méthodes enzymatiques
- Méthodes électrophorétiques
- Méthodes chromatographiques, sur gel de séphadex en colonne ou en
liquide à haute pression (HPLC).

2.2.12.6. Détails techniques sur la détermination des bilirubines


par diazotation

2.2.12.6.1. Principe

La bilirubine forme avec lřacide sulfanilique diazoté, un colorant


azoïque rouge en solution neutre et bleu en milieu alcalin. La bilirubine libre ne
réagit quřen présence dřun accélérateur ou solubilisant alors que la bilirubine
conjuguée le fait directement.

2.2.12.6.2. Echantillon : sérum ou plasma

2.2.12.6.3. Mode opératoire

Réactifs Blanc (ml) B.T (ml) B.D (ml)


Eau distillée 0,2 0,2 0,2
Sérum 0,02 0,02 0,02
Acide ascorbique 0,02 - -
Caféine 0,5 0,5 -
Mélange Diazo 0,1 0,1 0,1
Cours de Biologie Clinique | 150

Mélanger et laisser reposer pendant 15ř exactement.


Acide ascorbique - 0,02 0,02
Caféine - - 0,5
Fehling II 0,5 0,5 0,5

Mélanger et lire directement au spectrophotomètre à 580 nm contre


lřeau distillée.

N.B : - mélange Diazo : 0,03ml Diazo B + 1ml Diazo A à préparer


-acide ascorbique : 50mg dans 1ml dřeau distillée avant lřemploi

2.2.12.6.4. Calcul

Bilirubine Totale (mg %)= (DO BT ŕ DO BL) x 0,0646


Bilirubine Directe (mg %) = (DO BD ŕ DO BL) x 0, 0646
Bilirubine Indirecte = Bilirubine Totale Ŕ Bilirubine directe

2.2.12.6.5. Valeurs normales :


BT: < 2 mg%, 34,2mmol/L
BD: < 1 mg%, 17,1mmol/L

2.2.12.7. Recherche de la bilirubine dans les urines

2.2.12.7.1. Test au Lugol

L'iode oxyde la bilirubine en biliverdine. Il apparaît une couleur


verdâtre en cas de positivité. Cette couleur apparaît à l'interface urine-lugol.

- solution d'iode (lugol)


Iode pulvérisé 1 g
Iodure de K 2 g
Eau distillée q.s.p. 200 ml.
- manipulations
Dans un tube à essai, placer 5 à 6 ml d'urine. Pipetter la solution iodée
dans une pipette longue et effilée. Superposer le lugol à l'urine en laissant
couler doucement la solution iodée sur la paroi du tube et le placer sur une
étagère.
Attendre 5 minutes
Regarder le tube sur un fond blanc éclairé.
L'iode oxyde la bilirubine en un composé vert, la biliverdine, qui
apparaît à l'interface urine-lugol.
Annotation des résultats : 0, +, ++ ou +++

2.2.12.7.2. Test Harrison


Cours de Biologie Clinique | 151

Cette méthode est plus sensible et spécifique de la bilirubine que la


précédente. Comme test de routine, on utilisera la méthode au lugol. Si le
clinicien qui dirige l'observation estime que l'absence de bilirubine dans les
urines ne cadre pas avec ses observations cliniques, il peut demander un
contrôle avec une méthode plus sensible.

L'urine est additionnée de chlorure de baryum, Il se forme un précipité


qui absorbe les pigments biliaires. Le précipité est recueilli sur un papier filtre
sur lequel on oxyde la bilirubine avec le réactif de FOUCHET.

2.2.13. Dosage des hormones

2.2.13.1. Généralités sur les hormones

Définitions

Une hormone est définie comme une substance chimique qui est
produite par une glande spécialisée située en un endroit de lřorganisme et
transportée à distance sur un organe cible qui répond par une action de
régulation des fonctions précises dans lřorganisme.
A côté des glandes, il est actuellement connu aussi quřune hormone
peut être produite par des tissus non glandulaires situés dans plusieurs endroits
ou sites de lřorganisme, ou quřelle peut être transportée par dřautres
mécanismes que la circulation sanguine.
Cours de Biologie Clinique | 152

Figure 43 : Localisation des glandes endocrines dans lřorganisme.

Notons que certains organes, agissant comme des glandes endocrines,


ne sont pas représentés ici ; ce sont la rate, le rein et le foie.

2.2.13.2. Nature chimique et métabolisme hormonal

Les hormones se classifient en plusieurs catégories chimiques : elles


sont tantôt de nature polypeptidique ou protéique, tantôt stéroïdienne, ou
encore ce sont des dérivées dřacides aminés (AA) ou dřacides gras (AG). A ce
titre, elles obéissent donc aux processus métaboliques de toute substance
chimique : biosynthèse et sécrétion, transport, biotransformation et élimination.

2.2.13.2.1. Biosynthèse et sécrétion

Pour les hormones polypeptidiques ou protéiques, le processus de


synthèse est celui des protéines. Il se déroule au niveau des ribosomes ou du
réticulum endoplasmique granuleux. De là, les hormones sont transférées à
l'appareil de Golgi où a lieu la formation des granules sécrétoires dont le
contenu est expulsé hors de la cellule, le plus souvent par exocytose.

Pour les hormones stéroïdiennes, le précurseur est constitué par le


cholestérol et la transformation s'effectue grâce à des enzymes situées dans les
mitochondries et le réticulum endoplasmique. Il n'y a pas de stockage sous
forme de granules.
Cours de Biologie Clinique | 153

Les hormones dérivées des acides aminés ont un mode de formation


assez semblable à celui des stéroïdes. Mais le stockage cellulaire se fait sous
forme de granulations (ex. catécholamines). Le complexe est lui-même lié à la
membrane du granule. L'expulsion de la cellule se fait par exocytose.

Quant aux hormones thyroïdiennes, le processus est très particulier


puisque la synthèse a lieu à l'intérieur de la thyroglobuline, ultérieurement
soumise à une protéolyse libérant les hormones thyroïdiennes.

2.2.13.2.2. Transport

Les hormones sont ensuite déversées dans l'espace extracellulaire d'où


certaines gagnent la circulation qui leur permettra d'atteindre les cellules cibles.
La nature chimique de ces hormones a une incidence sur leur mode de transport
sanguin ainsi que leur durée de lřaction.
Les hormones stéroïdiennes étant généralement hydrophobes, circulent
liées aux protéines en ne laissant disponibles quřune infime proportion
dřhormones libres douées dřactivité biologique. Leur demi-vie plasmatique
varie généralement entre 30 et 100 minutes. Par contre, les hormones
polypeptidiques, hydrosolubles, circulent librement et leur concentration
plasmatique peut subir des fluctuations rapides. Leur demi-vie est de 10 à 30
minutes.

Pour les hormones dérivées dřAA, la demi-vie diffère selon la liaison ou


non aux protéines plasmatiques. La thyroxine (T4), liée à 3 protéines, a une
demi-vie allant à 1 semaine, tandis que lřadrénaline qui circule sous forme libre
a une demi-vie de moins dřune minute, dřoù son action fugace. On admet qu'au
niveau des tissus, seule la fraction libre de lřhormone peut se fixer sur le
récepteur cellulaire.

2.2.13.2.3. Biotransformation et Elimination

Dès sa mise en circulation, l'hormone va être l'objet de processus


chimiques complexes. Pour l'essentiel, ces processus aboutissent à l'inactivation
de l'hormone : attaque des protéines par des enzymes protéolytiques,
transformation des stéroïdes et des amines après hydroxylation et ou oxydation
en composés glucuro et sulfoconjugués.
Le tableau suivant énumère les différentes hormones avec les sources,
leurs natures chimiques et leurs principales actions dans les organes et cellules
cibles.
Tableau XIV : Hormones, sources et effets dans lřorganisme.

Glande endocrine et Nature de


Site dřaction Principaux effets
Hormone lřhormone
Cours de Biologie Clinique | 154
Hypothalamus
TRH (ou thyrotropine- Peptide Lobe antérieur Libération de TSH
releasing hormone) (3 AA*) de lřhypophyse et de prolactine
GnRH (gonadotropin-
releasing hormone) ou
Peptide Lobe antérieur Libération de LH
LHRH (luteinizing
(10 AA) de lřhypophyse et FSH
hormone-releasing
hormone)
CRH (corticotropin- Polypeptide Lobe antérieur Libération
releasing hormone) (41 AA) de lřhypophyse dřACTH et β-LPH
GHRH (growth
Polypeptide Lobe antérieur
hormone-releasing Libération de GH
(40 AA) de lřhypophyse
hormone)
Suppression de GH
Somatostatine ou et TSH ;
GHIH (growth Polypeptide Lobe antérieur Inhibition de
hormone-inhibiting (14 AA) de lřhypophyse gastrine, VIP, GIP,
hormone) sécrétine, motiline
insuline
PRF (prolactin- Lobe antérieur Libération de
Peptide ?
releasing factor) de lřhypophyse prolactine
PIF (prolactin- Lobe antérieur Suppression de
Dopamine
inhibiting factor) de lřhypophyse prolactine
Glande endocrine et Nature de
Site dřaction Principaux effets
Hormone lřhormone
Lobe antérieur de lřhypophyse
Stimulation de la
TSH (thyroid-
formation et de la
stimulating hormone) Glycoprotéine Glande thyroïde
sécrétion des T3 et
ou thyréotropine
T4
Croissance des
follicules ovariens
et, en synergie avec
Ovaire
LH, sécrétion
FSH (follicle œstrogénique et
Glycoprotéine
stimulating hormone) ovulation
Développement
des tubes
Testicule
séminifères,
spermatogénèse
Ovulation,
LH (luteinizing
Glycoprotéine Ovaire formation du corps
hormone)
jaune, sécrétion de
Cours de Biologie Clinique | 155
progestérone
Stimulation du
tissu interstitiel,
Testicule
sécrétion
dřandrogènes
Prolifération de la
glande mammaire,
Protéine (198 Glande initiation de la
Prolactine (PRL)
AA) mammaire sécrétion du lait,
Antagonisme de
lřinsuline

Hormone de
Protéine (191 Organisme Croissance osseuse
croissance ou
AA) entier et musculaire
somatotropine (GH)
Précurseur de β-
Polypeptide
β-Lipotropine (β-LPH) Inconnu MSH et
(91 AA)
endorphines
Stimulation de la
Adrénocorticotropine Polypeptide Cortex formation et de la
(ACTH) (39 AA) surrénalien sécrétion des
stéroïdes

Opiacés
endogènes,
augmentation du
Polypeptide
β-endorphine (β-END) Cerveau seuil de la douleur
(31 AA)
et influence de
lřactivité motrice
extrapyramidale
Dispersion des
α-MSH (α- granules de
Peptide (13
melanocyte- Peau pigment,
AA)
stimulating hormone) pigmentation
cutanée
Peptide (5
Enképhalines Cerveau Cfr β-endorphines
AA)

Glande endocrine et Nature de


Site dřaction Principaux effets
Hormone lřhormone
Lobe postérieur de lřhypophyse
Vasopressine ou Peptide (9 Elévation de la
Artérioles
hormone AA) pression sanguine
Cours de Biologie Clinique | 156
antidiurétique (ADH) Réabsorption de
Tubules rénaux
lřeau
Muscles lisses Contraction
Peptide (9
Ocytocine (utérus, glande (accouchement,
AA)
mammaire) éjection du lait)
Glande pinéal
Neurotransmetteur,
Systèmes stimulation ou
Sérotonine ou 5- cardiovasculaire, inhibition de divers
hydroxytryptamine Indoleamine respiratoire, muscles lisses et
(5-HT) gastro-intestinal, nerfs, rôle probable
et cerveau dans la santé
mentale
Suppression de la
sécrétion de FSH,
Mélatonine Indoleamine Hypothalamus LH et GH,
induction du
sommeil
Glande thyroïde
Stimulation de la
T4 (thyroxine) et T3 Tissus de
AA iodés consommation
(triiodotthyroxine) lřorganisme
dřO2
Inhibition de la
résorption du Ca,
Calcitonine ou Polypeptide
Squelette diminution de la
thyrocalcitonine (32 AA)
calcémie et de la
phosphorémie
Glandes parathyroïdes
PTH (parathyroid Régulation du
Polypeptide Squelette, rein,
hormone ou métabolisme
(84 AA) tube digestif
parathormone) phosphocalcique

Cortex surrénalien
Métabolisme des
glucides, des
protéines et des
Tissus de lipides
Cortisol Stéroïde
lřorganisme Inflammation,
résistance face à
lřinfection,
hypersensibilité
Balance
Aldostérone Stéroïde Rein
hydrosodée

Médullosurrénale
Cours de Biologie Clinique | 157
Noradrénaline et AA Récepteurs Stimulation du SN
Adrénaline aromatiques sympathiques sympathique
Foie, muscle, Glycogénèse,
Adrénaline
tissu adipeux lipolyse

Glande endocrine et Nature de


Site dřaction Principaux effets
Hormone lřhormone
Ovaire
Développement de
Organes sexuels
Stéroïdes caractères sexuels
Œstrogènes accessoires
phénoliques secondaires chez la
féminins
femme
Préparation de
Arbre génital lřutérus à la
Progestérone Stéroïde
féminin nidation, maintien
de la grossesse
Inhibition de la
Relaxine Polypeptide Utérus
contraction utérine
Contrôle de la
Inhibine Polypeptide Hypothalamus
sécrétion de FSH
Testicule
Développement de
Organes sexuels
caractères sexuels
Testostérone Stéroïde accessoires
secondaires chez
masculins
lřhomme
Inhibine Voir plus haut Voir plus haut Voir plus haut
Placenta
Œstrogènes Voir plus haut Voir plus haut Voir plus haut
Progestérone Voir plus haut Voir plus haut Voir plus haut
Relaxine Voir plus haut Voir plus haut Voir plus haut
Cfr LH
hCG (human chorionic Maintien des
gonadotropin ou fonctions du corps
Glycoprotéine Cfr LH
chorio- jaune,
gonadotropin) stéroïdogénèse
fœtale
Hormone placentaire Protéine (191
Cfr prolactine Cfr prolactine
lactogène (hPL) AA)
Pancréas
Régulation du
Plusieurs métabolisme
Insuline Polypeptide
cellules glucidique,
lipogenèse
Polypeptide
Glucagon Foie Glycogénèse
(29 AA)
Cours de Biologie Clinique | 158
Augmentation de
la motilité
intestinale
Polypeptide Polypeptide
Tube digestif Vidange gastrique
pancréatique (36 AA)
Inhibition de la
contraction de la
vésicule biliaire
Glande endocrine et Nature de
Site dřaction Principaux effets
Hormone lřhormone

Tube digestif

Sécrétion du HCl
Peptide (17
Gastrine Estomac Croissance
AA)
muqueuse
Polypeptide Sécrétion du HCO3-
Sécrétine Pancréas
(27 AA) et enzymes
Stimulation de la
Cholécystokinine Ŕ Vésicule
Polypeptide contraction de la
pancréozymine (CCK- biliaire et
(33 AA) vésicule biliaire
PZ) pancréas
Polypeptide Stimulation de la
Motiline Tube digestif
(22 AA) motilité
Neurotransmetteur
Relaxation des
VIP (vasoactive Polypeptide muscles lissses
Tube digestif
intestinal peptide) (28 AA) ↑libération hormones
↑sécrétion eau et
électrolytes
Inhibition de la
gastrine et de la
GIP (gastrointestinal Polypeptide
Tube digestif motilité,
inhibitory polypeptide) (42 AA)
↑sécrétion de
lřinsuline
Libération
dřhormones et
enzymes
pancréatiques
Contraction
Peptide
Bombésine Tube digestif musculaire lisse
(14 AA)
Hypothermie
Changement des
fonctions
cardiovasculaire et
rénale
Cours de Biologie Clinique | 159
Peptide Intestin et
Neurotensine Inconnu
(13 AA) cerveau

Neurotransmetteur
sensoriel,
analgésique
Contraction muscles
Peptide Intestin et
Substance P lisses digestifs
(11 AA) cerveau
Vasoactivité
Salivation
Libération
dřhistamine

Glande endocrine et Nature de


Site dřaction Principaux effets
Hormone lřhormone
Rein
Intestin Absorption Ca et P
↑ résorption os en
Os
1,25 (OH) 2 vit D Stérol synergie avec PTH
↑ réabsorption Ca
Rein
filtré
Erythropoïétine Glycoprotéine Moelle osseuse Hématopoïèse
Foie
Croissance
IGF-I (insulin-like Peptide (70
Diverses cellules cellulaire et
growth factor 1) AA)
linéaire
IGF-II (insulin-like Peptide (67 Activité insulin-
Diverses cellules
growth factor 1) AA) like
Thymus
Thymosine et Peptides (49 Maturation des
Lymphocytes
thymopoïétine et 28 AA) lymphocytes T
Cœur
Tissu rénal, Régulation de la
FAN (facteur atrial Peptide (28
vasculaire et volémie et de la
natriurétique) AA)
surrénalien pression sanguine
Multiples types cellules
PTH-RP (PTH-related Peptide (141 Actions PTH-like
Rein, os
hormon) AA) Marqueur tumoral
Cours de Biologie Clinique | 160
Facteurs de croissance
(de croissance de
lřépiderme, des
Croissance
fibroblastes, de Polypeptides
cellulaire
transformation
familiale, dérivés des
plaquettes, des nerfs)
Monocytes, lymphocytes, macrophages
Stimulation ou
Cytokines (IL** 1-9, inhibition
Polypeptides
TNF***, INF****) croissance
cellulaire

* Acide Aminé,
** Interleukines,
***Tumor necrosis factor,
**** Interferon

2.2.13.3. Fonctions hormonales

De manière large, il sřagit de :

2.2.13.3.1. Fonction régulatrice

La majeure fonction du système endocrinien est le maintien de la


constance du milieu intérieur (homéostasie), en régulant le métabolisme des
éléments minéraux, de lřeau, des hydrates de carbone, des lipides et des
protéines. Les autres fonctions de régulation hormonale concernent les
réponses de lřorganisme face au jeune, à lřinfection, le traumatisme, le stress
psychologique et la reproduction sexuelle.

2.2.13.3.2. Morphogenèse

Les hormones jouent aussi un rôle important dans la croissance et le


développement de lřorganisme. Lřinfluence de lřœstradiol et de la testostérone
sur le développement des caractères sexuels féminins et masculins en est le
meilleur exemple.

2.2.13.3.3. Action intégrative

Dès lors que lřon sait que chaque hormone assure une fonction qui lui
est spécifique, cette dernière est dřautant plus complexe que des hormones
produites par des glandes différentes agissent souvent en synergie pour réguler
Cours de Biologie Clinique | 161
une fonction particulière. Lřexemple illustratif est celui du métabolisme
glucidique dont le maintien requiert le concours des hormones produites par le
pancréas (insuline et glucagon), par lřhypophyse (hormone de croissance), les
glandes surrénales (glucocorticoïdes, adrénaline), par la glande thyroïde (T4) et
par les gonades (œstrogènes). Ces interactions ne sont pas limitées quřaux
seules glandes endocrines, mais elles sřétendent aussi au système nerveux. Les
minéralocorticoïdes (désoxycorticostérone, aldostérone) influencent
profondément lřéquilibre hydrominéral qui est corrélé par lřajustement
simultané du flux sanguin rénal, de la pression artérielle et de la
vasoconstriction assurée par le système nerveux autonome.

2.2.13.3.4. Régulation de la fonction hormonale

Il existe plusieurs mécanismes pour expliquer la balance entre la


production hormonale et les besoins en hormones ressentis par lřorganisme.
Cependant, lřon retient ici le contrôle hormonal et le contrôle par le SNC.

2.2.13.3.4.1. Contrôle hormonal

Lřantéhypophyse occupe la place centrale du contrôle de la sécrétion


des hormones. En effet, les hormones (trophines) quřelles produisent, ont pour
organes cibles dřautres glandes endocrines (glande thyroïde, cortex surrénalien,
gonades). Et en leur absence, celles-ci ne seraient à même dřassurer la stabilité
de leurs sécrétions hormonales.

La production de la plupart des hormones est régie par lřactivité


métabolique de lřhormone elle-même : cřest le rétrocontrôle (ou système de
feed-back) qui peut être positif ou négatif. On dit dřun rétrocontrôle quřil est
positif quand lřaugmentation de la sécrétion hormonale accroit lřactivité de
cette hormone qui, à son tour, amplifie sa sécrétion. Le rétrocontrôle est négatif
quand lřaugmentation de la sécrétion hormonale décroit lřactivité de cette
hormone qui, à son tour, réduit sa sécrétion. Généralement, cřest le
rétrocontrôle négatif qui est le principal mécanisme de contrôle de la sécrétion
hormonale.

2.2.13.3.4.2. Contrôle du SNC

Le SNC exerce un contrôle primaire sur la sécrétion des hormones post


hypophysaires (Ocytocine et ADH), et médullo-surrénaliennes (adrénaline).
Lřimportance de la relation entre le SNC et le système endocrinien apparait à
travers les mécanismes de rétrocontrôle faisant intervenir lřhypothalamus qui
reçoit aussi les signaux en provenance des centres supérieurs du cerveau (open-
loop system). Lřexemple illustratif ici est celui de la réponse hormonale face au
stress.

2.2.13.3.5. Méthodes de dosage des hormones


Cours de Biologie Clinique | 162

Lřon dispose actuellement de divers procédés de dosages hormonaux.


Mais, ils peuvent être divisés en 4 catégories.

2.2.13.3.5.1. Les explorations fonctionnelles (ou bioessais)

Le principe est de mettre en évidence la présence de lřhormone par


lřobservation de son activité biologique propre. Ce sont les premières méthodes
utilisées, et en général, les seules disponibles au début. Aujourdřhui, elles sont
surtout dřun intérêt historique. Mais, malgré la mise au point dřautres méthodes
plus performantes, elles conservent encore tout leur intérêt dans la recherche
fondamentale.

2.2.13.3.5.2. Le dosage des récepteurs hormonaux

Le principe est lřinteraction in vitro de lřhormone à doser avec son


récepteur spécifique, en présence dřune autre hormone marquée que déplace la
première. Ce dosage est plus sensible que les explorations fonctionnelles.
Cependant, les récepteurs ou la molécule marquée (traceur) peuvent être
dégradés par les enzymes compris dans lřéchantillon. A cela, sřajoute la
préparation complexe des récepteurs ainsi que leur labilité in vitro. Ce qui en
limite lřapplication en routine.

2.2.13.3.5.3. Les techniques immunologiques

Le principe est basé sur lřutilisation dřanticorps dirigés spécifiquement


contre une hormone. Il est donc nécessaire de rendre antigénique lřhormone à
doser. La liaison Ag-Ac sřobtient en utilisant un Ac monoclonal ou polyclonal.
LřAc ou lřAg est marqué (avec un radio-isotope, une enzyme, ou une substance
fluorescente ou luminescente). On étudie alors lřéquilibre entre molécules
libres et liées, marquées et non marquées et on déduit la concentration de
lřhormone dosée en comparant la valeur obtenue à une courbe dřétalonnage
(figures 40 et 41).

1° Dosages avec un excès de réactif : méthodes immunométriques ou


méthodes directes

Figure 44 Principe du dosage immunologique dřune hormone.


Cours de Biologie Clinique | 163
2° Dosages avec réactif limitant : méthodes par compétition ou
méthodes indirectes

Figure 45 : Principe du dosage immunologique dřune hormone.

2.2.13.3.5.4. La biologie moléculaire

Son application en hormonologie permet aujourdřhui le dosage


hormonal par la quantification dřARNm.

2.2.14. Les marqueurs de l’inflammation

2.2.14.1. Généralités

Les marqueurs de lřinflammation sont, en général, des Protéines de la


Réaction Inflammatoire (PRI), synthétisées par le foie sous lřaction de certains
médiateurs, notamment IL-1(Inter-Leukine-1), IL-6 (Inter-Leukine-6), TNFα
(Interféron-alpha) qui voient leur concentration sérique élevée dřau moins 25%
au cours dřun syndrome inflammatoire. Il en existe plus de 30, les plus étudiées
sont : C Reactive Protein (CRP), Serum Amyloïde A protein (SAA), α1-anti-
chymotrypsine, haptoglobine, orosomucoïde, fibrinogène, céruléo-plasmine,
transferrine, ferritine, α-1anti-trypsine, fraction C3 du complément, α 2-
macroglobuline.
A côté de ces protéines, lřon peut citer : les anomalies de
lřhémogramme évoquant un syndrome inflammatoire ; il sřagit de la V S et de
lřélectrophorèse des protéines. Toujours faire une sélection, afin de choisir le
marqueur le plus fiable.

2.2.14.2. Etude des Protéines de la Réaction Inflammatoire :


PRI

2.2.14.3. Qualités d’un marqueur idéal

a. dépendance exclusive ou sélective au processus inflammatoire ;


b. ne doit pas être la cause de lřinflammation (agent causal) ;
Cours de Biologie Clinique | 164
c. cinétique rapide (se révéler rapidement) ;
d. élévation significative pour une réaction faible (sensibilité élevée) ;
e. élévation proportionnelle au degré de lřinflammation ;
f. dosage facile, reproductible, standardisable ;
g. coût modéré du dosage ;
h. excellentes valeurs prédictives positives (VPP) et valeurs prédictives
négatives (VPN) : sa présence ou son absence doit respectivement affirmer ou
infirmer lřexistence dřune inflammation.

2.2.14.4. Problèmes rencontrés avec les PRI

1° Lřamplitude de variation au cours de la réaction inflammatoire est


différente dřune protéine de la réaction inflammatoire à lřautre.

1.5 fois Fraction C3, céruléoplasmine


2 à 4 fois Orosomucoïde, alpha-1-
antitrypsine,
alpha-1-anti-chymotrypsine,
fibrinogène, Haptoglobine
1000 fois CRP, SAA
Diminution Albumine, transferrine

2° La cinétique de variation des protéines nřest pas homogène :


- Rapide : CRP, SAA ;
- plus lente pour les autres PRI ;
3° Il nřy a pas de variation identique suivant lřâge ;
4° Il nřy a pas de réponse au traitement identique ;
5° Lřassociation de plusieurs situations pathologiques peut aboutir à des
valeurs nouvelles ou basses pour certaines protéines.
Cinétique des Protéines de la Réaction inflammatoire (PRI) :
Cours de Biologie Clinique | 165

Figure : 46 Cinétique des Protéines de la Réaction Inflammatoire.

2.2.14.5. Etude détaillée

2.2.14.5.1. Haptoglobine

Est un Alpha-2-glycoprotéine, synthétisé au niveau du foie. Il a une


cinétique lente, variant parallèlement à lřorosomucoïde. Il augmente après 3-4
jours.
Variations physiologiques:
- il baisse en cas dřhémolyse, chez le nouveau né et en cas
dřinsuffisance hépatique sévère ;
- il sřélève en cas de réaction inflammatoire chronique.
Intérêts spécifiques:
Cřest une protéine majeure de lřinflammation, qui permet dřinfirmer
un syndrome inflammatoire à VS accélérée ou dřaffirmer un syndrome
inflammatoire à VS normale. Il permet aussi de faire le diagnostic des
syndrômes hémolytiques (LED, Anémie hémolytique auto-immune).

2.2.14.5.2. La transferrine

Est une protéine de transport du fer évoluant des entérocytes vers le


plasma surtout, synthétisée par le foie. Elle a un délai de modification lent,
et augmente après 3-4 jours. Elle a une ½ vie de 8 jours.
Cours de Biologie Clinique | 166
Variations physiologiques et pathologiques:
Elle varie peu avec lřâge, régulée par le niveau du fer dans
lřorganisme, elle sřélève pendant la grossesse, car besoins de la gestante et
de lřenfant, et baisse au cours de la réaction inflammatoire (protéine
négative) de façon parallèle à lřalbumine, au cours de lřinsuffisance
hépatocellulaire, ainsi quřau cours de fuite protéique (glomérulaire,
intestinale, brûlures). Son taux augmente en cas de carence martiale,
dřhépatite virale, oestrogénothérapie.
Intérêt spécifique:
Il sert au diagnostic des carences martiales. Au cours dřun syndrome
inflammatoire, son abaissement non parallèle à celui de lřalbumine évoque
une carence martiale associée. Il est utile au dépistage des hémochromatoses
(accumulation du fer dans le foie ou autres tissus).

2.2.14.5.3. La ferritine

Est une protéine de haut poids moléculaire, intracellulaire,


constituant une réserve échangeable du fer. Il se présente sous forme
atoxique. Son délai de modification est lent. Ses valeurs physiologiques sont
de 30-300µg/L pour lřhomme, 20-200µg/L pour la femme.
Son abaissement signe une carence martiale.
Son élévation survient en cas de syndrome inflammatoire, de
maladie de Chauffard-Still où elle est tres spécifique (forme particulière de
polyarthrite chronique évolutive de lřenfant, sans modification des
articulations, avec fièvre, anémie et splénomégalie et adénopathies),
dřalcoolisme aigu, dřanomalie de lřérythropoïèse, de lyse cellulaire aiguë
(infarctus, hépatite, rhabdomyome ou tumeur du myocarde rencontrée
surtout chez les sujets jeunes), de cirrhose.
Son intérêt spécifique :
Elle aide au diagnostic des carences martiales et des surcharges en
fer. Il nřest pas un marqueur de lřinflammation en 1ère intention.

2.2.14.5.4. Le C-reactive protein: CRP

2.2.14.5.5. Chimie : cřest une protéine pentamérique,


constituée de 5 sous-unités de 23 kd, chaque sous-unité contient 206 acides
aminés. Elle est présente sous forme de trace.

2.2.14.5.5.1. Production : elle est synthétisée au niveau du


foie sous lřaction de lřIL6, IL1, TNFα. Le taux commence à sřélever 4 à 6h
après une lésion tissulaire et sřaccroît exponentiellement, doublant chaque
8-9h.

2.2.14.5.5.2. Fonction : comme protéine de lřinflammation, la


CRP a un rôle important dans la reconnaissance et lřactivation du processus
Cours de Biologie Clinique | 167
inflammatoire, induisant lřactivation du complément. Elle induit
lřexpression des molécules dřadhésion. Elle augmente la phagocytose,
active les leucocytes, les macrophages et lřopsonisation ou facilitation de
leur phagocytose. Elle a une activité anti-microbienne.

2.2.14.5.5.3. Délai de modification

Il est très rapide, il sřélève dès la 4è heure. Sa ½ vie est de 12 heures.

2.2.14.5.5.4. Variations physiologiques:

1) Il nřy a pas de modification avec lřâge ;


2) Il nřest pas modifié par les anti-nflammatoires, les
stéroïdiens et les immunosuppresseurs ;
3) Il baisse en cas de lřinsuffisance hépatocellulaire, mais à
un stade sévère uniquement ;
4) Il sřélève en cas de réaction inflammatoire jusquřà 300mg,
et en cas dřinfections bactériennes surtout.

2.2.14.5.5.5. Intérêts spécifiques:

1) Il aide au diagnostic des maladies inflammatoires ;


2) Il sřabaisse au cours de LED, de la maladie de Gougerot,
mais sřil est élevé, il faut penser à une infection intercurrente ;
3) Son élévation est constatée en cas de Polyarthrite
Rhumatoïde, de SPA et de vascularites (autour de 40mg) ;
4) Il sert au suivi de la maladie de Horton (artérite à cellules
géantes, de cause inconnue, touchant particulièrement les carotides) : il est
utile pour dire sřil existe encore une activité inflammatoire. Maladie trouvée
souvent chez une personne âgée avec une VS à 30mm|h ;
5) Cřest un marqueur dřefficacité de la maladie
inflammatoire dřautant quřelle nřest pas modifiée par les corticoïdes.
Associée à une anémie ferriprive, une CRP élevée doit faire rechercher un
cancer digestif ;
6) Dans les maladies infectieuses, ce test aide au :
Dépistage dřune infection néonatale;
Dépistage dřune infection en fin de grossesse ;
Surveillance des arthrites septiques;
Diagnostic des méningites bactériennes versus méningites virales ;
Diagnostic des pyélonéphrites versus infections urinaires basses ;
Marqueur dřefficacité des anti-infectieux grâce à sa cinétique
rapide.

2.2.14.5.6. Les autres marqueurs


Cours de Biologie Clinique | 168
2.2.14.5.6.1. Les anomalies de l’hémogramme évoquant un
syndrome inflammatoire :

- Anémie;
- Polynucléose (ou neutropénie), mais inconstante ;
- Thrombocytose > 400.000|mm3 voire 1.000.000|mm3, évoquant un
syndrome myéloprolifératif.

2.2.14.5.6.2. La VS

Le résultat dépend:
du nombre, de la forme des hématies et du volume ;
du contenu plasmatique : les facteurs qui modifient la répulsion
électrique des hématies entre elles et favorisent la formation de rouleaux de
sédimentation. Ces facteurs sont:
◊ Protéines asymétriques lourdes chargées négativement :
- fibrinogène surtout, les β-globulines ;
- gammaglobulines, et à un moindre degré, les α2-globulines
(haptoglobine, céruléoplasmine) ;
◊ Chaleur et acidose.
de lřhématocrite;
La VS nřest pas influencée par la tº corporelle.
Le fibrinogène sřélève en 3-4 jours et le retour à la normale dure
plusieurs semaines après une infection. En cas dřinsuffisance hépatique, le
fibrinogène baisse rapidement.

2.2.14.5.6.3. Intérêt spécifique de la VS en pratique

1) Une gammapathie monoclonale ou polyclonale doit être


suspectée, si une VS est retrouvée élevée sans autres stigmates de syndrome
inflammatoire.
2) La VS est normale dans 30 à 50% des cancers.
3) Elle permet le suivi des Polyarthrites Rhumatoïdes, des
vascularites où elle est élevée dans 90% des cas, le suivi de la maladie de
Horton ou artérite temporale (mais <20mm dans 8,5% des cas).
4) Il faut noter que la brucellose et la salmonellose modifient
peu la VS, alors que lřendocardite et la tuberculose lřélèvent constamment.
En résumé, on peut dire que la VS est un examen simple, rapide,
économique mais trop peu spécifique. Elevée, elle peut uniquement refléter
un syndrome ou affection sédimentaire. Normale, elle nřélimine pas un
syndrome inflammatoire. Ce nřest quřun syndrome ou une affection
sedimentaire.

2.2.14.5.7. Electrophorèse des protéines plasmatiques


Cours de Biologie Clinique | 169
Ses intérêts spécifiques sont nombreux : Intérêts du Ŗ coup dřœilŗ, en
examinant les tracés électrophorétiques, comme cela a été largement illustré
dans la figure 19.

2.2.14.6. Conclusion

Les marqueurs de lřinflammation orientent vers une maladie


organique dans certaines situations de diagnostic difficile et permettent de
suivre, en particulier, lřefficacité du traitement.
Les protéines de cinétique rapide comme, la CRP, SAA, α1-
antichymotrypsine, semblent se rapprocher le plus du marqueur idéal, mais
sont insuffisantes pour couvrir toutes les situations pathologiques.
Les marqueurs lents et majeurs comme le fibrinogène,
lřhaptoglobine et lřorosomucoïde peuvent être redondants de la VS.
A côté, ne pas oublier les anomalies de lřhémogramme et de
lřélectrophorèse des protéines plasmatiques.
Lřassociation de plusieurs protéines peut revêtir un certain intérêt.

Tableau XV : Situations contribuant à normaliser la VS au cours dřun


syndrome inflammatoire, ou à lřélever, en absence dřun syndrome
inflammatoire.

Facteurs abaissant la VS Facteurs ↑ la VS

Anomalies des GR : Age avancé


-microcytose, polyglobulie ; Sexe féminin
-hémolyse (haptoglobine abaissée). Oestrogènes (via fibrinogène)
Hypofibrinémie (fibrinolyse, CIVD) Anémie si Hcte < 30%
Syndrome néphrotique Macrocytose
Hypogammaglobulinémie Hypergammaglobulinémie
Hyperviscosité (cryoglobulinémie) Héparine
Hyperleucocytose majeure
ANS, Cachexie

2.2.15. Marqueurs tumoraux (MT)

2.2.15.1. Généralités

2.2.15.1.1 Introduction

Aux USA, plus dřun million de personnes apprennent pour la


première fois quřils sont atteints dřun cancer. Cependant, lřAmerican Cancer
Society estime que le cancer a été responsable de 564.000 décès en 1998,
soit ±23% de tous les décès.
Cours de Biologie Clinique | 170
2.2.15.1.2 Définitions

1° Oncologie (du grec oncos = tumeur), cřest lřétude des tumeurs ou


des néoplasies.
2° Cancer (du latin crabe) désigne toutes les tumeurs malignes.
3° Les MT ou Marqueurs Tumoraux peuvent être considérés comme
des indicateurs biologiques de la présence dřune tumeur.
En pratique, ce terme fait habituellement référence à une molécule
qui peut être détectée dans le plasma ou dans tout autre liquide de
lřorganisme. Il sřagit des substances produites principalement par les
cellules cancéreuses et que lřon peut retrouver dans le sang, telles que les
antigènes membranaires, les protéines cytoplasmatiques, les enzymes et les
hormones.

2.2.15.2. Les qualités d’un Marqueur Tumoral idéal

Production par la seule cellule cancéreuse ;


Etre libéré dans un milieu biologique facilement accessible ;
Totalement négatif chez des sujets en bonne santé=100%
spécifique à un tissu ou un organe ;
Totalement positif pour un type de tumeur : 100% sensible
(détection à faible concentration) ;
Doit permettre:
- la détection et la localisation;
- la mesure de lřextension et le suivi de lřévolution ;
- lřévaluation de lřefficacité du traitement.
A ce titre, un MT idéal nřexiste donc pas.

2.2.15.3. Classification et application

La classification des MT est fonction de leur nature chimique.

1) Glycoprotéines membranaires et sécrétées :


- Mucines: CA 15-3, CA 125, CA 19-9
- Molécule dřadhérence : ACE (Antigène Carcino-Embryonnaire)
- Transporteurs: AFP ( Alpha Foeto-Protéine)
2) Hormones et dérivés: HCG (Human Chorionic
Gonadotrophin), Tg (Thyroglobuline), CgA, Gastrine, Glucagon, Insuline,
Catécholamines, Calcitonine, etc…
3) Enzymes et dérivés : PSA (Prostate Specific Antigen),
NSE (Neuron Specific Enolase), PAP (Phosphatase Acide
Prostatique), LDH (Lactico-Déshydrogénases)…
Cours de Biologie Clinique | 171

Figure 47 : Les principaux marqueurs tumoraux et les organes qui les


produisent dřaprès M.F.Pichon et Collaborateurs.

Tableau XIV : Quelques marqueurs tumoraux.

2.2.15.4. Intérêt clinique des MT

Faire un bon usage du MT implique :


Cours de Biologie Clinique | 172
- Faire le choix du marqueur tumoral, en fonction de la tumeur
primitive selon les Standards, Options et Recommandations de la FNCLCC
(Fédération Nationale des Centres de Lutte Contre le Cancer). France
- Le respect des recommendations.

Dépistage
- Il sřagit de lřidentification des sujets atteints (qui sřignorent) dans
une population asymptomatique, en vue dřun diagnostic précoce ou
préventif.
- Types de dépistage :
1°Dépitage standard :
a) Consiste à identifier, dans une population
asymptomatique, à lřaide dřun test approprié, les sujets probablement
atteints dřun cancer ou dřune lésion pré-cancéreuse ;
b) Critères de lřOMS pour réaliser un dépistage standard :
-Maladie présumée fréquente, constituant un problème de santé
publique ;
-Détectable à un stade latent préclinique ;
-Traitement efficace précoce.
c) Caractéristiques des tests à utiliser : sensible, spécifique, sans
danger et facilement réalisable ;
d) Coût supportable pour la collectivité.
2°Dépistage de masse : Est illusoire, non justifié et coûteux.
3°Dépistage sur des populations à risques.
4°Dépistage individuel organisé ou planifié (check up).
Diagnostic
Le diagnostic histologique est porté au terme dřune démarche
intégrant des arguments cliniques, iconographiques et biologiques.
Cependant, certains MT sont assez spécifiques que pour avoir une valeur
diagnostique incontestable ; dès lors quřils ont atteint un taux significatif.
Cřest le cas de :
-catécholamines, pour le Neuroblastome ;
-PSA, pour le cancer de la prostate ;
-PSA >100µg/L=facteur prédictif dřune atteinte métastasique osseuse
;
-calcitonine pour une atteinte osseuse, CMT.
-HCG, pour le cancer testiculaire ;
- AFP+HCG : tumeurs germinales non séminomateuses ;
-CA 15-3 : cancer du sein ;
-AFP > 400µg/L : hépatocarcinome chez un patient cirrhotique.
Bilan d’extention
- Cřest un bilan qui permet de voir si la tumeur a regressé, sřest
arrêtée à un niveau ou si elle sřétend.
Suivi du traitement
Cours de Biologie Clinique | 173
- Détermination, par un test approprié, de lřévolution dřune
pathologie lors dřune prise en charge thérapeutique adaptée.
Etablissement du pronostic
- Il sřagit de dire si le pronostic vital est mis en jeu en fonction du
retentissement de la pathologie sur lřétat général du malade.

2.2.15.5. Surveillance post-thérapeutique et détection précoce


des récidives

1) Les variations de la concentration sérique du marqueur


reflètent lřefficacité du traitement : figure ci-dessous.
Dřoù la concentration initiale du marqueur est indispensable à
connaître ; soit on peut noter :
-Une augmentation paradoxale : cřest lřeffet pointe (à différencier
avec la progression tumorale sous traitement : 1 à 3 mois après la première
cure) ;
-Une décroissance initiale(en T1/2 vie) ;
-Une cinétique tardive de décroissance. Le nadir=> concentration du
MT mesurée sous ou après traitement = indicateur de maladie résiduelle.

Figure 48 : Evolution favorable dřun traitement, courbe descendante


au cours de temps.

2) En termes de profils évolutifs typiques, on peut également


noter :
- Un échappement thérapeutique : augmentation continue du
marqueur sous traitement ;
- Une inefficacité thérapeutique globlale :
 Demi-vie allongée
 Nadir élevé
- Une inefficacité thérapeutique partielle :
 T1/2 initiale courte
 Décroissance bi-exponentinentielle
 Nadir intermédiaire
Cours de Biologie Clinique | 174
 Seconde composante traduisant une libération physiologique ou
pathologique du marqueur.
Cřest une reprise évolutive néoplasique probable.
- Une inefficacité thérapeutique
 T1/2 initiale courte
 Décroissance monophasique
 Nadir faible

Figure 49 : Evolution défavorable dřune thérapie, décroissance


monophasique et Nadir faible.

Toutefois, il sřavère que des dosages répétés et réguliers des MT à


chaque visite de surveillance ne seront pas vraiment utiles, ni sur le plan
thérapeutique, ni sur le plan psychologique. Mais la surveillance clinique est
souvent suffisante. Il sera plutôt nécessaire dřétablir un protocole de
surveillance après traitement.

En conclusion, la surveillance post-thérapeutique et la détection


précoce des récidives permettent :
1° Lřestimation du temps de latence clinique, durant laquelle le
maladie est dans un état clinique dřaccalmie ou de guérison apparente ;
2° Prévision de la nature des récidives, après le temps de latence ;
3° Lřadaptation du calendrier de surveillance.

e) Bilan dřextension locale, ganglionnaire ou métastasique.


Bref, il sřagit de lřévaluation du pronostic et orientation de la
thérapeutique.
Ex : - AFP et HCG : tumeurs germinales non séminomateuses.
- CA 15-3 : cancer du sein.
- PSA > 100µg/l) : facteur prédictif dřune atteinte métastasique
osseuse.
Pour ce faire, il faut procéder de la manière suivante :
- le premier dosage a lieu avant le début du traitement et permet
dřavoir la valeur de référence ;
- dřautres dosages en cours de traitement font apprécier la réponse
thérapeutique et adapter le traitement ;
Cours de Biologie Clinique | 175
- les dosages pratiqués à la fin dřune cure et répétés après un temps
de latence, entrent dans le cadre du suivi, notamment de la détection des
rechutes.

2.2.15.6. Analyses Biologiques des MT

1. Le sérum est le liquide principal pour la recherche des MT.


Dřautres liquides sont utilisables, en fonction de la nature et de la localisatio
de la tumeur.
2. Les méthodes de dosage usuelles sont des méthodes
immunochimiques.
Le Marqueur est pris en sandwich entre deux réactifs (de capture et
de mesure).

Figure 50 : Détection immunochique des MT ; les cellules T sont


prises en sandwich par 2 réactifs (de capture et de mesure).

3. Le dosage doit se faire dans un même laboratoire, car les réactifs


utilisés sont variés.
4. Lřinterprétation des résultants exige du médecin la prudence :
tenant compte des fluctuations, des faux négatifs et des vrais négatifs.

2.2.15.7. Commentaires synoptiques et Attitudes cliniques vis-à-


vis des résultats des MT

Un grand nombre de marqueurs tumoraux ont été décrits, comme


nous venons de voir précédemment, et de nouveaux apparaissent chaque
année.
Seuls certains dřentre eux ont résisté à lřépreuve du temps et ont fait
la preuve de leur utilité clinique. Cřest pourquoi, nous les reprenons ci-
dessous, pour une meilleure compréhension.

2.2.15.7.1. Cancer du sein


Cours de Biologie Clinique | 176
Le premier cancer chez la femme.
Ce cancer, avec celui de lřovaire, entre dans le cadre des maladies
génétiques. 1 ou 2 marqueurs peuvent être utilisés : lřantigène CA15-3 et
lřACE.

1° CA 15-3
a) Nature
Décrit en 1985, il sřagit dřune glycoprotéine de HPM (Haut Poids
Moléculaire) présente au pôle ductal des cellules épithéliales normales de
nombreux tissus (sein, utérus, ovaires). Dans la cellule cancéreuse, elle
sřexprime sur toute la cellule.
b) Dépistage et diagnostic précoce
Sa faible sensibilité ne permet pas son utilisation pour le dépistage et
le diagnostic précoce, car son taux est élevé seulement dans 30-50% des cas.
Peu spécifique, car elle sřélève aussi chez les femmes saines au 3e
trimestre de la grossesse, et dans certaines pathologies non cancéreuses.
c) Surveillance après traitement
Une réduction importante de son taux sřobserve après exérèse
chirurgicale, mais elle est lente après radiothérapie et chimiothérapie. Son
dosage répété et régulier permet de détecter précocement près de la moitié
des récidives.
En résumé, le dosage de CA15-3 nřa aucune valeur dans le dépistage
et le diagnostic précoce du cancer de sein, mais conserve une valeur
pronostique. Son intérêt est réel dans le suivi des patientes traitées.

2° Antigène Carcino-Embryonnaire (ACE)


a)Nature
Cřest une glycoprotéine onco- fœtale de 200 KDa, sécrétée par les
organes du tube digestif fœtal (foie, pancréas) à partir du 2e mois de la
grossesse. Arrêt de la synthèse après la naissance, mais présente en petites
quantités dans le plasma sanguin dřun sujet adulte normal < 2,5 ug/L.
b) Dépistage et diagnostic précoce
Marqueur non spécifique, qui ne permet pas son utilisation dans le
dépistage ni dans lřinterprétation des valeurs élevées. De plus, il nřa pas de
valeur diagnostique précoce, suite à sa faible sensibilité.
c)Pronostic et surveillance
Garde une valeur pronostique importante pour les cancers du sein et
du colon. En effet, le niveau du marqueur reflète en général la masse
tumorale, car le taux sřélève avec la progression de la maladie.
Intérêt important dans la surveillance thérapeutique et dans le
diagnostic des rechutes. Pour certains auteurs, la combinaison ACE+CA15-
3 apporte une amélioration de la sensibilité de détection des récidives.

2.2.15.7.2. Cancer de la prostate


Cours de Biologie Clinique | 177
ème
Le 2 cancer le plus fréquent chez lřhomme, après le cancer du
poumon.
Un des premiers pour lequel on a utilisé la notion de marqueurs
tumoraux.
Il y a environ 20 ans, on utilisait les PAP (Phosphatases Acides
Prostatiques), mais ce marqueur a été abandonné au profit du PSA (Prostate
Specific Antigen).
1° PSA
a) Nature
Une glycoprotéine de 40 kDa exclusivement sécrétée par la prostate
dont le gène est situé sur le chromosome 19.
A une activité protéasique dont le rôle biologique est mal connu.
Présent dans la prostate, le sperme.
Circule sous 2 formes :
1. PSA libre,
2. PSA complexé :
- lié à lřα1-anti chymotrypsine et correspond au PSA total ;
- lié à lřα2-macroglobuline
Le taux normal est < 4ng/ml avec ½ vie de 2 Ŕ 3jrs.
Le taux normal sřélève avec lřâge, lřinterprétation doit donc tenir
compte de lřâge du patient et de son passé médical récent.
Lřhomme jeune < 2,5ng/ml ;
50 - 60 ans < 3.5ng/ml ;
60 - 70 ans < 4,5ng/ml ;
70 - 80 ans < 6,5ng/ml.

b) Dépistage et diagnostic précoce


Pas de valeur pour le dépistage systématique
A une spécificité dřorgane parfaite mais moins bonne spécificité de
pathologie, car varie aussi en cas de pathologies bénignes (adénome,
inflammation, infection). Il indique au moins, que lřorgane est atteint !
Le dépistage systématique du cancer par le dosage de PSA à été
refusé, suite à ce manque de spécificité, sauf antécédent familial.
On observe une bonne corrélation entre le taux sérique de PSA total
et le volume de la glande. « Ceci doit inciter à prendre soins de soi, en
évitant des infections, surtout chroniques, par : le respect d’une hygiène
intime rigoureuse, les rapports sexuels non contaminés, le renouvellement
journalier des sous-vêtements ; car ce sont ces derniers qui provoquent des
infections chroniques uro-génitales ascendantes, d’origine digestive et
urinaire surtout (souillure des sous-vêtements par les selles et les urines).
D’où le développement des urétrites, des cystites, des vaginites, des
cervicites, des prostatites, des urétérites, des pyélonéphrites, des
glomérulonéphrites pouvant aller jusqu’à l’insuffisance rénale, etc).
Cours de Biologie Clinique | 178
Ces infections, qui évoluent souvent à bas bruit durant la période de
vie sexuelle active, sont notamment à l’origine de l’augmentation
progressive du volume prostatique ou adénome bénin chez l’homme.
Avec l’âge, elles favorisent les néoplasies cervico-utérines et
prostatiques qui finissent par se muer en une tumeur maligne ou cancer.
La polygamie, la multiplicité des partenaires, l’obsession sexuelle,
ainsi qu’une vie sexuelle active à un âge très avancé, sont des facteurs
favorisant cet état des choses. Les cancers de la prostate et cervico-utérins
se rencontrent davantage dans cette catégorie de personnes.
Sans oublier d’autres effets collatéraux comme les stress, les AVC
(Accidents Vasculaires Cérébraux), les infarctus de myocarde, les infarctus
pulmonaires, les infarctus mésentériques, et le CIVD (Coagulation Intra-
Vasculaire Disséminée) sous-jacent. Ces accidents, devenus monnaies
courantes, sont actuellement causes de mort subite ou inexpliquée».

c) Pronostic
A une valeur pronostique importante.
Le taux initial avant le traitement permet dřévaluer les possibilités
de rémission.

d) Surveillance après traitement


Son plus grand intérêt réside dans le suivi du traitement et le
diagnostic des rechutes. Le taux baisse en fonction de traitement adopté :
plus rapidement après prostatectomie, plus lentement après radio et
hormonothérapie.
Une élévation du taux sérique après traitement est le signe le plus
précoce dřune récidive ou échappement.
Cours de Biologie Clinique | 179

Figure 51 : En haut, prostate normale, en bas, cancer de la prostate


(volume augmenté, aspect multinodulaire et obstruction de lřurètre).

e) Méthodes de dosage
Nombreuses méthodes de dosage du PSA total (libre, lié) ne donnent
pas les mêmes résultats, pour 2 raisons :
- absence dřune référence internationale ;
- utilisation dřanticorps spécifiques pour la détection de lřantigène.
Le taux de PSA est 1000 fois plus élevé dans le liquide séminal.
Eviter toute manipulation (toucher rectal, massage prostatique) sur la glande
qui peut faire élever le taux de PSA, ni le doser dans les 3 semaines qui
précèdent le TR (Toucher Rectal).

Le PSA total ne permet pas de différencier une hypertrophie bénigne


de la prostate cancéreuse, mais la proportion de PSA libre est plus
importante dans les hypertrophies bénignes de la prostate que dans les
cancers. Ce marqueur a une précision totale, si bien que son association avec
le TR est recommandée.

2.2.15.7.3. Cancers testiculaires

Deux marqueurs, AFP et HCG (Alpha Foeto-Protéine et


Gonadotrophines Chorioniques Humaines), sont très importants dans les
tumeurs germinales du testicule (~95% des tumeurs testiculaires), car ils
permettent dřidentifier lřorigine histologique de la tumeur.

2.2.15.7.3.1. Alpha foeto protéine (AFP)


Cours de Biologie Clinique | 180

a) Nature :
Le premier marqueur qui a été découvert ;
Glycoprotéine de 70kDa ;
Produit par le fœtus au niveau du foie, sac vitellin, tractus digestif
1 an ;
Il persiste chez lřadulte à lřétat de trace : <10 -20 ng /ml ;
½ vie plasmatique de 5-6 jours.

b) Dépistage et diagnostic :
Pas spécifique du cancer testiculaire, car élévation aussi bien dans
états physiologiques que dans certaines pathologies bénignes ;
Dépistage des anomalies du tube neural du fœtus (spina bifida,
anencéphalie, et de plus en plus de la trisomie 21) ;
Utilisation dans le diagnostic des cancers primitifs du foie ;

c) Pronostic et surveillance :
Le taux initial est un facteur de pronostic important ;
Permet de suivre lřefficacité du traitement et dřorganiser la
surveillance post-thérapeutique ;
Un bon signe de récidive.

2.2.15.7.3.2. HCG

Sécrétée par les cellules syncitio-trophoblastiques du placenta


pendant les 3 premiers mois de la grossesse.
A deux sous unités :
- chaîne α ;
- chaine ß spécifique : libre, utile.
Taux plasmatique <0,1ng/ml, ½ vie de 36-48 heures.
Les méthodes de dosage sont immunochimiques basées sur la
spécificité et la nature de lřAc.
Le dosage de ces chaînes serait plus sensible et plus spécifique de
la malignité du type de cancers.
Son intérêt :
Lřintérêt de ce marqueur permet de suivre de près lřévolution sous
traitement ;
En cas de môle hydatiforme, de choriocarcinomes et de cancer
testiculaire chez lřhomme ;
Utilisation la plus courante pour le diagnostic de la grossesse.

2.2.15.7.4 Cancers ovariens

Les tumeurs épithéliales : sont les plus fréquentes.


Cours de Biologie Clinique | 181
Le CA125 : marqueur des tumeurs de type séreux. Peu spécifique
de cette localisation, il peut sřélever dans le cas de :
- femme saine en fonction de son cycle mensuel, 3e trimestre de la
grossesse.
- maladies bénignes : péritonite, pleurésie, cirrhose, endométriose,
kystes ovariens.
Est défini comme un groupe de molécules ayant un épitope
commun reconnu par un Ac monoclonal : OC125.
Taux normal < 30 U/ml.
Taux élevé dans les cystadénocarcinomes séreux dans 80-100% des
cas : bonne sensibilité.
Un bon facteur pronostique.
Intérêt dans le suivi des patients traités, le dosage est réalisé 3 Ŕ 4
semaines après.
Le taux sérique sera alors corrélé au résidu tumoral.
Son élévation signe la récidive.

2.2.15.7.5. Tumeurs Digestives

1) Cancers de lřestomac : CA 72-4


Figure 52 : Muqueuses gastrique et intestinale tuméfiées.

- Meilleur marqueur des cancers gastriques.


- Pas un marqueur de dépistage et de diagnostic.
- Contribue au bilan dřextension.

2) Cancers colo-rectaux : CA19-9 et ACE


- CA19-9 : Ag de différenciation dřorgane, associé impérativement à
ACE.
3) Cancer du pancréas : CA19-9
Cours de Biologie Clinique | 182
N.B : La qualité du diagnostic est améliorée par des combinaisons de
marqueurs plutôt que des dosages isolés : Combinaison : ACE +CA19-9 +
CA72-4

Figure 53 : Tumeur située presquřà la queue du pancréas.

2.2.15.7.6. Cancers bronchiques

La principale cause de mortalité dans les 2 sexes suivie de la prostate


et du sein.
Anapath, on décrit 4 groupes :
1. cancers à petites cellules : NSE (Neuron Specific Enolase)
2. cancer épidermoïde
3. adénocarcinome
4. cancer indifférencié à grandes cellules

2.2.15.7.6.1. Enolase Neuron Spécific (NSE)

Un dimère appartenant à une famille composée de 3 chaînes (α, β,


γ) mais NSE a 2 chaînes (γ- γ).
Retrouvé dans le système nerveux et le tissu neuroendocrinien.
Bonne sensibilité : ↑ dans 70% des cas.
Spécificité assez bonne également.
Utile dans le suivi thérapeutique.

2.2.15.7.6.2. Cyfra 21-1


Cours de Biologie Clinique | 183

Meilleur marqueur de cancer non à petites cellules.


Au stade précoce, nřest pas utilisable dans le dépistage car
sensibilité limitée.
Pas de valeur diagnostique.
Valeur pronostique démontrée, intérêt dans le suivi thérapeutique.
Utilisé en combinaison : ACE + cyfra21-1.
Cours de Biologie Clinique | 184

CHAPITRE III : HEMATOLOGIE


3.1. HEMO-CYTOLOGIE

3.1.1. Hématopoïèse
La moelle osseuse active est le siège dřun processus de multiplication
et de maturation cellulaire à partir des cellules souches. On distingue
plusieurs types de cellules souches :
- Les Cellules Souches Totipotentes (CST) : cellules communes aux
lignées myéloïdes et lymphoïdes. Elles sřengagent dans le cycle cellulaire de
différenciation sous lřinfluence des facteurs de croissance dont IL3 et GM-
CSF (Granulocyte Monocyte-Colony Stimuling Factor).
- Les Cellules Souches Pluripotentes (CFU-GEMM : Colony
Forming Unit : Granulocyte, Erythrocyte, Macrophage, Mégacaryocyte), qui
donnent lřensemble des cellules myéloïdes : érythroblastes, granulocytes,
monocytes et mégacaryocytes. Elles sont stimulées par IL3 et
lřérythropoïétine
- Les Cellules Souches engagées ou progéniteurs, qui donnent des
populations pures en réponse à une stimulation spécifique :
 BFU-E (Burst Forming Unit-Erythrocyte) devient CFUE
(Colony Forming Unit-Erythrocyte), qui est stimulé par lřérythropoïétine
pour donner la lignée érythrocytaire
- GFU-GM (Granulocyte Forming Unit- Granulocyte Monocyte), qui
est stimulé par GM-CSF (Granulocyte Monocyte- Colony Stimuling Factor)
pour donner la lignée granulo-monocytaire
- qui est stimulé par G-CSF (Granulocyte-Colony Stimuling Factor),
pour donner la lignée granulocytaire
- qui est stimulé par M-CSF (Monocyte-Colony Stimuling Factor),
pour donner la lignée monocytaire
 CFU Ŕ Mégacaryocyte, qui est stimulé par la thrombopoïétine pour
donner la lignée mégacaryocyto-plaquettaire

3.1.1.1. Erythropoïèse

Les globules rouges de lřhomme adulte normal proviennent de


cellules souches de la moelle osseuse hématopoïétique. Les cellules souches
engagées ou progéniteurs se différencient et subissent une maturation qui
dure 6 jours environ. Au cours de cette période de multiplication et de
maturation, les cellules subissent des modifications morphologiques et
biochimiques qui déterminent une série de stades bien définis ; on distingue
les proérythroblastes, les érythroblastes basophiles I, les érythroblastes
basophiles II, les érythroblastes polychromatophiles, les érythroblastes
acidophiles. Entre chacun de quatre premiers stades se situe une mitose, si
Cours de Biologie Clinique | 185
bien quřune cellule souche engagée donne théoriquement 16 érythroblastes
acidophiles.

Figure 54 : Différenciation et maturation des cellules sanguines


érythrocytaires.

La classification des stades érythroblastiques repose sur plusieurs


critères : la taille cellulaire, le rapport nucléo-cytoplasmique, la basophilie
du cytoplasme, lřétat de condensation de la chromatine. Au cours de ce
processus, il y a une réduction progressive du volume cellulaire, le noyau
diminuant de volume plus rapidement que la cellule entière.

3.1.1.1.1. Proérythroblastes

Leur nombre est régulé par le nombre dřérythrocytes circulants par


lřintermédiaire de lřérythropoïétine.
Cřest une cellule jeune de 20 Ŕ 25 µm de diamètre qui a un
cytoplasme bleu foncé et un noyau constitué dřeuchromatine avec un ou
plusieurs gros nucléoles occupant une importante surface du noyau.

3.1.1.1.2. Erythroblastes basophiles I et II

Ce sont des cellules de 16 à 18 µm de diamètre au cytoplasme bleu


foncé, et la chromatine du noyau se condense en mottes disposées en rayons
de roue très caractéristiques.

3.1.1.1.3. Erythroblastes polychromatophiles I et II

Cellules dont le rapport nucléo-cytoplasmique continue à décroître,


de même que la taille pour atteindre 9 à 12 µm. Lřhémoglobine envahit
progressivement le cytoplasme en même temps que la basophilie diminue.
Lřérythroblaste polychromatophile a la ferritine disposée en amas.

3.1.1.1.4. Erythroblastes acidophiles


Cours de Biologie Clinique | 186
Les érythroblastes acidophiles possèdent un noyau avec un maximum
dřhétérochromatine. Cřest une cellule chargée de lřhémoglobine. Les
érythroblastes acidophiles parvenus à maturité perdent leur noyau par un
mécanisme dřexpulsion et deviennent des réticulocytes

3.1.1.1.5. Réticulocytes

Les réticulocytes sont de cellules douées de mouvement. Ils se


déplacent et gagnent la circulation où ils ont une durée de vie de 48 heures
avant de se transformer en globules rouges (GR). Les réticulocytes
contiennent une substance réticulo Ŕ filamenteuse mise en évidence par la
coloration au bleu de crésyl.
Beaucoup de matériaux sont nécessaires à lřédification du GR. Il
sřagit de :
Vit B12 Folates : qui jouent un rôle dans la synthèse de lřADN.
Vit B6 : qui jouent un rôle dans la synthèse des porphyrines.
Vit C : qui est un antioxydant.
Vit E : empêche la péroxydation des lipides.
Protéines
Fer, cuivre, cobalt, zinc, …
Régulation :
°Facteurs stimulant : lřhypoxie, lřanémie, les hormones
(érythropoïétine, thyroxine, testostérone, cortisone et somathormone)
°Facteurs inhibant : la polyglobulie, lřatmosphère riche en O2,
lřinsuffisance thyroïdienne.
3.1.1.2. Aspects morphologiques
Proérythroblaste
Cellule arrondie
Taille = 20-30 µm de
diamètre
Rapport nucléo
cytoplasmique élevé
Noyau = rond ; chromatine
fine et nucléoles nets
Cytoplasme = bleu foncé
(richesse en ARN)
Cours de Biologie Clinique | 187
Erythroblaste basophile :
Taille : 15 Ŕ 18 µm
Noyau rond
la chromatine se condense
Le cytoplasme reste
basophile

Erythroblaste
polychromatophile :
Taille : 15 µm
Noyau rond dont la
chromatine se condense plus
nettement
Le cytoplasme devient gris
(superposition du bleu de lřARN et
de lřorangé de lřhémoglobine)

Erythroblaste acidophile :
Petite cellule (10 µm)
Petit noyau rond et dense
Cytoplasme qui a presque la
couleur dřune hématie
Cette cellule perd son noyau
et devient un GR (en réalité un
réticulocyte puis un GR)

Le réticulocyte : obtenu
après l'expulsion du noyau de
l'érythroblaste acidophile
Le réticulocyte possède
encore des ribosomes et des
mitochondries, qui précipitent
avec certains colorants (bleu de
crésyl brillant, bleu de
méthylène nouveau) ou fixent
des composés fluorescents, ce
qui permet de les colorer et de
les quantifier (N = 20 Ŕ 80 g/L).
Durée de vie dans le sang = 3
jours.
Cours de Biologie Clinique | 188
3.1.1.3. Granulopoïèse

Les granulocytes renferment dans leur cytoplasme de nombreuses


granulations classées en 3 catégories différentes suivant leur affinité
tinctoriale : ainsi, on a les granulocytes neutrophiles, éosinophiles et
basophiles. Ces cellules se forment dans la moelle osseuse mêlées aux
cellules de la série érythrocytaire. Elles se développent à partir des cellules Ŕ
souches qui se différencient, puis subissent des multiplications et une
maturation progressive en 4 jours. Elles subissent 4 Ŕ 5 mitoses, élaborent
des granulations spécifiques, et changent leur taille, la forme des noyaux et
la basophilie de leur cytoplasme. Ceci permet de distinguer les stades
suivants de précurseurs : myéloblastes, promyélocytes, myélocytes,
métamyélocytes et granulocytes ou polynucléaires.

3.1.1.3.1. Myéloblastes
Cellules de 20 Ŕ 25 m,
ovalaires ou arrondies dont le rapport
nucléoŔcytoplasmique est élevé, le
noyau a une chromatine ombragée et
quelques nucléoles. Le cytoplasme est
bleu sans granulations ou contient
quelques granulations azurophiles.

3.1.1.3.2. Promyélocytes
Cellules de 20 m avec un
noyau excentré qui présente une légère
concavité. Le cytoplasme est basophile
avec des granulations azurophiles et des
granulations neutrophiles. En regard de
la concavité nucléaire sřobserve une
zone claire occupée par lřappareil de
Golgi.
Cours de Biologie Clinique | 189
3.1.1.3.3. Myélocytes neutrophiles

Cellules de 15 Ŕ 20 m à noyau
excentré, à masse chromatinienne bien
visible. Le cytoplasme acidophile
contient des granulations neutrophiles.

3.1.1.3.4. Métamyélocytes neutrophiles

Cellule de 12 Ŕ 14 m à noyau
réniforme dont la convexité est proche de
la membrane cytoplasmique et la
concavité correspond au centrosome. Sa
chromatine est dense.

3.1.1.3.5. Polynucléaires neutrophiles

Cellule terminale de 12 à 14
microns qui sort de la moelle osseuse
pour circuler dans le sang périphérique et
jouer son rôle de défense. Le noyau est
segmenté et possède 2 à 5 lobes. La
chromatine est condensée, mottée sans
nucléole. Les granulations sont de type
neutrophile.
Cours de Biologie Clinique | 190

Figure 55 : Schéma synthétique de la granulopoïèse.

3.1.1.4. Thrombopoïèse

La cellule tête de lignée est le mégacaryocytoblaste. Elle donne


naissance, par ENDOMITOSE, à une cellule géante de plus de 100 m de ,
multinucléée et appelée Mégacaryocyte.
NB : ENDOMITOSE = division du noyau sans division du
cytoplasme.

La morphologie des mégacaryocytes donne trois types de


mégacaryocytes, en fonction des stades de maturation :

3.1.1.4.1. Mégacaryoblastes ou type I :

Cellules à cytoplasme très basophile sans granulations, au rapport


nucléo-cytoplasmique (N/C) important.

3.1.1.4.2. Mégacaryocytes basophiles ou type II :

Cellules à cytoplasme basophile avec quelques granulations.


Cours de Biologie Clinique | 191

3.1.1.4.3. Mégacaryocytes granuleux ou type III :

Cellules à cytoplasme acidophile et rempli de granulations. Son


noyau est segmenté et le rapport N/C est faible. Les mégacaryocytes sont
de grandes cellules avec, à l'intérieur de leur cytoplasme, des membranes de
démarcation qui apparaissent au cours de la maturation. Ces membranes
vont délimiter les futures plaquettes.
La régulation de la thrombopoïèse se fait par le taux de plaquettes et
la thrombopoïétine.

3.1.1.4.4. Plaquettes ou thrombocytes,

Sont de petites cellules anucléées de 2 à 4 microns qui prennent


naissance dans la moelle hématopoïétique (moelle des os plats). Elles sont
produites par les mégacaryocytes. C'est par la fragmentation de son
cytoplasme que le mégacaryocyte va libérer dans la circulation plusieurs
milliers de plaquettes. Leur nombre est de 150 000 à 400 000 par millimètre
cube de sang.
Cours de Biologie Clinique | 192

Figure 56 : Schéma synthétique de la thrombopoïèse.

3.1.2. Les méthodes d’exploration en hématologie


Lřhématologie comporte trois secteurs distincts :
- la cytologie ;
- lřhémostase ;
- lřImmuno-hématologie ;
Seules les méthodes principales sont citées.

3.1.2.1. La cytologie

Cřest la partie de lřhématologie qui sřoccupe des éléments figurés du


sang. Elle étudie la synthèse, la forme, le nombre, la répartition et le
comportement général de ces éléments dans leur milieu naturel ou dans leur
milieu dřétude.
Ainsi les méthodes dřexplorations sont :
- la numération de GR, GB, plaquettes ;
- le dosage de lřhémoglobine ;
- la mesure de lřhématocrite ;
- le frottis sanguin et la formule leucocytaire ;
- le calcul des constantes globulaires : VGM (Volume Globulaire
Moyen), CCMH (Concentration Corpusculaire Moyenne en Hémoglobine),
TCMH (Teneur Corpusculaire Moyenne Hémoglobinique) ;
- le taux des réticulocytes ;
- la cinétique du fer radioactif ;
- lřexploration des constituants qui entrent dans la composition de
lřhémoglobine : le fer sérique, lřacide folique et vit B12 ;
- le myélogramme ;
- la vitesse de sédimentation.
Cours de Biologie Clinique | 193

3.1.2.2. L’hémostase

Lřhémostase sřoccupe des phénomènes de coagulation, de


lřhémostase primaire et de la fibrinolyse. Ils nécessitent la présence des
protéines de coagulation, du calcium, des inhibiteurs et des activateurs.
Son exploration comporte pour :
Hémostase primaire : le TS (Temps de Saignement), la numération
plaquettaire, le temps de Quick, le temps de céphaline activé, le dosage du
fibrinogène, le dosage du facteur Von Willebrand.
La coagulation : le temps de Quick, le temps de céphaline activé, le
temps de thrombine, le temps de reptilase et le dosage de différents facteurs
de coagulation et de calcium, le temps de coagulation, le temps de Howells,
le dosage des inhibiteurs.
La fibrinolyse : PDF (Produits de la Dégradation de la Fibrine),
D-dimères, complexes solubles, le temps de thrombine, temps de lyse des
euglobulines, le dosage du plasminogène et de lřantithrombine III.

3.1.2.3. L’immuno-hématologie

- la détermination des groupes sanguins ABO et Rhésus.


- la détermination des groupes phénotypés, càd, en plus des antigènes
du système ABO, rechercher les différents antigènes des systèmes Rhésus,
Kell et Duffy.
- le test de compatibilité.
- la Recherche des Agglutinines Irrégulières (RAI).
- le Dépistage Simple des Agglutinines Irrégulières (DSAI).
- le test dřélutions.
- le gel test.
- la technique dřagglutination.

3.1.2.4. Méthodes d’investigation de la fonction médullaire

3.1.2.4.1. Hémogramme

Cytopénie portant sur une, deux ou trois lignées dans le cas :


- raccourcissement de la durée de vie ;
- insuffisance de production.
Hypercytose dans le cas de polyglobulie, mais le passage des
éléments immatures dans le sanguin périphérique traduit une pathologie
médullaire grave.

3.1.2.4.2. Taux de réticulocytes


Cours de Biologie Clinique | 194
Permet dřapprécier la production médullaire en cas dřanémie, de
pancytopénie ou dřhyperhémolyse. Le résultat donné en % doit être apprécié
en valeur absolue, en tenant compte du taux des GR.

3.1.2.4.3. Myélogramme

On le réalise après la ponction de la moelle osseuse, à lřaide dřune


aiguille à IM (Intra-Musculaire).
-Chez lřAdulte : ponction sternale, ponction iliaque ;
-Chez le nourrisson : ponction de la tubérosité tibiale supérieure ;
-Chez lřenfant : ponction iliaque postérieure ;
Les grains de moelle sont étalés par frottis et colorés au MGG (May-
Grünwald-Giemsa) ou utilisé pour dřautres investigations.
La lecture comporte :
-Un temps dřobservation au faible grossissement, pour apprécier la
richesse de la moelle, les cellules étrangères et les mégacaryocytes.
-Un temps dřanalyse des cellules à lřobjectif à immersion (100X)

3.1.2.4.4. Biopsie de moelle

Elle est réalisée en décubitus latéral et position genou Ŕ pectorale, au


niveau de lřépine iliaque postéroŔsupérieure, à lřaide du Trocart de
JAMSHIDI.

3.1.2.5. L’exploration des anémies

3.1.2.5.1. Définition

Lřanémie est définie par la diminution du taux dřhémoglobine


circulante qui peut être accompagnée ou non du nombre des globules rouges
dans un volume plasmatique constant. Ainsi un excès de volume
plasmatique définit lřhémodilution et son déficit définit
lřhémoconcentration.

3.1.2.5.2. Mécanisme physiopathologique

- Perte de sang par lřhémorragie.


- Arrêt de fabrication des hématies par aplasie ou intoxication.
- Destruction excessive des GR ou hémolyse.
- Anomalie de lřhématopoïèse ou de la synthèse de lřhémoglobine
(anémie réfractaire, déficit vitaminique, carence de tout genre…).

3.1.2.5.3. Etiologies des anémies


Cours de Biologie Clinique | 195
On distingue deux causes fondamentales.
 Les causes centrales des anémies :
- Anémies carencielles : fer, vitamines B12, B1, C, PP, B6
(pyridoxine), acide folique, oligoéléments (Zn, Cu, Mn, Mg, Pb…) ;
- Anémies non carencielles : insuffisances médullaires et anémies
sidéro-achrestiques (ensemble dřanémies microcytaires caractérisés par une
augmentation du taux de fer).
 Les causes périphériques des anémies :
- Anémies post hémorragiques aiguës ou chroniques ;
- Anémies hémolytiques par défaut intrinsèque des GR ou par des
agents hémolytiques (défaut extrinsèque des GR).

3.1.2.5.4. Clinique : cfr cours d’Hématologie

- Exploration dans un contexte de normovolémie ;


- Définir lřanémie par le dosage de lřHb ;
- Faire la numération de GR, Ht, Plaquettes, GB… pour apprécier
une anémie isolée ou associée à une anomalie plaquettaire ou leucocytaire
mais aussi pour distinguer une anémie inflammatoire ;
- Calculer les constantes globulaires pour catégoriser lřanémie :

VGM = 90 10 fl

TCMH = 29 3 pg

CCMH = 34 4%

- Réticulocytes, pour apprécier lřétat de la régénération médullaire ;


- Frottis sanguin et formule leucocytaire, pour examiner la
morphologie des GR, GB, Plaquettes, les inclusions et les ponctuations
basophiles ;
- Test inflammatoire : la vitesse de sédimentation ;
- Electrophorèse de lřHb ;
- Myélogramme, pour voir la richesse des éléments nucléés, leur
répartition inter et intra lignées ;
- Coloration de Perls à la recherche des sidéroblastes ;
- Biopsie de la moelle osseuse ;
- Cinétique du radio fer ;
- Incorporation de thymidine tritiée (liée à lřisotope radioactif de
lřhydrogène, de nombre de masse 3) ;
- Culture du sang ou de la moelle ;
- Dosage de lřérythropoïétine ;
Cours de Biologie Clinique | 196
- Dosage du fer, vit B12, acide folique.

3.1.2.5.4.1. Exploration dans un contexte de spoliation


sanguine

- Les pertes sont égales entre le plasma et les globules.


- Les taux sont normaux pendant quelques heures. LřHb baisse en 24
Ŕ 36 heures. Après, on observe la montée du taux des réticulocytes.

3.1.2.5.4.2. Exploration dans un contexte d’hémolyse

Hémolyse extravasculaire : bilirubine indirecte, selles colorées


Hémolyse intravasculaire : Hbplasmatique méthémoglobine
Haptoglobine (Nl : 1 5 g/L).
Hémoglobinurie, hémosidérinurie,
schizocytes (globules rouges cassés).

3.1.2.5.4.3. Exploration dans un contexte de variation


volémique

Volume plasmatique : hypo-volémie hémoconcentration avec


de tous les chiffres Hb, Ht, GR. → →→Si Hb est normale = anémie.
Volume plasmatique : hyper-volémie hémodilution avec de
tous les paramètres →→→ Si Hb est normale dans hémodilution =
polyglobulie.

3.1.2.6. Exploration des hémoglobinopathies

On distingue deux grands groupes :


- anomalies de structure de lřune des chaînes : alpha et bêta. Ex :
HbS
- anomalies de synthèse de chaînes alpha ou bêta. Ex : thalassémie
- Moyens dřétudes :
- hémogramme complet
- frottis sanguin
- recherche du corps de Heinz
- électrophorèse ou iso-électrofocalisation de lřHb en milieu alcalin
ou acide.
- test de Kleihauver
- test de falciformation
- test de stabilité de lřHb en présence dřisopropanol
- étude de lřaffinité de lřHb pour lřO2 et dosage du 2,3-DPG
Cours de Biologie Clinique | 197

3.1.2.7. Prélèvement en Hémocytologie et en Biochimie

3.1.2.7.1. Préambule

La qualité d'un résultat dépend avant tout de la qualité du


prélèvement. Il est par conséquent vain d'attendre du laboratoire un résultat
fiable, si le prélèvement a été effectué dans de mauvaises conditions. C'est
pourquoi, il nous est apparu nécessaire de donner les modes de prélèvement
qui conviennent à la plupart des techniques pratiquées actuellement dans le
Service de Biologie Clinique.

Ce chapitre vise donc à ôter de la tête de la plupart des gens l'idée


selon laquelle il suffit de piquer quelqu'un, de lui prélever le sang et de
l'envoyer au laboratoire.

3.1.2.7.2. Prélèvement de sang

Le prélèvement de sang obéit à des règles qu'il faut observer


scrupuleusement pour que le résultat soit correct ou fiable. D'une façon
générale, il est préférable pour la reproductibilité des résultats et leur
meilleur comparaison, que la prise de sang du malade se fasse le matin à
jeun ; en effet, sait-on par exemple qu'un prélèvement en post-prandial (3
heures après le repas) peut entraîner une diminution du taux d'hémoglobine
de l'ordre de 10 %.

3.1.2.7.2.1. Ponction veineuse

Le sang veineux sera prélevé, de préférence, sans seringue, en


laissant le garrot pendant le minimum de temps nécessaire à l'introduction
de l'aiguille. Le garrot sera donc retiré dès que le sang s'écoule. Une stase
veineuse exagérée provoque une hausse du taux des protéines plasmatiques
de l'ordre de 1g%; l'hémoglobine augmente parallèlement, la réserve
alcaline diminue. Il en est de même de plusieurs constituants chimiques qui
subissent des modifications dans l'un ou l'autre sens.

3.1.2.7.2.2. Le matériel de prélèvement

Doit être soigneusement lavé et rincé à l'eau distillée. Les moindres


traces de sels, d'eau, d'alcool ou d'éther peuvent provoquer une hémolyse qui
rend beaucoup de dosages impossibles ou perturbés.

3.1.2.7.2.3. Conservation

La plupart des constituants chimiques et cellulaires se conservent tout


au plus 6 heures environ à la température ambiante, d'autres moins que cela ;
Cours de Biologie Clinique | 198
2 heures pour le glucose et les facteurs de coagulation. Mis au frigo à 4°C, la
conservation peut s'étaler sur une semaine sans risque. Par contre, les
électrolytes (Na+, K+, Ca++...) se conservent indéfiniment à toutes
températures. Si c'est congelé, la conservation peut s'étaler sur plusieurs
mois, voire des années (à -20° -60°C).
NB : On ne congèle jamais un sang total contenant les globules
rouges, ceux-ci seront hémolysés dans ces conditions.

3.1.2.7.3. Analyses proprement dites

Les analyses se pratiquent soit sur le sérum, soit sur le plasma, soit
sur les globules rouges ou sur le sang total.

3.1.2.7.3.1. Analyses pouvant se pratiquer sur le sérum

C'est le cas de la quasi totalité des analyses biochimiques :


cholestérol, lipides totaux, acide urique, créatinine, protéines, thymol,
kunkel, cadmium, cross, bilirubine, phosphatases, transaminases, amylases,
ainsi que la plupart des enzymes ; la réserve alcaline et les électrolytes, ainsi
que les analyses immunologiques telles que le Coombs indirect, WIEME,
recherche d'Anticorps etc...

Cas du fer sérique : prélever environ 5 ml dans un tube spécialement


préparé par le laboratoire et boucher le tube pour éviter les contaminations.
N.B : a) Le sérum, c'est le plasma défibriné, sans éléments figurés. Il
est obtenu en prélevant le sang dans un tube sec, sans anticoagulant et en le
laissant se cailler pendant 30 minutes ou plus. La rétraction du caillot est
accélérée et complète à froid (température du frigo : 4°C à 8°C), pas au
freezer.
b) Au sujet de la phosphatase acide (PAC) : cette enzyme étant
très labile, sa détermination doit se réaliser dans les heures qui suivent. Il
faut donc prévenir le laboratoire et plonger le tube coagulé dans un bain de
glace.
c) Cas du glucose : ne pas attendre plus de 2 heures, le tube
devant être très propre, afin d'éviter la consommation du glucose par les
bactéries (glycolyse).

3.1.2.7.3.2. Analyses pouvant se pratiquer sur le plasma :

Sang à prélever sur un anticoagulant. Dans ce cas, la nature de


l'anticoagulant peut influencer les réactions chimiques, on en tiendra donc
compte :

a) Sang hépariné (liquémine)


Convient pour l'urée (méthode à l'uréase), bilirubine (microméthode
réservée aux nourrissons et aux grands brûlés), électrophorèse
Cours de Biologie Clinique | 199
d'hémoglobine, hémoglobine alcalino-résistante ou foetale et la G-6-PD.
Ainsi que pour toutes analyses enzymatiques et les constituants cités en 1) -
a), à l'exception des anticorps et de l'électrophorèse des protéines. A la place
de l'héparine, l'on peut utiliser l'oxalate de K ou de Na.
b) Sang oxalaté avec fluorure de sodium
Réservé à la glycémie (et l'urée dans le cas où on n'utilise par
l'uréase).

3.1.2.7.3.3. Analyses pouvant se pratiquer sur les globules


(Rouges et Blancs) ou sang total

a) Sang avec sequestrène (EDTA ou Titriplex : Ethylene Diamin


Tetra Acetic Acid)

C'est un anticoagulant destiné à la cytologie (hématologie ou de


liquide de ponction), hémoglobine, hématocrite, globules rouges,
leucocytes, test d'Emmel, réticulocytes, éosinophiles, résistance osmotique,
Coombs indirect, détermination des groupes sanguins. Les globules rouges
se conservent mieux à son contact. On peut utiliser également de l'oxalate de
sodium ou de K sans fluorure à sa place.
L'oxalate peut remplacer aussi l'héparine, sans trop d'inconvénient.

b) Sang citraté
- Convient mieux pour les tests de coagulation, car il est décalcifiant
modéré dans la proportion utilisée : fibrinogène, taux de prothrombine ou
temps de Quick, tolérance à l'héparine, etc... : dans un tube gradué siliconé,
pipeter 0,5 ml de citrate de sodium à 3,8 % et prélever le sang jusqu'au trait
marquant 5 ml. La prothrombine doit être déterminée endéans deux
heures.
- -Pour la vitesse de sédimentation ou V.S.
La V.S. se pratique sur du sang citraté à raison de 4 volumes de sang
pour 1 volume de citraté à 3,8 %. Généralement, on prélève le sang jusqu'à 2
ml si le volume du citrate est de 0,5 ml. La méthode est ainsi standardisée
avec du citrate.

3.1.2.7.3.4. Analyses pouvant se pratiquer sur le sang


capillaire

Les temps de saignement, de coagulation sur lame ainsi que la


numération des plaquettes se font exclusivement sur sang capillaire, sans
aucun adjuvant. Il en est de même de la goutte épaisse (GE) et de la FL
(Formule leucocytaire), autrement appelée Numération Formule
Leucocytaire (NFL).
Cours de Biologie Clinique | 200
Dans les cas où la ponction veineuse est impossible (grand brûlé), ou
doit être répétée plusieurs fois dans un laps de temps court, les examens
suivants peuvent se réaliser sur sang capillaire : hémoglobine, hématocrite,
leucocytes, globules rouges, groupes sanguins, réticulocytes, urée, glycémie
et bilirubine.

3.1.2.7.4. Quantité de sang à prélever

a) Sang coagulé : au minimum 5 ml de sang, en tenant


compte du fait que la majorité des analyses nécessitent environ 0,2 ml de
sérum, et que 5 ml de sang permettent d'obtenir environ 2 ml de sérum. Pour
mieux faire et éviter de repiquer le malade, l'on prélèvera du coup 10 ml.
b) Sang avec anticoagulant

La proportion entre la quantité de sang et l'anticoagulant est exigée.


Nous venons de le voir par exemple pour la V.S et les tests de coagulation.
Une pincée de séquestrène ou d'oxalate suffit pour 2 ml de sang au
maximum. 0,5 ml de citrate suffit pour 5 ml de sang. Quelques gouttes
d'héparine (1 à 2) suffisent pour environ 5 ml de sang.

En définitive, les modes de prélèvement de sang paraissent


complexes et enchevêtrés, pourtant ils sont simples. Il faut néanmoins les
connaître et les observer scrupuleusement, pour un meilleur rendement de
laboratoire.

3.1.2.8. Exploration des hémopathies

Les hémopathies sont des syndromes qui touchent :


a) les lignées myéloïdes avec augmentation du volume plasmatique,
dřoù lřhyper-volémie qui entraîne une hémodilution avec diminution de tous
les paramètres. Si lřHb reste normale dans lřhémodilution, il faut conclure à
une polyglobulie.
b) les lignées lymphoïdes par :
- la dysmyélopoïèse
- la prolifération des cellules souches
- la prolifération monoclonale des cellules lymphoïdes

Le but de lřexploration est de :


- affirmer et préciser les caractères morphologiques de la
prolifération
- identifier la nature T ou B pour les lymphocytes
- identifier le caractère monoclonal
- rechercher les anomalies du système immunitaire
- préciser le degré dřextension de lřaffection
Cours de Biologie Clinique | 201
- affirmer la myélodysplasie
- préciser le degré de maturité de la prolifération
- préciser le degré de prolifération ou son importance.

Les différentes explorations sont :


- hémogramme complet ;
- frottis sanguin et la formule leucocytaire ;
- myélogramme par ponction médullaire ;
- biopsie médullaire ;
- adénogramme : biopsie ganglionnaire ;
- étude des immunoglobulines ;
- étude du phénotype ;
- études immunologiques ;
- caryotype et recherche de chromosome Ph1 et les différentes
translocations ;
- recherche de lřHb fœtale ;
- biochimie : vit B12, lysosome sérique, acide urique ;
- hémostase pour CIVD ;
- groupage sanguin et phénotype ;
- bilan dřexploration (VS, hyper alpha-2 globuline, fibrinogène).

3.1.2.9. Techniques micrososcopiques hémocytologiques

-Méthodes manuelles-

3.1.2.9.1. Numération des globules rouges

La numération des globules rouges peut être faite sur le sang prélevé
au doigt ou sur le sang prélevé à la veine, et rendu incoagulable par le
Complexon (Titriplex). Dans ce dernier cas, il est très important
d'homogénéiser le sang par inversion ou sur un agitateur rotatif à 45°
dřinclinaison du rotateur ou « Rotator ».
Tout échantillon contenant un caillot, minime soit-il, doit être écarté.

Matériel
Pipette de 0,02 ml bien calibrée.
Tube de 75 x 10 mm avec bouchon en caoutchouc bien adapté.
Liquide de dilution : 1 volume de formol commercial à 40%,
additionné de 99 volumes de citrate de sodium à 3 % : c'est le liquide de
HAYEM.
Chambre à numération : Cellules de BURKER, de NEUBAUER....

Méthode
On dilue le sang à 1/200 en pipetant 20 μl de sang dans 4 ml de
liquide de Hayem placés au préalable dans un tube en verre du modèle décrit
Cours de Biologie Clinique | 202
ci-dessus. Le tube est bouché et retourné plusieurs fois pendant 1 à 2
minutes (Ne pas agiter pour ne pas détruire les G.R).
On remplit ensuite la chambre à numération recouverte de son
couvre-cellule, au moyen d'une pipette de Pasteur. Il faut remplir la chambre
en une seule opération, en prenant bien soin que le liquide ne déborde pas et
ne souille pas la surface supérieure du couvre-cellule. On laisse en position
horizontale pendant 3 minutes pour permettre la sédimentation des éléments.
Il faut faire la numération sans plus attendre, car l'évaporation peut
concentrer le liquide de dilution et fausser les résultats.
La cellule de Bürker (fig.53) a une surface de 3 mm² divisée en
grands et en petits carrés. Les grands carrés ont 1/5 mm de côté et les petits,
1/20 mm de côté.
Les globules rouges sont comptés dans les petits carrés. Les cellules
situées sur le bord supérieur et latéral gauche sont comptées et les cellules
qui chevauchent le bord inférieur et latéral droit des petits carrés sont
négligées.

1/20mm 1/5 mm

Figure 57 : Cellule de Bürker.

La cellule est divisée en petits carrés de 1/20 mm de côté et en grands


carrés de 1/5 mm de côté.
- Justification du mode de calcul :
On a compté N cellules dans 40 petits carrés dont le volume se
calcule comme suit : 40 x 1/20mm x 1/20 mm x 1/10 mm= 1/100 mm3.

Dès lors, le nombre N de cellules doit être multiplié par :


100 x 200 = 20.000 si la dilution est de 1/200.
100 x 100 = 10.000 si la dilution est de 1/100, pour connaître le
nombre des globules rouges contenus dans 1mm3 de sang.
Méthode utilisant la cellule de Neubauer.
Cours de Biologie Clinique | 203
Le sang dilué à 1/200 comme ci-dessus, est introduit dans la cellule
de Neubauer (figure 54) recouverte de son couvre-objet. En comptant les
érythrocytes dans deux rangées horizontales de petits carrés, soit dans 40
petits carrés, il faut multiplier le N obtenu par 20.000 pour connaître le
nombre des globules rouges par mm3.

En comptant les cellules présentes dans 4 rangées de 20, soit dans 80


petits carrés, le nombre N obtenu doit être multiplié par 10.000 pour
connaître le nombre des globules rouges que contient 1 mm3 de sang.
La justification des calculs est la même :
40 petits carrés = 1/20 x 1/20 x 1/10 = 1/4000 mm3
1/4000 x 40 = 40/4000 = 1/100 mm3
Ramener à 1 mm = 1/100 x 100 = 100/100 = 1 mm3.
3

Tenir compte de la dilution (1/200) = 200 x.


Soit 100 x 200 = 20.000
G.R = N x 20.000 si la dilution est de 1/200
N x 10.000 si la dilution est de 1/100.

¼ mm 1/20 mm

Figure 58 : Cellule de Neubauer.

Réseau de la cellule de Neubauer : Elle est divisée en petits carrés de


1/20 mm de côté et en grands carrés de 1/4 mm de côté. Les petits carrés
situés au centre servent à numérer les globules rouges et les grands carrés
situés dans les angles sont utilisés pour la numération des globules blancs.
Cours de Biologie Clinique | 204
Valeurs normales
Hommes ……………………... 4,0 à 6,0 millions par mm3
Femmes………………………. 3,8 à 5,5 millions par mm3
Nouveau-né…………………… 4 à 5,6 millions par mm3
Enfant 1 an ……………………… 4,5 millions par mm3
Enfant 10 ans…………………… 4,7 millions par mm3.

Remarques :
La numération de globules rouges est fastidieuse et ne donne pas de
résultats très précis.
Exemple : - on compte 200 G.R dans 40 petits carrés ; ceci revient à
200 x 20.000 GR/mm3, la valeur est normale. Ceci représente en moyenne
200/40 = 5 GR/petits carrés.
Admettons que le sang soit mal prélevé et contient des micro-caillots
qui embrigadent les GR, on risque de trouver 120/40 petits carrés au lieu de
200, d'où 20 x 20.000 = 2.400.000 GR/mm3. Ceci représente une erreur
importante.
On réalise donc combien de petites erreurs peuvent influencer le
résultat final.

On ne l'utilisera pas pour rechercher la présence d'une anémie ; le


dosage de l'hémoglobine ou la détermination de l'hématocrite donnent plus
rapidement des résultats plus précis. La numération des G.R. reste
néanmoins indispensable pour établir le caractère macrocytaire d'une anémie
(voir les rubriques sur les constantes globulaires).

Les pipettes de dilution à bulbe sont encore largement répandues.


Les numérations sont facilement faussées si on utilise des pipettes
mal calibrées, ce qui arrive fréquemment.
La généralisation de l'usage d'une pipette à hémoglobine de 0,02 ml
et de la méthode de dilution indiquée ci-dessus est souhaitable en vue
d'éliminer un facteur d'erreur important.

3.1.2.9.2. Dosage de l’hémoglobine

Nous utilisons dans le service, la méthode exigeant l'étalonnage d'un


photomètre. Elle exige l'usage d'un photomètre muni d'un filtre vert
correspondant à la bande spectrale de 535 à 545 nm, photomètre permettant,
en outre, des mesures d'extinction de 0 à 2.

3.1.2.9.2.1. Technique

- Prélever 20 mm3 de sang au doigt ou de sang recueilli sur Titriplex


ou EDTA ; les projeter dans un tube à essai contenant 5 ml de solution de
Drabkin (solution de ferricyanure de potassium).
- Rincer la pipette. Agiter.
Cours de Biologie Clinique | 205
- Procéder à la lecture ensuite. Une courbe d'étalonnage donne la
concentration en g d'hémoglobine pour 100 ml de sang. Actuellement, l'on
doit exprimer cette concentration en mol/L ; plus exactement en mmol/L.
Exemple 15 g %, représente 2,4 mmol/L (voir en annexe les tableaux de
conversion des unités).

Attention : Les mesures peuvent être faussées si la solution de


Drabkin est trouble. C'est ce qui arrive pour les solutions déjà anciennes. Si
cet incident survient, il faut écarter la solution trouble et en préparer une
nouvelle.
Voir point sur les réactifs de Drabkin.

3.1.2.9.2.2. Valeurs normales

Homme…………………12,5 + 18 g %, soit 1,9 à 2,8 mmol/L ;


Femme………………….10, 5 - 15 g %, soit 1,6 à 2,3 mmol/L ;
Enfant N.N……………..15,6 - 19,6 g %, soit 2,1 à 3 mmol/L ;
Enfant 1 an…………………………11,2 g %, soit 1,8 mmol/L ;
Enfant de 10 ans ………………… 12,9 g %, soit 2,0 mmol/L.

3.1.2.9.3. Mesure de l’hématocrite (Wintrobe)

L'hématocrite représente la fraction des éléments figurés du sang en


% du sang total, ou c'est le volume qu'occupent les G.R. et autres éléments
figurés dans 100 ml de sang.

On le détermine par centrifugation du sang total jusqu'à ce que les


éléments aient atteint un volume minimal. La hauteur de la colonne des
cellules est ensuite comparée à la hauteur totale.
Le suffixe "crite" signifie : séparation ; en effet, la centrifugation
sépare le plasma et les G.R. notamment.
Intérêt : dire s'il y a anémie, et pouvoir la caractériser en :
- macrocytaire : carence en Acide folique et en vitamine B12 ;
- normocytaire : hémolytique ;
- microcytaire : anémie ferriprive, sphérocytose.

3.1.2.9.3.1. Méthode
Le sang est collecté sur titriplex (1 mg ou une pincée pour 1 ml de
sang). Ecarter l'échantillon qui contient un caillot.

3.1.2.9.3.2. Valeurs normales


Homme……………………. 38 - 52 %
Femme……………………….. 32 - 45 %
Enfant 1 an…............................. 35 %
Enfant 10 ans……………………... 37 %
Enfant N.N…………………… 44 - 62 %
Cours de Biologie Clinique | 206

3.1.2.9.3.3. Intérêt clinique

Détermination de lřanémie ;
Caractérisation d'une anémie, dans ce cas, on détermine en même
temps l'hémoglobine
Cours de Biologie Clinique | 207
Tableau XVI : Taux dřhémoglobine et index de coloration.
Gr.% = % Gr.%=%
1,2 =7,9
5,1=34,1 9,1=60,6 13,1=87,6 17,1=114,2
1,3=8,7
5,2=34,7 9,2=61,2 13,2=88,2 17,2=114,9
1,4=9,3
5,3=35,3 9,3=61,8 13,3=88,8 17,3=115,6
1,5=10
5,4=35,9 9,4=62,4 13,4=89,4 17,4=116,3
1,6=10,7
5,5=36,5 9,5=63 13,5=90 17,5=117
1,7=11,4
5,6=37,1 9,6=63,6 13,6=90,6 17,6=117,7
1,8=12,1
5,7=37,7 9,7=64,2 13,7=91,2 17,7=118,4
1,9=12,8
5,8=38,3 9,8=64,8 13,8=92,4 17,8=119,1
2=13,9
5,9=38,9 9,9=65,4 13,9= 17,9=119,8
6=40 10=66,2 14=93 18=120
2,1=13,7
2,2=14,4
6,1=40,7 10,1=67,2 14,1=93,7
2,3=15,1
6,2=41,4 10,2= 14,2=94,4
2,4=15,8
6,3=42,1 10,3=68,3 14,3=95,1
2,5=16,5
6,4=42,8 10,4=69,3 14,4=95,8
2,6=17,2
6,5=43,5 10,5=70 14,5=96,5
6,6=44,2 10,6=70,7 14,6=97,2
2,8=18,6
6,7=44,9 10,7=71,4 14,7=97,9
2,9=19,3
6,8=45,6 10,8=72,1 14,8=98,6
3=20
6,9=46,3 10,9=72,8 14,9=99,3
7=47 11=73,5 15=100
3,1=20,6
3,2=21,2
7,1=47,7 11,1=74,2 15,1=100,7
3,3=21,8
7,2=48,2 11,2=74,9 15,2=101,4
3,4=22,4
7,3=48,8 11,3=75,6 15,3=102,1
3,5=23
7,4=49,4 11,4=76,3 15,4=102,8
3,6=23,6
7,5=50 11,5=77 15,5=
3,7=24,2
7,6=50,6 11,6=77,7 15,6=103,5
3,8=24,8
7,7=51,2 11,7=78,4 15,7=104,2
3,9=25,4
7,8=51,8 11,8=79,1 15,8=104,9
4=26,5
7,9=52,4 11,9=79,8 15,9=106,3
4,1=27,2
8=53,5 12=80 16=107
4,2=27,9
4,3=28,6
8,1=47,7 12,1=80,7 16,1=107,6
4,4=29,3
8,2=48,2 12,2=81,4 16,2=108,2
4,5=30
8,3=48,8 12,3=82,1 16,3=108,8
4,6=30,7
8,4=55,9 12,4=82,8 16,4=109,4
4,7=31,4
8,5=56,5 12,5=83,5
8,6=57,1 12,6=84,2
4,9=32,8
8,7=57,7 12,7=84,9
5=33,5
8,8=58,3 12,8=85,6
8,9=58,9 12,9=86,3
9=60 13=87
Cours de Biologie Clinique | 208
3.1.2.9.4. Constantes globulaires

La comparaison des taux de globules rouges, dřhémoglobine et de


lřhématocrite permet dřétablir les constantes érythrocytaires.
Le volume globulaire moyen (VGM) est obtenu par calcul du rapport
Hte/taux de GR. Cependant dans les méthodes électroniques, il est mesuré
par intégration des volumes individuels des hématies, lřhématocrite étant
calculée (nbre de GR x VI). Le VGM normal varie de 80 - 100
microcubiques, ainsi, une anémie peut être soit normocytaire, soit
microcytaire ou macrocytaire, selon que le VGM est normal, inférieur ou
supérieur à la normale.

Hématocrite en % x 10 45 x 10
V.G.M=────────────────────=───=90microcubiques
Nombre de GR/mm3 en millions 5

La teneur corpusculaire moyenne en hémoglobine (TCMH) est


obtenue par le rapport entre taux dřHb/ taux de GR. Elle varie très
généralement dans le même sens que le VGM. Elle est normalement de 30
2 pg.

Hb g % x 10 15.000.000.mcg x10
TCMH=─────────────────=──────────= 30 pg/GR
Nombre de GR en millions par mm3 5.000.000

La concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (CCMH)


est donnée par le rapport taux dřHb/Hte mesuré ou calculé. Les valeurs
normales diffèrent légèrement selon que lřHte a été mesuré par
centrifugation (30-34%) ou calculé par un compteur automatique des
particules (32-36%). Cette constante nřest pratiquement jamais supérieure à
la normale, lřhématie étant saturée en hémoglobine ; ainsi, il nřexiste pas
dřhyperchromie. Sa diminution traduit lřhypochromie.

Hb g % x 100 100 x 15
CCMH = ────────────── = ─────── = 30 %
Hématocrite en % 45

3.1.2.9.5. Numération des globules blancs

Prélever le sang dans la pipette à G.B jusqu'à la marque 0,5 et


compléter à 11 avec le liquide de dilution (dilution 1/20) ; soit 0,1ml de sang
+ 1,9ml du réactif.
Cours de Biologie Clinique | 209
a) Numération dans cellule de Bürker équipée d'un couvre-
cellule spécial (assez dur, non léger et flexible comme celui quřon utilise
pour les examens à frais : selles, culot urinaire) :

Compter les éléments dans 50 grands carrés, soit dans 4 rangées de


12 grands carrés plus deux grands carrés (3 rangées de 16 + 2).
Calcul : Nombre de G.B comptés x 100 = Nombre de G.B par mm 3.

Justification du calcul

Le volume correspondant à 50 grands carrés, la profondeur de la


cellule étant de 0,1mm, peut se calculer comme suit : 50 x 1/5 x 1/5 x 1/10 =
1/5mm3.

Comme le sang a été dilué 20 fois, le nombre d'éléments contenus


dans 1mm3 sera de : N (nombre d'éléments comptés dans 50 carrés) x 20 x
5, soit N x 100.
b) Numération dans la cellule de Neubauer :
Le sang est dilué au 1/20, comme ci-dessus et introduit dans la
cellule de Neubauer recouverte dřune lamelle spéciale. On compte le
nombre de globules blancs présents dans un des quatre groupes d'angle
comprenant chacun 16 grands carrés de 1/4 mm de côté.
Il faut multiplier le nombre N des leucocytes comptés par 200 pour
connaître le nombre des globules présents dans 1 mm3 de sang.

ustification du calcul

Le volume correspondant à un groupe de 16 grands carrés, la


profondeur de cellule étant de 0,1 mm, peut se calculer comme suit : 16 x
1/4 x 1/10 = 1/10 mm3.
Soit : 16 x 0,25 x 0,25 x 1/10 (Hauteur) = 0,1mm3.

Comme le sang a été dilué 20 fois au préalable, le nombre des


globules blancs par 1mm3 est de :
N x 10 x 20 soit N x 200.

Formule pratique utilisée

Un groupe de 16 carrés du coin : 0,1mm3


Compter dans 4 groupes du coin : 0,1 x 4 = 0,4mm3
Pour avoir 1mm3 = 0,4 x 2,5
La dilution étant de 1/20, la formule devient : 2,5 x 20 = 50. Soit N x
50.
Cours de Biologie Clinique | 210
3.1.2.9.5.1. Valeurs normales

- Adulte 3.500 à 10.000 par mm3


- Nouveau-né 10.000 à 25.000 par mm3
- Enfant 1 an 8.000 à 18.000 par mm3
- Enfant 4-7 ans 6.000 à 15.000 par mm3
- Enfant 8-12 ans 4.000 à 13.500 par mm3

3.1.2.9.5.2 Valeurs pathologiques

Leucopénie : diminution de leucocytes < à 5000 chez le Blanc, < à


3500 chez le Noir.
-Typhoïde
-Brucelloses (mélitococcie, fièvre de Malte, maladie de Bang, fièvre
ondulante, fièvre méditerranéenne) : maladies infectieuses dues aux
différentes espèces de Brucella
-Viroses (grippes, rougeole, hépatite infectieuse etc,...)
-Intoxication, etc...
-Leucémie aleucémique, surtout chez lřenfant : absence dans la
moelle osseuse des cellules de la série lymphatique, granulocytaire ou
monocytaire
-Leucocytose (Hyperleucocytose) : augmentation de leucocytes >
10.000
-Beaucoup d'états infectieux
-Leucémies (30.000 et plus) : affections généralisées, aiguës ou
chroniques, atteignant primitivement les organes hématopoïétiques,
caractérisées par une prolifération exubérante des leucocytes et de leurs
cellules souches
-Certaines : - convulsion - températures etc,...

3.1.2.9.6. Formule leucocytaire : Technique de May-Grünwald et


Giemsa

Précautions importantes

Il est essentiel de préparer de beaux étalements. Pour ce faire, on


procédera comme suit :
-Préparation des lames, de préférence neuves, dégraissées dans un
récipient en verre muni d'un couvercle ; contenant un mélange d'alcool et
d'éther, volume par volume.
-Les lames seront séchées et essuyées avec un chiffon propre. Elles
doivent être conservées dans des boîtes bien fermées, emballées dans du
papier mince, par paquet de cinq lames.
Cours de Biologie Clinique | 211
-L'étalement doit toujours utiliser du sang frais, prélevé au bout du
doigt après piqûre avec aiguille stérile à usage unique. Cette
précaution dans le prélèvement du sang capillaire est essentielle. En effet,
les aiguilles stérilisées à l'alcool peuvent transmettre, d'un individu à l'autre,
le virus de l'hépatite épidémique et autres...
-Pour ce faire, tout laboratoire où on exécute ces prélèvements doit
être équipé d'un bec Bunsen ou d'une lampe à alcool.
-Le sang prélevé sur anticoagulant ne peut pas être utilisé pour
préparer un étalement destiné à l'établissement de la formule leucocytaire.
-En approchant le porte-objet de la pulpe digitale, on prélève
délicatement la partie supérieure de la goutte de sang, en la déposant à
l'extrémité droite de la lame porte-objet.

-La lame rodée, utilisée pour étaler la goutte, est mise en contact avec
la partie droite de la lame porte-objet, sous un angle d'environ 45°. Puis, on
déplace la lame rodée de gauche à droite jusqu'à ce qu'elle entre en contact
avec la goutte. Immédiatement, la goutte s'étale le long de l'arrête de la
lame. On évitera de faire pénétrer la lame dans la goutte, car cette
manoeuvre provoque la destruction d'un grand nombre de cellules.
-Le sang qui adhère à la lame rodée est tiré et étalé de droite à
gauche. L'index et le pouce de la main gauche fixent la lame en maintenant
son extrémité gauche contre la surface de la table.
-La préparation est bonne lorsque le sang étalé n'atteint pas l'autre
extrémité de la lame porte-objet, qu'il reste en haut et en bas une marge et
que le frottis n'est ni trop mince ni trop épais.
-Si la goutte prélevée est trop volumineuse, on manoeuvre la lame
rodée de manière à n'utiliser qu'une partie de la goutte, le reste du sang est
laissé en place non étalé.

3.1.2.9.6.1. Identification des lames

On peut employer plusieurs méthodes


1) Inscrire avec un stylo d'acier ou un crayon noir bien pointu
le nom et le numéro du patient dans la partie épaisse et droite du frottis. La
partie la plus épaisse du frottis est la moins utile à l'examen microscopique.
2) Inscrire le nom et le numéro du patient sur une étiquette
placée à la face inférieure de la lame. Cette identification risque d'être
illisible après coloration. Elle ne peut être que provisoire. On placera
l'étiquette du côté épais de l'étalement.
3) La méthode idéale consiste à fournir le frottis au
laboratoire après l'avoir glissé dans un petit sac en papier sur lequel nom,
numéro et date sont inscrits à l'encre ou au crayon.

Le laboratoire se chargera d'inscrire les marques d'identification


après coloration. Les marques définitives doivent être inscrites sur une
Cours de Biologie Clinique | 212
étiquette dont la largeur égale celle de la lame. L'étiquette est collée du côté
de l'étalement et du côté de la partie la plus épaisse de la préparation.

3.1.2.3.6.2. Technique de May-Grünwald proprement dite

3.1.2.3.6.2.1. Fixation

Fixer pendant 3 minutes par 10 gouttes de May-Grünwald.

3.1.2.3.6.2.2. Coloration

Ajouter 10 gouttes d'eau tamponnée. Bien mélanger en inclinant la


lame dans tous les sens. Laisser colorer 1 minute.
Rejeter le colorant. Verser sur la lame le colorant de Giemsa dilué
dans l'eau tamponnée dans un petit cylindre gradué à raison de 3 gouttes
pour 2 ml d'eau. Laisser agir 8 à 12 minutes.

3.1.2.3.6.2.3. Lavage

Rincer la lame à l'eau courante : pour cela ne pas rejeter le colorant,


mais le chasser par un jet d'eau pour éviter que la pellicule irisée qui se
forme à la surface du colorant n'adhère au frottis.
Le lavage doit être prolongé, si la solution de Giemsa a tendance à
précipiter. Laisser sécher.

3.1.2.3.6.2.4. Commentaires

(1) Il ne peut se former de précipité dans la solution de


Giemsa.
Si c'est le cas, l'eau de dilution ou le colorant lui-même sont de
mauvaise qualité.
(2) Pour les frottis de moelle ou de ponction d'organe, il faut
les fixer à l'alcool éthylique ou méthylique pendant 10 minutes dans un
cylindre de Borrel. Cette précaution vaut surtout si les frottis sont
épais.
(3) Si on veut garder des frottis de sang non colorés pendant
plusieurs jours, il faut les fixer à l'alcool pendant 3 minutes au moins.
(4) Pour colorer les frottis de moelle ou d'organes, il faut
surveiller la progression de la coloration par le Giemsa pour obtenir un bon
résultat. Un pH trop alcalin, au-dessus de 7,2, accentue la tonalité bleue de
la préparation. Un pH trop acide, en dessous de 6,8, accentue la tonalité
rouge par prise excessive de l'éosine. L'expérience nous a appris qu'on
obtenait d'excellentes colorations avec une eau de pH 7 préparée comme suit
:
Cours de Biologie Clinique | 213

KH3PO4 : 10 g
Na2H2PO42H2O : 30 g
Eau distillée ad : 10 litres.

3.1.2.3.6.3. Valeurs normales de la formule leucocytaire

Adultes :
Neutrophiles 30 - 67 % soit 1.500 - 7.500/mm3
Lymphocytes 26 - 60 % soit 1.500 - 5.000/mm3
Monocytes 0 - 10 % soit 50 - 1.000/mm3
Eosinophiles 0 - 12 % soit 10 - 1.200/mm3
Basophiles 0-2% soit 15 - 200/mm3.

(5) On notera également la présence de cellules anormales. Dans


ce cas, il est bon d'appeler un médecin spécialiste en Hématologie pour
établir une formule correcte. Toute lame présentant des anomalies
importantes doit être étiquetée et conservée dans les collections.
(6) On notera aussi les anomalies des globules rouges : hématies
falciformes, poïkiloïcytes, anisocytes, hématies en cible, sphérocytes,
polychromasie, résidus nucléaires, corps de Jolly, anneaux de Cabot,
présence dřérythroblastes ; présence de parasites sanguicoles.

Il est souhaitable que le laborantin chargé des examens


hématologiques puisse consulter un ouvrage d'hématologie bien illustré.

3.1.2.3.6.4. Mécanismes de la coloration

1) Le premier temps est celui de la fixation. Celle-ci peut être


obtenue, soit par l'alcool méthylique, soit par la solution de May-Grünwald
qui est à base d'alcool méthylique. La durée de la fixation doit atteindre ou
dépasser 3 minutes.
2) Le deuxième temps est celui de la coloration par le May-
Grünwald. Le mélange à volume égal d'eau et de colorant assure la
coloration des éléments éosinophiles en rouge (globules rouges, granulations
éosinophiles) et des éléments basophiles en bleu (protoplasme des
lymphocytes, monocytes et cellules jeunes).
3) Le troisième temps, utilise la solution aqueuse de Giemsa. Ce
colorant complexe se fixe sur les structures nucléaires et sur les grains
azurophiles. Comme il s'agit d'un colorant délicat, il flocule facilement, ce
qui rend les colorations impossibles ou illisibles.
Pour éviter cet accident, on n'introduira jamais de pipette dans les
flacons de Giemsa. On évitera de mettre la solution diluée en contact avec
des instruments en métal, on veillera à la propreté du cylindre où se fait le
mélange Giemsa eau tamponnée, on utilisera une eau tamponnée correcte.
Cours de Biologie Clinique | 214
Le cylindre doit être lavé à l'alcool, puis à l'eau pour dissoudre les
concrétions de colorants qui peuvent troubler la stabilité de la solution.

3.1.2.3.7. Etalement, coloration et interprétation des frottis


médullaires

3.1.2.3.7.1. Préparation des étalements après ponction de la


moelle osseuse

-Chez lřadulte, la ponction se réalise au niveau du sternum, mais


parfois également dans lřos iliaque (massifs postérieurs, épines iliaques
antéro-supérieures, crête), et plus rarement aux épines vertébrales.
-Chez lřenfant, on préfère les os iliaques, lřépine iliaque postérieure
et chez le nouveau-né, la face antéro-interne du tibia.La ponction peut être
ou non précédée dřune anesthésie locale.
-Il existe de nombreux modèles de trocarts de ponction, mais le plus
souvent utilisé est le trocart de Mallarmé.
-Actuellement, pour le prélèvement dřune faible quantité de moelle
(quelques frottis), on utilise une aiguille plus fine (aiguille pour PL avec
mandrin) ou même simplement une aiguille pour injections I.M. Cette
aspiration est vivement ressentie par le malade.
-Le liquide aspiré est toujours un mélange de moelle et de sang : un
prélèvement riche en grumeaux sera étalé tel quel sur les lames de verre ;
plus pauvre, on pourra retirer rapidement les quelques grains, les isoler et les
étaler sur une lame comme pour des frottis sanguins.
-La ponction de la moelle osseuse nřa pas de véritable contre-
indication, mais éviter de prélever lors des coagulopathies sévères, par
risque dřune hémorragie incontrôlable.
-Les frottis réalisés sont rapidement séchés à lřair puis, comme les
frottis sanguins, fixés dans le méthanol pendant 3 à 10 minutes. Ils sont
ensuite colorés au May-Grünwald - Giemsa ou par une méthode au bleu de
Prusse destinée à mettre en évidence les inclusions riches en fer. Cette
méthode est décrite à propos de l'examen du sédiment urinaire.

3.1.2.3.7.2 Présentation des résultats

Les proportions des différents éléments médullaires sont établies


après numération différentielle de plusieurs centaines de cellules blanches
comprenant les cellules souches, les cellules en maturation et les cellules
mûres des lignées granuleuses, lymphocytaire et réticulaire.
Lřexamen microscopique :
-Au faible grossissement :
On réalise une approche globale de la moelle, aspect hétérogène ou
homogène (envahissements massifs).
Les régions les mieux étalées. On réalise une approximation de la
richesse médullaire : normale, augmentée ou pauvre. Les mégacaryocytes
Cours de Biologie Clinique | 215
sont recherchés (surtout présents aux extrémités des frottis) et on apprécie
leur présence et leur densité approximative.
Les éléments de grande taille et rares sont recherchés :
- Normaux :- ostéoblastes dans les MO (Moelle Osseuse) dřenfants
- Histiocytes Macrophages ou non.
- Anormaux : - Cellules non hématopoïétiques isolées ou en placards.
-Au fort grossissement, deux aspects :
On explore divers endroits (bien étalés) de la lame, simplement pour
examiner plus à fond les cellules : on regarde dřabord les cellules que lřon
connaît le mieux (poly, lympho…). Cet examen donne une partie du
résultat : lřaspect qualitatif des cellules. Ensuite, on réalise un décompte de
tous les éléments nucléés : pour un très bon décompte, il faudrait dénombrer
500 éléments ; en pratique, un résultat convenable peut être obtenu avec 200
éléments comptés à divers endroits de 2 frottis.

Résultats :
Tableau XVI : Valeurs normales du myélogramme

Richesse Riche
Mégacaryocytes Nombreux
Présence de blastes Néant
Myéloblastes ………………… ……… 0,1 Ŕ 3,5 %
Promyélocytes ………………. … ….. 0,5 Ŕ 5 %
Myélocytes neutrophiles……........ ….. 5 Ŕ 20 %
Métamyélocytesneutrophiles …… ….. 10 Ŕ 30 %
Polynucléaire neutrophiles ………….. 7 Ŕ 25 %
Myélocytes éosinophiles………….. … 0,1 Ŕ 3 %
Métamyélocytes éosinophiles ....... ….
Polynucléaireéosinophiles……………. 0,2 Ŕ 3 %
Polynucléaire basophile……………… 0 Ŕ 0,5 %
Proérythroblastes……………………. 0,5 Ŕ 5 %
Erythroblastes basophiles……………..
Erythroblastes polychromatophiles…... 7 Ŕ 30 %
Erythroblastes acidophiles……….. ….
Plasmocytes …………………………. 0,1 Ŕ 3,5 %
Lymphocyte …………………………. 5 Ŕ 20 %
Monocyte ……………………………. 0 Ŕ 0,2 %
Cellules réticulaires…………………...
Macrophages…………………………. 0,1 Ŕ 2 %
Autres…………………………………

3.1.2.3.7.3. Interprétation générale

1° Il faut connaître le lieu de la ponction, ainsi que la dureté de lřos.


Exemples : os très dur : penser au SMC (Splénomégalie Myéloïde
Chronique) ou métastases ou tricholeucocytes ; os très mou : penser aux
métastases
Cours de Biologie Clinique | 216
2° Lřappréciation de la richesse : lorsque lřon hésite entre moelle
pauvre (aplasie) et moelle diluée, regarder le décompte du frottis sanguin,
proche de celui du myélogramme, si la moelle est diluée.
3° Les éléments non inclus dans le décompte :
- les mégacaryocytes : très important (voir plus haut)
- les cellules métastatiques non hématopoïétiques : globalement,
cřest signaler leur présence qui est important ; leur quantification
(facultative) ne se réalise que si elles sont supérieure à 2%.
- les histiocytes : macrophages ou non, on les signale quand leur
nombre augmente (états inflammatoires, surcharge constitutionnelle …)
- ostéoblastes, ostéoclastes : signaler leur présence.
- cellules endothéliales : fibroblastes : mastocytes, adipocytes.

3.1.2.3.8. Numération des éosinophiles

-Prélever le sang au doigt dans une pipette à G.B. jusqu'à la marque I


et compléter à II avec le liquide de Dunger. Celui-ci doit être conservé en
glacière.
-Agiter la pipette sans brusquerie pendant 30 secondes. Rejeter les
premières gouttes et déposer un peu de liquide sous le couvre-objet de la
cellule de Bürker ; la numération doit se faire dans tout le quadrillage.
- Multiplier le résultat par 10 pour connaître le nombre d'éosinophiles
par mm3. Comme le volume de la cellule est de 0,931 mm3, le facteur de
multiplication exact est de 10,74 ; dans la pratique, il suffit de multiplier par
10.
Valeur normale : moins de 300 éosinophiles par mm3.

3.1.2.3.9. Numération des plaquettes sanguines

-On dilue le sang à 1/50 en projetant 20 mm3 (une pipette à


hémoglobine de sang) dans 1 ml de solution à 1 % d'oxalate d'ammonium.
La solution doit être conservée en glacière. Elle doit être filtrée avant usage
sur papier Wattman N° 50. Le sang peut être prélevé au doigt ou dans un
tube avec Titriplex. Remplir la cellule et laisser sédimenter 20 minutes.
-Numération : compter les éléments dans 80 petits carrés et multiplier
par 2.500.
-Valeurs normales : 150.000 à 400.000 plaquettes/mm3.
80 petits carrés = 1/50e mm3 x 50 --> mm3 x 50 (dilution) N x 50 x
50 = N x 2.500.

3.1.2.3.10. Numération des réticulocytes

3.1.2.3.10.1. Intérêt clinique


Cours de Biologie Clinique | 217
Ce sont des hématies jeunes renfermant une substance granulo-
filamenteuse qu'on peut mettre en évidence par certaines colorations
spéciales (crésyl-bleu). Les réticulocytes représentent des formes mises en
circulation avant la maturation complète.
Ils représentent normalement 0,2 à 2 % des hématites mûres en
circulation.

Ils augmentent lorsque la mise en circulation des hématies


augmente : hémorragie, crise hémolytique, traitement au fer (synthèse
augmentée). Cette augmentation peut aller jusqu'à 50 %o soit 5 %. Il s'agit
d'une crise réticulocytaire, signe d'une réactivité de la moelle.

3.1.2.3.10.2. Technique

Avec une baguette de verre, étaler un mince film de solution de


bleu de crésyl à 1 % dans l'éthanol, sur une lame de verre propre ; laisser
sécher à l'air. Prélever à la pulpe digitale 1 goutte de sang à la face inférieure
colorée de la lame. Mettre en chambre humide. Examiner à l'immersion
après 1/4 d'heure. Compter 100 G.R et déterminer le pourcentage de
réticulocytes.

3.1.2.3.10.3. Chiffres normaux

Adultes : 2 à 20 %o (0,2 à 20 %)
Enfant nouveau-né : 20 à 50 %o (2 à 5 %).

3.1.2.3.11. Vitesse de sédimentation(Westergreen)

3.1.2.3.11.1. Technique

-Préparer une solution de 3,8 g % de citrate neutre de sodium


(Na2O2H5O7+2H2O).
-La solution est répartie dans des flacons à pénicilline qui sont
stérilisés à l'autoclave.
-Pour éviter que le bouchon ne saute, il est maintenu par une
cordelette, un ruban adhésif ou encore serti d'une bague en aluminium.
1. La mesure doit être faite à jeun.
2. Les tubes doivent être propres (rincer à l'eau, l'alcool-éther) et
secs.
-On prélève, avec un minimum de stase, 1,6 ml de sang dans une
seringue de 2 ml contenant 0,4 de citrate de soude à 3,8 %.
-Le mélange sang et citrate doit être fait avec exactitude, en
respectant les volumes prescrits. Il est inutile de faire la mesure, si les
volumes de citrate et de sang sont incorrects ou s'il y a coagulation, même
partielle.
Cours de Biologie Clinique | 218
-La mesure est également faussée si les tubes sont humides ou
malpropres.
-Une position oblique des tubes entraîne une accélération sensible de
la V.S.
-Si la limite entre la colonne des G.R. et le plasma surnageant est
imprécise parce que progressive, le laborantin notera : la V.S. est
approximativement de ...mm/h, la limite entre G.R et plasma est imprécise.
-La mesure doit être faite exactement une heure après le remplissage
et la mise en position verticale du tube de Westergreen.

3.1.2.3.11.2. Valeurs normales

Homme : 1 à 16 mm/h.
Femme : 2 à 22 mm/h (valeurs chez le noir africain).

3.1.2.3.11.3. Variations pathologiques


- augmentation : indique les états pathologiques suivants : états
inflammatoires, infections aiguës, subaiguës, chroniques, nécrose tissulaire
(infarctus), irradiation, maladies immunitaires, macroglobulinémie si très
nettement élevée : myélome multiple, etc. TBC, cancer, anémie, grossesse
avancée (10è semaine).
- diminution : polycythémie par exemple, hémoconcentration par
perte plasmatique (brûlure).
3.1.2.3.11.4. Explication du phénomène
- les globules ont tendance à tomber au fond du tube, car leur poids
spécifique est supérieur à celui du plasma. Cette chute s'accompagne
cependant d'un courant ascendant du plasma qui retarde cette sédimentation.
Normalement, elle est donc lente (VS). Si le nombre des G.R. est nettement
diminué, le courant ascendant du plasma est retardé, lent et donc les G.R. ne
sont pas retardés dans leur chute et tombent vite : V.S.= accélérée ou
augmentée. De même si les G.R. se groupent en agrégats, leur surface avec
le plasma diminue et la V.S. augmente. Ce phénomène se rencontre, quand
la surface des G.R. nřest pas suffisamment en contact avec le plasma : c'est
ce qui se produit dans les états pathologiques ci-haut énumérés et où il y a
augmentation des globulines qui regroupent ou agglutinent les G.R.
- 3.1.2.3.12. Recherche des hématies falciformes
Cours de Biologie Clinique | 219

Les hématies falciformes peuvent être découvertes


accidentellement sur un frottis coloré. Pour les mettre en évidence à coup
sûr, on peut utiliser le test d'Emmel.

3.1.2.3.12.1. Test d'Emmel : méthode lente

-Sur une lampe porte-objet parfaitement propre, déposer au moyen


d'un compte-goutte ou d'une pipette de Pasteur, une goutte de solution
physiologique NaCl à 0,9 %.
-Prélever une goutte de sang par piqûre du bout du doigt, et mélanger
à la goutte de solution physiologique.
-Recouvrir d'une lamelle.
-Lutter la préparation au moyen de paraffine en fusion.
-Examiner la préparation avec l'objectif x 45 après 12 h.
-Rechercher la présence des cellules en faucille, en feuilles de houx
et de prolongements filamenteux ; noter leur abondance.

3.1.2.3.12.2. Test d'Emmel : méthode rapide avec réducteur

-Préparer chaque jour une solution fraîche de dithionate de sodium en


dissolvant 200 mg dans 10 ml d'eau.
-La solution n'est utilisable que pendant quelques heures.
-Sur une lame porte-objet, placer 1 goutte de sang, ajouter une goutte
de solution réductrice au moyen d'une pipette de Pasteur. Mélanger et
couvrir d'une lamelle. Examiner après 30 minutes avec l'objectif x 45.

3.1.2.3.12. Résultats et interprétations

-En cas de Sickle cell trait, on note 30 à 50 % de cellules falciformes.


Il s'agit d'un cas d'hémoglobinose AS.
Cours de Biologie Clinique | 220
-En cas de Sicklanémie, la proportion est plus élevée et il apparaît
des formes filamenteuses. Il s'agit d'hémoglobinose SS. Actuellement, le test
d'Emmel est surclassé par la technique d'électrophorèse, beaucoup plus
précise et fiable ; mais nécessitant un équipement spécial et des réactifs
spécifiques.
3.1.2.3.13. Solutions pour les techniques hématologiques

3.1.2.3.13.1. Numération des globules rouges : solution de


HAYEM.

-Dans un ballon jaugé de 1000 ml, mettre 30 g de citrate trisodique


neutre, 10 ml de formol à 40 %.
-Compléter au volume 1000 ml avec l'eau distillée.
-Conserver dans un flacon de verre blanc, bouché à l'émeri.
-Répartir en flacon de 20 ml (bouteilles à pénicilline) pour l'usage
courant.

3.1.2.3.13.2. Hémoglobine : solution de Drabkin

-Dans un flacon jaugé de 1 litre, mettre :


1 gr de bicarbonate de soude
0,2 g de cyanure de potassium (poison violent)
0,2 g de ferricyanure de potassium K3Fe (CN) 6.
-Ajuster ces volumes avec de l'eau distillée. Solution à conserver
dans un flacon de verre brun bouché à l'émeri.
-Si la solution se trouble, il faut la renouveler.

3.1.2.3.13.3. Numération des globules blancs : solution de Türck

-Dans un flacon jaugé de 1 litre, mettre 20 ml d'acide acétique


glacial. Ŕ
-Ajouter une pointe de couteau de violet de gentiane ou cristal violet.
-Compléter à 1 L avec de l'eau distillée, répartir en petits flacons de
20 ml (bouteilles à pénicilline) munis d'un bouchon de caoutchouc.

3.1.2.3.13.4. Numération des éosinophiles : Solution de Dünger

Dans un flacon jaugé de 50 ml ; mettre :


0,5 g d'éosine
5 ml d'acétone.
Ajuster à 50 ml d'eau distillée, agiter afin que les cristaux d'éosine se
dissolvent. Filtrer. Boucher convenablement le flacon ; conserver en
glacière.
Cours de Biologie Clinique | 221
3.1.2.3.13.5. Solution de May-Grünwald

Peser 0,6 g de colorant (May-Grünwald en poudre), transférer dans


un Erlenmeyer de 500 ml.
Ajouter 200 ml de méthanol
Couvrir d'un bouchon renversé pour limiter l'évaporation. Placer
l'erlenmeyer dans l'eau d'un bain-marie qui vient de bouillir. Amener la
température de l'alcool à 50°C sous le contrôle d'un thermomètre. Dès que
cette température est atteinte, retirer la solution de bain-marie et laisser
refroidir à la température de la chambre. Couvrir d'un entonnoir pour éviter
l'évaporation.
Après 24 heures d'attente, la solution doit être filtrée sur papier
Wattman n° 1 et conservée dans un flacon parfaitement propre et sec, en
verre brun, muni d'un bouchon émeri. La solution est prête à l'emploi. Il est
indispensable de suivre cette technique dans tous ses détails pour obtenir un
colorant de qualité.

3.1.2.3.13.6. Colorant selon Giemsa

Peser 600 mg de colorant en poudre Giemsa.


Les placer dans un grand mortier en porcelaine.
Broyer finement la poudre à sec.
Mesurer 50 ml de glycérine neutre
Verser 15 ml de glycérine dans le mortier. Broyer.
Verser dans un erlenmeyer de 250 ml.
Sur le restant, verser 15 ml de glycérine, broyer et verser dans un
erlenmeyer. Recommencer avec les 20 ml de glycérine qui restent de
manière à ne pas perdre de colorant.
Placer l'erlenmeyer obturé par un bouchon d'ouate dans un bain-
marie à 55- 60°C pendant 2 heures. Secouer de demi-heure en demi-heure.
Après 2 heures, ajouter 50 ml de méthanol dont une partie a servi
pour rincer le mortier et récupérer le colorant. Mélanger par agitation.
Filtrer.
Conserver en flacon bouché à l'émeri muni d'un bouchon à compte-
goutte.
Le colorant est facilement dénaturé par l'introduction d'impuretés,
aussi faut-il éviter d'introduire dans le flacon des pipettes et des instruments
en métal. Tout colorant qui flocule doit être éliminé. On prendra l'habitude
de conserver le colorant en voie d'utilisation dans des flacons munis d'une
pipette à poire de caoutchouc et avec rodage à l'émeri.

3.1.2.3.13.7. Colorants pour la méthode de Field

a) Bleu de méthylène polychrome


Dans un flacon de 1 litre, placer :
Cours de Biologie Clinique | 222
Bleu de méthylène 1,5g
Na2HPO4+2H2O 1,5g
Eau distillée 50ml
Evaporer au bain-marie bouillant jusqu'à dessiccation.
Ajouter KH2PO4 0,5g
H2O - q.s. 50ml
Laisser reposer 2 jours, puis filtrer.

b) Tampon phosphate (boîte à coloration 2 et 4)


Na2HPO4.2H2 O 1,5g
KH2PO4 0,5g
H2O q.s. 500ml.
c) Eosine
Eosine 1,0g
Na2HPO4 + 2H2O 1g
KH2PO4 0,5g
H2O - q.s. 500 ml.

Dissoudre d'abord les phosphates dans 50 à 100 ml d'eau. Ajouter


ensuite l'éosine puis compléter à 500 ml. Laisser reposer 2 jours, puis filtrer.
Si les deux colorants se troublent, filtrer. Ecarter la solution d'éosine, si elle
devient verdâtre.

3.1.2.3.14. Anticoagulants. Précautions. Usage.

3.1.2.3.14.1. Citrate à 3,8 %.

-Préparer une solution de citrate à 3,8 %.


-La répartir dans des flacons type pénicilline de 20 ou 50 ml.
-Fermer par un bouchon de caoutchouc et sertir par une bague
d'aluminium à la pharmacie centrale.
-Stériliser pendant 1 heure à l'autoclave à 120°C.
-Cette solution est utilisable pour les tests de coagulation, à raison de
1 ml de solution anticoagulante pour 9 ml de sang. Comme la solution est
stérile, elle peut être introduite dans une seringue de 10 ml pour y prélever
les 9 ml de sang, prélèvement en vue de mesurer la vitesse de sédimentation.

III.1.2.3.14.2. Mélange oxalate de potassium et ammonium

-Peser 6 g d'oxalate ammoniaque 4 g d'oxalate potassique


-Dissoudre dans 250 ml d'eau, dans un ballon jaugé.
-Garder dans un flacon bouché à l'émeri.
-Coller une étiquette mentionnant : Mélange anticoagulant de Heller.
0,5 ml = 20 mg d'oxalate.
Cours de Biologie Clinique | 223
-Usage : Le mélange est anticoagulant à raison de 2 mg par ml de
sang
1° Dans un tube de 20 ml, pipeter 0,5 ml du mélange, dessécher une
nuit à l'étuve à 60 - 100°C.
2° Dans un tube à centrifuger gradué à 10 ml, mettre le même
volume et faire de même.
Cet anticoagulant est valable pour :
1° dosage de la prothrombine
2° étude de la coagulation
3° la préparation d'une solution d'hémoglobine pour dosage Hb F et
électrophorèse,
4° détermination du taux de la glucose-6-phosphate déshydrogénase
globulaire.
5° la mesure de l'Hb et de l'hématocrite.

3.1.2.3.14.3. Titriplex ou E.D.T.A. sodique

-Préparer une suspension E.D.T.A. sodique ou Titriplex sodique à


raison de 10 g dans 100 ml. Emulsionner, prélever 0,25 ml, soit 5 ml
E.D.T.A.
-Placer dans un tube à hémolyse. Laisser sécher en position semi-
horizontale pendant une nuit à 60-100°C.
Ce tube convient pour prélever 1 à 5 ml de sang et empêche la
coagulation, à condition d'homogénéiser après le prélèvement.
Le sang ainsi prélevé convient pour les usages suivants :
• numération des G.R. ;
• numération des G.B. ;
• numération des plaquettes ;
• dosage de l'hémoglobine ;
• mesure de l'hématocrite ;
• détermination de la résistance osmotique ;
• tests immuno-hématologiques sur G.R. lavés.

3.1.2.4. Techniques automatiques d’hémocytologie : Cytométrie


en flux (CMF)

3.1.2.4.1. Introduction

La cytométrie en flux était autre fois basée sur la capacité des


cellules à réfléchir la lumière mesurable, lumière dont les propriétés
physiques étaient caractéristiques de chaque cellule. Au fil de temps,
lřappareillage de mesure a évolué, pour détecter également les signaux
fluorescents émis par des molécules spécifiques attachés directement aux
cellules ou aux protéines à travers des anticorps monoclonaux. Ces
Cours de Biologie Clinique | 224
substances colorantes sont de la fluorescéine, capable dřémettre des
rayonnements réfléchis à partir des cellules.

Le développement des anticorps est le facteur le plus significatif qui


a contribué à une plus large application de la cytométrie en flux de nos
jours.
Quoique le terme cytométrie en flux indique la mesure de la cellule,
elle est également appliquée avec satisfaction à lřétude dřautres particules
telles que les chromosomes, les micro-organismes et les protéines.
Lřavantage principal de la cytométrie en flux sur les autres
techniques est la capacité dřanalyser rapidement des multiples paramètres
sur un grand nombre de cellules.

Pour identifier et classifier les cellules, la cytométrie en flux (CMF)


apporte les informations en rapport avec :
• Taille de la cellule (Forward Scatter),
• Granularité ou complexité cellulaire (Side Scatter),
• Son intensité relative à la fluorescence.

Actuellement, cette technique nřest pas seulement utilisée pour


lřanalyse de la lignée cellulaire dřune leucémie aiguë ou pour la détection de
la clonalité dans une population lymphoïde, mais permet aussi de détecter
des populations anormales dans un désordre myéloïde chronique, de
quantifier la maladie résiduelle minimale, et enfin de contrôler ou surveiller
les états dřimmunodéficience

3.1.2.4.2 Généralités

3.1.2.4.3 Historique

La Cytométrie en flux (CMF) est née du besoin dřautomatisation du


comptage des constituants cellulaires du sang. Ses origines sont anciennes,
puisque cřest en 1934 que MOLDAVAN, à Montréal, conçut le premier
appareil avec lequel il réalisait des numérations cellulaires, en faisant défiler
les cellules dans un fin capillaire où elles étaient vues par un capteur photo-
électrique.

En 1949, W. COULTER a mis au point un appareil permettant de


compter des cellules et de mesurer leurs tailles par variation de résistivité du
courant liquidien.

En 1965, KAMENTSKY permet une avancée supplémentaire, en


permettant lřanalyse des constituants cellulaires.
Cours de Biologie Clinique | 225
Dan VILLA en 1969, utilise le laser comme source lumineuse car, il
permet une meilleure focalisation du faisceau, une grande puissance
dřexcitation, et une stabilité du chromatisme.

Dans les années 70, les chercheurs de Los Alamos et Stanford,


associaient des méthodes de mesure individuelle du volume ou de la
fluorescence de cellules entrainées par un flux avec des méthodes
électrostatiques permettant le tri cellulaire dans des conditions vitales.

Ainsi, cette technique permet de faire simultanément lřanalyse de


plusieurs paramètres sur des éléments en suspension : cellules, levures,
bactéries, ou constituants cellulaires (noyau, mitochondries, chloroplaste,
chromosomes …). Ainsi, un grand nombre dřéléments peut être analysé, ce
qui apporte précision et représentativité aux résultats. Avec lřanalyseur
trieur, on peut en outre séparer physiquement les éléments analysés en
population, selon les propriétés mesurées.

3.1.2.4.4. Définition

La cytométrie en flux est lřétude précise des cellules isolées


entraînées dans un flux liquide. Cřest une technique de caractérisation
individuelle, quantitative et qualitative des particules en suspension dans un
liquide. Cřest le dénombrement et identification de chaque cellule au sein
dřune population cellulaire en suspension, en fonction de sa taille et son
rapport nucléo-cytoplasmique.

Cřest une technique qui consiste à analyser les signaux optiques ou


physiques émis par une particule coupant le faisceau lumineux dřun laser ou
dřune lampe à arc. Ce procédé dřanalyse individuelle (cellule par cellule) est
multiparamétrique, et peut sřeffectuer à la vitesse de plusieurs milliers
dřévénements par seconde.

3.1.2.4.5. Principe

Le principe de la Cytométrie en Flux (CMF) est de faire défiler des


cellules en suspension dans un flux laminaire liquide à grande vitesse,
devant un faisceau monochromatique et de haute énergie (en général un
laser). Ce principe repose sur le guidage des cellules en suspension assurant
leur passage « en file indienne » devant le système d'illumination, pour
permettre leur analyse dans un temps très court, de l'ordre de quelques
microsecondes.

Pour faire fonctionner un cytomètre en flux, il faut nécessairement


une combinaison de :
 Système fluidique : pour introduire et canaliser les
cellules,
Cours de Biologie Clinique | 226
 Système optique : une source dřexcitation et de
récupération des signaux,
 Système électronique : pour convertir les signaux optiques
en des signaux électroniques proportionnels, et les numériser pour les
analyser avec un ordinateur.

Le laser est un tube creux, qui contient un gaz inerte tel que lřArgon,
lřHélium ou le Néon. Une intense lumière laser monochromatique est
produite, lorsquřon fait passer un courant électrique à travers le tube (laser)
rempli de gaz, le courant excite les molécules inertes du gaz qui atteignent
un niveau énergétique élevé.

Lorsquřelles reviennent à leur niveau initial, elles dégagent de


lřénergie sous forme de photon de lumière. Cette lumière, dans le laser, est
intensifiée par une série des miroirs et finalement émise comme un étroit
rayon lumineux spécifique dřune longueur dřonde déterminée. La longueur
dřonde de la lumière est caractéristique du gaz se trouvant à lřintérieur du
laser.

Lřéchantillon est alors aspiré dans un tube qui contient un liquide


périphérique (courant liquidien périphérique), et un courant liquidien central
(qui est lřéchantillon avec les cellules).

Les cellules, alignées les unes derrière les autres et séparées dřau
moins 1 mm, défilent à grande vitesse (plus de 30 km/h) devant une source
lumineuse : un laser (argon, krypton) ou une lampe (mercure).

Les cellules injectées au centre d'une veine liquide indépendante (le


liquide de gaine) adoptent une progression particulière, en file indienne, et
croisent un faisceau laser qui irradie une à une, durant quelques minutes,
toutes les cellules à la cadence moyenne de 1.000 cellules / seconde.

Durant cet instant, chaque cellule diffuse toujours une partie de la


lumière incidente et émet simultanément une ou plusieurs lumières de
fluorescence, en fonction des sondes fluorescentes qu'elle porte. Les signaux
lumineux captés par une optique appropriée sont transmis à des détecteurs
photoélectriques, puis à un ordinateur qui mémorise toutes les données
individuelles, et dans l'ordre de passage de chaque cellule.

Le flux est laminaire, c'est-à-dire, que les deux liquides ne se


mélangent pas et progressent chacun selon leur propre trajectoire.

Les signaux détectés par le système optique sont amplifiés, convertis


en signaux électroniques puis en valeurs numériques. Elles sont analysées
grâce à l'unité informatique du cytofluorimètre.
Cours de Biologie Clinique | 227
Les données sont représentées par des histogrammes de distribution
de fréquence : l'axe horizontal correspond à l'étendue des canaux, l'axe
vertical au nombre de cellules par canal. L'histogramme mono paramétrique
de la fluorescence montre la distribution des cellules marquées. Les mesures
de taille, de contenu cellulaire, de fluorescence étant réalisées, l'exploitation
de ces données permet, au sein d'une population cellulaire homogène,
d'exprimer en pourcentages, les cellules marquées.
Le cytofluorimètre analyseur de cellules peut être équipé pour devenir trieur
de cellules : les cellules repérées sont déviées vers un tube collecteur et ainsi
isolées ou triées.

La déflection est réalisée en utilisant des gouttelettes chargées


électriquement dans lesquelles se situent les cellules, et sont déviées par un
champ électrique permettant ainsi le regroupement de sous-populations
cellulaires pures.

Figure 59 : Le principe de la cytométrie.

3.1.2.4.6 Commentaires

Les cellules sont dispersées dans du sérum physiologique et passent à


travers un faisceau de lumière laser. La diminution de lřintensité du faisceau
direct permet de mesurer la masse cellulaire
Les cellules qui émettent de la fluorescence sont reconnues par une
cellule photoélectrique particulière.
Enfin, on peut éventuellement séparer les cellules selon leur charge
électrique : séparateur de cellules
Cours de Biologie Clinique | 228

Forwad
scatter(FSC)

Side scatter
(SSC)
Side scatter (SSC)
Figure 60 : Principe du centrage hydrodynamique.

Les longueurs dřonde non réfléchies sont transmises, on obtient ainsi


des miroirs dichroïques, cřest-à-dire, capables dřoffrir des colorations
diverses suivant la direction de lřobservation.

Pour les filtres, on retrouve en transmission les mêmes courbes que


pour les miroirs, par contre les longueurs dřonde non transmises ne sont pas
réfléchies, et elles sont soit absorbées, soit détruites.
Après avoir traversé cette succession de miroirs et de filtres, la lumière est
recueillie et transformée en signal électrique par un photomultiplicateur ou
une photodiode.

Deux types de sources sont actuellement utilisés :


•Les lasers (les plus fréquemment utilisés), qui présentent un
grand nombre dřavantages : puissance, stabilité, finesse du faisceau.
Le laser produit une lumière monochromatique qui excite
spécifiquement un fluorochrome à une longueur d'onde donnée et
transforme lřénergie sous forme de photons. Le plus utilisé est à ion argon
qui émet une lumière à une longueur d'onde de 488 nm.

De nombreux fluorochromes peuvent être excités à cette longueur


d'onde, et l'on peut ainsi étudier plusieurs paramètres cellulaires. D'autres
lasers argon peuvent être utilisés à des longueurs d'onde différentes, on peut
Cours de Biologie Clinique | 229
également faire appel à un second laser (xénon, krypton, hélium-néon,
hélium- cadmium), pour augmenter la gamme des fluorochromes utilisables
simultanément.

Les fluorochromes sont des substances capables, quand elles


reçoivent un rayonnement incident d'une certaine longueur d'onde, de
réémettre, lors de leur déexcitation électronique, une radiation de longueur
d'onde supérieure. En dřautres termes, le fluorochrome absorbe lřénergie du
laser et restitue lřénergie absorbée par :
-vibration et dissipation de chaleur ;
-émission de photons de longueur dřonde supérieure.

La détection de plusieurs paramètres n'est limitée que par les sources


d'excitation disponibles. Ainsi, sont souvent utilisés l'isothiocyanate de
fluorescéine et la phycoérythrine R, qui sont excitables à la même longueur
d'onde, mais qui émettent à 2 longueurs d'onde bien séparées, permettant
ainsi de récupérer 2 signaux différents.

Le nombre de cellules nécessaire est de 500.000 cellules au


minimum. Ce nombre est augmenté, si la population étudiée représente
moins de 1 % de la population totale enregistrée. Les lasers ont des spectres
dřémission discontinus.

•Les lampes à vapeur de mercure ou au xénon, sont aussi


utilisées. La focalisation est moindre que dans le cas du laser, mais le
spectre est assez large et leur coût est limité.

Collecte de la lumière émise :


Les différents signaux optiques émis par la cellule doivent
être focalisés, séparés, puis acheminés vers des systèmes de détection,
photomultiplicateurs ou photodiodes. Ils sont pour cela, sélectionnés par
différents circuits optiques, composés dřune alternance de miroirs et de
filtres.
Un miroir est une surface réfléchissante, et suivant le traitement de
sa surface, on peut obtenir trois types de miroirs :
 passe-haut (Long Pass), qui transmettent des longueurs
dřondes supérieures à une longueur dřonde donnée ;
 passe-bas (Short Pass), qui transmettent les longueurs
dřondes inférieures ;
 passe bande (Band Pass), qui transmettent les longueurs
dřondes comprises entre deux valeurs.
Cours de Biologie Clinique | 230

 La lumière diffusée renseigne sur la morphologie et la


structure de la cellule. Si la diffusion de la lumière est mesurée dans lřaxe du
rayon incident, lřintensité du signal peut être corrélée avec la taille et la
viabilité cellulaire.
Sous un angle de 90°, la mesure correspond à la structure intracellulaire de
la cellule (réfringence du cytoplasme, morphologie, rapport nucléo-
cytoplasmique). Lřutilisation simultanée de ces deux paramètres permet de
distinguer, dans un sang périphérique par exemple, les plaquettes, les
lymphocytes, les monocytes et les polynucléaires.

Figure 61 : Utilisation de la double diffusion de la lumière pour


distinguer les diverses sous populations sanguines (FSC : diffusion aux
petits angles, SSC : diffusion aux grands angles).
Cours de Biologie Clinique | 231
3.1.2.4.7. Présentation des résultats

Le moyen le plus simple, de représenter les résultats cytométriques,


est lřhistogramme ; et les valeurs numériques issues des convertisseurs sont
stockées par lřinformatique et présentées sur les écrans des cytomètres sous
deux formes :
•des histogrammes mono paramétriques, où lřaxe des abscisses représente
lřintensité du signal analysé et lřaxe des ordonnées le nombre de cellules.
•des histogrammes bi paramétriques ou cytogrammes, présentant deux
signaux simultanément.

Figure 62 : Représentation graphique dřun histogramme

Il représente la fluorescence relative par rapport au nombre


dřévènements.
Pour apprécier les caractéristiques relatives aux autres paramètres, il est
nécessaire dřutiliser des représentations « dot plot », « density plot » Ou «
contour plot »

GRANULOCYTES

MONOCYTES

LYMPHOCYTES

Figure 63 : Représentation de la taille et de la granulosité

Pour chaque cellule qui passe, sa taille est analysée par rapport à sa
granulosité. Cela est un bon moyen de détecter un petit nombre
dřévènements dont les populations sont clairement séparées, mais ne donne
Cours de Biologie Clinique | 232
pas de renseignements sur la densité relative des évènements : cřest la raison
principale pour utiliser la «densité plot ».

3.1.2.4.8. Avantages

La cytométrie en flux permet :


-d'identifier une sous-population au sein d'une population hétérogène
sans enrichissement préalable de cette population ;
-de faire la différence entre une faible augmentation d'expression
d'une molécule sur toutes les cellules ou une augmentation importante dans
une sous population ;
-une analyse rapide : 100 000 cellules/minute en moyenne ;
-d'obtenir une sensibilité de détection et une quantification supérieure
à la microscopie optique, ainsi l'échelle d'intensité comprend de 256 à 1024
canaux ;
-de mesurer plusieurs paramètres, en utilisant des fluorochromes
différents (il faut faire attention au chevauchement des spectres respectifs
des fluorochromes). Des fluorochromes de plus en plus nombreux ont des
spectres d'excitations proches et des spectres d'émission bien séparés, ce qui
permet de n'utiliser qu'un seul laser.
Ce qui distingue la cytométrie en flux des autres techniques
analytiques et préparatives est quřelle réunit les cinq caractéristiques
essentielles suivantes : analyse quantitative, sensibilité de détection, rapidité,
analyse multiparamétrique cellule par cellule, tri.

3.1.2.4.9. Principales applications

1° L’hématologie a été lřune des premières disciplines médicales à


bénéficier des applications cliniques de la cytométrie en flux (CMF).
Certaines de ces applications sont maintenant utilisées régulièrement pour le
diagnostic ou le suivi thérapeutique de différentes affections. Ces
applications concernent aussi bien lřétude fonctionnelle des cellules saines
que la mise en évidence du caractère pathologique des cellules analysées.

2° En cancérologie, la détection de la cellule pathologique est


lřapplication la plus développée. Cette détection repose essentiellement sur
la mesure dřun contenu anormal dřADN dans le noyau de la cellule
tumorale.

3° L'immunologie utilise la cytométrie en flux pour la détection ou


l'identification des sous-types des cellules impliquées dans l'immunité.

4° Etude des cellules de l'immunité.


Les lymphocytes peuvent être caractérisés par des marquages à l'aide d'Ac
monoclonaux comme les anti-CD4, -CD8, -CD3, -CD2, -CD19, ou à l'aide
de colorants des acides nucléiques.
Cours de Biologie Clinique | 233
La densité d'expression de ces marqueurs peut aider à identifier des stades
de maturation différents.
Dans le SIDA, la cytométrie en flux est une méthode de choix pour étudier
ce syndrome immunodéficitaire caractérisé par une lymphopénie avec
diminution du nombre des TCD4+ et augmentation des CD8+ aux stades
initiaux.
La coloration des cellules par l'acridine orange (ADN/ fluorescence verte et
ARN/rouge) permet, par exemple, de différencier lymphocytes et monocytes
en fonction du contenu en ARN.

5° Le cycle cellulaire représente lřintégralité de la période de


division, cřest-à-dire lřensemble des événements biochimiques et
morphologiques qui sont responsables de la prolifération cellulaire. La
cytométrie en flux offre une méthodologie rapide et simple à mettre en
œuvre pour lřanalyse du cycle cellulaire. Elle permet de suivre la
distribution des cellules dans les différentes phases du cycle en fonction de
divers stimulus ou de lřajout de certaines drogues. Elle permet aussi de voir
la présence des cellules avec des contenus anormaux dřADN.

6° Etudes pharmacologiques : de nombreuses études en


pharmacologie font aussi appel à des techniques de cytométrie en flux : mise
au point ou étude de drogues antimitotiques, immunothérapie.

7° En océanographie : la cytométrie en flux est devenue une


méthode de routine pour compter les différentes populations du pico
plancton photosynthétique, sur la base de la fluorescence des pigments tel
que la chlorophylle. Après marquage des échantillons avec des marqueurs
de l'ADN tels que le SYBR-Green, on peut aussi énumérer bactéries et
virus.
Dřautres recherches font appel à la cytométrie en flux : lřanalyse des
chromosomes, la physiologie végétale (ploïdie, contenu en ADN, pour la
sélection des plantes les plus résistantes), etc.
Cours de Biologie Clinique | 234
QUELQUES IMAGES DE CYTOMETRIE EN FLUX

L'appareil : deux modèles différents.

Un cytomètre analyseur de paillasse


Cours de Biologie Clinique | 235

Est un cytomètre trieur de cellules, beaucoup plus imposant.


Cours de Biologie Clinique | 236
CHAPITRE IV : HEMOSTASE

Lřhémostase regroupe les différents mécanismes qui assurent la


prévention des saignements spontanés et lřarrêt des hémorragies, en cas de
rupture de la continuité de la paroi vasculaire. Elle comprend classiquement
un temps vasculaire, un temps plaquettaire, et un temps plasmatique dominé
par lřintervention des facteurs de coagulation suivie de ceux de fibrinolyse.

Les deux premiers temps constituent lřhémostase primaire dans


laquelle le vaisseau, les plaquettes et au moins deux facteurs protéiques
plasmatiques ; le facteur Willebrand et fibrinogène interviennent.

Les éléments de lřHémostase sont :


• le vaisseau (lřendothélium et les structures sous endothéliales) ;
• les plaquettes ;
• les phospholipides plaquettaires ou non plaquettaires, dont le rôle
est de constituer des surfaces favorisant lřinteraction des différentes
protéines entre elles ;
• le facteur Willebrand ;
• les protéines plasmatiques de la coagulation ;
• lřion calcium ;
• le facteur tissulaire ;
• les inhibiteurs de la coagulation ;
• les facteurs du système fibrinolytique.

4.1. PHYSIOLOGIE DE L’HEMOSTASE PRIMAIRE

Lřhémostase primaire est lřensemble des phénomènes responsables


de la focalisation initiale du processus de lřhémostase, par la formation du
clou plaquettaire. Ceci permet lřarrêt du saignement après effraction
vasculaire au niveau des vaisseaux de petit calibre.

4.1.1. Eléments impliqués dans l’interaction Plaquette/Vaisseau

 Le vaisseau, composé de :
-La cellule endothéliale : est non thrombogène, à perméabilité
sélective, lieu de synthèse du facteur Willebrand et cellule capable de
transformer les phospholipides de sa membrane en prostacycline avec
activité vasodilatatrice et antiagrégante.
-Le sous-endothélium : est lui, thrombogène et composé de
macromolécules (collagène, membrane basale, microfibrilles, fibronectine,
glycosamino-glycanes) en grande partie synthétisées par la cellule
endothéliale.

 Les plaquettes :
Cours de Biologie Clinique | 237
La membrane plaquettaire est constituée dřune double couche de
phospholipides incluant des glycoprotéines (GP) responsables des réactions
plaquettaires spécifiques.
-GP Ib : fixation de vWF (Facteur de Von Willebrand) ;
-GP II b/III a : fixation du fibrinogène et du calcium ;
-GP V : fixation de la thrombine ;
-Les organelles intracytoplasmiques : les granules denses contenant
ADP, ATP, sérotonine, calcium et les granules contenant les protéines de
la coagulation : fibrinogène, proaccélerine, facteur Willebrand, fibronectine
et dřautres protéines spécifiquement plaquettaires ; le facteur 4 antihéparine,
le PDGF.
 Le facteur Willebrand : Ce facteur circule dans le plasma
lié au facteur VIIIC dont il est la protéine porteuse. Ce sont les multimères
de haut poids moléculaire seuls qui interviennent dans lřinteraction.
 Les forces hémodynamiques : Principalement la force de
cisaillement due à la vitesse dřécoulement au niveau de la paroi.

4.1.2. Mécanismes de l’Hémostase Primaire

La séquence des phénomènes peut être schématisée ainsi :


 La vasoconstriction réflexe immédiate mais transitoire de
petits vaisseaux freine la perte sanguine et favorise la margination des
plaquettes au niveau de la brèche vasculaire.
 Lřadhésion des plaquettes aux structures sous-
endothéliales qui nécessite la fixation du facteur Willebrand au sous-
endothélium, et son interaction avec la glycoprotéine GP Ib de la membrane
plaquettaire.
 Lřactivation des plaquettes, caractérisée par :
-les modifications morphologiques (étalement, émission de
pseudopodes) ;
-la sécrétion du contenu des granules et ;
-la stimulation du métabolisme des phospholipides membranaires
aboutissant à la formation de thromboxane A2, puissant agent agrégant ;
-lřagrégation des plaquettes entre elles : processus actif qui nécessite
du Ca++, du fibrinogène et de lřénergie. Elle se fait en réponse à un
stimulus : ADP, Acide arachidonique, thrombine... Le fibrinogène et les
autres protéines adhésives ancrées sur les récepteurs forment en présence du
calcium des ponts intercellulaires reliant une plaquette à plusieurs autres.
Cet amas cellulaire colmate la brèche et constitue un thrombus blanc.
Cours de Biologie Clinique | 238
4.2. Pathologies de l’Hémostase Primaire

La pathologie de lřhémostase primaire se traduit par un allongement


du temps de saignement et se manifeste par un syndrome hémorragique
essentiellement cutanéo-muqueux.

4.2.1. Syndromes hémorragiques par anomalies vasculaires

4.2.1.1. Purpuras infectieux

-Bactéries : méningococcémies, fièvre typhoïde, endocardite


dřOSLER, autres septicémies.
-Virus : phase prodromique de lřhépatite B, syndromes malins des
maladies éruptives.
-Rickettsioses : fièvre pourprée de montagnes rocheuses, typhus.
-Parasitaires : paludisme.

4.2.1.2. Purpuras immunoallergiques

-Médicaments : penicilines, sulfamidés, phénacetine, procaïne,


iodure, antivitamine K, belladone.
-Maladies sériques, rhumatoïdes, angéites nécrosantes : PAN, LED,
Wagner-Unverricht (Poïkilodermatomyosite).

4.2.1.3. Purpuras hyper et dysglobulinémies

-Purpuras hyperglobulinémiques : cirrhose, sarcoïdose, Sjögren


(kérato-conjonctivite sèche : insuffisance des glandes à sécrétion externe).
-Purpuras cryoglobulinémiques.
-Manifestations hémorragiques de myélome et de macroglobulinémie
de Waldenström.
-Amylose.

4.2.1.4. Anomalies de la paroi vasculaire

-Constitutionnelles : fragilité capillaire constitutionnelle,


télangiectasie hémorragique héréditaire, maladie dřEhleir Danlos.
-Acquises : purpuras corticothérapique et syndrome de Cushing,
purpuras sénile, scorbut.

4.2.1.5. Dermatoses avec manifestations hémorragiques

-Purpuras annulaires télangiectasiques, maladie de Shamberg.


-Sarcome de Kaposi ou au cours de Sida.
Cours de Biologie Clinique | 239
4.2.1.6. Purpuras par sensibilisation auto-érythrocytaire et
psychogène

4.2.2. Anomalies plaquettaires

4.2.2.1. Quantitatives

- Thrombopénies constitutionnelles : syndrome de Wiskott-Aldrich,


maladie de May-Hegglin, amégacaryocytose, aplasie de Fanconi.
- Toutes les thrombopénies acquises.

4.2.2.2. Qualitatives

4.2.2.2.1. Thrombopathies constitutionnelles

a) Dystrophie de Bernard et Soulier : cřest lřabsence dřune


glycoprotéine de membrane GP Ib, récepteur de facteur Willebrand et
nécessaire à lřadhésion plaquettaire aux structures sous endothéliales.
Maladie à transmission autosomale récessive.
b) Thrombasthénie de Glanzman : absence du complexe
glycoprotéique membranaire II b/IIIa, récepteur du fibrinogène et cofacteur
principal de lřagrégation. Maladie à transmission autosomale récessive.
c) Anomalie de la sécrétion plaquettaire due :
- à lřabsence des granules denses : maladie du pool vide ;
- à lřabsence des granules alpha : syndrome de plaquettes grises ;
- à lřanomalie de la voie des prostaglandines.

4.2.2.2.2. Thrombopathies acquises

- Médicamenteuses : aspirine, anti inflammatoire non stéroïdien,


penicilline G à forte dose, ticlopidine, dipyridamole, tranquillisant,
- Thrombopathies associées à dřautres maladies SMP (Syndrome
Myeloproliferatif) anémies réfractaires, insuffisance rénale chronique,
cardiopathie congénitale.

4.2.3. Maladie de Willebrand

Affection constitutionnelle à transmission autosomale liée à une


anomalie quantitative et/ou qualitative du facteur Willebrand
(Pseudohémophilie, qui ne se manifeste que chez la femme).
Cours de Biologie Clinique | 240
4.2.3.1. Clinique

-hémorragies cutanéo-muqueuses : épistaxis, ménorragie,


ecchymose ;
-Hémorragies post traumatiques, post opératoires ;
-Peu ou pas dřhémarthroses sauf dans les formes sévères.

4.2.3.2. Biologie dans la forme typique

Allongement du temps de saignement


Allongement de TCA (Temps de Céphaline Activée)
Diminution de facteur Willebrand antigène et de son activité
biologique
Diminution de lřactivité du facteur VIII.
Il existe plusieurs variantes de la maladie.

4.2.3.3. Physiopathologie

Lřallongement du TS (Temps de Saignement) est dû à lřabsence


dřune protéine plasmatique nécessaire à lřadhésion des plaquettes aux
structures sous endothéliales : le facteur Willebrand. La diminution du
facteur VIII est secondaire à la diminution du facteur Willebrand qui le
protège de la dégradation excessive.
.
4.2.3.4. Traitement

Apport de concentrés enrichis en facteur Willebrand ou


cryoprécipités.
Administration de DDAVP (D-amino-D-arginine Vasopressive,
MinirinR) si les taux de facteur VIII et Willebrand de base sont supérieur à
5%.
Lors dřune intervention chirurgicale, le traitement est commencé 12
Ŕ 18 heures avant lřopération pour maintenir le taux de facteur VIII
supérieur à 30% nécessaire pour éviter les complications hémorragiques.

4.3. Explorations de l’Hémostase Primaire

1° Temps Saignement.
2° Numération plaquettaire.
3°Etude de leur comportement sur lame (étalement, modification
morphologique, agrégation).
4° Durée de vie éventuelle.
5° Etude de lřadhésivité des plaquettes :
-A la brèche vasculaire in vivo : test de Borchgrevink avec lřindex
dřadhésivité normal = 20 Ŕ 40%
Cours de Biologie Clinique | 241
-A des billes de verre in vitro : test de Salzman dont la normale est :
20 Ŕ 50%
6° Etude de lřagrégabilité des plaquettes par la mesure de la variation
de densité optique dřun plasma riche en plaquettes en présence de différents
agents agrégants (ADP, Collagène, Adrénaline, thrombine, ristocétine).
7° Etude de la rétraction du caillot : qui dépend du nombre et de la
qualité des plaquettes et aussi du taux du fibrinogène et de lřhématocrite. La
rétraction complète se fait endéans 4h à 37°C.
8° Le dosage du facteur Willebrand.
9° La mesure de la résistance capillaire est dřintérêt discutable.

CHAPITRE V : COAGULATION

La coagulation du sang permet la transformation dřune protéine


soluble, le fibrinogène en une protéine insoluble, la fibrine. Le clou
hémostatique apparu à lřissu du temps plaquettaire permet une hémostase
imparfaite et temporaire. La coagulation intervient pour consolider le
thrombus plaquettaire et réaliser une hémostase permanente.
Dans les conditions physiologiques, les mécanismes de la
coagulation sont indissociables de ceux de lřhémostase primaire.

5.1. Eléments impliqués dans la Coagulation

1° Les protéines plasmatiques de la coagulation : ces protéines sont


au nombre de dix, auxquelles il convient dřajouter la prékallicréine et le
Kininogène de Haut Poids Moléculaire (KHPM), médiateur de lřactivation
par contact.
2° Le facteur tissulaire (FT) : présent dans la cellule endothéliale,
cellule musculaire lisse, le fibroblaste et le monocyte.
3° Les phospholipides : qui constituent une surface favorable à
lřactivation enzymatique des facteurs de la coagulation.
4° Le calcium : nécessaire dans les réactions enzymatiques et
indispensable à la fixation des protéines K-dépendantes aux phospholipides.
5° Les inhibiteurs physiologiques : -Les antiprotéases : antithrombine
III (ATIII), 2 macroglobuline ( 2 M), 1 antitrypsine ( 1 AT), inhibiteur
de la C1 estérase (C1 INH).
-Le système protéine C / protéine S qui sont des protéines
synthétisées par le foie en présence de vitamine K.
Cours de Biologie Clinique | 242

Tableau XVII : Facteurs inhibés.

Facteurs ATIII 2M 1 AT C1 INH P


inhibés CA
Sérines
protéases
Kallicréine + + +
XIIa + +
XIa + + +
Ixa +
Xa +
Iia + + +
Cofacteurs
Va +
VIII:Ca +

5.2. Facteurs de la Coagulation

Facteurs et dénominations Lieu de synthèse Interventi


on de la Vit K
I Fibrinogène Foie
II Prothrombine Foie +
III Thromboplastine tissulaire /
IV Calcium ionisé * /
V Proaccélerine Foie
VI Accélerine *
VII Proconvertine Foie +
VIII Antihémophilique A
IX Antihémophilique B Foie +
X Facteur de Stuart Foie +
XI Facteur PTA (Plasma Thromboplastin ?
Antecedent)
XII Facteur Hageman ?
XIII Facteur stabilisant la fibrine ?
Facteur Fletcher : prékallicréine ?
Facteur Flaugeac : KHPM ?
Cours de Biologie Clinique | 243
5.3. Etapes de la Coagulation
5.3.1.Génération de la prothrombinase

5.3.1.1.Voie intrinsèque

a) Lřactivation initiale par contact : le sang, au contact avec une


surface chargée négativement, active la prékallicréine en kallicréine, la kallicréine
active le XII en XIIa, réaction amplifiée par le KHPM. Le XIIa active le XI en
présence dřion calcium.
b) Lřactivation des facteurs antihémophiliques : le IXa, activé par le
XIa, en présence dřions calcium, se fixe sur la membrane plaquettaire par
lřintermédiaire dřion Ca++, et va transformer le X en Xa, réaction accélérée par le
facteur VIII activé. Le facteur VIII est activé par la thrombine. NB : a=activé

5.3.1.2. Voie extrinsèque

La thromboplastine tissulaire est capable dřactiver, en présence dřion


calcium, la proconvertine ou facteur VII en VIIa. Celui-ci, associé à la
thromboplastine, active le facteur X.

5.3.1.2.1. Formation de la prothrombinase

Le facteur Xa adsorbé à la surface des phospholipides et associé à Va


constitue la prothrombinase : Xa + Va + F3P + Ca++.

5.3.1.2.2. Thrombinoformation

Lřactivation de la prothrombine, facteur II par le Xa de la


prothrombinase libère la thrombine ou facteur IIa.

5.3.1.2.3. Fibrinoformation

-Lřaction de la thrombine sur le fibrinogène libère des monomères de


fibrine et des fibrinopeptides A et B.
-Lřagrégation de monomères de fibrine et des fibrinopeptides, grâce
à des liaisons hydrogènes, forme des molécules de fibrine insolubles.
-Le facteur de stabilisation de la fibrine ou facteur XIII activé par la
thrombine solidifie les liaisons entre monomères en liaisons covalentes
stables et rend le caillot insoluble.

5.3 Maladies de la Coagulation

5.4.1. Maladies de la voie intrinsèque de la coagulation :


Hémophilies A
Cours de Biologie Clinique | 244
Affections constitutionnelles transmises de façon récessive, liée au
sexe, càd nřatteignant que les garçons et transmises par les femmes
apparemment saines, mais porteuses de la tare.
*Clinique :
Il existe deux formes dřhémophilies : majeure et mineure.

5.4.1.1. Hémophilie sévère ou majeure

-Premiers accidents vers lřâge dřun an ou plus tôt, lors de la


circoncision.
-Accidents de lřappareil locomoteur spontané qui sont
caractéristiques de lřhémophilie ; les hémarthroses récidivantes pouvant
atteindre toutes les grosses articulations avec une douleur vive, et pouvant
entraîner une destruction progressive des cartilages et des surfaces
articulaires, les hématomes musculaires, sous cutanés ; présence de
nombreuses ecchymoses mais pas de pétéchies.
-Hémorragies post traumatiques ou per/post opératoire, si le
diagnostic est méconnu (amygdalectomie, appendicectomie etc.).
-Hémorragies buccales, gastro-intestinales, cérébro-méningées,
hématuries fréquentes, épistaxis fréquents.

5.4.1.2. Hémophilie modérée ou mineure

-Pas ou peu dřaccidents hémorragiques spontanés, mais mêmes


risques quřhémophilie sévère en situation chirurgicale.
*Physiopathologie :
La maladie est due à un défaut de synthèse du facteur VIII ou à la
production dřune molécule de structure anormale. Lřexpression dřune
diminution de lřactivité du facteur VIIIc responsable des hémorragies
importantes à caractères suivants :
-Provoquées par un facteur minime et démesuré, par rapport à la
cause.
-Sans tendance à lřarrêt spontané.
-Retardées, car reprennent au moment de la chute du caillot.
*Biologie :
-Temps de coagulation allongé.
-Temps de céphaline avec activateur allongé (TCA). Cet allongement
est corrigé par lřaddition du plasma normal.
-Dosage spécifique du facteur VIII, qui donne le degré du déficit.
-Temps de saignement (TS) normal.
*Traitement : 3 Ŕ 4 û/ml fc VIII, DDVAP (D-amino-D-arginine
vasopressive, MinirinR).
Cours de Biologie Clinique | 245
5.4.2. Maladies du complexe prothrombinique

5.4.2.1. Avitaminose K

La vitamine K est une vitamine liposoluble apportée par


lřalimentation ou synthétisée par les bactéries de lřintestin. Elle est
nécessaire à la synthèse des facteurs VII, X et II par le foie. Son déficit se
révèle par :
- TQ (temps de Quick) allongé ;
- TCA allongé ;
- Taux des facteurs II, VII, XI, X, protéine C et protéine S diminués ;
-Taux de facteur V normal ;
Ces anomalies sont corrigées par lřadministration parentérale de
vitamine K.

5.4.2.2. Déficience du parenchyme hépatique

Les atteintes hépatiques provoquent des déficits par défaut de


synthèse de protéines hépatiques intervenant dans le processus de la
coagulation impliquant :
-TQ allongé ;
-TCA allongé ;
-Taux des facteurs II, VII, IX, X, protéine C et protéine S diminués ;
-Taux de facteur V diminué ;
-Taux dřantithrombine III (ATIII) diminué ;
-Facteur VIII est souvent augmenté ;
-Temps de thrombine (TT) allongé.

5.4.2.3. Syndrome de coagulation intravasculaire disséminé :


CIVD

Cřest une activation du processus de coagulation et transformation du


fibrinogène en fibrine, suivie dřune fibrinolyse secondaire réactionnelle.
a) Les facteurs déclenchant capables dřinitier in vivo les processus de
coagulation sont :
-La mise en circulation de certains extraits tissulaires ;
-Les lésions endothéliales étendues ;
-Les complexes Ag Ŕ Ac entraînant des altérations plaquettaires.
b) Les principales étiologies sont :
-Les infections : septicémies, paludisme à plasmodium falciparum ;
-Les causes obstétricales : décollement prématuré du placenta,
rétention du fœtus mort, septicémies du post partum ou post abortum ;
-Les néoplasies : cancers métastasés, leucémies aiguës M3 ;
-Les causes pédiatriques : infections néonatales, détresse
respiratoire ;
-Les causes chirurgicales ;
Cours de Biologie Clinique | 246
-Les causes médicales diverses.

5.4.2.3.1. Physiopathologie du CIVD

Le processus de la CIVD résulterait de la formation anormale dans le


sang circulant de thrombine en faibles quantités, aboutissant à la formation
de complexes solubles. Ces derniers sont composés de monomères de
fibrine et de fibrinogène ou de produits de dégradation de la fibrine.
La lyse in situ, au moins partielle des dépôts fibrineux, entraîne
lřapparition des produits de dégradation de la fibrine, qui seront retrouvés
dans le sérum.
Les accidents hémorragiques résultent de la consommation des
plaquettes et de différents facteurs plasmatiques nécessaires à la
coagulation.
La CIVD peut sřaccompagner à la fois dřaccidents
thromboemboliques et hémorragiques.

5.4.2.3.2. Clinique du CIVD

Sřobserve dans les formes chirurgicales, obstétricales et médicales


caractérisées par : le saignement en nappe, les hémorragies aux points de
piqûres, les ecchymoses, les hématuries et les hémorragies utérines en
obstétrique. Se complique souvent de collapsus.

5.4.2.3.3. Diagnostic biologique du CIVD

Thrombopénie ;
fibrinopénie < 2g/l ;
TQ allongé ;
TT allongé ;
Présence des PDF et D. Dimères ;
Présence des complexes solubles ;
Déficit de facteur V.

5.4 Exploration de la Coagulation

5.5.1. Tests globaux

- Temps de coagulation ;
- Temps de recalcification en tube du plasma riche en
plaquettes(Howell).

5.5.2. Tests semi-analytiques

- TP : Temps de Quick (II, V, VII, X) ;


Cours de Biologie Clinique | 247
- TCA : Temps de céphaline avec activateur (XII, XI, IX, VIII, X, V,
II, I, KHPM) ;
- TT : Temps de thrombine (fibrinogène, IIa, la présence de PDF
et/ou héparine) ;
- Etude de la solubilité du caillot.

5.5.3. Dosage spécifique de différents facteurs : Fibrinogène et


Facteur de Willebrand.

CHAPITRE VI : PHYSIOLOGIE DE LA FIBRINOLYSE

La fibrinolyse est le processus physiologique qui assure


normalement la disparition des caillots de fibrine intra et extravasculaires et
joue un rôle dans la réaction inflammatoire.

6.1. Eléments du Système Fibrinolytique

a) Le plasminogène PG : glycoprotéine de 90 Kd synthétisée par le


foie, présent dans le plasma à la concentration de 100 Ŕ 200 g/ml Il a la
propriété de se lier étroitement à la fibrine lors de la coagulation.
b) La plasmine PE : enzyme protéolytique provenant de lřactivation
du plasminogène, effecteur de la fibrinolyse.
c) Les activateurs du plasminogène : leur activation se fait selon
trois voies :
-Activation intrinsèque (hormonale), qui fait intervenir le facteur XII,
la prékallicréine et le KHPM.
-Activation extrinsèque (t-PA) provient des tissus ou de
lřendothélium vasculaire, la pro-urokinase (Pro-Uk)
-Activation exogène : induite par les agents thrombolytiques
thérapeutiques, lřurokinase et la streptokinase.
Les inhibiteurs du système fibrinolytique sont groupés en trois :
inhibiteurs de lřactivation du plasminogène par la voie intrinsèque
ou anti-activateurs : C1 inhibiteur, AT III, 2M.
inhibiteurs de lřactivation du plasminogène par la voie extrinsèque :
PAI-1, PAI-2 synthétisés par la cellule endothéliale, les cellules granuleuses
et les hépatocytes, les Glycoprotéines Riches en Histidine (HRGP).
Inhibiteurs de la plasmine : antiplasmine ; 1AT, 2 AP
(antiplasmine), 2M.

6.2. Mécanismes de la fibrinolyse

Le plasma normal contient une globuline synthétisée en partie au


niveau du foie : le plasminogène, qui va être activé en enzyme
protéolytique, la plasmine, par des activateurs plasmatiques et tissulaires.
Lřactivateur tissulaire du plasminogène ou t-PA a une grande affinité pour la
Cours de Biologie Clinique | 248
fibrine, il stimule lřactivation du plasminogène après son adsorption sur le
réseau fibrineux. La présence éventuelle de caillots dans un vaisseau
entraîne la libération de lřactivateur du plasminogène contenu dans les
cellules endothéliales. Cet activateur agit sur le plasminogène présent dans
les caillots ; il se forme localement de la plasmine qui agit sur la fibrine et le
fibrinogène en donnant naissance à des PDF. Ces derniers ont, de plus, une
activité anticoagulante et ils inhibent la polymérisation de la fibrine.

6.3. Explorations de la Fibrinolyse

-Lyse du caillot de sang total ;


-Temps de lyse des euglobulines ;
-Dosage : plasminogène, Activateurs, Antiplasmines, PDF ;
-Recherche de Complexes solubles.

CHAPITRE VII : ETUDES DES AUTRES HUMEURS


BIOLOGIQUES

7.1. Etude des urines

INTRODUCTION

L'analyse d'urine doit se faire chez tout nouveau malade, car elle fait
partie de l'examen sommaire, tout comme la prise de la température, du
pouls, de la pression artérielle. Chez un ancien malade, cette analyse doit
être répétée de temps à autre, car des altérations rénales peuvent s'ajouter au
tableau clinique. Quand il s'agit d'un malade atteint d'affection aiguë ou
rénale, des examens d'urines doivent être faits journellement.

7.1.1. Production des urines

Nous pouvons schématiser ces phénomènes en trois processus


suivants : la filtration, la résorption et la sécrétion.

7.1.1.1. La filtration

C'est au niveau des glomérules que se déroulent les processus de


filtration. La première étape consiste en un simple processus physique de
filtration de liquide à partir des capillaires glomérulaires dans l'espace
environnant. Elle est sous la dépendance du régime circulatoire du
glomérule, du débit sanguin à son niveau et de la pression hydrostatique
régnant dans les anses glomérulaires. Il s'agit d'une ultrafiltration (filtration
très sélective) à travers les pores submicrocospiques de l'endothélium
capillaire.
L'analyse chimique du liquide qui passe dans la chambre
glomérulaire a montré que cette "urine glomérulaire" contient de l'eau, du
Cours de Biologie Clinique | 249
chlorure sodique, des phosphates, du glucose et très peu de protéines. Il n'y a
pas d'éléments figurés sanguins (globules rouges, globules blancs,
plaquettes..).
Cette filtration est sous la dépendance, avons-nous dit, du régime
circulatoire. Nous savons par exemple que le débit cardiaque par minute
chez un homme normal est d'environ 5 litres de sang, dont 1,2 litre traverse
les reins, ce qui correspond à un débit rénal de 700 ml de plasma par minute.
De ces 700 ml, 130 environ passent sous forme de
l'ultrafiltrat, dans la capsule de Bowman (débit glomérulaire). Or, le volume
de l'urine arrivant au niveau de la vessie est d'environ 1 ml par minute, soit
environ 60 ml par heure ou 720 ml en 12 heures ou environ 1.400 ml par 24
heures.
7.1.1.2. La résorption

Il s'opère donc une résorption d'eau de 129 ml par minute. Il n'y a


pas que l'eau qui est absorbée, d'autres substances le sont également. Par
exemple, le glucose est totalement réabsorbé et ne se retrouve pas
normalement dans l'urine vésicale ; les protéines sont quasi-totalement
résorbées et se rencontrent normalement dans l'urine sous forme
d'holoprotéines ou glycoprotéines à des concentrations de 1 à 5 mg %. Ces
concentrations ne sont pas détectées par des méthodes classiques (acides
forts, chaleur etc).
Actuellement, il s'est développé des méthodes plus sensibles qui
détectent les protéines à ces taux là sans que cela soit pathologique. C'est le
cas des tests tels que l'Albym-test, Albustix, Bili-Labstix etc...

7.1.1.3. La sécrétion

Une partie des éléments de l'urine provient aussi d'une activité


sécrétoire de cellules des tubes. C'est le cas par exemple d'ions H+ qui
proviennent de l'acide carbonique sanguin qui sont sécrétés au niveau
tubulaire en échange d'une réabsorption de Na+. C'est aussi le cas de NH3-
(ammoniaque) sécrété sous forme de NH4+ (ion ammonium)
vraisemblablement.
En définitive, la solution qui arrive ainsi au niveau de la vessie,
appelée URINE, n'a pas la même composition chimique que le plasma
glomérulaire ou plasma sanguin, comme le montre la figure 60. Selon cette
figure qui représente la composition de l'urine de 24 h 00' d'un individu
recevant une alimentation normale, la concentration totale des substances
dissoutes est, dans l'urine, plus du double de ce qu'elle est dans le plasma.
Le pH est beaucoup plus acide, des protéines, du glucose, des anions HCO-3,
ne se rencontrent pas dans l'urine. Par contre, l'urine contient le cation NH4+.
Cours de Biologie Clinique | 250

mEq/L

800 Ŕ 400

750 Ŕ 375 INDOSE


URINAIRE
700 Ŕ 350

650 Ŕ 325

600 Ŕ 300

550 Ŕ 275

500 Ŕ 250 Glucose UREE

450 Ŕ 225 N non uréique

400 Ŕ 200 Urée


H2CO3 Créatinine
350 Ŕ 175 H2CO3

300 Ŕ 150 NH4


Cl-
HCO3
250 Ŕ 125
Na+ Na+
200 Ŕ 100 HPO4=
Cl-
150 Ŕ 75 SO4=
+
HPO4= K
100 Ŕ 50 K+ SO4= Ca++
Ac.org
50 Ŕ 25 Protéines Mg++ Ac.org
Ca++
0 Mg++
PLASMA URINE
pH 7,4 pH 5,4
Figure 64 : Composition du plasma et de l'urine d'un homme normal,
alimenté normalement. A droite de l'ordonnée, les chiffres indiquent les valeurs
correspondant à chaque colonne. Ceux qui sont à gauche de l'ordonnée représentent
la somme des équivalents (d'après Gamble).
Le seul élément à concentration égale dans les deux liquides est l'acide
carboniqueH2CO3 (CO2+HCO3)
Cours de Biologie Clinique | 251
VII.1.2. Composition chimique de l’urine : Tableau XVIII
Constituants ou caractéristiques g/24 H. g/Litre mEq/L.

Eau ....................................................................... 1920 960 350 cc NaOHN/10


Acidité totale environ .......................................... ........... ........ 3 à 6 cc N/10
Acidité titrable des acides organiques environ. ........... ........
Densité ................................................................ 1,003-1,030
Résidus d'évaporation......................................... 60 40
Substances minérales
- Sodium ............................................................. 6 4,3
- Potassium ........................................................ 1,6-2,5 0,4 187
- Calcium .......................................................... 0,07-0,3 0,1 10,2
- Phosphore (PO4)............................................. 2,5 1-1,5 5,0
- Magnésium .................................................... 0,06-0,20 0,12 26,3
- Chlorures (Cl-) ............................................. 10 6,5 10
- Soufre total (en SO3) .................................... 2,5 180,2
- Sulfates totaux (en SO3) .............................. 2,0
- Sulfates inorganique (en SO3)…………… 1,8
- Sulfates des esters (en SO3)………………. 0,2
- Soufre neutre (en SO3) ................................ 0,03
- Fer……………………………………….. 0,0002
Substances organiques azotées
- Urée............................................................... 15 à 40 20
- N ammoniacal .............................................. 0,3 à 0,6 0,5
- Acide urique ................................................. 0,1-2 0,4
- Créatinine....................................................... 0,7-1,5 0,8
- Créatine ......................................................... 0-traces 0-traces
- Acide hippurique ........................................... 0,7 0,5
- Indican ........................................................... 0,004-0,020 -
- Acides aminés ............................................... 0,6 0,4
- Autres bases puriques .................................... traces traces
Substances organiques non azotées
- Acide oxalique ................................................ 0,015-1,34 0,01
- Acide citrique .................................................. 0,1 à 1,34 0,15
- Acide lactique .................................................. 0,050-0,0200 0,11
- Phénols .............................................................. 0,2-0,5 -
- Corps cétoniques (acides butyrique, acéto-acétique,
acétone) ........................................ ….. 0,040-0,050
- Cholestérol ....................................................... traces traces
- Pigments (urochrome, urobiline, uroérythrine) 0 ou traces traces
- Hormones, vitamines, ferments, etc... .
Cours de Biologie Clinique | 252

7.1.3. CARACTERISTIQUES PHYSIQUES ET CHIMIQUES DE


L’URINE AINSI QUE LEURS MODIFICATIONS

La connaissance de ces caractéristiques permet de mieux apprécier


tout trouble manifesté par l'urine.

7.1.3.1. Prélèvement

Pour bien apprécier ces caractéristiques, il faut savoir recueillir


correctement l'urine.

7.1.3.1.1. Récipients

On utilise des flacons à large goulot, en verre épais, de 250 à 500 ml;
les flacons usagés du service de transfusion, débarrassés de leur armature
métallique et de leur étiquette, conviennent parfaitement. Ces flacons
doivent être lavés chaque jour, sous la surveillance du laborantin de salle,
avec une brosse et une solution diluée de Teepol (1). Une fois rincés, ces
flacons, débarrassés de leurs étiquettes usagées, sont mis à sécher, goulot
vers le bas sur séchoir.
Le laborantin est tenu comme responsable de la disponibilité, de la
propreté de ce matériel. Il est indispensable de n'utiliser que des flacons
propres et bien transparents. La collecte des urines dans des flacons souillés
entraîne la prolifération des microbes, des levures. Ces dernières rendent
tout examen microscopique illusoire ; elles peuvent être confondues avec les
globules rouges.

7.1.3.1.2. Prélèvement proprement dit

Chez l'homme : les urines sont recueillies directement dans les


flacons à large goulot par miction normale.
Chez la femme : l'échantillon destiné à l'examen usuel, c'est-à-dire
recherche du glucose et des protéines doit, être prélevé par sondage de
préférence.
En effet, les urines émises spontanément par la femme peuvent être
contaminées par des sécrétions vaginales riches en protéines et en cellules.
Le risque du sondage cependant, est la contamination ou le traumatisme de
la femme. C'est pourquoi, sauf nécessité bien indiquée par l'expérience de
l'analyste du laboratoire, on accepte l'urine émise spontanément par la
femme.
Dans tous les cas, et chez la femme toujours, les échantillons destinés
aux autres analyses que celles citées ci-dessus, seront recueillis après
miction normale.

7.1.3.1.3. Identification des échantillons


Cours de Biologie Clinique | 253

Le personnel préleveur doit indiquer les noms et le numéro du


malade sur une étiquette neuve, collée au moment même sur le flacon. Il
faut éviter d'employer des flacons malpropres, porteurs d'étiquettes usagées.

7.1.3.1.4. Conservation des urines

Tous les composants des urines se décomposent rapidement surtout


en pays chauds, à l'exception des électrolytes. Ceci, à cause des bactéries ou
des champignons entraînés dans l'urine recueillie par les poussières. C'est
pourquoi, les examens doivent donc être pratiqués aussitôt que possible
après le prélèvement (endéans 2 heures). Si néanmoins on doit attendre très
longtemps avant l'examen, utiliser le meilleur préservatif qu'est le thymol.
Un petit cristal assure la conservation pendant plusieurs jours.

7.1.3.2. Caractéristiques proprement dites

Ces caractéristiques sont : aspect ou limpidité, volume, densité ou


poids spécifique, odeur, pH, et couleur.

7.1.3.2.1. Aspect ou limpidité de l'urine

Les urines normales sont claires et limpides à l'émission. Lorsqu'on


laisse reposer, elles laissent apparaître normalement une légère opacification
ou turbidité : c'est le nubécula ou sédiment urinaire, constitué de mucus, de
cellules épithéliales, de leucocytes, etc.
Le nubécula est très fréquent et abondant chez la femme normale. Le
nubécula est un trouble ou une turbidité normale.

7.1.3.2.2. Autres troubles normaux

7.1.3.2.2.1. Trouble dû aux phosphates et aux carbonates


ferreux : après un repas copieux, les urines peuvent présenter un louche
blanchâtre qui peut se déposer sous la forme d'un sédiment blanchâtre
insoluble à chaud. Etant plus concentrés en post-prandial, ils traversent en
proportion importante le filtre glomérulaire et se retrouvent en quantité
appréciable dans l'urine, malgré la réabsorption tubulaire.
Les urines sont alors neutres ou alcalines. Ce précipité se dissout
quant on acidifie les urines : acide acétique dilué à 10 % ou autre acide.

7.1.3.2.2.2. Trouble dû au froid : l'urine normale refroidie peut


laisser se déposer un sédiment d'urates, qui se dissout quand on réchauffe
l'urine ou quand on l'alcalinise avec un peu de la soude caustique, car les
urates sont les substances acides. C'est l'une des caractéristiques physico-
chimiques des urines.
Cours de Biologie Clinique | 254
7.1.3.2.2.3. Trouble dû à la fermentation ammoniacale : dans ce
cas l'urine devient alcaline et elle se trouble par la suite d'une précipitation
de phosphate calcique. Normalement, le même trouble peut exister dans
l'urine des végétariens qui est alcaline. Comme on le constate,
l'alcalinisation du pH urinaire par l'ammoniaque, substance très basique, est
à la base de la précipitation des phosphates.

7.1.3.2.4. Troubles anormaux ou pathologiques

Trouble dû aux bactéries, globules blancs.

7.1.3.2.4.1. Pus : Les sécrétions purulentes visqueuses s'accumulent


au fond du récipient. Elles contiennent d'innombrables globules blancs et
globules de pus.
L'acide acétique, la soude caustique et l'ébullition ne suppriment pas
le trouble des urines purulentes, celui-ci persiste ou augmente.

7.1.3.2.4.2. Urines laiteuses : Très rares. L'apparence laiteuse est


due à la chylurie. Les gouttelettes graisseuses en émulsion ne sédimentent
pas sous forme de culot après centrifugation ordinaire. Ceci se rencontre
dans certaines affections métaboliques ou rénales.

7.1.3.3. Volume urinaire

Le volume urinaire par 24 heures est appelé volume par nycthémère


ou nycthéméral ou circadien, diurèse. Il est de 1000 à 1500 ml ; il peut
varier entre 2 extrêmes de 900 à 2000 ml. On considère par exemple que
chez un adulte sain, recevant une alimentation normale, vivant dans un
climat tempéré et accomplissant un travail modéré ; le volume des urines par
nycthémère est de 900 à 1200 ml. Proportionnellement à son poids, l'enfant
excrète une plus grande quantité d'urine que l'adulte.

7.1.3.3.1. Volume urinaire diminue : C'est l'Oligurie. Dans ce cas,


le volume est < 900 ml.
L'oligurie se rencontre :
a) dans l'état normal : Grande transpiration par les glandes
sudoripares (soleil, exercices physiques intenses).
b) dans l'état pathologique : Diarrhées profuses, vomissements
incoercibles de la grossesse, sténose pylorique, affections fébriles, etc...

7.1.3.3.2. Il y a Anurie, quand les reins sont atteints au point de ne


pouvoir excréter les urines dans la vessie. C'est le cas dans la néphrite aiguë,
dans la décompensation cardiaque.

7.1.3.3.3. Il y a Rétention urinaire : les reins sécrètent


normalement l'urine, mais celle-ci est retenue dans la vessie suite à
Cours de Biologie Clinique | 255
l'obstruction au niveau de l'urètre : calcul vésical, sténose urétral (urétrite
gonococcique...).

7.1.3.3.4. Le volume urinaire augmente : c'est la Polyurie ou


miction importante : > 2000ml.

7.1.3.3.4.1. Dans l'état normal

Ingestion augmentée des boissons ou d'aliments liquides, d'alcool


(inhibition de l'hormone antidiurétique).

7.1.3.3.4.2. Dans l'état pathologique

Diabète insipide (l'hormone antidiurétique sécrétée au niveau de


l'hypothalamus est insuffisante ou inhibée), diabète sucré, néphrite
chronique ou aiguë (tubes atteints).
N.B. 1° Ne pas confondre POLYURIE et POLLAKIURIE qui est
une augmentation de fréquence des mictions comme dans la rétention
vésicale, la cystite, la grossesse.

2° Le diabète insipide est causé par une lésion du système


neurohormonal post-hypophyso-sous-thalamique avec carence en hormone
anti-diurétique.
Causes : tumeurs, TBC, méningite de la base encéphalique, Σ,
traumatisme crânien, électrocution, etc.

7.1.3.4. Densité ou poids spécifique de l'urine

7.1.3.4.1. Définitions

La densité dřun corps est le rapport de sa masse volumique à la


masse volumique dřun corps pris comme référence. Le corps de référence
est lřeau pure à 4°C pour les liquides et les solides. Dans le cas de gaz ou
vapeur, le corps de référence est lřair, à la même température et sous la
même pression. La densité est une grandeur sans dimension et sa valeur
Pcorps
sřexprime sans unité de mesure. : d=----------
Pref
Cours de Biologie Clinique | 256
où Pcorps est la masse volumique du corps considéré et Pref est la
masse volumique ou corps de référence.

7.1.3.4.2. Origine de la densité urinaire

Non seulement l'urine est produite par les trois processus que nous
avons décrits à savoir, la filtration, la résorption et la sécrétion, mais au
cours de son passage dans le tube rénal, l'urine subit la déconcentration et la
concentration successive, grâce au phénomène de la pompe à sodium et du
principe de "système à contre-courant" de WIRZ.
A la fin, la densité urinaire est normalement de 1,010 à 1,025 avec
des variations extrêmes de 1,003 à 1,030.

7.1.3.4.3. Variation pathologique de la densité

-La densité diminue dans le diabète insipide, dans la néphrite aiguë,


toxique ou chronique (conséquence de la perte du pouvoir de concentration
tubulaire).
-Elle est élevée dans le diabète sucré (présence de glucose), dans la
décompensation cardiaque avec oligurie (urine dense).

7.1.3.4.4. Prise de densité

En pratique, pour mesurer la densité urinaire, on procède de la


manière suivante :
On remplit aux 3/4 un cylindre d'une capacité d'environ 500 ml ou
plus avec l'urine.
On y plonge un densimètre ; sans qu'il soit en contact avec la paroi
du cylindre ni avec son fond. On lit le chiffre de la densité jusqu'à la
troisième décimale et on note la température de l'urine au moyen d'un
thermomètre.
On corrige la densité lue en fonction de la température de la manière
suivante : pour 3 degrés au-dessus de 15°C, on ajoute 1 unité à la troisième
décimale et inversement pour 3 degrés en-dessous de 15°C.
Exemple : La T° est de 25°C et on lit 1,020.
La correction est de 10 : 3 = 3.
La densité est de 1,020 + 0,003 = 1,023.
S'il y a protéinurie, retirer une unité à la troisième décimale pour
chaque 4 g%o de protéines urinaires.
S'il y a glycosurie, retirer une unité à la troisième décimale pour
chaque 2,7g %o de glucose. Pour faciliter les calculs, on retirera une unité à
la troisième décimale pour chaque 3g%.
Si le volume urinaire est insuffisant : on dilue le petit volume urinaire
obtenu avec un même volume d'eau distillée et on multiplie la fraction
décimale de la densité trouvée par 2.
Cours de Biologie Clinique | 257
7.1.3.5. Résultats et interprétation

Le volume total uriné pendant les heures peut être plus grand que le
volume bu; cela peut se rencontrer normalement (pas après 2 heures quand
même, après 12 heures...).
Le volume uriné est petit que la quantité ingérée : insuffisance rénale
par rapport au volume (glomérulonéphrite) théorique qui est de 1 ml/minute
: donc après 2 heures si c'est moins que 100 ml par exemple.
- Les néphrétiques (atteinte tubulaire) et décompensation
cardiaque ne concentrent ni ne déconcentrent : la densité reste invariable, les
tubes atteints ne fonctionnant pas normalement ; pas d'absorption d'eau
suffisante, ni d'autres substances.
- Les néphrotiques (atteinte de la membrane basale
glomérulaire) concentrent et déconcentrent (ici c'est le glomérule et non le
tube, qui est atteint), le volume est aussi augmenté : passage facile.

7.1.3.6. Odeur de l'urine

Son odeur légèrement aromatique est due à la présence d'acides


volatils (acide oxalique, acide citrique, acide lactique, phénol, acides
cétoniques). Cette odeur peut être modifiée par différents facteurs (aliments,
médicaments).
Si on laisse reposer l'urine à la température de la chambre, elle ne
tarde pas à subir la fermentation ammoniacale : transformation de l'urée en
NH3, O2 et H2O et son odeur devient désagréable (urineuse), piquante.
Dans les infections vésicales ou cystites, l'urine fermente dans la
vessie, et lors de l'émission, sent le NH3.

7.1.3.7. pH urinaire

Dans les conditions d'une alimentation mixte normale, le pH de


l'urine varie suivant les moments, entre 5,2 et 7,5 ; l'urine totale mélangée de
24 heures étant normalement acide : entre 5,5 et 5,9.

7.1.3.7.1. Le pH urinaire diminue : quand il y a augmentation


d'excrétion des déchets acides : il peut atteindre la valeur de 4,8.
- désamination azotée dans l'inanition, dans la fièvre,
l'hyperthyroïdie, certaines intoxications (augmentation du métabolisme),
dans l'acidose diabétique (corps cétonique).

7.1.3.7.2. pH augmente (alcalin)

- physiologiquement : dans le cas d'une alimentation


végétarienne (pH 6,6) contenant des carbonates, citrates, tartrates (fruits).
On a observé un pH de 8,7 en cas d'ingestion de bicarbonate de sodium.
Cours de Biologie Clinique | 258
- accidentellement : fermentation ammoniacale par
conservation sans antiseptique.
- pathologiquement : hyperchlorhydrie gastrique, infections
vésicales (cystites) d'où fermentation ammoniacale dans la vessie; alcalose
métabolique par suite de vomissements acides.
N.B. : L'urine peut être neutre ou alcaline un certain temps après
un repas même non végétarien : dû à la sécrétion gastrique acide ("alcaline
tide" des anglo-saxons ou période alcaline).
En pratique, le pH s'apprécie au papier Tournesol :
-Urines acides, le papier vire au rose-rouge;
-Urines alcalines, le papier vire au bleu-violet.
Si pour des raisons précises, il est nécessaire de connaître le pH
exact, on utilisera le papier Merck 9557 dont la gamme de virage s'étend
entre 3,4 et 8 est parfois nécessaire.

7.1.3.8. Couleur de l'urine et pigments biliaires

7.1.3.8.1. La couleur normale de l'urine

La teinte de l'urine humaine normale varie du jaune pâle au jaune


ambré ou jaune rougeâtre suivant l'importance de la diurèse, le degré de
concentration de l'urine et le pH urinaire : l'urine acide est généralement plus
foncée que l'urine alcaline ; dans la polyurie, l'urine est plus pâle que dans
l'oligurie.
Le pigment principal est l'UROCHROME, substance azotée
présentant une coloration brun-rouge avec fluorescence verte en solution
concentrée ; l'urine normale en contiendrait environ 0,30 g/litre.
L'urochrome est de nature complexe ; il donne par hydrolyse un mélange
d'acides aminés, contiendrait en outre de l'acide indoxyl-glycuronique et
serait lié à une partie de l'acide urique.
Un autre pigment existe dans l'urine, c'est Uroérythrine ou Uréthrine,
il est rouge et soluble dans l'alcool amylique. C'est ce pigment qui colore les
sédiments d'urates sur lesquels il s'absorbe. Sa concentration est accrue dans
la fièvre ; c'est pourquoi les urines peuvent être rouges en cas de fièvre.
On trouve également dans l'urine normale des quantités minimes
d'autres pigments : urobiline, stercobiline et les porphyrines qui sont les
pigments tétrapyrroliques précurseurs de la protoporphyrine.
La couleur de l'urine trouve surtout son importance dans la
pathologie hépato-biliaire. Les pigments qu'on retrouve dans l'urine à ce
moment-là sont des dérivés de la bilirubine.

7.1.3.8.1.1. Dégradation de l'hémoglobine en bilirubine

Peroxydases, myoglobine, hémoglobine, cytochromes,


catalases
Cours de Biologie Clinique | 259

HEME

Biliverdine

Bilirubine

La bilirubine est un produit de catabolisme de l'hémoglobine, mais


l'hémoglobine n'est pas la seule source de bilirubine. La bilirubine peut dériver
également de la myoglobine, cytochromes, catalases et peroxydases qui sont
comme l'hémoglobine des dérivés tétrapyrroliques, c'est-à-dire qui ont dans
leur structure chimique 4 noyaux pyrroles (Voir aussi figures 38, 39 et 41)

7.1.3.8.2. Colorations anormales de l'urine.

7.1.3.8.2.1. Couleur due aux médicaments

rouge : due aux pyramidon, antipyrine, pyridium, urogantanol.


rouge en milieu alcalin et jaune en milieu acide : se comportent
comme les indicateurs du pH : santonine, phénolphtaléine, PSP,
phénacétine.
Tandis que les substances suivantes apportent leur teinte,
indépendamment du pH :
jaune avec fluorescence verdâtre : Vitamine B2 ou Riboflavine
bleu ou vert : bleu de méthylène
jaune foncé : atébrine, acide picrique, etc...

7.1.3.8.2.2. Couleur due à la présence des pigments organiques

rouge ou brun foncé : il s'agit d'hématurie ou d'hémoglobinurie,


c'est-à-dire la présence des GR ou de l'hémoglobine dans les urines. On
reconnaît la présence de sang dans l'urine en examinant le culot de
centrifugation.
Celui-ci est rouge et est constitué d'innombrables GR.
jaune foncé ou brun verdâtre : il s'agit des pigments biliaires qui
signent l'existence d'un trouble hépato-biliaire, surtout la bilirubine.
rouge bordeaux ou Vin de Porto : Urobiline, porphyrines. Lorsqu'il
y a des porphyrines dans l'urine, le patient émet des urines vin porto. Elles
Cours de Biologie Clinique | 260
brunissent spontanément en quelques heures. Le brunissement s'accélère si
elles sont chauffées avec quelques gouttes d'HCl.
urines noires : Mélanurie, Méthémoglobinurie, Alcaptonurie. S'il
s'agit précisément de la mélanurie, les urines sont d'un aspect normal à
l'émission, puis brunissent progressivement et spontanément par
transformation d'un pigment incolore, le mélanogène, en mélanine noire.
En résumé, le laborantin notera :
La couleur de l'urine à son arrivée au laboratoire ;
Toute tendance à devenir plus foncée par vieillissement ou par
adjonction du NaOH ou HCl ;
Le caractère du sédiment : sa couleur, son importance, sa viscosité.

7.1.3.9. Recherche des pigments dans l'urine

7.1.3.9.1. Recherche de l'hémoglobine ou du sang

Réaction du Pyramidon : Oxydation du pyramidon par l'hémoglobine


et l'H2O2 en produit coloré en bleu-violet.
-A 10 ml d'urine, ajouter quelques gouttes d'acide acétique glacial ;
-Attendre 5 minutes ;
-Ajouter 10 ml dřéther ;
-Agiter fort pendant 1 minute ;
-Décanter l'éther de l'urine.
-Agiter fort pendant 1 minute ;
-Décanter l'éther de l'urine.
-A l'éther décanté, ajouter 1ml de solution alcoolique de pyramidon
et quelques gouttes de perhydrol ou eau oxygénée ;
-S'il y a de l'hémoglobine, une coloration bleu-violet se développe ;
L'emploi de l'éther sert à extraire le sang ou hémoglobine dans le cas
d'urines pigmentées.
Quand l'urine n'est pas pigmentée, on peut faire la réaction
directement.
NB : Signification de la réaction : oxydation du chromogène
(pyramidon) en produit coloré par le pigment sanguin (hémoglobine) et l'eau
oxygénée.

7.1.3.9.2. Recherche de la bilirubine

a) Test au Lugol
Cours de Biologie Clinique | 261
L'iode oxyde la bilirubine en biliverdine, Il apparaît une couleur
verdâtre en cas de positivité. Cette couleur apparaît à l'interface urine-lugol.
- solution d'iode (lugol)
Iode pulvérisé 1 g
Iodure de K 2 g
Eau distillée q.s.p. 200 ml.
- manipulations
Dans un tube à essai, placer 5 à 6 ml d'urine. Pipetter la solution
iodée dans une pipette longue et effilée. Superposer le lugol à l'urine en
laissant couler doucement la solution iodée sur la paroi du tube et le placer
sur une étagère.
Attendre 5 minutes
Regarder le tube sur un fond blanc éclairé.
L'iode oxyde la bilirubine en un composé vert, la biliverdine, qui
apparaît à l'interface urine-lugol.
Annotation des résultats : 0, +, ++ ou +++
b) Test Harrison
Cette méthode est plus sensible et spécifique de la bilirubine que la
précédente. Comme test de routine, on utilisera la méthode au lugol. Si le
clinicien qui dirige l'observation estime que l'absence de bilirubine dans les
urines ne cadre pas avec ses observations cliniques, il peut demander un
contrôle avec une méthode plus sensible.
L'urine est additionnée de chlorure de baryum, Il se forme un
précipité qui absorbe les pigments biliaires. Le précipité est recueilli sur un
papier filtre sur lequel on oxyde la bilirubine avec le réactif de FOUCHET.
solution de travail :
Chlorure de baryum 10 g
Eau distillée q.s.p. 100 ml
Réactif de FOUCHET :
FeCl3 à 10 %
Dissoudre 25 g d'acide trichloracétique dans 100 ml d'eau, ajouter
ensuite 10 ml de solution de FeCl3
Manipulations
A 5 ml d'urine, ajouter 5 ml de solution BaCl2. Il se forme un
précipité. Mélanger et filtrer sur papier Whatman N° 2 plié en 4.
Déplier le papier avec précaution, l'étaler sur une lame de verre ou de
porcelaine propre.
Laisser tomber 1 à 2 gouttes de réactif de FOUCHET sur la couche
du précipité.
S'il y a la bilirubine, il se forme un cercle vert autour de la goutte de
réactif.
Annotation des résultats : 0, +, ++, +++
N.B. : il ne faut pas tenir compte des autres colorations qui
peuvent apparaître ; elles sont sans signification pour la bilirubine. Seule
donc une coloration verte est à prendre en considération.
Cours de Biologie Clinique | 262
7.1.3.9.3. Recherche de l'Urobiline

Test Schlessinger :
Peser 10 g d'acétate de Zn, les porter dans un flacon en verre blanc
muni d'un bouchon émeri. Ajouter 100 ml d'éthanol à 90° (éthanol dénaturé
à l'éther).le réactif doit être agité avant usage.
A 5 ml d'urine, ajouter 1 à 2 gouttes de Lugol pour oxyder
l'urobilinogène en urobiline.
Ajouter 5 ml de solution d'acétate de Zn.
Mélanger.
Filtrer.
Placer le filtrat qui doit être limpide dans le faisceau lumineux
d'une lampe microscopique.
Observer le filtrat sur un fond noir.
En cas d'urobilinurie, il apparaît une fluorescence verte.

7.1.3.9.4. Interprétation des résultats des examens de laboratoire

L'interprétation des résultats réside essentiellement dans l'intérêt


clinique que l'on porte à ces examens de laboratoire. Et l'intérêt clinique de
ces tests est de faire le diagnostic différentiel des affections hépato-biliaires,
et surtout dans la recherche du diagnostic biologique des ictères.

7.1.4. Autres recherches courantes effectuées dans l’urine

Il s'agit de Glucose, Protéines, Mucus, Acide diacétique, Sels


biliaires, Sang et Examen microscopique.

7.1.4.1. Glucose

7.1.4.1.1. Description de quelques techniques simples appliquées


à l’urine
Nous ne parlerons que des méthodes réductimétriques et
enzymatiques, qui sont très couramment utilisées sur l'urine.

7.1.4.1.1.1. Recherche qualitative

Vise à mettre en évidence la présence du glucose, sans le doser.


a) Méthode de FEHLING
Nature du réactif
C'est une solution d'oxyde de cuivre hydraté appelée Fehling A de
coloration bleue et qui se réduit très rapidement à chaud en oxyde cuivreux
de coloration rouge brique.
Cours de Biologie Clinique | 263
Cette réaction s'effectue dans un mélange de tartrate appelé Fehling
B qui a la propriété de solubiliser et de stabiliser l'oxyde cuivreux rouge qui
a tendance à précipiter dans le fond du tube.
On conserve le Fehling A dans un flacon bouché à émeri et le B dans
un flacon en polyéthylène. Chaque jour on prépare, selon le besoin, 100 à
500 ml du mélange en ajoutant un volume de Fehling A à un volume de
Fehling B.
Ce mélange ne se conserve que quelques jours.

7.1.4.1.1.1.1. Technique

Dans un tube à essai, mettre à volume égal (V/V) les solutions A et


B, par exemple 1 ml de A et 1 ml de B.
Chauffer à l'ébullition. Si la solution est bonne, elle ne verdit pas ;
Dans un second tube à essai, mettre un volume d'urine correspondant
au volume des deux solutions, dans notre exemple 2 volumes d'urine.
Mélanger le tout et chauffer le mélange jusqu'à l'ébullition.
N.B : Pour des raisons d'économie, l'on peut même utiliser les
compte-gouttes. Exemple : 1 ou 2 gouttes de A et de B + 2 ou 4 gouttes
d'urine.

7.1.4.1.1.1.2. Résultats

Si la solution reste bleue, on note négatif ou 0 ;


si la solution verdit légèrement, on note trace ;
si la solution brunit ou devient rouge brique, on note + à ++ ;
Les résultats douteux doivent être contrôlés par des examens
répétés pendant plusieurs jours et par une épreuve d'hyperglycémie, si le
médecin le juge nécessaire.

7.1.4.1.1.1.3. Causes d'erreurs

glycurono-conjugués (formés après ingestion d'hydrate de chloral,


camphre, menthol, thymol, antipyrine, etc...) ;
acide urique : coloration verdâtre par créatinine ;
albumine, mucus (mucopolysaccharides) ;
lactose (disaccharide) : dans l'urine des femmes enceintes et en
lactation ;
subtosan, acide gentisique, acide ascorbique à doses massives (Vit.
C).
b) Méthode au "Clinitest"
Nature du réactif : Il s'agit d'un mélange de sulfate de
cuivre, de soude caustique, de carbonate de soude et d'acide citrique, sous
forme de comprimés pour faciliter les manipulations. Par exemple, le
Cours de Biologie Clinique | 264
chauffage extérieur est supprimé, le Clinitest dégageant tout seul la chaleur
à l'intérieur du tube au contact avec l'urine.
conservation des comprimés "Clinitest" :
Garder à l'abri de la chaleur et de la lumière ;
Eviter l'humidification qui détériore vite le comprimé qui bleuit. Les
comprimés sont normalement d'une couleur blanc-bleu mouchetée.
Ne pas donc utiliser un comprimé virant au bleu foncé.
Manipuler les comprimés avec précaution, ils contiennent de la
soude caustique, substance corrosive.
- Mode d'emploi :
Pipetter les urines proprement recueillies au moyen d'un compte-
gouttes.
Tenir bien droit le compte-goutte de manière à ce que les gouttes
d'urines tombent complètement dans le fond du tube, sans longer les parois.
Laisser tomber dans le fond d'un tube propre, 5 gouttes d'urines.
Rincer le compte-gouttes et ajouter 10 gouttes d'eau.
Laisser tomber un comprimé dans lřéprouvette ; surveiller jusqu'à
ce que la réaction s'achève (fin de l'ébullition). Ne pas agiter le tube pendant
la réaction, ni avant 15 secondes après que la réaction ait cessé.
Après avoir attendu 15 secondes, agiter doucement l'éprouvette et
comparer la couleur de la réaction avec celles de l'échelle qui accompagne
les boîtes de comprimés Clinitest.
Résultats :
Négatif : la solution reste bleue au bout de 15 secondes d'attente.
Toutes les nuances de bleu sont négatives.
Positif : Comme dans le Fehling selon la teinte de la solution et au
moyen de l'échelle des colorations.
On peut exprimer la concentration de sucre en g%, selon l'échelle
colorimétrique qui accompagne les clinitests.
c) Méthode de Nylander :
Nature du réactif : C'est de l'hydroxyde de bismuth qui, en présence
de glucide, se réduit en bismuth métallique noir. Ce test est plus
caractéristique que la réaction de Fehling.
Dissoudre 2 g de sous-nitrate de bismuth et 4 g de tartrate sodico-
potassique dans 100 ml de potasse caustique à 10%. Filtrer après
refroidissement.
Technique : Un volume d'urine et 1/5 de volume de Nylander
(exemple : 5 ml d'urine et 1 ml de Nylander) ;
Chauffer à l'ébullition.
Résultats :
Production d'une couleur brun-foncé, puis d'un précipité
noir : Test
Causes d'erreurs :
*Protéinurie
*Indican
Cours de Biologie Clinique | 265
*Uroérythrine
*Urochrome augmentés, donc urines foncées.
Possibilités d'éliminer certaines causes d'erreurs :
- Pour les protéines et substances connexes : faire bouillir l'urine
avec quelques gouttes d'acide trichloracétique à 15% (défécation), filtrer et
neutraliser le filtrat avec quelques gouttes de NaOH/N; et sur celui-ci,
effectuer la réaction de réduction.
- Fermentation : par la levure de boulanger : bien laver la levure à
l'eau distillée. En mettre quelques gouttes dans un tube d'urine
complètement rempli (sans bulle d'air et bouché).
- Conserver ce tube pendant 24 heures dans un endroit chaud (à au
moins 37°C). Une substance fermentescible, comme les glucides, se marque
par la présence du CO2, à l'exception du lactose qui ne fermente pas en
présence de la levure.
d) Tes-Tape : Comme on le voit, les sels métalliques peuvent parfois
prêter à équivoque dans la mesure où ils interfèrent avec d'autres substances.
Le Tes-Tape, qui est un papier indicateur imbibé de glucose-oxydase réagit
spécifiquement avec le glucose. C'est un moyen de contrôle sûr en cas de
doute.
Technique
- Dérouler environ 2 cm de Tes-Tape en le tirant vers le bas et le
sectionner sur le bord tranchant de l'emballage en tirant vers le haut.
- Tremper le bout du morceau de Tes-Tape dans l'urine et le retirer
aussitôt. Il suffit d'une très petite quantité d'urine. Une humidification
uniforme du morceau de Tes-Tape assurera le résultat le plus précis.
L'extrémité du ruban tenu entre les doigts doit demeurer sèche.
- Attendre 1 minute. Le développement d'une coloration jaune
signifie que l'urine ne contient pas de glucose.
- Comparer alors immédiatement la zone la plus foncée du morceau
de ruban à l'échelle colorimétrique appliquée sur le "dispenser". Si le ruban
indique 1/2 pour cent ou plus, attendre une minute supplémentaire et faire la
comparaison définitive.
Interprétation
Le test est spécifique du glucose, sucre présent lors des réactions
positives chez les diabétiques ; les autres sucres ou substances ne réagissent
pas avec le Tes-Tape. Lorsqu'on a trouvé sur l'échelle colorimétrique la
couleur correspondant à celle de la bandelette de Tes-Tape, la quantité de
glucose peut être exprimée en pour cent ou par une notation semi-
quantitative de 0 à ++++.

e) Technique au Glucotest : celui-ci est présenté sous forme de


bandelettes.
- Tremper la bandelette entièrement et la retirer aussitôt.
- Le reste, agir comme dans le cas de Tes-Tape ;
Cours de Biologie Clinique | 266
- Comparer la coloration de la bandelette à l'échelle colorimétrique
appliquée sur la boîte contenant les bandelettes.
Interprétation
Les tests sont spécifiques du glucose, sucre présent lors des réactions
positives chez les diabétiques ; les autres sucres ou substances ne réagissent
pas avec le glucose-oxydase.
Lorsqu'on a trouvé sur l'échelle colorimétrique la couleur
correspondant à celle de la bandelette, exprimer en pour cent ou par une
notation semi-quantitative de 0 à ++++.

7.1.4.1.1.2. Recherche quantitative du glucose ou dosage

a) Principe : Il est assez simple : dans la liqueur de Fehling portée à


l'ébullition, l'on fait tomber l'urine disposée dans une burette graduée. Cette
addition est réalisée jusqu'à réduction de l'ion cuivrique.
L'on procède par ailleurs à un titrage d'un volume égal de la même
liqueur de Fehling avec une solution de glucose à une concentration connue,
soit G millilitres de solution de glucose contenant Y mg de glucose par
millilitre. Une simple règle de trois permettra de calculer la concentration X
mg par millilitre d'urines :

U.X = G.Y

G.Y
d'où X = ───────
U
X étant le mg/ml, pour exprimer cela en % ou %o, on multipliera les
résultats respectivement par 100 ou 1000.
b) Récolte des urines
Les urines des diabétiques sont prélevées deux fois par 24 heures ;
Le premier échantillon couvre la période de 6 heures du matin à 18
heures : c'est l'échantillon du jour ;
Le second couvre la période de 18 heures à 6 heures du matin : c'est
l'échantillon de la nuit ;
On peut travailler sur un seul échantillon de 24 heures.
Total des urines : Quelle que soit la manière de procéder, on notera
les résultats comme suit :
-échantillon de 6H-18H : volume ... ml ; glucose g %o;
-échantillon de 18H à 6H ou de 24H : idem.
c) Réactifs
- Fehling A : Peser 34,6 g de CuSO4.5H2O, les dissoudre à chaud
dans environ 400 ml d'eau distillée ; refroidir et porter au volume de 500 ml
dans un flacon jaugé, avec de l'eau distillée.
- Fehling B : Peser 173g de sel de Seignette (tartrate double sodico-
potassique) et 50 g de NaOH, les dissoudre à froid dans environ 400 ml
d'eau distillée. Refroidir et porter au volume 500 ml dans un ballon jaugé.
Cours de Biologie Clinique | 267
- Ferrocyanure de potassium : Peser 50 g de ferrocyanure de
potassium : dissoudre à la température du laboratoire dans environ 900 ml
d'eau distillée dans un ballon jaugé.
La solution A doit être gardée dans un flacon en verre. La solution B
fortement alcaline attaque le verre et le caoutchouc, elle cale les bouchons
de verre rodé. Il faut la conserver dans un flacon de polyéthylène avec
bouchon à visser.
La solution de ferrocyanure se conserve bien en flacon de verre.
En pratique, on prépare chaque jour un volume à parties égales de
solutions A et B selon les besoins quotidiens.
Le mélange A + B ne se conserve pas plus de quelques jours.
Il faut 50 mg de glucose pour réduire 10 ml de mélange A + B.
Toutefois, dans les urines et en présence de ferrocyanure de potassium, cette
relation n'est pas respectée. On se reportera au tableau ci-joint qui établira la
concentration de l'urine en glucose.
d) Méthode
Placer un erlenmeyer de 100 à 250 ml sur une toile amiantée, au-
dessus d'un bec Bunsen allumé.
Y porter successivement
10 ml de Fehling A + B mesurés à la pipette
5 ml de ferrocyanure de potassium à 5 %,
5 ml d'eau distillée mesurée avec un cylindre gradué ;
Faire bouillir doucement ;
Avec une pipette de 10 ml graduée en 0,1 ml, laisser tomber l'urine
goutte à goutte dans l'erlenmeyer en maintenant une douce ébullition ;
On notera le volume d'urine nécessaire pour que la solution de
Fehling passe du bleu au brun.
Le volume d'urine est reporté sur la table II, pour en déduire la
concentration en glucose.

7.1.4.1.2. Intérêt clinique de la recherche du sucre ou glucose

L'intérêt clinique de la recherche et de son dosage réside dans l'étude


des troubles du métabolisme du glucose. La pathologie du métabolisme
hydrocarboné est dominée par l'étude du diabète.
On distingue généralement 3 types de diabètes :
Le diabète sucré ;
Le diabète néphrogénique ou diabète rénal ;
Le diabète insipide.
1. Le diabète sucré

Le diabète sucré est caractérisé cliniquement par 3 signes cardinaux


qui sont:
la polyurie;
la polydipsie;
Cours de Biologie Clinique | 268
la polyphagie
et biologiquement par :
une hyperglycémie
le passage dans l'urine d'une quantité plus ou moins
importante de glucose: Glycosurie et ceci par suite d'une
mauvaise utilisation des hydrates de carbone.
Le facteur pathogénique fondamental invoqué dans le diabète sucré
est une déficience de la sécrétion d'insuline par le pancréas.

2. Diabète néphrogénique ou diabète rénal.

Le nom de diabète rénal a été donné par KLEMPER en 1896 à un


syndrome caractérisé par de la glycosurie sans hyperglycémie.
Le diabète rénal est dû à un abaissement du seuil rénal pour le glucose. Cet
abaissement se voit assez souvent de manière transitoire au cours de la
grossesse. On peut le rencontrer parfois dans l'hyperthyroïdie ou la néphrite
chronique. Cette affection qui représente 20 % des glycosuries est souvent
héréditaire et familiale.
Cours de Biologie Clinique | 269

TABLEAU : XIX
Dosage du glucose dans les urines:
10 ml de Fehling A et B + 5ml de ferrocyanure de potassium + 5ml d'eau
distillée.

Uml G.%o Uml G.%o Uml G.%o Uml G.%o Uml G.%o Uml G.%o
0,5 82 2,10 19,52 4,30 9,53 6,60 6,21 8,90 4,61 14,50 2,82
0,55 74,5 2,20 18,63 4,40 9,31 6,70 6,04 9,00 4,55 15,00 2,73
0,6 68,3 2,30 17,82 4,50 9,11 6,80 6,02 9,10 4,50 15,50 2,64
0,65 63,07 2,40 17,08 4,60 8,91 6,90 5,44 9,20 4,45 16,00 2,56
0,7 58,5 2,50 16,40 4,70 8,72 7,00 5,85 9,30 4,40 16,50 2,48
0,75 54,66 2,60 15,76 4,80 8,54 7,10 5,77 9,40 9,40 17,00 2,41
0,8 51,25 2,70 15,18 4,90 8,36 7,20 5,69 9,50 4,31 17,50 2,34
0,85 48,23 2,80 14,60 5,00 8,20 7,30 5,61 9,60 4,27 18,00 2,27
0,9 45,55 2,90 14,13 5,10 8,03 7,40 5,53 9,70 4,22 18,50 2,21
0,95 43,15 3,00 13,6 5,20 7,88 7,50 5,46 9,80 4,18 19,00 2,15
1,00 41 3,10 13,22 5,30 7,73 7,60 5,39 9,90 4,14 19,50 2,10
1,05 39,04 3,20 12,81 5,40 7,59 7,70 5,32 10,00 4,00 20,00 2,05
1,10 37,27 3,30 12,42 5,50 7,45 7,80 5,25 10,50 3,90
1,15 35,65 3,40 12,05 5,60 7,32 7,90 5,19 11,00 3,72
1,20 34,16 3,50 11,71 5,70 7,18 8,00 5,12 11,50 3,56
1,25 32,80 3,60 11,38 5,80 7,06 8,10 5,06 12,00 3,41
1,30 31,53 3,70 11,08 5,90 6,90 8,20 5,00 12,50 3,28
1,40 29,28 3,80 10,78 6,00 6,80 8,30 4,94 13,00 3,15
1,50 27,33 3,90 10,51 6,10 6,70 8,40 4,88 13,50 3,03
1,60 25,62 4,00 10,25 6,20 6,60 8,50 4,82 14,00 2,92
1,70 24,11 4,10 10,00 6,30 6,50 8,60 4,76
1,80 22,77 4,20 9,76 6,40 6,40 8,70 4,71
1,90 21,57 6,50 6,30 8,80 4,66
2,00 20,00
Ainsi, le médecin peut calculer la perte journalière du diabétique en glucose.

3. Diabète insipide.

Le diabète insipide est caractérisé par une polyurie durable sans


glycosurie ni lésions rénales, continuant à se manifester après suppression des
boissons.
Le diabète insipide s'observe chez des individus porteurs de lésions de
l'hypophyse ou de l'hypothalamus; mais dans 2/3 des cas, l'étiologie reste
obscure, et l'examen anatomique le plus minutieux ne montre aucune lésion.
Il s'agit d'une insuffisance en hormone antidiurétique.

Symptômes:
- polyurie
- polydipsie
- glycosurie négative
Cours de Biologie Clinique | 270
- urines pâles, très diluées
(densité = 1,001 à 1,005).

7.1.4.2. Protéines

Les méthodes de routine appliquées à l'urine constituent le minimum


que vous devez connaître au mieux, car faciles à introduire dans n'importe
quel laboratoire, petit soit-il.

7.1.4.2.1. Protéines totales dans l’urine

Dans l'urine, la recherche des protéines se révèle indispensable pour


le diagnostic de bon nombre de maladies.
Le filtrat glomérulaire contient environ 10 mg de protéines
plasmatiques pour 100 ml ; ce qui, pour les 187 litres filtrés par jour
correspond à 18,7 g de protéines environ qui arrivent dans la capsule de
Bowman.
Si la quasi totalité de ces protéines sont absorbées, une petite quantité
de l'ordre de 1 à 5 mg% constituée principalement de holoprotéines et de
glycoprotéines se retrouve dans l'urine.
Les méthodes de routine utilisées dans les laboratoires médicaux ne
détectent pas ces taux infimes.
Si, soit par une mauvaise réabsorption, soit par inflammation ou
lésion des voies rénales, les protéines augmentent à environ 20 mg%, elles
seront détectées par les méthodes ci-dessous décrites. Par conséquent, en
routine médicale, il ne faut pas utiliser des méthodes trop sensibles qui ne
vous permettront pas de distinguer le taux normal du pathologique.

7.1.4.2.1.1. Recherche qualitative

Vise à mettre en évidence la présence des protéines.


a) Méthode : Les urines troubles doivent être filtrées ou centrifugées
au préalable.
Remplir un tube à essai en pyrex aux 3/4 avec de lřurine ;
Porter la partie supérieure du tube dans la flamme jusqu'à ébullition.
L'apparition du trouble est due soit à la présence de phosphates, de
carbonates ou de protéines ;
Acidifier les urines avec 3 à 5 gouttes d'acide acétique à 10%
(volume/volume) ou avec l'acide trichloracétique 15 M.
Si le trouble disparaît après acidification, il est dû à des phosphates
ou de carbonates de calcium, qui peuvent apparaître dans l'urine normale. Si
le trouble persiste, apparaît ou s'accentue après addition d'acide, il s'agit des
protéines.
Lecture du trouble :
Notation : - Aucun trouble
Cours de Biologie Clinique | 271
+ Trouble à peine visible : traces
++ Trouble granuleux sans floculation, cela correspondrait à une
concentration de 1 g%o.
+++ Nuage dense, opaque, avec floculation ; cela correspondrait à
2 à 3 g%o.
++++ Précipité très dense, d'allure presque solide, cela correspondrait
à une concentration de 5g%o ou davantage.
Les urines notées +++ au moins peuvent être raisonnablement
soumises au dosage par la méthode d'Esbach.
b) Interprétation
La présence des protéines dans les urines est signe d'une atteinte des
voies uro-génitales : syndrome néphrotique, néphrites (aiguë, chronique,
toxique), inflammation de la vessie ou de l'urètre ; décompensation
cardiaque, calculs.
c) Protéines Bence-Jones
Il peut arriver que la floculation apparaisse à 60°C et disparaisse à
l'ébullition à 100°C ; tandis que le refroidissement le fait réapparaître et
une nouvelle ébullition le redissout. Il s'agit de la protéine de Bence-Jones
des noms des auteurs qui l'ont décrite les premiers. Ce caractère thermo-
soluble signe le myélome multiple de Kahler ; et se rencontre dans certaines
leucémies. La maladie de Kahler est caractérisée par le développement de
tumeurs multiples des os et une infiltration de la moelle osseuse, ave
douleur, fractures spontanées et anémie. Généralement il y a la protéine de
Bence-Jones dans l'urine. L'évolution est fatale.

7.1.4.2.1.2. Recherche quantitative ou dosage des protéines

Au moyen d'un tube gradué en gr. p.1000 : Tube d'Esbach.


a) Méthode
On utilise un tube gradué en g%o, tube d'ESBACH
Dans un tube d'ESBACH, mettre de l'urine filtrée jusqu'au trait U.
Ajouter le réactif picro-citrique d'ESBACH jusqu'au trait R.
Boucher et retourner le tube une dizaine de fois.
Lire le résultat correspondant à la hauteur du précipité après 24
Heures.
N.B : Si le trouble est trop dense et qu'on prévoit qu'il y aurait plus de
précipité ; diluer l'urine de 1/2 ou de 1/4 :
-Dilution 1/2 : 1 volume d'urine + 1 volume d'eau
-Résultat final à multiplier par 2
-Dilution 1/4 : 1 volume d'urine + 3 volumes dřeau ; résultat final à
multiplier par 4.
b) Réaction picro-citrique d'Esbach
Acide picrique ................................ …10 g
Acide citrique ................................ ….20 g
Eau distillée jusqu'à ......................... ..1000 ml
Cours de Biologie Clinique | 272
c) Intérêt du dosage des protéines : Dans certaines affections
rénales (syndrome néphrotique ou néphrite chronique), il y a une telle perte
de protéines qu'il faut en connaître la quantité pour évaluer sa compensation
par une alimentation riche en protéines.

7.1.4.3. Acide diacétique ou acéto-acétique

7.1.4.3.1. Rappel biochimique et biologique

L'acide diacétique ou acéto-acétique, ensemble avec l'acide β-


Hydroxybutyrique et l'acétone forment ce qu'on appelle "Les corps
cétoniques".
L'importance diagnostique de la recherche de ces corps sera mieux
comprise si l'on se remémore rapidement le mécanisme biochimique de leur
formation et de leur excrétion. Tous les trois ont une même signification
pathologique ; c'est surtout l'acide acéto-acétique et l'acétone que les réactions
utilisées mettent en évidence.

Il existe dans le foie des mammifères un cycle métabolique appelé cycle


de l'HMG-CoA dont le fonctionnement est le suivant :
L'acéto-acétyl CoA (formé à partir de l'acétyl CoA) se condense avec
une molécule d'acétyl CoA (Hydroxy-Méthyl-Glutaryl-Coenzyme A).
Cette molécule est aisément attaquée par un enzyme qui la scinde en
acétyl-CoA et en acide acéto-acétique ; l'acétyl-CoA libéré pouvant être
réutilisé pour la resynthèse d'HMG-CoA. HMG-CoA qui peut également
provenir du catabolisme de la leucine, est un précurseur du cholestérol (Fig. 8)
Dans le foie, le fonctionnement de ce cycle métabolique est la cause
principale de la formation d'acéto-acétate.
D'autre part, dans ce même tissu, l'acide acéto-acétique formé ne peut
être métabolisé que partiellement par le foie, le surplus passe dans le sang
circulant et peut être en partie catabolysé par les cellules musculaires qui
possèdent un enzyme catalysant la formation d'acéto-acétyl-CoA à partir de
l'acide acéto-acétique et du succinyl-CoA.
Le taux sanguin d'acides cétoniques (CETONEMIE), est dans les
conditions normales, de l'ordre de 0,5 à 2mg %.
Le mécanisme de la cétogenèse se conçoit aisément si l'on envisage le
sort des acides gras libres, NEFA en anglais (No Esterificated Fatty Acid) qui
parviennent au foie en provenance du tissu adipeux.

ß-oxydation CH3-C-CH2-COS-CoA Acétyl CoA


acide acéto-acétyl-CoA Leucine

Acétyl CoA COOH


I
Cours de Biologie Clinique | 273
Pyruvate CH3-CoSCoA HMG-CoA CH2
I
CH3-C-OH
I
Cycle de Krebs CH2
I
CoSCoA
+ TPNH
COOH
I
CH2
I
O O CH3-C-OH
Ac. Diacétique -CO2 II I
CH3-C-CH2-COOH CH3-C-CH-3 CH2
MVA (acide Mevalonique)
Corps +OH Acétone
Cétoniques
CH3-CHOH-CH2-COOH CH2OH

Ac. ß-Hydroxybutyrique
(Hydroxylation)

Cholestérol

Figure 65 : Cycle de HMG-CoA et formation des corps cétoniques.

Le taux sanguin dřacides cétoniques est, dans les conditions normales,


de lřordre de 0,5 à 2 mg%.
Le mécanisme de cétogenèse se conçoit aisément si lřon envisage le sort
des acides gras libres, NEFA en anglais (No Esterificaded Fatty Acid) qui
parviennent au foie en provenance du tissu adipeux :

Estérification (synthèse TG, P-lipides et esters de cholestérol)

glycérol Ŕ P
+
T.A. (Tissu adipeux) NEFA= (No Esterified Fatty Acid)

Mitochondries= ß oxydation acétyl-CoA. CO2+ATP

HMG-CoA

Cholestérol acéto-acétate
Cours de Biologie Clinique | 274
-CO2 Acétone

+ OH
ß-Hydroxylation

ß-Hydroxybutyrique

Décarboxylation

Acétone
Figure 66 : Mécanisme de la cétogénèse.

On voit sur le schéma que l'estérification hépatique des NEFA


constitue le principal mécanisme anti-cétogénique, et que la formation accrue
d'acéto-acétate résulte de deux causes fondamentales :

1°. L'accélération de la lipolyse au niveau du tissu adipeux, qui entraîne


un afflux exagéré des NEFA dans le foie (donc d'Acétyl-CoA) ;

2°. La diminution de la réserve hépatique de glycogène qui abaisse le


taux hépatique de glycérol-P. Ces conditions se rencontrent dans le jeûne
prolongé et dans le diabète sucré.
En ce qui concerne l'Acétone, l'acide acéto-acétique qui n'est pas
catabolisé par le tissu musculaire peut être décarboxylé spontanément dans les
poumons et dans la vessie en donnant naissance à lřACETONE ; ce qui
explique l'odeur particulière de la respiration et de l'urine observée dans les
états pathologiques caractérisés par une augmentation de la CETONEMIE.

Notons pour finir que c'est par la voie urinaire que s'excrète
principalement l'acide acéto-acétique.

On retiendra par ce bref rappel que l'importance diagnostique de la


recherche des corps cétoniques, dont la recherche doit se réaliser dans tous les
cas de diabète et de la glycosurie, est en définitive, de détecter d'une façon plus
sûre l'ACIDOSE diabétique ou Métabolique (jeûne glucidique, vomissements
prolongés, certaines intoxications).

7.1.4.3.2. Mise en évidence de l’acide acéto-acétique dans l’urine

Réaction de GERHARDT :
5 ml d'urines à laquelle on ajoute goutte à goutte du perchlorure de
fer (FeCl3) jusqu'à ce qu'il ne se forme plus de précipité (phosphate
ferrique).
La présence d'acide diacétique se manifeste par une teinte rouge-
bordeaux.
Cours de Biologie Clinique | 275
a) Réactif de Gerhardt : Solution officinale de perchlorure de fer à
1%
b) Interprétation : Trouble du métabolisme des hydrates de carbone
comme nous venons de le voir : le jeûne, la fièvre, le diabète sucré associé
l'acétone dès qu'il s'agit d'un trouble sérieux.
c) Causes d'erreur : La plupart de substances à noyau benzénique :
acide acétylsalicylique (Aspirine), acide salicylique, phénacétine
(butazolidine, tanderil..), donc beaucoup de médicaments analgésiques,
bicarbonate de soude
d) Pour éliminer ces importantes causes d'erreurs, on pourrait utiliser
la propriété chimique de transformation de l'acide diacétique en acétone par
l'ébullition (cette réaction se fait in vivo par réaction enzymatique).
Dans ce cas, l'acétone distille et il ne reste plus d'autres corps
cétoniques. De plus, l'acétone ne donne pas de réaction avec FeCl3, il est
donc préférable de contrôler la présence d'acide diacétique par la présence
de l'acétone qui coexiste avec le premier.
Cette recherche doit s'effectuer dans tous les cas de glycosurie
positive.

7.1.4.3.3. Mise en évidence de l’acétone dans l’urine

1° Méthode :
-A 6 ml d'urine fraîche, ajouter 10 gouttes de solution de
nitroprussiate de Na
-Pipetter, avec précaution, de l'ammoniaque concentrée dans une
pipette longue et effilée.
-Laisser couler lentement l'ammoniaque sur la paroi du tube
légèrement incliné en plaçant la pointe de la pipette à 10 mm de la surface
de l'urine. L'ammoniaque, de densité faible que l'urine, surnage ; si l'on agit
avec précaution.
-Après avoir laissé couler environ 1 ml d'ammoniaque, redresser le
tube et le placer sur une étagère pendant 5 minutes.
-En présence d'acétone, il apparaît un anneau violet, couleur
permanganate. L'apparition d'un trouble en anneau ou d'un anneau brun n'a
pas de signification.
Noter : Acétone -
Acétone +, ++ ou +++
La méthode ne donne de bons résultats qu'avec de l'ammoniaque
concentré. C'est pourquoi, pour éviter d'affaiblir la concentration de
l'ammoniaque qui est un liquide volatil, il est de rigueur de boucher la
bouteille contenant ce réactif bien étanche avec un bouchon émeri.

2° Signification : - Voir l'acide diacétique.


N.B : Apprendre à reconnaître l'odeur de l'acétone dans d'haleine
des diabétiques en acidose et dans leurs urines.
3° Solution de nitroprussiate de potassium : Réactif de Légal
Cours de Biologie Clinique | 276
Dissoudre 10 g de nitroprussiate de potassium dans 50 ml d'eau.
Ajouter lentement et goutte à goutte 2 ml d'acide sulfurique
concentré.
Ajuster au volume de 100 ml avec l'eau distillée.
Conserver la solution dans une bouteille brune munie d'un compte-
goutte.
Il est inutile de préparer de grands volumes de ce réactif qui ne se
conserve pas. Mieux, faire extemporanément de très petites quantités de
réactif pour le jour.

7.1.4.4. Sels biliaires

7.1.4.4.1. Intérêt clinique de la recherche des sels biliaires dans


les urines

H3C 19 20 H 3C H 3C
18 21
CH3 12 17 22 COOH CH3 COOH CH3 COOH
OH 11 13 16 HO -OH
CH3 CH3 CH3
5 10 14 15
4 6 9
-OH
3 1 8
HO 2 H 7 OH HO H HO H -OH
Acide Cholique Ac. Désoxycholique Ac. Chénodésoxycholique.

Figure 67 : Acides biliaires de lřhomme.

Dans les ictères, surtout d'origine obstructive où le test est positif ;


Nřexistent pas dans les ictères hémolytiques, car ici l'ictère est plutôt
dû à la bilirubine pré-hépatique (ou non conjuguée) ;
Ni non plus dans les ictères d'origine hépatique.
Cours de Biologie Clinique | 277
7.1.4.4.2. Réaction de Hay

Sur la surface de l'urine refroidie à 15°C, saupoudrer de la fleur de


souffre, finement pulvérisée.
Ne pas agiter.
S'il y a présence de sels biliaires, la poudre de soufre tombe dans le
fond du verre ; dans le cas négatif, la poudre surnage à la surface des urines.

7.1.4.4.3. Causes d’erreurs

Les urines conservées par le thymol peuvent donner une réaction


positive, car le thymol abaisse la tension superficielle des liquides ;
D'autres substances sont à écarter de l'urine quand on réalise la
réaction de HAY, car elles abaissent elles aussi, la tension superficielle des
urines ; c'est le cas de l'éther, d'alcool, du chloral, chloroforme, des savons,
du camphre et d'autres détergents ("Teepol", etc...).
Prendre donc bien soin d'enlever toute trace de ces substances du
récipient utilisé pour le test, en rinçant abondamment ce récipient.

7.1.4.5. Sang dans les urines

7.1.4.5.1. Intérêt clinique

Le sang se rencontre dans certaines néphrites ou hématuries de


causes diverses : purpura, cancer rénal, tuberculose rénale, calculs rénaux ou
vésicaux ; lésions traumatiques des reins ou de ses voies, cystite.
Hémoglobinurie de causes diverses (maladies de Marchiafava
Micheli) ou Hémoglobinurie "a frigore".

7.1.4.5.2. Recherche du sang ou d’hémoglobine

Réaction de Pyramidon : Oxydation du Pyramidon par l'hémoglobine


et l'H202 en produit coloré en bleu violet.
A 10 ml d'urine, ajouter quelques gouttes d'acide acétique glacial.
Attendre 5 minutes.
Ajouter 10 ml d'éther.
Agiter fort pendant 1 minute. Décanter l'éther de l'urine.
A l'éther décanté, ajouter 1 ml de solution alcoolique de pyramidon et
quelques gouttes de perhydrol ou eau oxygénée.
S'il y a de l'hémoglobine, une coloration bleu-violet se développe.
L'emploi de l'éther sert à extraire le sang ou hémoglobine dans le cas
d'urines pigmentées. Quand l'urine n'est pas pigmentée, on peut faire la
réaction directement.
N.B : Signification de la réaction : oxydation du chromogène
(Pyramidon) en produit coloré par le pigment sanguin (hémoglobine) et
l'eau oxygénée.
Cours de Biologie Clinique | 278

7.1.4.6. Examen microscopique de l’urine ou examen du sédiment


urinaire

7.1.4.6.1. Généralités

Nous avons vu plus haut et nous savons maintenant que l'urine


excrète normalement diverses substances organiques et inorganiques
(Tableau XVIII).
Fraîchement émise ou abandonnée quelques heures dans un récipient,
elle laisse se sédimenter un dépôt d'aspect variable, constitué de certains de
ces éléments excrétés, en fonction de leurs propriétés physico-chimiques.
Ces éléments étant en fait des corps chimiques, leur comportement
dans les urines dépend des conditions de conservation de celles-ci. En effet,
le refroidissement, le chauffage, l'alcalinisation de l'urine, amènent la
précipitation ou la dissolution d'un certain nombre des constituants normaux
dont la solubilité variera selon leur nature chimique. C'est ainsi que nous
savons déjà de par ses caractéristiques que les urates précipitent à froid, les
carbonates et phosphates à chaud etc...
Son volume peut avoir une signification pathologique ou pas.

A côté de ces éléments normaux, peuvent s'ajouter des éléments,


surtout organiques, dont la présence est presque toujours pathologique ; bien
que quelques éléments puissent se rencontrer à l'état physiologique comme
unités isolées. C'est donc ceux-ci qui sont beaucoup plus importants que les
inorganiques, qu'on doit mieux connaître dans un sédiment ou culot urinaire.

En fait, le but d'un examen microscopique des urines est de


rechercher et de reconnaître avec précision la composition d'un trouble
urinaire, savoir s'il est de nature minérale ou organique : cristaux, éléments
figurés du rein, des voies d'excrétion, du sang, microbes ; et surtout, de ne
pas les confondre avec les éléments accidentels ou artéfacts.

7.1.4.6.2. Technique

1° L'examen ne peut être fait que sur de l'urine fraîchement prélevée


dans un récipient très propre.

2° Le prélèvement se fait :
-Chez l'homme : dans un verre très propre, sur miction directe, après
désinfection du gland et du méat par du phénosalyl, de l'oxycyanure de
mercure 1/40.000 ou tout autre antiseptique doux. Ici, le sondage vésical
n'est pas nécessaire.
-Chez la femme, le sondage vésical est toujours nécessaire, après
avoir désinfecté les grandes lèvres et le méat urinaire par des désinfectants
usuels. Néanmoins, compte tenu d'une part du risque de contamination par
Cours de Biologie Clinique | 279
cette manoeuvre, et d'autre part de l'expérience de l'analyste, l'on peut se
passer de ce sondage dans la plupart des cas.

3° La Centrifugation
Se fait à faible vitesse, 2000/min. pendant 5 minutes après avoir bien
mélangé les urines.
On centrifuge environ 15 ml d'urines.
Bien équilibrer le tube d'urine contre un autre contenant soit de l'eau.
Apprécier la hauteur du culot.
Verser l'urine surnageante.
Prélever le culot avec l'anse de platine (flambée et refroidie) ou le
verser directement sur une lame porte-objets.
Ne pas colorer
Couvrir avec une lame couvre-objets sans provoquer des bulles d'air
et examiner au faible grossissement x 10, puis au moyen x 45, sous une
faible lumière.
Il est important pour l'interprétation des résultats, de savoir
l'abondance approximative de certains éléments (leucocytes, cellules
épithéliales) en appréciant leur nombre par champ microscopique.

4° L'addition des réactifs


Si on ajoute l'acide acétique à 2% à une goutte de sédiment, on peut
dissoudre les précipités des phosphates et ainsi les reconnaître ou les
éliminer. On peut aussi utiliser le liquide destiné à la numération des
globules blancs (liquide de Türck) qui contient de l'acide acétique à raison
de 2 ml pour 100 ml.
La même manoeuvre permet de détruire les globules rouges et
d'accentuer les détails cellulaires des globules blancs et des cellules
épithéliales.
Si les usines contiennent beaucoup d'urates, on peut les chauffer à
40°C avant la centrifugation, pour diminuer le précipité.

7.1.4.6.3. Description des éléments du sédiment urinaire

Il y a des éléments :
 inorganiques : cristaux et éléments amorphes
 organiques.

7.1.4.6.3.1. Eléments inorganiques

On distingue mieux les éléments inorganiques selon que l'urine est acide ou
alcaline (leur meilleure reconnaissance est par conséquent améliorée en
ayant préalablement connu le pH urinaire.

Tableau XX : Principaux cristaux


Urine acide Urine alcaline
Cours de Biologie Clinique | 280
A. AMORPHES
- Urates acides (granuleux jaunes) Phosphates alcalino- terreux : Ca, Mg : incolores.
Ca, CO3
B. CRISTAUX Urate d'ammonium (boules épineuses, faisceaux)
Acide urique (jaune), Oxalate calcique Phosphate ammoniaco-magnésien (couvercle de
(enveloppe, sablier), Sulfate Ca de (rare) : sblier) cercueil, feuille de fougère, étoile, sablier).
Longs cristaux prismatiques, minces Phosphate calcique (lames).
extrémités minces, biseautées. Carbonate calcique (boules, massues, haltères,
biscuits).
Il est bon de reconnaître ces cristaux qui peuvent apparaître dans les
urines. On notera cependant que l'identification des cristaux, en ayant sa
valeur, ne constitue pas la partie la plus importante et utile de l'examen
microscopique des urines.
Ainsi donc :
-Les cristaux les plus fréquents sont ceux d'acide urique, d'urates, de
phosphates ammoniaco-magnésiens, d'oxalates decalcium.
-La cystine ne se rencontre que dans la cystinurie, maladie rare,
héréditaire et familiale. En cas de cristaux d'allure cystinique, demander au
laboratoire spécialisé la recherche spécifique de la cystine : placer une
goutte de KCN à 3% et une goutte de nitroprussiate à 10 %. Une couleur
violette apparaît en cas de la cystinurie.
-La tyrosine et la leucine apparaissent dans les urines ictériques des
patients atteints de coma hépatique.
N.B. : Dans le tableau XX des solubilités :
0 signifie insoluble
+ signifie soluble
± signifie peu soluble ou relativement insoluble.
Tableau XXI : La plupart des cristaux et leur brève description
Solubilité
Sédiment Présences + = très soluble
0 = insoluble
Remarque U U C N H
rine rine hauffa aOH Cl c.
alcaline a ge
cide cét.
+
Cristaux le plus souvent A P
AC.urique ( + 0
jaunâtre à lřexception des plus petits bsent résent
60°)
T
Amorphe, petites masses U ous les (
Urates + 0
arrondies jaunâtres rates autres 60°)
urates
Phosphates de Cristaux en rosettes, P A
0 0 +
calcium rares résent bsent
Phosphate P A
En forme de cerceuil 0 0 +
amoniaco-magnesium résent bsent
De taille des G
Oxalate de A
érythrocytes. En forme énérale- 0 0 +
calcium bsent
dřenveloppes ment
Cristaux incolore, A P
Cysure 0 + 0
hexagonaux, rares bsent résent
Aiguille, souvent
P
Tyrosine associé à lřictère de lřatrophie jaune 0 + +
résent
aigue, rares
Même conditions que P
Leusine + + +
tyrosine résent
Sulfamidé Cristaux en aiguilles très soluble dans lřacétone
Cours de Biologie Clinique | 281
NB : Note spéciale sur l’hémosidérine

*Physiopathologie

Quand l'hémoglobine plasmatique traverse le filtre glomérulaire au


cours des maladies hémolytiques de longue durée, il se forme l'hémosidérine
dans plusieurs organes (pouvant entraîner l'hémosidérose) dont les cellules
tubulaires. L'hémosidérine apparaît dans les urines sous forme de granules
inclus dans les débris cellulaires. On ne peut pas la reconnaître sans
coloration spéciale.

*Techniques d’analyse

Méthode 1
Etaler le culot de centrifugation ;
Sécher à la chaleur douce, à la flamme ;
Recouvrir d'une lame ;
Laisser en chambre humide pendant 30 minutes ;
Examiner à l'objectif x 45 ;
S'il y a de l'hémosidérine dans les débris cellulaires, elle apparaît
colorée en bleu-vert.
Méthode 2
On peut étaler le culot et le laisser sécher à l'air ;
Fixer à l'alcool,
Plonger pendant 10 minutes dans la solution d'acide ferrocyanure
Pendant 2 minutes, laver dans jet d'eau distillée et colorer quelques
secondes à la safranine à 0,5%;
Les grains d'hémosidérine apparaissent en bleu-vert sur le fond
orange de la préparation.

La méthode 2 peut être appliquée aux frottis de sang pour la


recherche des sidérocytes ou des cellules réticulaires chargées de fer dans
les frottis de la moelle en cas d'anémie mégaloblastique ou hémolytique.
L'absence des granules ferriques dans la moelle est un stigmate
presqu'infaillible de sidéropénie (anémie avec épuisement des réserves de
fer).
Réactifs

Dissoudre 20 g de ferrocyanure de potassium dans 1000 ml d'eau.


Conserver en flacon de verre bouché à l'émeri.
Diluer de l'acide chlorhydrique concentré à raison de 10 ml dans 990
ml d'eau.
Au moment de l'emploi, mélanger 25 ml de ferrocyanure et 75 ml
d'acide chlorhydrique dilué. La solution ne se conserve pas plus de quelques
heures.
Le mélange doit être préparé immédiatement avant son usage.
Cours de Biologie Clinique | 282
On peut mettre les lames en contact avec la solution acide de
ferrocyanure : soit en plongeant la lame dans une boîte à colorant remplie de
solution, soit en déposant le colorant sur la préparation.

7.1.4.6.3.2. Eléments organiques cellulaires : Voir leurs légendes


1 à 30, pages suivantes.

Beaucoup plus importants que les précédents, car leur présence est
presque toujours pathologique bien que quelques éléments puissent se
rencontrer à l'état normal isolément.

7.1.4.6.3.2.1. Cellules de l'épithélium uro-génital

7.1.4.6.3.2.1.1. Epithélium rénal des tubes contournés

Ce sont des cellules de contours polyédriques, à noyau unique


arrondi ou ovalaire, souvent réunies ensemble ; dans ce cas, on les reconnaît
très aisément. On les confond très facilement avec les globules blancs si
elles sont isolées et gonflées ; mais à la différence de ceux-ci, elles sont plus
grandes.
Leur grand nombre signifie une desquamation de l'épithélium rénal et
signe une atteinte rénale certaine.

7.1.4.6.3.2.1.2. Voies urinaires : du bassinet jusqu'à l'urètre

Ce sont, soit des cellules pavimenteuses ou polyédriques de la


couche superficielle de l'épithélium stratifié, soit des cellules à
prolongement unique ou multiple, en raquette de la couche profonde. Il est
quasi impossible de distinguer les différentes couches.
Normalement, on trouve ces cellules épithéliales qui sont de
grandes cellules isolées par suite d'une desquamation physiologique.
En pratique, on ne s'efforcera pas de reconnaître les différents types
de cellules. Mais quand elles sont abondantes et en placards, elles signent un
processus de desquamation inflammatoire.

7.1.4.6.3.2.2. Cylindres

Avec les cellules rénales épithéliales, ils sont les éléments les plus
importants pour le diagnostic de la néphrite. Ils correspondent à des masses
de nature protéique, coagulées et moulées dans les tubules et qui englobent
ou non les éléments cellulaires.

7.1.4.6.3.2.2.1. Cylindres hyalins

Constitués de gel de protéines et de mucopolysaccharides, plus ou


moins longs (examiner sous forte lumière), ne présentent guère de
Cours de Biologie Clinique | 283
granulations ; sont homogènes. Peuvent prendre le pigment biliaire dans
l'ictère.
Signification peu grave : Stase rénale (décompensation cardiaque) ;
albuminurie, ictère.

7.1.4.6.3.2.2.2. Cylindres granuleux et épithéliaux (granulo-


épithéliaux)

Ce sont des cylindres d'aspect granuleux, constitués de débris de


l'épithélium tubulaire contenant aussi quelques globules blancs et rouges en
proportions variables.
Signification plus sérieuse que les précédents :
Inflammation du parenchyme ou des tubes rénaux (néphrites).

7.1.4.6.3.2.2.3. Cylindres cellulaires ou épithéliaux

Aggravation de la situation précédente.


Assemblement en masse des cellules épithéliales et de globules
blancs et rouges.
Signification d'une atteinte massive des tubes rénaux (pyélonéphrite),
avec présence de plusieurs globules blancs et globules de pus
(polynucléaires surtout).

7.1.4.6.3.2.2.4. Cylindres granulo-graisseux

Dégénérescence graisseuse des éléments cellulaires, sont très


réfringents, inégaux : phase de guérison ou de convalescence.

7.1.4.6.3.2.2.5. Cylindres hémorragiques ou hématiques

Ce sont des globules rouges agglomérés, de teinte brun-verdâtre ; se


rencontrent dans la glomérulonéphrite aiguë ou chronique.

7.1.4.6.3.2.3. Mucus

En petite quantité, est un constituant normal de l'urine. Il augmente


considérablement en cas d'inflammation urinaire. Se présente sous la forme
d'une substance transparente, s'étalant en couches minces, formant parfois
des filaments à ne pas confondre avec les cylindres. C'est un produit de
sécrétion muqueuse.

7.1.4.6.3.2.4. Globules blancs


Cours de Biologie Clinique | 284
Les globules blancs traversent normalement par diapédèse la
muqueuse et sont 1 à 5 par champ microscopique. Ils sont isolés, soit
regroupés en petits amas. On appréciera toujours leur nombre par champ en
pratique.
Une distinction est à faire cependant, selon l'âge et le sexe :
- de 0 âge jusqu'à l'adolescence, le nombre de 1 à 5 GB par champ
microscopique est le même.
- à l'âge adulte, en activité sexuelle, ce nombre peut normalement
varier de 1 à 10, chez l'homme et chez la femme dont l'urine est sondée. Si
l'urine n'est pas sondée, les GB peuvent aller jusqu'à 20, car il y a apport
vaginal et nombreuses cellules épithéliales.
L'augmentation peut être modérée et signe l'inflammation rénale ou
de ses voies (il y a plus des polynucléaire quede lymphocytes).
Si l'augmentation est grande, ils signent l'inflammation des voies
urinaires (cystite, pyélite) ; il y a alors beaucoup de polynucléaires et de
globules de pus : pyurie.

7.1.4.6.3.2.5. Globules rouges

Ils se présentent sous la forme de disques biconcaves, ce qui les


différencie des levures qui prolifèrent dans les flacons malpropres. Les
levures sont, elles, ovoïdes et de tailles variables. Elles ne sont pas lysées
par l'acide acétique à 2%. La présence des globules rouges est toujours
pathologique ; le sondage peut en faire apparaître.
Signification : dans toutes les hémorragies du tractus urinaire :
néphrites chroniques ou aiguës, glomérulonéphrites, cancer, pyelonéphrites,
raumatisme.

7.1.4.6.3.2.6. Trichomonas

Ils sont fréquents dans l'urine de la femme et rares chez l'homme. Ils
sont mobiles, faciles à reconnaître dans une urine fraîche.

7.1.4.6.3.2.7. Microbes ou bactéries

La découverte de microbes (coques ou bacilles) n'a pas de la valeur


que si l'examen est pratiqué immédiatement après la miction et que l'urine
ait été prélevée dans un flacon très propre. Dans ce cas, on décrira le type de
microbes, leur abondance et on fera un étalement à colorer pour connaître
les renseignements supplémentaires : bleu de méthylène, gram, Ziehl.
Et si en plus, on doit procéder à leur identification en culture, le
flacon doit être stérile de surcroît.

7.1.4.6.3.2.8. Eléments accidentels ou occasionnels et artéfacts

7.1.4.6.3.2.8.1. Spermatozoïdes
Cours de Biologie Clinique | 285

Peuvent se rencontrer occasionnellement dans l'urine de l'homme


ou de la femme non sondée ayant connu récemment des rapports sexuels.
Sont faciles à reconnaître par leur morphologie et mobilité.

7.1.4.6.3.2.8.2. Levures

Dans les urines recueillies dans un récipient malpropre, les levures


se multiplient facilement. Peuvent signifier une levurose, candidose : chez le
diabétique, infection uro-génitale chez la femme.

7.1.4.6.3.2.8.3. Fibres de coton

Provenant des vêtements ou de l'ouate utilisée pour nettoyer la


vulve ou le gland avec la solution antiseptique. Elles se présentent sous
forme de filaments très longs qu'il ne faut pas confondre avec les cylindres.

Lég. 1 Lég. 2
Acide urique Gross. : 100x Cristaux en Acide urique Gross. : 100x Cristaux
forme de tonneau, incolores ou colorés en tabulaires quadratiques et losangiques.
jaune-brun par des pigments urinaires.
Cours de Biologie Clinique | 286

Lég. 3 Lég. 4
Acide urique Gross. : 100x Urate dřammonium Gross. : 150. Gross
a) Cristaux en forme de meule 400x Cristaux en forme de sphères
à aiguiser et de rosaces. épineuses.
b) Naissance de macles par
entrecroisement de cristaux.

Lég. 5 Lég. 6
Urates amorphes Gross. : 400x Urates Urates amorphes Gross. : 150 et 350x
de sodium, de potassium, de calcium et couches cohérentes, formation de
de magnésium. pseudo-cylindres par précipitation sur
fils muqueux, etc.
Cours de Biologie Clinique | 287

Lég. 9 Lég. 10
Phosphate ammoniaco-magnésien Phosphate ammoniaco-magnésien
Gross. : 150x Forme rare, étoilée. Gross : 150x Forme rare, étoile
empennée.

Lég. 11 Lég. 12
Oxalates de calcium Gross. : 150x Phosphates triples Gross. : 150x Formes
Cours de Biologie Clinique | 288

Lég. 15 Lég.16
Cours de Biologie Clinique | 289

Lég. 17 Lég.18
Leucine Gross. : 600x Globules jaunes ou jaune- Tyrosine Gross. : 150x Fines aiguilles réunies en
brun à couches concentriques et bandes radiales. aigrelettes. Surviennent en cas dřaltérations
Se rencontrent en cas dřaltérations hépatiques. hépatiques.

Lég. 19 Lég. 20
Erythrocytes Gross. : 150x 500x Leucocytes Gross. : 150x 500x
Disques intacts, jaune clair et Vésicules incolores, réfringentes, sans
biconcaves ou formations annulaires noyau nettement visible. Dans les
vides, transparentes (x). En cas maladies inflammatoires rénales,
dřhémorragie dans les tubes rénaux, accumulation sous forme de cylindres
accumulation sous forme de cylindres (voir lég. 30).
Cours de Biologie Clinique | 290

Lég. 21 Lég. 22
Cellules épithéliales des organes Cellules épithéliales de voies urinaires contrastes de phase
génitaux (vagin, vulve, prépuce). 200x.
Contrastes, de phase 200x. Grandes a) Forme rondes ou contour polygonal des couches
cellules épithéliales, plates, avec muqueuses supérieures. Noyau à forme vésiculaire
contour polygonal, fréquemment avec 1-2 nucléoles. La distinction avec les cellules
repliées ou des bords retournés. Noyau épithéliales des organes génitaux est quelquefois
très petit et compact. difficile.
b) Forme allongée, munie dřappendices des cellules
épithéliales des couches sous- adjacentes.

Lég. 23 Lég. 24
Cellules épithéliales rénales contrastes Cellules épithéliales en graisseuse.
phase 250x. Petites cellules épithéliales Gross. : 500x.
rondes, cubiques, un peu plus grandes a) des voies urinaires
que les leucocytes. Gros noyau arrondi. b) du rein.
Présence fréquente de chapelet de
cellules ou cylindres épithéliaux.
Cours de Biologie Clinique | 291

Lég. 27 Lég. 28
a) Cylindres du coma : courts a) Cylindres hématiques Gross. :
massifs, granulés avec extrémités 150x.
brisées ou rongées b) Cylindres leucocytaires : Gross. :
b) Cylindres épithéliales : formé de 350x.
cellules desquamées des tubes
rénaux.

Lég. 30 Lég. 29
Gross. : 600x Cylindres graisseux en lumière Gross. : 600x Corps lipoïdes en lumière
naturelle. naturelle.
Cours de Biologie Clinique | 292
7.2. L’ETUDE DU LIQUIDE CEPHALORACHIDIEN

7.2.1. Intérêt clinique de l’examen du liquide céphalo-rachidien :


L.C.R.

L'examen du L.C.R doit se réaliser dans tous les cas de suspicion


d'atteinte cérébro-spinale, à savoir : convulsions, malaria cérébrale,
trypanosomiase, méningite, hémorragie cérébrale, hypertension
intracrânienne, hémiplégie ou paraplégie, certaines intoxications
(saturnisme...), encéphalites etc...
Dans la grande majorité de ces affections, son étude donne le
diagnostic de certitude ; car il y a presque toujours une réaction méningée
qui se traduit par la modification du taux de l'un ou de tous les constituants
suivants : cellules, protéines, glucose et chlorures (Cl-) ; auxquels il faut
ajouter la recherche bactériologique.

7.2.2. Rappel anatomo-physiologique

En effet, le L.C.R. s'interpénètre intimement avec la substance


cérébro-spinale et avec le sang d'où il provient, selon des modalités qui ne
sont pas encore totalement définies.

7.2.2.1. Compartiments ou système communicant

Ce liquide est contenu dans 2 compartiments


-le compartiment central
-le compartiment périphérique.

7.2.2.1.1. Compartiment central

C'est le système interne. Il est constitué par les 2 ventricules latéraux,


le troisième ventricule (communiquant avec les premiers par le trou de
Monro) et le quatrième ventricule (communiquant avec le troisième par
l'aqueduc de Sylvius).
Les ventricules contiennent les plexus choroïdes qui semblent être les
organes principaux de formation du L.C.R.

7.2.2.1.2. Compartiment périphérique

C'est le système externe, constitué par l'ensemble des espaces sous-


arachnoïdiens (actuellement appelés « espaces leptoméningés ») mais, qui
en fait, sont compris entre les feuillets viscéral et pariétal de l'arachnoïde et
sont donc inter-arachnoïdiens.
Ces espaces forment par endroit des poches appelées "citernes" ou
"lacs". Ce sont notamment :
1° à la base du cerveau, la grande citerne cérébromédullaire ;
Cours de Biologie Clinique | 293
2° à la partie inférieure du canal rachidien, le lac spinal.

Le compartiment périphérique communique avec le compartiment


central par le trou de Magendie (au niveau du quatrième ventricule) et par
les trous de Luschka (au niveau des parties latérales du quatrième
ventricule).

Figures 68 : Compartiments central et périphérique du SNC.

7.2.2.2. Rôle du L.C.R.

Ce rôle est multiple.

7.2.2.2.1. Rôle essentiel : Protection mécanique


Cours de Biologie Clinique | 294

Le L.C.R. s'interpose tel un matelas aqueux entre le cerveau et les


méninges, et amortit ainsi les déplacements du cerveau, et de la moelle vers
les régions dures du crâne et de la colonne vertébrale.

7.2.2.2.2. Epuration biochimique du cerveau et de la moelle

Le renouvellement du L.C.R. facilite l'évacuation de ses différents


métabolites. Il s'agit entre autres de l'albumine, de l'acide lactique, des
immunoglobulines et des médiateurs chimiques (comme la dopamine et la
sérotonine). On estime que ce renouvellement se fait 3 fois par 24 heures.

7.2.2.2.3. Véhicule des hormones

Le L.C.R. véhicule les hormones hypophysaires (posthypophyse) et


vraisemblablement celles de l'hypothalamus.

7.2.2.2.4. Protection immunologique

Le L.C.R joue ce rôle actif grâce à la présence des cellules


intrathécales immunocompétentes, au cours de certains processus
inflammatoires.

7.2.2.2.5. Il participe probablement à la nutrition des parois entre


lesquelles il s'écoule.

7.2.2.3. Origine et destinée du L.C.R.

Le volume du L.C.R contenu dans les espaces ventriculaires et


interarachnoïdiens est en moyenne de 140 ml.

7.2.2.3.1. Sécrétion

Dans les conditions normales, la totalité du L.C.R est renouvelée en


l'espace de 8 à 12 heures. 60 % environ du L.C.R. sont produits par les
organes spécialisés, les plexus choroïdes ; 40 % sont formés par le tissu
nerveux du cerveau et de la moelle épinière.

Le L.C.R. est donc un mélange provenant de 2 sources


différentes. La composition chimique du L.C.R montre des différences
importantes avec le plasma. La barrière hémo-méningée normale ne se laisse
pas traverser par toutes les substances. Ainsi par exemple, bon nombre
d'antibiotiques ne la franchissent pas. Il ne s'agit cependant pas d'un simple
ultra-filtrat, mais bien dřune filtration sélective et active, par échanges
ioniques. Ainsi la teneur de NaCl est plus élevée dans le L.C.R. que dans le
plasma.
Cours de Biologie Clinique | 295

7.2.2.3.2. Résorption

De ses sources, le L.C.R chemine lentement vers ses aires de


résorption dans le système veineux. Cette résorption veineuse se fait
essentiellement au niveau des granulations de Pacchioni, sortes
d'excroissances leptoméningées faisant saillie dans les sinus veineux
intracrâniens.

7.2.3. Prélèvement

C'est QUINCKE qui, en 1890, a réalisé la première ponction


lombaire (P.L) permettant ainsi l'étude biologique du L.C.R.
Le prélèvement peut donc s'effectuer soit :
a) au niveau du lac spinal par ponction lombaire. On pique
habituellement au niveau de L4-L5, soit en dessous de L2 pour ne pas
risquer de blesser le cône terminal (le LCR descend jusque S2 alors que la
moelle sřarrête à L2).
b) au niveau de la grande citerne cérébello-médulaire : par
ponction sous-occipitale.
c) au niveau des ventricules cérébraux : par ventriculo-
ponction chez les bébés.

Figure 69 : Technique de la ponction lombaire.


Cours de Biologie Clinique | 296
Aussitôt que le liquide commence à couler en goutte à goutte,
recuellir stérilement dans trois tubes :

- Dans le premier tube, 1 à 2 ml pour le laboratoire de bactériologie ;


cet échantillon est réservé à l'identification des micro-organismes éventuels.
- Dans un second tube (pas stérile nécessairement, mais très propre
au moins) prélever environ 8 ml pour le dosage biochimique (protéines,
glucose, chlorures)
- Dans un troisième tube, mettre 1 ml pour la numération et
l'identification des éléments ou cellules.

NB : il arrive qu'on obtienne un liquide hémorragique. Ceci peut-être


dû, soit à :

a) une hémorragie cérébrale ou sous-arachnoïdienne : en


recueillant ce liquide dans une série de 3 tubes, son aspect sanglant reste
égal partout.
b) une hémorragie par accident technique : quand on a blessé
une veine ou artère en piquant, l'aspect hémorragique est décroissant dans
les trois tubes.

Dans les deux cas, la recherche des protéines et des éléments


cellulaires est illusoire, le liquide étant très contaminé par les constituants
sanguins.

7.2.4. Examens du L.C.R.

Nous devons tenir compte de l'aspect, la protéinorachie, la


glucorachie, la chlorurorachie ; ces éléments sont utiles à rechercher
simultanément, afin de mieux caractériser la nature du trouble cérébro-
spinal.

7.2.4.1. Techniques d'analyses

L'examen du L.C.R. est une urgence et son prélèvement doit être


examiné sans délai.

7.2.4.1.1. Dosage des protéines

7.2.4.1.1.1. Méthode de SICARD et CANTALOUBE

1. Remplir le tube de SICARD jusqu'au trait (4 ml) de L.C.R.


2. Chauffer légèrement vers 80°C-90°C sur bec de Bunsen jusqu'à
dégagement des premières bulles.
3. Ajouter 12 gouttes d'acide trichloracétique à 33 % ou 20 gouttes de
20 %.
Cours de Biologie Clinique | 297
4. Laisser sédimenter en position verticale.
5. Après 3 heures, on peut déjà apprécier un résultat provisoire.
6. Attendre 24 heures pour lecture définitive.

7.2.4.1.1.1.1. Lecture des résultats par la hauteur du dépôt :

1° trait : 22,0 mg % soit 0,22 g/L


2° trait : 40,0 mg % soit 0,40 g/L
3° trait : 56,0 mg % soit 0,56 g/L
4° trait : 71,0 mg % soit 0,71 g/L
5° trait : 85,0 mg % soit 0,85 g/L.

Cette méthode est simple, peu précise, mais donne des valeurs
satisfaisantes pour la clinique, si elle est bien exécutées. Elle est basée sur la
précipitation en solution des protéines par un acide, précipitation facilitée
par la chaleur.

7.2.4.1.1.2. Méthode de BIURET

1°.Disposer de trois tubes dont :


Le premier, qui constitue « le blanc » dans lequel on y met 2,5ml du
réactif de Biuret.
Le deuxième, « lřétalon » constitué de 0,05ml de la solution étalon +
2,5ml du réactif de Biuret.
Le troisième, « le test » constitué de 0,05ml de LCR + 2,5ml du
Réactif de Biuret.
2°.Mélanger chaque tube et laisser reposer 30řà la température
ambiante
3°.Lire à 550 nm contre le blanc
4°.Résultat : Concentration de lřéchantillon=D.O du test X
Concentration de lřétalon (6,4g/dl)/D.O de lřétalon.

7.2.4.1.2. Dosage du glucose dans le L.C.R.

Car un certain nombre d'affections du Système Nerveux,


notamment bactériennes, s'accompagnent de diminution ou même
d'augmentation du sucre.

7.2.4.1.2.1. Réactif de Benedict pour L.C.R.

-Dissoudre 17,3g de CuSO45H2O dans 150 ml d'eau distillée.


-Dissoudre 100 g de Na2CO3 anhydre dans 600 ml d'eau et y ajouter
ensuite 173 g de citrate de sodium, en agitant vigoureusement.
-Mélanger les deux solutions et ajouter de l'eau distillée jusqu'à 1
litre.
Cours de Biologie Clinique | 298

7.2.4.1.2.2. Dosage

-Prendre 5 tubes à essai et y porter exactement 1 ml de Benedict.


-Ajouter des volumes croissants de L.C.R.
x dans le 1er tube : 0,050 ml
x dans le 2e tube : 0,1 ml
x dans le 3e tube : 0,15 ml
x dans le 4e tube : 0,20 ml
x dans le 5e tube : 0,25 ml
Cette addition de L.C.R. peut aussi se faire respectivement par 1, 2,
3, 4, 5 gouttes, à l'aide d'un compte goutte calibré à 20 gouttes pour 1 ml.
-Mettre les 5 tubes dans un bain d'eau bouillante pendant 10 minutes.
-Noter le nombre de tubes où la réaction de Benedict est positive ; ce
qui se manifeste par la présence d'une coloration verte ou orange.

7.2.4.1.2.3. Interprétation

1°Réaction positive dans 5 tubes : 50 mg % ou plus


2°Réaction positive dans 4 derniers tubes : 45 mg %
3°Réaction positive dans 3 derniers tubes : 35 mg %
4°Réaction positive dans 2 derniers tubes : 25 mg %
5°Réaction positive dans le dernier tube : 15 mg %
6°Pas de réaction dans aucun tube : 10 mg % ou moins.
-S'il y a augmentation : diabète sucré, intoxication, encéphalite
épidémique, état fébrile.
-S'il y a diminution : Méningite aiguë ou chronique.

7.2.4.1.4. Numération des éléments cellulaires

a) Cellule de Nageotte

Figure 70 : Cellule de Nageotte, dont la profondeur est de 0,05mm et


dont chaque rectangle vaut 1,25 mm³.
Il existe aussi des cellules de 0,25 mm de profondeur.

Lecture :
Cours de Biologie Clinique | 299
a)Si le liquide ne contient pas de G.R

-Utiliser le liquide comme tel, en déposer une goutte dans la cellule


recouverte de son couvre-objet.
-Examiner avec l'objectif X 45.
-Compter les éléments présents dans 8 rectangles (8 x 1,25 mm3 = 10
3
m ) et diviser le résultat par 10 pour connaître le nombre d'éléments par
mm3.
-Noter différemment le nombre de lymphocytes et polynucléaires.

b)Si le liquide contient les G.R


-A un volume de liquide (0,2 ou 0,5 ml), ajouter un volume égal de
liquide servant à la numération des globules blancs préalablement filtré
(Liquide de Türck, contenant de l'acide acétique hémolysant).
-Compter les éléments présents dans 8 rectangles et diviser le résultat
par 5 (= moitié de 10) ou diviser le résultat par 10 et multiplier après par 2.
N.B : On a hémolysé les globules rouges avec le colorant de Türck
qui contient lřacide acétique, pour ne laisser dans le champ microscopique
que les globules blancs qui résistent à lřhémolyse. Les éléments comptés
sont les mononucléaires ou les polynucléaires.

b) Cellule de Fuchs Rosenthal

La surface totale de la cellule est de 16 mm3, soit 4 x 4 mm. Sa


profondeur est de 0,2 mm. Chaque grand carré délimité par les traits gras a 1
mm de côté et chaque petit carré a 1/4 mm ou 0,25 mm de côté.
Le volume correspondant à un grand carré est de 0,2 mm³ (soit 1 x 1
x 0,2 = 0,2 mm³). Dans ce cas, plusieurs possibilités de comptage se
présentent.
En effet :
a) - Le volume de toute la surface est de 16 x 16 x 0,2 (H) = 3,2
mm3.
- 1 mm3 = 3,2 mm : 3,2.
b) - 5 grands carrés = 0,2 mm x 5 = 1 mm3.
Les calculs pourraient être les suivants, le liquide n'étant pas dilué,
on le remplit dans la cellule, il suffit de compter le nombre d'éléments
contenus dans 5 grands carrés pour connaître le nombre de cellules que
Cours de Biologie Clinique | 300
3
renferme 1mm de L.C.R., ou en compter dans un grand carré et multiplier
le résultat par 5; ou sur toute la surface et diviser le résultat par 3,2.

7.2.4.1.5. Recherche des bactéries

En même temps qu'on effectue la numérotation des éléments, on


peut mettre en évidence la présence des bactéries (qui n'existent
normalement pas dans le L.C.R).
Se présentent sous forme de coques ou de bâtonnets. S'il faut des
précisions, faire le Gram, la culture (sur prélèvements stériles) et
antibiogramme éventuel ; Ziehl en cas de recherche de Bacille de Koch
(BK) : toujours rares ; chercher soigneusement.

7.2.4.1.6. Recherches sérologiques

Très importantes dans certaines affections démyélinisantes et en cas


de syphilis.

7.2.4.2. Résultats normaux

1) Aspect : clair, limpide, dit "eau de roche"; à tous les niveaux de


prélèvement.
2) Protéines :
7 à 10 mg % au niveau du ventricule ;
10 à 40 mg % au niveau du rachis.
3) Glucose : 40 à 70 mg % au niveau du rachis et du cerveau.
4) Chlorures : 115 à 130 mEq/L.
5) Eléments :
0,1/mm3 au niveau ventriculaire ;
1 à 5 lymphocytes/mm3 au niveau du rachis.

7.2.4.3. Résultats pathologiques

L'aspect varie selon la maladie : léger trouble ou purulent, flocons


de fibrine, hémorragique ou sanglant, jaune citrin ou xanthochromique
(hémorragie ancienne). Quant aux différents constituants, nous les
envisageons sous forme de tableau XXI.
Cours de Biologie Clinique | 301

Tableau XXII : Diagnostic différentiel des principales formes dřatteinte cérébro-


spinales
RE E MEN MEN MEN COM TRYPAN
SULTAT TAT INGITE INGITE TBC INGITE PRESSION OSOMIASE
NORMAL PURULENTE OU VIRALE ABC
OU BACTERIENNE MENINGITE ES CEREBRAL
BACTERIENNE A LIQUIDE DEBUTANTE HEM
CLAIR INTOXICATION ORRAGIE
CEREBRALE
Asp C Trou Clair Clair Légè Clair
ect lair ble rement trouble
ou rouge
Elé 1 100 à 100 à 100 Nor Variable,
ments à 5 plusieurs milliers 1000 3000, mal ou augmenté normal à élevé,
lymphocytes à prédominance prédominance prédominance (si hémorragie) prédominance
polynucléaire lymphocytes lymphocytes par lymphocytes cellule de
contamination MOTT et plasmocytes.
sanguine
Pro 1 10 à Varia 45 à 45 à 45 à
téinnorachie 0 à 40 % 500 mg% ble : Normal à 250mg% 250mg% 250mg%
augmenté
gly 4 Dimi Nor Norm norm Normal
corachie 0 à 70mg% nué voire même mal al al
0

7.3. L’ETUDE DU CONTENU DU TUBE DIGESTIF

Au point de vue de la sémiologie du tube digestif proprement dit,


l'examen des sécrétions digestives et des matières fécales sont à peu près les
seules méthodes à la portée du médecin praticien.
Nous examinerons successivement les sécrétions gastriques,
duodénales ainsi que les matières fécales.

7.3.1. Suc gastrique

7.3.1.1. Composition, caractères et sécrétion

Le suc gastrique, de densité voisine de 1,000(1,010) est un suc


mixte résultant de la sécrétion des cellules muqueuses, des cellules
pariétales et des cellules peptiques de la muqueuse gastrique.

Son volume à jeun par sondage ne dépasse pas 100 ml (en moyenne
40 ml); en réalité, sa sécrétion par 24 heures est de 2 à 3 litres dont 0,2% ou
plus composé d'acide chlorhydrique sécrété par les glandes pariétales, le
reste étant des sucs alcalins contenant surtout des chlorures et des
bicarbonates sécrétés par les autres glandes et qui agissent en tamponnant
l'acidité du HCl; aidés par des protéines et de la salive déglutie. Il y a aussi
la sécrétion de la pepsine sous forme de pepsinogène.
Cours de Biologie Clinique | 302
Il n'a pas d'odeur et est normalement incolore ou gris-perle. Il est
parfois (dans 50 % des cas) teinté en jaune ou en vert par la présence de bile
due au reflux de celle-ci dans l'estomac.

Tableau XXII : Composition du suc gastrique humain(Martin).


Teneur en eau 99,4 p. 100 ml.
mg p. 100 ml
Chlorures (Cl) .......................... ……………..550
HCl libre ............................... ……………….200
N total ................................. ……………..50 - 80
N non protéique ......................... ………...20 - 48
N aminé ...........................…………………..2 - 8
N urique ..............................………………...3 - 9
N ammoniacal ....................………………..4 - 12
N acide urique ........................………..0,27 - 0,66
Créatinine ..........................……………………..0

La sécrétion du suc gastrique est continue, mais elle présente des


variations d'intensité.
A la sécrétion basale se superposent des phases digestives de
sécrétion gastrique :
1° Phase psychique, déclenchée par la vue ou l'odeur des
aliments, ou encore leur évocation ; comme par d'autres états mentaux non
reliés à la notion d'aliment (nervosité, douleur, maladie).
2° Phase gastrique, provoquée par des stimuli naissant dans
l'estomac et déterminant la production d'une hormone de la muqueuse de
l'antre gastrique, la gastrine, ou agissant directement sur les cellules
pariétales ou agissant indirectement par l'intermédiaire d'une formation
d'histamine (l'alcool par exemple).
3° Phase intestinale, due à la présence des aliments dans
l'intestin (action hormonale par l'intermédiaire de la gastrine).

La fonction principale de l'acide chlorhydrique est l'établissement


d'un pH favorable à la digestion des protéines par la pepsine. Celle-ci est la
seule enzyme d'origine gastrique sécrétée sous la forme inactive et instable
en solution acide : pepsinogène. Il a d'autres rôles dont notamment :

-l'activation du pepsinogène en pepsine et d'autres enzymes


pancréatiques ;
-la facilitation de l'absorption du fer : pour être absorbé au niveau du
tube digestif, le fer doit être soluble, ionisable et ultra-filtrable ; cette
solubilité est obtenue grâce à l'acidité gastrique. Autrement dit, en milieu
alcalin (alimentation riche en phosphates), le fer se lie aux phosphates
(phosphates ferriques) qui précipitent, car insolubles ;
-la stimulation de la production de sécrétine dans le duodénum ;
Cours de Biologie Clinique | 303
-la réduction des fermentations dues aux microbes, grâce à son action
bactéricide.

L'existence de ce dernier effet est démontrée par l'intensité des


putréfactions intestinales que l'on observe chez certains malades atteints
d'insuffisance de la sécrétion d'acide chlorhydrique.

Nous venons de faire mention à la pepsine ; en effet, la pepsine est


l'enzyme du suc gastrique. Elle est sécrétée par les cellules peptidiques, sous
forme d'un précurseur, le pepsinogène qui est instable en solution acide.
Sous un pH inférieur à 5,5, le pepsinogène est converti en pepsine et
la réaction est activée par cette dernière.

L'optimum d'action protéolytique de la pepsine est voisin du pH 2,0


(ce qui est le pH normal) du suc gastrique maintenu grâce à l'acide
chlorhydrique.

C'est une endopeptidase, c'est-à-dire une peptidase capable


d'attaquer des liaisons peptidiques autres que celles qui sont voisines des
groupements terminaux.

7.3.1.2. Examen du suc gastrique

1. But : Cet examen doit être fait :


-Chez les malades avec troubles digestifs prédominants (gastralgie,
etc..) et chroniques.
-Chez certains anémiques : anémie pernicieuse ou ferriprive.
-Tuberculose : recherche des bacilles de Koch dans le liquide de
stase.

2. Technique : Tubage gastrique simple. On utilise la sonde


dřEinhorn.
a) Introduction de la sonde :
Le malade doit être à jeun (sauf si l'on effectue un tubage après
repas spécial), assis ou demi-assis. Calmer ses appréhensions. Si le malade
est trop nerveux, faire une légère anesthésie locale du voile du palais et
piliers avec de la novocaïne à 2% ; en badigeonnant la gorge. Dès que la
sonde franchit le pharynx, la pousser 40 cm environ par déglutition. Faire
respirer par le nez en cas de spasme de la glotte.
Avec une seringue, retirer par aspiration tout le liquide de stase et
mesurer le volume.
b) Caractéristiques normales du suc gastrique
-Volume : maximum 100 ml, moyenne 40 ml ;
-Aspect : filant, blanchâtre.
c) Caractéristiques anormales :
Cours de Biologie Clinique | 304
1°Volume : Supérieur à 100 ml ou inférieur à 30 ml ou presque nul.
2°Aspect :
-mélangé aux aliments (à jeun) : cela signe une sténose pylorique.
-sanglant : hémorragie, cela se présente sous forme de marre de café :
sang digéré, noirâtre (néo ou ulcère).
-jaune ou vert : présence de la bile, signe le reflux duodénal ; n'est
pas pathologique.
d) Analyse chimique :
Est la plus importante, et consiste en la détermination du pH ou
acidité actuelle au moyen du papier tournesol. Normalement ce pH est de 1
à 2, soit les valeurs favorables à la digestion.
-Si le pH est de 1 à 3 = normal ;
-Si le pH est plus élevé : pratiquer des épreuves d'excitation de la
sécrétion, soit par absorption de 300 ml de solution aqueuse d'alcool à 5%;
soit par une injection sous cutanée de 1/3 mg de chlorhydrate d'histamine
(excitant le plus violent : ne pas le faire chez quelqu'un avec hyperacidité
connue ou ulcère).
-Si 30 minutes après cette excitation, le pH descend vers 1 ou 2 =
normal. Si par contre le pH reste élevé (7 à 6), cela signe une achlorhydrie :
gastrite atrophique par anémie de Biermer, Cancer.

En pratique courante, ces tests simples suffisent et sont fructueux.


D'autres analyses telles que la détermination de l'acidité libre et totale,
recherche de l'acide lactique, ne sont pas plus supérieures que les tests
simples que nous venons de voir ; aussi n'est-il pas nécessaire de les
détailler ici, elles relèvent des laboratoires spécialisés.

7.3.2. Le liquide duodénal

7.3.2.1. Généralités

Le liquide duodénal a une importance beaucoup plus grande que


celle du suc gastrique à cause de son rôle dans la digestion des aliments. Il
est un mélange de sécrétions pancréatique, biliaire et duodénale, auxquelles
il faut ajouter en quantité variable la salive et le suc gastrique.
Ses caractéristiques physiques et techniques normales peuvent être
résumées comme suit :
a) Aspect : jaune or, limpide
b) Consistance : visqueuse
c) Densité : 1,007 à 1,010
d) Réaction : alcaline : pH 6,6 à 7,6.

7.3.2.2. Composition

Nous envisagerons sa composition selon son origine.


Cours de Biologie Clinique | 305
7.3.2.2.1. Suc pancréatique

a) composition

Le suc pancréatique est un liquide incolore, inodore et alcalin (pH


8,7 à 9,0), de faible viscosité et à forte saveur de bicarbonate de sodium. Il
contient cette substance à une concentration élevée correspondant
approximativement, en équivalents, à la moitié de la concentration du
sodium plasmatique, environ 72 mEq/l. Ses principaux cations sont le
sodium, le potassium et le calcium, ce dernier a une concentration nettement
moindre que dans le plasma. Le suc pancréatique contient
approximativement 98,7% d'eau.
b) Sécrétion
Dépend de la sécrétine intestinale ou duodénale de l'acide
chlorhydrique sur la muqueuse duodénale ; ceci ayant pour conséquence
principale la production du bicarbonate. Tandis que la stimulation par le
vague ou par les substances parasympathicomimétiques, produit plus
d'enzymes qui sont :
-Chymotrypsinogène et le trypsinogène, précurseurs respectifs des
chymotrypsine et trypsine (endopeptidase) (Les principaux).
-Carboxypeptidase (exopeptidase).
-Lipase, amylase, maltase, lactase et l'invertase.
Ces enzymes sont sécrétées comme on le voit, la plupart (les
peptidases), d'abord sous forme non active ; c'est soit au contact du suc
intestinal, soit sous l'action de l'acidité apportée par le suc gastrique, qu'elles
deviennent actives. En fait, le pancréas sécrète les précurseurs des
peptidases.
Il ne nous appartient pas ici de développer leur structure chimique
ainsi que leurs rôles ; il suffit de se rappeler qu'en tant qu'enzymes, ce sont
les protéines, à structure chimique différenciée et à actions respectives
spécifiques dans l'hydrolyse (donc la digestion) des aliments.

7.3.2.2.2. La bile

Le foie sécrète environ 800 à 1000 ml de bile par 24 heures, avec


prédominance de la sécrétion diurne sur la sécrétion nocturne. Cřest un
liquide faiblement alcalin et comme nous le savons déjà (voir pigments
biliaires et sels biliaires), ses constituants les plus abondants sont les sels
biliaires. La bile s'accumule dans la vésicule biliaire où elle se concentre.

Quand le chyme alimentaire passe à travers le pylore, les lipides


qu'elle contient agissent sur la muqueuse duodénale qui y libère une
hormone voisine de la sécrétine, la cholécystokine qui, amenée par la
circulation au niveau de la vésicule et du sphincter d'Oddi, contracte la
première et relâche le second.
Cours de Biologie Clinique | 306
La bile est alors déversée dans l'intestin. Le même effet résulte de
l'action du sulfate de magnésium ou d'une série d'autres substances appelées
pour cette raison des chalagogues. Les sels biliaires émulsionnent les
glycérides et apparaissent comme nécessaires à l'action des lipases.

En outre, rappelons-nous que la bile est une voie d'excrétion du


cholestérol et des pigments biliaires.

7.3.2.2.3. La sécrétion duodénale proprement dite

a) La sécrétine : résulte de la stimulation, par le chyme acide


gastrique, de la muqueuse intestinale et provoque, par le pancréas, la
sécrétion d'une solution aqueuse de bicarbonate et l'écoulement de la bile.
Provoque aussi la sécrétion de l'insuline.
b) La gastrine : hormone de la muqueuse pylorique, elle stimule la
sécrétion acide de l'estomac et l'inhibe quand il y en a trop ; aussi stimule la
production du pepsinogène à des doses plus élevées. Stimule la motilité
gastrique, intestinale et la sécrétion pancréatique.
c) Cholécystokine : sécrétée par la muqueuse duodénale sous l'action
des lipides alimentaires. Résorbée dans le sang, elle fait contracter la
vésicule et dilater le sphincter d'Oddi. Ainsi, la bile arrive dans l'intestin et
facilite la digestion des lipides, grâce aux sels biliaires qu'elle contient.
d) Pancréozyme : provoque l'apparition de l'amylase et de
trypsinogène dans le suc pancréatique.

Tableau XXIII : Composition de la bile humaine.

Bile hépatique Bile vésiculaire


densité 1,010 densité 1,040
pH 7,4 - 8,5 pH 5,4 - 6,9
Eau ............... 97,5 85,0
Sels biliaires .... 1,0 2 - 10
Mucine et pigments. 0,3 3,00
Lipides totaux .... 0,3 - 0,4 1,3 - 2,6
Acides gras ....... 0,1 0,1
Cours de Biologie Clinique | 307
Glycérides ........ 0,04 - 0,1 0,1 - 0,6
Phosphatides ...... 0,06 0,2
Cholestérol ....... 0,05 - 0,2 0,3 - 0,9
Substances- 0,5 - 1,0 0,5 - 1,0
inorganiques

7.3.3.3. Tubage duodénal

1) But

On pratiquera un tubage duodénal dans les cas de suspicion


d'affection de la vésicule biliaire, affection hépatique, pancréatique
(cholécystite, calcul vésiculaire ou cholédocien, cancer de la tête du
pancréas ou du sphincter d'Oddi).

2) Technique

1° Introduire par déglutition la sonde d'Einhorn, à jeun, comme pour


le tubage gastrique.

2° Quand elle se trouve dans l'estomac à 40-45 cm environ,


coucher le malade sur le côté droit, siège surélevé afin de faciliter l'obtention
du liquide spontanément. Laisser avaler jusqu'à 75 cm environ et attendre
qu'elle s'introduise d'elle-même dans le duodénum. Vérifier la situation de la
sonde par différents procédés :

a) Aspect du liquide et réaction : pas très sûr.


b) Injection d'eau rougie (10-20cc) par la sonde. Si l'on retire
cette eau après 3-4 minutes, on est encore dans l'estomac.
c) Par radioscopie. Dès qu'on est certain d'être en place dans
le duodénum, on recueille le liquide qui s'écoule spontanément ou après
aspiration.

3) Analyse

1° Liquide A ou "Bile A" : il s'agit en réalité du suc duodénal tel


que nous venons de le décrire, auquel il faut bien se rendre compte, il se
mélange évidemment de la bila A ou cholédocienne. Il s'agit d'un liquide qui
présente de très rares leucocytes, d'aspect jaune doré, fluide, de pH 6,6 à 7,6.

Résultats et interprétations :

-Aspect incolore : signe l'acholie : absence de bile : suspicion d'une


obstruction de la voie cholédocienne, du sphincter d'Oddi : calcul migrateur,
néo du sphincter ou de la tête du pancréas, néo ou tumeur extra-vésiculaire
Cours de Biologie Clinique | 308
comprimant la voie cholédocienne. Dans ce cas, il y a dépigmentation des
selles et stéathorrée.
-Trouble : comme de la purée de pois avec coloration verte : il s'agit
soit d'un mélange avec du liquide gastrique, soit d'une infection des voies
biliaires.

-Recherche des pigments biliaires : On prendra la précaution


d'empêcher l'oxydation, en ajoutant à 10 ml du liquide duodénal, quelques
mg d'acide ascorbique (un fragment de Vit. C par exemple). Envoyer le
liquide au laboratoire spécialisé où l'on effectuera, à la demande du
médecin, le dosage de la bilirubine :

b) Valeurs normales : 30 à 50 mg %
c) Si la bilirubine (totale) est augmentée : il s'agit d'ictère
catarrhal possible, due à une hépatite.
d) Valeur jusqu'à 120 mg% : Cholémie familiale de Gilbert.
e) Valeur Jusqu'à 400 mg% : ictère hémolytique
f) Taux normal : Cirrhose veineuse
g) Taux diminué : Obstruction hépatobiliaire.

-Recherche des sels biliaires : Méthode de Chabrol et Scott.


Normalement 8 à 10 g/litre. Cette teneur baisse en cas d'obstruction des
voies biliaires ou d'atteinte hépatique prononcée.
Le symptôme prédominant en cas de déficit en sels biliaires est la
stéatorrhée : élimination importante des matières grasses par les fèces.

-Recherche d'enzymes ou ferments pancréatiques

Lipases : Beurre de cacao, coulé en boîtes de Pétri, partager


la surface en compartiments. Diluer le liquide duodénal au 1/2, 1/4, 1/8,

1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256. Déposer une goutte de chaque solution
sur le beurre de cacao. Après 24 heures de repos au laboratoire (non à
l'étuve), verser dans la boîte du sulfate de cuivre) à 5%.

Il se forme des plages vertes de savon de cuivre, en


contact des acides gras libérés, là où le ferment a hydrolysé la graisse.

Noter la dernière dilution visible.

Normalement jusqu'au 1/64 approximativement.

Diminution : obstruction du canal de Wirsung par un néo du


pancréas.
Cours de Biologie Clinique | 309
Trypsine : Couler dans une boîte de Pétri 100 c du milieu
suivant rendu fluide au bain-marie : 100 cc de gélatine à 5% + 1 cc de
formol à 10% sont neutralisés par le HCl environ N/5. Vérifier au papier
indicateur.

Ensemencer le liquide avec les dilutions ci-dessus. Après 24 heures,


verser dans la boîte du Ziehl dilué au 1/5 et laver après décantation.

Les godets de digestion sont clairs sur fond rouge. Normalement,


jusqu'au 1/256 approximativement. Diminution, comme pour la lipase.

2° Le liquide B ou "Bile B"

C'est de la bile d'origine vésiculaire, directement obtenue 20 ou 30


minutes après injection d'un cholagogue ; soit en sous-cutanée de 10 à 20
unités de pituitrine, soit par injection par la sonde dans le duodénum de 40
cc MgSO4 à 20% tiédi (Epreuve de Meltzer-Lyon). Il s'agit d'une bile plus
pigmentée, foncée, brune, moins liquide. Au microscope, comprend des
cellules épithéliales.

Résultats et interprétations :

a) Microscopie

N.B : Ajouter quelques gouttes de formol pour empêcher la digestion


des éléments par la trypsine.

-Présence des cellules épithéliales et de quelques rares leucocytes.


On peut d'une façon pathologique, trouver des cellules de pus et des
microbes. Ce qui signifie une cholécystite.
b) Absence de la bile B

Obstruction du canal cystique; on obtient à la radio le phénomène


de la "vésicule exclue".
Peut se rencontrer dans l'obstruction du canal chlolédocien par néo-
pancréatique. Il y a même absence des ferments pancréatiques.

7.3.4. Les matières fécales

7.3.4.1. Introduction

En parlant de l'examen des matières fécales, beaucoup, surtout dans


les pays tropicaux, ramènent cela à la simple recherche des parasites. Il nřen est
rien. Plusieurs analyses peuvent être effectuées sur les selles dans divers buts :
Cours de Biologie Clinique | 310
-Aspect et examen chimique : exploration de la digestion, des enzymes
et par conséquent du pancréas et du foie notamment.
-Recherche des parasites
-Recherche du sang
-Recherche des bactéries, culture, etc...
C'est pourquoi, il m'a paru utile de rappeler un certain nombre de
notions sur les matières fécales.

Au bout de 24 heures environ, le bol alimentaire devient bol fécal ou


matières fécales ou fèces ou excréments ; de quelle manière ?
D'abord, ce bol alimentaire est constitué principalement de :
-Protéines
-Hydrates de carbone
-Lipides
-Sels minéraux
-Cellulose
-Eau
-Bactéries
-Vitamines.

1. Au niveau de l'estomac, il subit :

-Le malaxage, au contact d'eau de boisson et sous l'effet du péristaltisme


gastrique, pour devenir ainsi une bouillie ou suspension liquide susceptible de
traverser le pylore : le chyme ;

-La digestion ou l'hydrolyse des protéines, sous l'action de la pepsine


amenant ainsi la plupart des protéines en peptides ;

-L'absorption de fer sous l'effet du pH fortement acide apporté par


l'acide chlorhydrique.
Jusque-là, soit au bout de 4 à 9 heures, le bol est encore "alimentaire",
ses constituants principaux n'ayant pas encore subi de modification notable ou
hydrolyse : c'est du chyme gastrique.

2°. Au niveau de l'intestin grêle (du duodénum à l'iléum), le bol


alimentaire subit une forte modification sous l'action des nombreuses enzymes

Les protides et peptides : la chymotrypsine et trypsine poursuivent


l'action de la pepsine, en hydrolysant les protides jusqu'au stade des peptides,
tandis que diverses carbopeptidases ou exopeptidases achèvent cette action
jusqu'à la production des acides aminés.

Les hydrates de carbone : subissent l'hydrolyse successive des


amylases (salivaire et pancréatique), des maltases, des lactases et des invertases
jusqu'à la production du glucose.
Cours de Biologie Clinique | 311

Les lipides subissent l'hydrolyse de la lipase jusqu'à la production des


triglycérides.

A ce stade, soit au bout de 4 à 5 heures après que l'estomac se soit


vidé complètement, il y a production et absorption de :

-Acides aminés
-Glucose et autres hexoses comme le fructose, le galactose
-Triglycérides
-Sels minéraux et vitamines
-Eau

3° Au niveau du gros intestin : l'absorption se poursuit, notamment


hydrique, ainsi, le bol alimentaire devient bol ou matières fécales ; un peu plus
ferme ou dur, du fait d'une grande perte d'eau.
En même temps commence la putréfaction sous l'action des bactéries
saprophytes et production des vitamines de groupes B notamment. Cette
putréfaction dure 7 à 14 heures au bout desquelles le bol fécal s'accumule dans
le côlon descendant, soit au bout de 24 heures environ (4 à 9 heures : vidange
de l'estomac
+ 4 à 5 : digestion intestinale + 7 à 14 heures : putréfaction dans le gros
intestin).
4 + 4 + 7 = 15 heures
9 + 5 + 14= 28 heures.
Soit en moyenne ± 22 heures.

Donc, au bout de 24 heures environ, l'on doit aller à selles si l'on a pris
un repas équilibré, en quantité suffisante, avec assez de légumes pour remplir
normalement le gros intestin et provoquer le réflexe d'exonération ou
défécation.

7.3.4.2. Caractères normaux des matières fécales

1. Quantité : Normalement, dans le cas d'une alimentation mixte


moyenne, le poids des matières fécales de 24 heures est de 100 à 150g dont 20
protéines non digérées, cellulose et autres matières organiques diverses.

Avec un régime végétarien plus abondant, les matières fécales


peuvent peser jusqu'à 350g contenant 75g de matières sèches.

2. Consistance : Elles sont normalement semi-solides et de forme


cylindrique et moulée.

3. Coloration : Varie entre le brun clair et le brun foncé. Cette


coloration est due à la présence des dérivés des pigments biliaires dont le
Cours de Biologie Clinique | 312
principal est la stercobiline, voisine de l'urobiline (100 à 200mg par jour contre
1 à 3mg dans l'urine).

Ce sont les actions bactériennes sur la bilirubine amenée par la bile


dans le tube digestif qui produisent une série de produits de réduction qui sont
des pigments rouge-orangé, la stercobiline, l'urobiline IXa et la D-urobiline,
pigments différant par leur pouvoir rotatoire.

pH : Le pH des matières fécales de l'adulte varie entre 7,0 et 7,5. Chez


le nourrisson recevant l'alimentation maternelle, elles sont acides. Elles
deviennent alcalines, lorsqu'on alimente l'enfant au lait de vache.

Composition des matières fécales : Tells qu'elles sont émises lors de la


défécation, les matières fécales sont constituées par des produits de sécrétion et
d'excrétion intestinales, par des bactéries et parasites éventuels ; des débris
cellulaires provenant de la desquamation de la muqueuse intestinale ; et par les
résidus alimentaires et l'eau (Tableau XXIII).

Tableau XXIII : Compositon des matières fécales normales. 100-150g


par 24 heures, dont 20-40gr des matières sèches.
Eau ........................... ……….. 74 - 79g %
N total ....................... … …… 1,0g/24 h
Lipides (extrait éthéré) ...... … 2 - 7g/24 h
Cholestérol ................... … 1,0 g/24 h
Ca ..........................…….. …. 0, 3 - 0, 5 g/24 h
Mg ..........................…… ….. 0, 05 - 0, 18 g/24 h
P ............................. …… …... 0,5 - 0,7 g/24 h

Bilirubine

C33H36O6N4
+4H
Mésobilirubine

C33H40O6N4 + 2H
+ 4H
Mésobilirubinogène D-urobilinogène
+2H

C33H44O6N4 C33H42O6N4
-2H +4H -2H
Urobiline IXa Stercobilinogène
(Urobiline inactive) C33H48O6N4 D-urobiline

C33H42O6N4 -2H C33H40O6N4


Stercobiline
Cours de Biologie Clinique | 313

C33H46O6N4

Figure 71 : Interrelations d'une série de pigments dérivés de la bilirubine


(d'après Watson).

C'est au cours de son séjour dans le gros intestin que le bol alimentaire
(+acide à la sortie de la vulve iléo-cæcale) est transformé en bol fécal neutre ou
légèrement alcalin. Au cours de cette transformation, dont la durée dépasse
normalement un jour, s'opèrent d'une part une résorption d'eau et de certains
autres constituants ; et d'autre part une série de modifications chimiques sous
l'action du suc intestinal composé particulièrement d'enzymes en majorité des
exopeptidases hydrolysant les éléments jusqu'aux petites molécules (acides
aminés, glucose, CO2...) : maltase, invertase, aminopeptidase, tripeptidases,
dipeptidases, nucléotidases, entérokinase…

6. Odeur des matières fécales

L'odeur caractéristique des matières fécales est due à la présence de


l'indol et du scatol, de H2S, de mercaptans libérés par la fermentation de
différents acides aminés par les bactéries intestinales (Tableau N° XXIV et
Figure 66).

Tableau XXIV : Donnant le processus général de fermentation et de


putréfaction, réalisées par les bactéries du gros intestin.

Glycérides .......……………………..glycérol + acides gras


Lécithine .......... ……………………choline, neurine, muscarine
Glucides ........... ………………….. acide oxalique, acides gras
(formique, acétique, acétique propionique, lactique, etc), acétone, CO2,
méthane, H2
Protéines ........…………………... peptones, albuminoses, acides
aminés, ammoniaque, H2S.

NH2
I
CH2-CH-COOH CH2 -CH2-CH2-COOH CH2CH3

NH NH NH

a) Tryptophane Acide indol-propionique Ethyl-indol

CH2-COOH CH3

NH CH3 NH2 + NH
Cours de Biologie Clinique | 314
Acide indol-acétique Scatol

CH2-CH2-NH2

C2-NH2+
NH NH
Indol-éthylamine Indol
b) Histidine Histamine
c) Lysine Cadavérine (odeur du cadavre)
d) Argine Ornothine Putrescine
Cystine Cystéine
Ethyl-mercaptan et Méthyl-mercaptan = Substances à groupement SH.

Figure 72 : Fermentation des acides aminés.


7.3.4.3. Modifications des caractères normaux des matières
fécales

1. Modification de quantité

-Elles peuvent diminuer avec un régime à prédominance protéinique ou


glucidique, matières complètement digérées (lait, formage, riz, oeufs, viande,
poisson, pomme de terre, igname, pain blanc, macaroni, fufu).
-Elles peuvent, dans certains cas pathologiques, peser jusqu'à 1 à 1,5
Kilo (maladie d'Hirsprung, dolichocôlon, dolico-mégacôlon, entraînant
uneconstipation grave).

2. Modification de consistance

a) Plus sèches, plus foncées, en scybales et globuleuses : cas de


constipation.
b) Fragments durs dans la masse liquide : cas de fausse diarrhée
de la constipation.
c) Selles diarrhéiques : plus ou moins liquides, pâteuses,
onctueuses (stéatorrhée, sprue).

Dans ce cas, l'analyse chimique montrera une augmentation d'eau et


de sels des matières fécales, tandis que leur teneur en substances sèches
diminuera.
On sait par ailleurs qu'en cas de diarrhée, le péristaltisme intestinal est
augmenté, l'examen microscopique montrera en plus une insuffisance des
sécrétions digestives traduite par la présence des éléments non digérés tels que :
-fibres musculaires non dissociées : défaut d'action peptidique sur tissu
conjonctif.
-fibres musculaires avec noyaux et striations : insuffisance pancréatique.
-amidon, décelable par goutte de solution d'iode à 1 % : insuffisance
pancréatique.
-globules de graisses visibles : stéatorrhée hépatique (sels biliaires) ou
pancréatique.
Cours de Biologie Clinique | 315
Normalement, on trouve des cellules végétales plus ou moins bien
conservées (à ne pas confondre avec les oeufs de parasites).

3. Modification de la coloration

1° Cas pathologique
-selles vertes : présence de pigments biliaires : diarrhée, accélération du
transit digestif.
-selles décolorées (mastic) : insuffisance des pigments biliaires,
occlusion des voies hépato-biliaires.
-selles noires : méloena : présence de sang venant des parties hautes du
tube digestif (gingivorrahagie, varices oesophagiennes, ulcère de l'estomac ou
du duodénum, intestin grêle).
-selles sanglantes : hémorragie située sur des parties basses de l'intestin :
iléum, gros intestin, rectum (hémorroïdes) et dans le cas de l'amibiase
intestinale.

2° Cas dus à l'alimentation ou aux médicaments

Blanc ou orange pâle …… : régime lacté, kaolin, sulfate de baryum.


Noir brunâtre………… : régime carné.
Noir …………………… : sous-nitrate de bismuth, fer, charbon.
Brun-clair …………… : végétaux sans chlorophyle.
Brun rougeâtre…….. : cerises.
Brun foncé………... : café.
Verdâtre………………. : végétaux à chlorophyle.
Vert ………………. : calomel.
Bleu………….. : bleu de méthylène.
Jaune foncé ……….. : santonine.
Jaune …………. : rhubarbe.

4° Modification de la composition, en rapport avec certains


organes.

Présence plus ou moins importantes de graisses : insuffisance hépato-


biliaire ou pancréatique.
Présence de fibres musculaires : insuffisance de la sécrétion
pancréatique, dans ce cas l'N fécal est augmenté.
Augmentation des cendres minéraux (Ca, P) : trouble du métabolisme
minéral (osseux).

7.3.4.4. Techniques d’examen

1. Préliminaires
Cours de Biologie Clinique | 316
Les selles sont fournies au laboratoire dans une boîte de carton paraffine
ou dans une boîte de Pétri ; avec marque d'identification.
Après usage, les récipients en verre qui ont contenu des selles sont
rincés à l'eau courante, puis lavés à la brosse avec une solution antiseptique.
La manipulation des selles sera facilitée par l'utilisation des pipettes et
spatules en bois à jeter après usage. Des baguettes de verre peuvent aussi
convenir tout en étant moins pratiques.
Dès la fin de l'examen, plonger la lame et lamelle dans un récipient
contenant de l'antiseptique en détachant bien les lames des lamelles. Après
quelques heures, rincer abondamment à l'eau courante. Récupérer les lames et
jeter les lamelles.
On notera l'aspect des selles et notamment : couleur, présence de sang,
diarrhée, mucus, débris alimentaires, médicaments, vers, consistance, etc.

2. Examen de la digestion

a) Réactifs :
Solution d'iode : Lugol pour coloration des formes végétatives et des
kystes d'amibes.
Solution de Soudan III : Dans un erlenmeyer de 300 ml, placer 100 ml
d'acide acétique glacial.
Ajouter environ 1 g de Soudan III.
Placer l'erlenmeyer au bout d'un entonnoir renversé dans un bain d'eau
bouillante.
L'y maintenir une dizaine de minutes. Refroidir.
Filtrer.
Conserver dans un flacon bouché à l'émeri.
Solution acqueuse de bleu de Nil à 2% : Filtrer et conserver dans un
flacon bouché à l'émeri.

b) Précautions : Pour permettre un bilan de l'activité digestive,


l'examen microscopique doit porter sur une selle provenant d'un régime mixte
comprenant la viande, des légumes (pommes de terre, bananes), du pain et du
beurre ou de la margarine. L'examen se fera en deux phases.
Dans la première, l'on examinera un fragment de selle homogénéisée
dans une goutte de Lugol, ceci afin de rechercher l'amidon, les dextrines et de
colorer les graisses.
Dans la seconde phase, on recherchera les graisses avec le réactif au
Soudan et la solution de bleu de Nil.

1) Examen en solution iodée


Cet examen se propose de mettre en évidence l'amidon. Sur la même
préparation, on peut faire des observations sur les fibres musculaires, la
cellulose et les graisses neutres.
Cours de Biologie Clinique | 317
L'amidon : L'amidon se colore en bleu sous l'action de l'iode.
L'amidon partiellement digéré se colore en rose-violet.
On distingue l'amidon amorphe, celui du pain ou des pâtes
alimentaires, sous forme grains amorphes bleus ou violets. Cet amidon apparaît
en cas d'insuffisance pancréatique marquée ou en cas d'évacuation accélérée du
c cum.
L'amidon inclus se présente sous forme de masses violacées plus ou
moins foncées, contenues dans des membranes de cellulose.

L'amidon cru (bananes) se trouve à l'état de graine ayant conservé


leurs couches concentriques et colorées en violet noir par l'iode.

La cellulose : Est représentée par toutes les membranes


végétales ayant subi une différentiation. Il en existe dans toutes les selles.
Les fibres musculaires : Elles existent en petites quantités
dans les selles normales. Elles sont alors dans un état de digestion avancée et se
présentent sous forme de débris plus ou moins rectangulaires, colorés en brun
par la stercobiline.
On les trouve en nombre excessif en cas de transit accéléré et dans
l'insuffisance pancréatique. Leur striation est alors conservée.
Notations : Fibres musculaires : absentes, présentes, peu nombreuses,
très nombreuses avec straition, sans striation.
2° Recherche des graisses

-Examen au Lugol : un fragment de selles est émulsionné dans une


petite goutte de Lugol. L'examen direct entre lame et lamelle permet de
reconnaître les graisses sous deux aspects :

Graisses neutres : elles apparaissent sous forme de


gouttelettes jaune-brunâtres.
Acides gras : aiguilles fines et longues de cristaux
enchevêtrés. Si on chauffe la lame, des cristaux se transforment en globules
graisseux arrondis.

-Examen au Soudan III : On place sur une lame un petit grain de


selle. On l'émulsionne dans une goutte de soudan en solution dans l'acide
acétique. On recouvre d'une lamelle. Chauffer prudemment à la flamme jusqu'à
l'apparition de petites bulles de gaz entre lame et lamelle. Cesser le chauffage.
Examiner à l'objectif X 45.

-Les graisses neutres apparaissent sous forme de gouttes rondes,


intensément colorées en rouge. La paraffine liquide donnée à titre de purgatif
ne se colore qu'en rose pâle.
Cours de Biologie Clinique | 318
-Examen au sulfate de bleu de Nil : Mélanger une goutte de colorant,
une goutte de solution de bicarbonate à 5% et un peu de selle sur une lame.
Recouvrir d'une lamelle. Examiner à l'objectif X 45.
La préparation est bleue dans son ensemble.

Les graisses neutres apparaissent sous forme de masses


arrondies rouges ou oranges.
Les acides gras apparaissent en aiguilles ou sont amorphes;
ont une couleur bleue
La paraffine ne se colore pas.

3°. Recherche des hémorragies occultes


Utiliser des tubes à essai très propres, lavés à l'antiseptique puis rincés
à l'eau. On peut au besoin les passer au mélange chromique.

Réactif :
Dans un tube à essai spécialement lavé, placer une pointe de couteau
de benzidine. Ajouter 1 ml d'acide acétique glacial. Verser dans ce tube 1ml
d'eau oxygénée à 1 %.
Si le réactif bleuit, le tube contient des traces de sang ou d'hémoglobine.
Préparer une nouvelle solution qui ne doit pas bleuir.

Solution d'eau oxygénée 1 % :


Perhydrol ............. 15 ml
Eau distillée ......... 29 ml
L'eau oxygénée doit être conservée dans un petit flacon bouché à
l'émeri. Elle se conserve mal. C'est pourquoi, il faut en préparer de petites
quantités. Pour tester son activité, on fait le contrôle suivant :

Dans un tube à essai, dissoudre quelques cristaux de bicarbonante de


K dans 10 ml d'eau, ajouter 1 ou 2 gouttes d'acide sulfurique concentré.
Mélanger un volume de bichromate et un volume d'eau oxygénée à tester. Si
celle-ci est encore active, le mélange passe de la couleur orange à la couleur
bleue.

- Procédure
Quelques précautions utiles :
Régime sans hémoglobine pendant 3 jours avant la récolte des selles :
exclure viande et légumes vertes. Soumettre le patient au lait avec beurre, riz,
pâtes, biscuits ; mais le tout après cuisson. Evacuer l'intestin s'il y a tendance à
la constipation. Attention aux hémorragies gingivales ou nasales.

Technique :
Etaler sur une lame porte-objet bien propre et sèche, un petit grain de
matière fécale. L'étalement se fait avec une spatule ou une baguette en verre.
Cours de Biologie Clinique | 319
Réaliser un étalement de 2 cm de côté au moins.
Sur l'étalement, verser un peu de réactif à la benzidine.
Préparer un témoin négatif sur la partie non utilisée de la lame en y
versant un peu de réactif à la benzidine, à distance de la tâche de selle. Préparer
un témoin positif sur une autre lame en mettant en contact une trace de sang et
le réactif à la benzidine.

Résultats et interprétations
Le témoin négatif doit être incolore
Le témoin positif doit être intensément coloré en bleu
L'échantillon de selle peut être négatif, faiblement ou
fortement positif. Dans ce cas, on répondra : hémorragie 0, + ou ++
L'interprétation est qu'il s'agit d'ulcère digestif, néoplasie...

4° Recherche des bacilles tuberculeux


Ces mycobactéries se localisent surtout à la surface des selles
moulées. Prendre des matières fécales, la grosseur d'un haricot, et délayer dans
20 ml d'eau. Centrifuger avec 2 volumes d'alcool à 96 %. Examiner le culot par
la méthode habituelle de Ziehl.

5° Recherche des parasites


Si la selle est pâteuse, prélever un fragment quelconque. Si la selle est
très liquide, laisser sédimenter dans un verre conique, écarter le surnageant et
examiner des fragments solides.
Si les selles sont solides ou sèches, on prélève une petite parcelle sur
une lame porte-objet et triturer avec une goutte d'eau. Couvrir avec une
lamelle; réaliser une couche mince et examiner en lumière réduite.
En cas de diarrhée suspecte d'amibiase, examiner les selles dès
l'émission pour rechercher les amibes hématophages et découvrir leurs
mouvements amiboïdes.
Dans un examen microscopique direct des selles, on notera :
-globules rouges
-globules blancs
-mucus
-oeufs de parasites
-kystes de parasites
-parasites mobiles ou immobiles.

6° enrichissement des selles pour parasites

- Matériel nécessaire
Tubes à centrifuger coniques de 15 ml
Cours de Biologie Clinique | 320
Carton paraffines (ou verres de Berlin)
Entonnoirs de 5 ou 7 cm de diamètre
Spatules en bois
Bâtonnets en bois
Solution de formol à 10 % dans l'eau distillée (dilution à 1/10
ou formol commercial en solution à 40 %).
Morceaux de 10 x 10 cm de gaze.

- Technique
Mettre dans un carton (ou verre) environ 2 g de selles. Ajouter 10 ml
d'eau physiologique. Bien mélanger au moyen d'une spatule en bois.

Verser cette émulsion dans un tube à centrifuger à travers un morceau


de gaze.

Centrifuger à 2500 t/m. pendant une minute.


Décanter le surnageant. Cette opération peut être répétée.

Ajouter environ 3 ml d'éther (loin de flamme Bunsen), environ jusqu'à


3/4 de la hauteur du tube.

Mettre un bouchon de caoutchouc. Agiter vigoureusement pendant 30


secondes.
Enlever le bouchon. Centrifuger pendant 1 minute à 1500 t/m. On doit
obtenir 4 couches :

6) un petit culot contenant la plupart des parasites : larves et


oeufs dřhelminthes ;
7) la solution de formol ;
8) une couche de débris de selles ;
9) une couche d'éther à la surface.

Libérer la couche de débris au moyen d'un bâtonnet ou d'une aiguille


de platine. Décanter les trois couches surnageantes par aspiration prudente au
moyen d'une pipette de calibre assez fin reliée à une trompe à eau.

Mélanger le sédiment avec le peu de liquide resté dans le tube.


Examiner à frais (oeufs et larves) et en solution iodée (kystes).

7.4. L’ÉTUDE DU SPERME

7.4.1. Définitions

Sperme : est un liquide visqueux blanchâtre sécrété par le testicule et


la prostate. Il contient les spermatozoïdes. Les spermatozoïdes libérés des tubes
Cours de Biologie Clinique | 321
séminifères sont immobiles et non fécondants.Cřest grâce aux échanges
complexes de glycoprotéines à la surface des spermatozoïdes, tout au long du
trajet épididymaire, que ces cellules acquièrent leur mobilité et leur capacité de
féconder lřovocyte.
Le plasma séminal est constitué des sécrétions épididymo-
déférentielles (10 % du volume de lřéjaculat), des secrétions des glandes
annexes : prostate (15-30%) et vésicules séminales (50-80%).
Spermogramme ou étude du sperme : étude au microscope des
spermatozoïdes en suspension dans les sécrétions de glandes génitales de
lřhomme. Il permet de quantifier les spermatozoïdes pouvant expliquer la
stérilité du couple.
Son but est de rechercher une anomalie du sperme ou des
spermatozoïdes pouvant expliquer la stérilité du couple. Elle fait partie du bilan
de première intention de lřinfertilité masculine.

7.4.2. Rappel sur la spermatogenèse

La spermatogénèse est la production des spermatozoïdes. Cette


production passe par plusieurs stades. Les spermatogonies, cellules du tube
séminifère du testicule, donnent naissance aux spermatocytes de 1èr ordre,
diploïde. Ceux-ci subissent une méiose donnant les spermatocytes de 2ème
ordre, haploïdes. Dans un 3ème stade, les spermatocytes de 2ème ordre se
transforment en spermatides, précurseurs de spermatozoïdes. Les 2 premiers
stades constituent la spermatocytogénèse. Le 3ème stade est la spermiogénèse.

7.4.3. Prélèvement

1. Précautions préalables
Il faut sřassurer que le patient nřest pas atteint dřune maladie
infectieuse, de la distance dřune intervention chirurgicale, de lřabsence de toute
notion de fièvre car ceci peut influencer les résultats.
Le patient doit sřêtre abstenu, sexuellement, pendant 3 à 5 jours avant
le prélèvement. Dřune durée inférieure à 3 jours résulte dřune réduite de
lřéjaculation et dřune durée supérieure à 5 jours résulte de la perte de mobilité.
Le patient ne doit pas prendre de bain chaud pendant les jours qui
précèdent lřexamen, car ceci altère la mobilité des spermatozoïdes.
Instructions pour le prélèvement:
-prendre RDV au laboratoire après la prescription du médecin ;
-il faut disposer dřun bon flacon stérilerécolte stérile ;
-il faut que le prélèvement soit réalisé de préférence au laboratoire, dans
une pièce à part ou chez le patient ;
-il est aussi demandé de boire beaucoup avant lřexamen ;
-le patient doit savoir que le recueil de sperme doit être effectué par
masturbation, après avoir urine ;
Cours de Biologie Clinique | 322
-après avoir uriné, le lavage préalable au savon des mains et de pénis est
indispensable pour éviter toute contamination ;
-éviter absolument tout contact du pénis et des mains avec le vagin, la
bouche ou lřanus par risque de contamination de lřéchantillon ;
-éviter lřemploi de lubrifiants (salive, gel, huile de massage), car ils
contiennent des substances toxiques pour les spermatozoïdes ;
-une fois lřéjaculat recueilli, le patient doit sřassurer que le tube ou autre
flacon de récolte porte bien son identité. En cas de perte dřune partie de
lřéjaculat, le patient doit lřannoncer au laboratoire.

2. Méthodes de recueil du sperme


Lřéjaculat : cřest le sperme obtenu par éjaculation. Le recueil est fait
par le patient lui-même par masturbation (vibromassage, électro-éjaculation).
Le sperme récupéré par le prélèvement : nécessitant lřintervention du
médecin. Ce prélèvement est réalisé dans plusieurs organes dans lesquels on
trouve les spermatozoïdes. Ce type de prélèvement est utilisé chez les patients
atteints dřune azoospermie obstructive ou sécrétoire.
Il sřagit:
 Au niveau des canaux déférents : de mauvaise qualité
souvent ;
 Au niveau de lřépididyme par ponction transcutanée ou
PESA (Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration), par prélèvement
chirurgical, en effectuant une autre micro-incision testiculaire pour récupérer le
sperme intratesticulaire.
Il faut savoir aussi quřen cas dřune éjaculation rétrograde (dans la
vessie), on peut trouver des spermatozoïdes dans le 1er jet dřurine, dans le cas
dřune aspermie ou hypospermie

7.4.4. Méthode de dosage

Dans la majorité des cas, les paramètres qui concernent directement les
spermatozoïdes (concentration, mobilité, morphologie,) sont analysés à
lřexamen direct, entre lame et lamelle, au microscope optique ou à contraste de
phase, ou à fluorescence, en comptant les leucocytes, cellules épithéliales par
mm3, les spermatozoïdes, morphologie, vitalité. Après, on procède aux
étalements sur lame, coloration MGG ou Papanicolaou pour rechercher les
anomalies de formes. Les autres paramètres nécessitent des examens plus
spécialisés.

7.4.4.1. Les paramètres étudiés

Nombreux paramètres établis par lřOMS sont étudiés :


1. Le volume
2. La numération de spermatozoïdes (concentration en
spermatozoïdes)
Cours de Biologie Clinique | 323
3. Mobilité des spermatozoïdes
4. Morphologie des spermatozoïdes
5. La présence des leucocytes
6. pH de lřéjaculat
7. Vitalité de spermatozoïdes
8. Viscosité et coloration de lřéjaculat

Dřautres données peuvent également être complétées :

 la biochimie du plasma séminal : ceci consiste à doser les


différentes molécules en cas dřabsence des spermatozoïdes dans lřéjaculat :
a.dosage du zinc, du citrate (acide citrique) et des phosphatases acides.
Ces molécules sont produites par la prostate;
b. dosage du fructose produit par les vésicules séminales ;
c.dosage de la L-carnitine produite par lřépididyme.
Ces dosages peuvent mettre en évidence un obstacle ou une
malformation sur les voies excrétrices des spermatozoïdes (épididyme, canal
déférent, vésicules séminales, prostate).
Valeurs normales:
Zinc: 4-14 µmol/éjaculat
Fructose:25-103 µmol/éjaculat
Carnitine: 0,8-2,85 µmol/éjaculat

 Immunologie : recherche dřAc antispermatozoïdes dans le


plasma séminal, dans le sang et sur les spermatozoïdes. Ceci est fait
généralement devant la présence dřagglutinats de spermatozoïdes dans le
sperme ou dřanomalie de la motilité des spermatozoïdes dans lřéjaculat ou dans
la glaire cervicale de la conjointe (lors du test post-coïtal).
 Analyse automatisée des mouvements des spermatozoïdes
par ordinateur, qui permet de déceler des anomalies de la motilité, non visibles
au microscope.
Cours de Biologie Clinique | 324

Figure 73 : Les spermatozoïdes sont composés dřune tête, dřune


pièce intermédiaire et dřun long flagelle qui leur permet de se propulser
dans le liquide séminal. (© C.N.R.I. © Larousse 2006).

7.4.5. Etude détaillée des différents paramètres

a) Volume
Le volume permet de vérifier les capacités de sécrétion des glandes
annexes (prostate, vésicules séminales, épididyme). Le volume normal doit
supérieur à 2ml (2-6ml).

b) La concentration en spermatozoïdes
Est exprimé par ml dřéjaculat. La concentration normale est supérieur à
20 millions/ml, varie de 20-250 millions/ml, avec une moyenne de 40 millions
/ml. Cette concentration varie dřune manière importante, compte tenu de la
variabilité physiologique du spermogramme.
Les facteurs en cause sont :
 La durée dřabstinence
 Le stress
 Lřabsorption excessive dřalcool
 La prise de certains médicaments et drogues
 Les traumatismes physiques

c) Mobilité des spermatozoïdes


Cours de Biologie Clinique | 325
Est le facteur le plus déterminant du pouvoir fécondant de sperme. Elle
est examinée à la 1ère heure et à la 3ème ou 4ème heure après lřéjaculation. On
considère que la mobilité totale des spermatozoïdes à la 1ère heure est
supérieure à 50% des spermatozoïdes, et à la 4ème heure inférieure à 50% des
spermatozoïdes.Un sperme est dit « normal » si :
Une heure après le recueil, au moins 50% des spermatozoïdes ont une
mobilité (déplacement) progressive et dont plus de 25% ont un mouvement
rapide (mobilité en trajet fléchant rapide).
4 heures après le recueil, au moins 30% des spermatozoïdes ont une
mobilité normale progressive.

d) Morphologie des spermatozoïdes


Du point de vue morphologique, un sperme est normal, si plus de 30%
des spermatozoïdes ont une forme normale, car si la tête est volumineuse, elle
éprouve beaucoup de difficultés à traverser la glaire féminine ainsi que les
enveloppes de lřovocyte, avec pour conséquence lřinfécondité masculine.
Lřétude de la morphologie (taille et forme) des spermatozoïdes est
spécifiquement étudiée en spermocytogramme.
On examine 3 parties :
La tête (acrosome)
La pièce intermédiaire
Le flagelle
Ce paramètre a une appréciation subjective, car on observe une très
grande variabilité inter-observateurs et inter laboratoire, de sorte que ce
paramètre reste le moins apte (considéré) à prédire lřaptitude fécondante dřun
sperme. Mais les valeurs très basses permettent dřindiquer une baisse de
lřaptitude à féconder.

e) Présence de leucocytes (GB)


Dans un sperme normal, on trouve des leucocytes et quelques cellules
épithéliales. Jamais du sang ni des bactéries. Valeurs normales :
GB<1million/ml.

f) pH du sperme:
Varie de 7,2 à 8. Le sperme a un pouvoir tampon, celui de neutraliser
lřacidité vaginale qui est de pH3.

g) Vitalité des spermatozoïdes

Est le pourcentage des spermatozoïdes vivants/ml. Elle est normalement


supérieure à 75%.

h) Viscosité : le sperme est visqueux et non liquide ni fluide


Cours de Biologie Clinique | 326
i) Coloration : la coloration normale est jaune sodet, blanc
opalescent

j) Aspect: opaque

k) Odeur: acre ou fade

En résumé, les valeurs normales selon lřOMS sont :


1. Volume: 2-6 ml
2. pH: 7,2-8
3. Numération des spermatozoïdes: 20-250.106 /ml
4. Morphologie: > à 30 % des formes normales
5. Mobilité : 1h >50% progressive et 25% rapide, 3h>30%
progressivement
6. Vitalité: >75% de spermatozoïdes vivants.
Ces valeurs sont variables dřun échantillon à lřautre chez le même
patient.

Résultats anormaux et quelques définitions

1. Volume de l’éjaculat

 Volume<2ml : hypospermie (déficit de sécrétion).

Ces quantités sont:


o fonction de la durée de lřabstinence : augmente si lřabstinence est
longue
o infection
o diminue avec lřâge
 volume >6ml: hyperspermie
 éjaculation rétrograde (dans la vessie) → 0,5 ml :
aspermie/hypospermie
CAT (conduite à tenir) : rechercher les spermatozoïdes dans les
urines
 anéjaculation

2. Concentration en spermatozoïdes
 Oligospermie/oligozoospermie modérée : <20.106/ml ou
<20.000.000. En deça de 5.106 (<5.000.000) ou oligospermie sévère, les
chances de fécondation naturelle sont très limitées.
 Cryptozoospermie ou oligospermie extrême : absence de
spermatozoïdes observée à lřexamen microscopique direct.
 Polyspermie: >250.106 /ml.
 Azoospermie : absence des spermatozoïdes dans lřéjaculat.
Cours de Biologie Clinique | 327
Peut être dřorigine sécrétoire : due à un défaut de fabrication de
spermatozoïdes ; en cas de traitement anticancéreux, maladies (oreillons chez
lřadulte), anomalie génétique chromosomique : syndrôme de Klinefelter
47XXY)
Peut être dřorigine excrétoire : absence de canaux déférents
(agénésie), obstruction de canaux due à une infection ou après vasectomie.

3. Mobilité
Selon lřOMS, la mobilité est répartie en 4 classes :
0: spermatozoïdes statiques
1: mobiles, mais non progressifs
2: à progression lente
3: à progression rapide

Lorsque le taux des formes progressives (classe 2+3) est < à 50% à la
1ère heure ou <30% à la 3ème heure, on parle de lřasthénozoospermie, c à d,
les sprmatozoïdes sont asthéniques.

Facteurs:
 La durée dřabstinence trop long>5jours
 Absorption excessive dřalcool
 Exposition de testicules à la chaleur (position assise prolongée,
exposition aux chaudières, à la vapeur chaude
 Infections à chlamydia, mycoplasma…
 La prise de certains médicaments et drogues
 Anomalie génétique syndrome de Kartegener < à 30% de formes
normales
 Morphologie : Teratospermie : <30% de formes normales selon OMS
ou < 50% selon dřautres auteurs.
On classe les anomalies en 4 catégories
a.Anomalies de la tête : < à 35%. Ceci englobe:
Les microcéphalies
Les macrocéphalies
Tête allongée
Tête irrégulière
b. Anomalies de la pièce intermédiaire : <20% présence de
restes cytoplasmiques
c.Anomalies du flagelle: <20%
 Flagelle angulé
 Flagelle enroulé
d. Formes doubles: < à 10%
4 Vitalité: proportion des spermatozoïdes vivants
Nécrozoospermie : pas de spermatozoïdes vivants à lřéjaculation. Il faut
rechercher un problème infectieux ou oxydatif
Cours de Biologie Clinique | 328
6
Présence de leucocytes : Leucospermie :>1.10 /ml signe une infection
et faire la spermoculture pour identifier le germe en cause.
Si présence de sang: hémaspermie
Si présence du pus: pyospermie
5 pH:
-pH <6,5 : défaut de production de vésicules séminales
-pH <6,5 : insuffisance prostatique ou une infection

7.5. L’ETUDE DES EPANCHEMENTS

7.5.1. Définitions

Un épanchement est une accumulation anormale ou pathologique


du liquide interstitiel ou vasculaire dans les cavités ou dans les espaces
lacunaires où il n'a pas l'habitude de stagner.

C'est le cas notamment de :


 la cavité pleurale : Dans ce cas, l'épanchement s'appelle
pleurésie : ceci se rencontre en cas de TBC, décompensation cardiaque,
cancer pulmonaire à position périphérique.
 la cavité péritonéale : dans ce cas, l'épanchement s'appelle
ascite : ceci se rencontre en cas de cirrhose du foie, péritonite ou
inflammation du péritoine, décompensation cardiaque..;
 la cavité péricardique : dans ce cas, l'épanchement
s'appelle épanchement péricardique : en cas de péricardite, d'infarctus, de
décompensation cardiaque..;
 l'articulation : dans ce cas l'épanchement s'appelle
hydarthrose : en cas d'arthrite ou inflammation de l'articulation (BK,
gonocoque, rhumatisme articulaire aiguë ou RAA, traumatisme);
 des espaces lacunaires : dans ce cas l'épanchement
s'appelle oedème : ceci se rencontre en cas de décompensation cardiaque ou
d'atteinte rénale (oedème des pieds ou malléolaire et des mains, oedème
pulmonaire, bouffissure du visage ou oedème des paupières),
hypoalbuminémie.

7.5.2. Caractères des épanchements

Les épanchements sont classés en TRANSSUDAT et en


EXSUDAT. Cette distinction, nette dans les cas extrêmes, ne l'est plus dans
certaines situations où un TRANSSUDAT peut virer à l'exsudat.
Un TRANSSUDAT est un épanchement résultant d'un
passage du liquide interstitiel ou vasculaire dans les cavités ou espaces
lacunaires, sans qu'il y ait inflammation ou traumatisme au départ.
Cours de Biologie Clinique | 329
Un EXSUDAT par contre, résulte d'un processus
inflammatoire ou traumatisme. La connaissance parfaite des caractères
distinctifs entre les deux types d'épanchements est très importante, car cela
aide au diagnostic étiologique dans maints cas. C'est pourquoi, nous allons
examiner ces caractéristiques.

7.5.3. Prélèvement

Avant de procéder à l'examen d'un liquide d'épanchement, il faut


procéder à son prélèvement, avec une aiguille toujours stérile. Ce
prélèvement est très souvent en même temps évacuateur, dans ce sens qu'il
constitue le premier acte thérapeutique dans les épanchements. Après donc
ou avant l'évacuation, prévoir à peu près 4 ml pour la recherche
bactériologique (tube stérile), 10 ml pur la recherche cytologique et
biochimique (tube propre, pas nécessairement stérile).
Noter avec soins le volume total ponctionné, ceci donne l'idée sur la
gravité de l'affection.

7.5.4. Examens proprement dits

7.5.4.1. Aspect

Un transsudat est jaune citrin (paille). Il s'agit d'une stase simple.


Un exsudat par contre, peut présenter plusieurs aspects selon la cause
:
- jaune citrin (donc comme un TRANSSUDAT) : dans le cas de
tuberculose (TBC) miliaire, début d'inflammation à germes banaux ;
- brun ou purulent (trouble) : pneumococcie ou staphylococcie
éventuelle ;
- verdâtre : inflammation à pyocyanique ;
- hémorragique : cancer, tuberculose éventuelle, traumatisme.

7.5.4.2. Odeur
Transsudat : Inodore ou fade
Exsudat : Putride, surtout en cas d'infection.

7.5.4.3. Tendance à la coagulation

Pour mettre ce caractère en évidence, prélever un tube à essai de


liquide, sans addition d'anticoagulant, le laisser une heure sur une étagère et
noter l'apparition de quelques filaments de fibrine ou éventuellement une
coagulation en masse.
Un liquide qui coagule est toujours un exsudat.

7.5.4.4. Densité
Cours de Biologie Clinique | 330
Transsudat : entre 1,008 et 1,015 (à 15°C).
Exsudat : au-dessus de 1,018.

7.5.4.5. Réaction de Rivalta

1° Méthode : Dans un verre à pied, on introduit 100 ml d'eau


distillée et 2 à 3 gouttes d'acide acétique glacial. On laisse tomber dans cette
solution, quelques gouttes de liquide d'épanchement.
2° Résultats
Un exsudat donne une traînée grisâtre comme de la fumée de
cigarette, due à la précipitation des protéines. On dit que le Rivalta est
positif.
Un transsudat ne développe pas ce phénomène. On dit que le Rivalta
est négatif.

7.5.4.6. Au point de vue chimique

Un transsudat est moins riche en protéine : moins de 25g%.


Un exsudat en est riche : plus de 25g%.
Dosage des protéines : On procédera exactement, comme pour les
urines ; il faut diluer le liquide pleural ou péritonéal au 1/5 ou au 1/10 et
multiplier le résultat final par 5 ou par 10.

7.5.4.7. Au point de vue microscopique

Un transsudat présente des cellules épithéliales par prédominance et


quelques leucocytes.
Un exsudat présente en prédominance des leucocytes, polynucléaires
en cas d'inflammation aiguë, et lymphocytes en cas d'inflammation
chronique.
Il existe des formes de transition entre les deux liquides : un vieux
transsudat peut se transformer en exsudat.
Examen cytologique : Coloration de May-Grüwald. Voir Techniques
hématologiques.
Un liquide d'épanchement prélevé pour examen microscopique, doit
être recueilli sur Titriplex à raison de 5 mg pour 5ml de liquide.
Cette précaution évite la formation d'un caillot de fibrine qui englobe
les éléments figurés. Centrifuger à moyenne vitesse et étaler le culot qu'on
colore par la méthode panoptique pour reconnaître les différents leucocytes
ou utiliser les colorations telles le bleu de méthylène ou de toluidine, Gram
ou Ziehl éventuellement pour mettre en évidence le type de bactéries.
Un transsudat a une formule à prédominance endothéliale, quelques
leucocytes.
Cours de Biologie Clinique | 331
Dans un exsudat, les leucocytes prédominent ; en cas d'inflammation
chronique, il y a majorité de lymphocytes. En cas d'inflammation aiguë, ce
sont les polynucléaires plus ou moins dégénérés qui prédominent.
Ne pas confondre les cellules épithéliales dégénérées avec les
cellules néoplasiques.

7.6. ETUDE DE L’EXPECTORATION (CRACHAT)

7.6.1. Formation

Lřexpectoration est un produit de sécrétion de différentes glandes


séreuses et muqueuses de lřépithélium respiratoire.
Dřun volume très variable allant normalement de quelques crachats à
0,5ml maximum, son volume augmente en cas dřinflammation des voies
respiratoires.
Dans certaines affections, ce volume peut atteindre une proportion de
lřordre de 500ml et plus ; on lřappelle alors une VOMIQUE. Cřest le cas
dans les dilatations bronchiques ou bronchiectasies, lřabcès et la gangrène
pulmonaires, tuberculose pulmonaire avancée, fistule pleuro-pulmonaire…

7.6.2. Précautions

Lřexpectoration représente sans conteste le matériel pathologique le


plus dangereux car, cřest par elle que se transmettent beaucoup
dřaffections ; il est donc indispensable de prendre des mesures dřasepsie
rigoureuse en manipulant ce matériel : le malade doit éviter de répandre ses
crachats nřimporte où, il doit cracher dans un mouchoir.
Sřil doit remettre lřexpectoration pour des analyses, il doit cracher
dans un crachoir avec couvercle.
Après lřexamen, le crachoir en carton doit être brûlé et celui en
métal, en porcelaine ou en verre soigneusement stérilisé au formol à 10%
pendant 24heures ou dans un bain-marie bouillant pendant 15-20 minutes.
Bien désinfecter les mains après manipulations.

7.6.3. Haleine

Cřest lřair expiré contenant oxygène, azote et le gaz carbonique en


proportion importante ; ainsi que de lřeau (lřhaleine, est toujours humide).
Telle quelle, elle est sans odeur, fade. Elle change, devient putride, suite à la
présence des produits de putréfaction bactrienne quřelle entraine par
expiration.
En effet, les bactéries qui augmentent en cas dřinfection, provoquent
lřinflammation qui augmente la sécrétion qui contient des protides, des
monosaccharides, des globules de pus. Ces substances sont attaquées par les
bactéries, dřoù production de lřindole, scatol, mercaptan, acide lactique,
oxalique, comme exactement dans le cas de la putréfaction intestinale. Dřoù
Cours de Biologie Clinique | 332
mauvaise haleine, qui signe ainsi une infection respiratoire ou de la bouche,
minime soit-elle.

7.6.4. Examen proprement dit

7.6.4.1. Odeur
Sans odeur particulière ou fade normalement, le crachat devient
putride ou fétide dans les gangrènes ou abcès pulmonaires, affections dans
lesquelles cette odeur est caractéristique. Ceci peut être remarqué en cas de
putréfaction des acides aminés et monosaccharides par les bactéries, comme
nous lřavons mentionné dans lřhaleine.

7.6.4.2. Examen macroscopique

Cet examen dans lequel on sřintéresse à lřaspect et à la consistance,


suggère déjà la nature de lřaffection.
La consistance dépend des proportions variables de mucus, pus, sang.

7.6.4.2.1. Expectoration muqueuse

Blanchâtre ou grisâtre, filante, plus ou moins collante : se présente


dřhabitude en deux couches (muqueuse et liquide). Elle se rencontre dans
les bronchites aiguës, lřasthme. De nature allergique, elle signe plus
lřinflammation que lřinfection

7.6.4.2.2. Expectoration purulente

Jaune verdâtre ou jaunâtre, assez fluide : se présente dans lřabcès


pulmonaire, bronchiectasie, empyème fistulisée dans les bronches. Elle
signe plus lřinfection.

7.6.4.2.3. Expectoration muco-purulente

Mieux liée, plus collante : parties transparentes (muqueuses) et


jaunâtres ou jaune-verdâtres (purulentes) :
Se rencontre dans la tuberculose cavitaire, bronchite chronique,
bronchiectasie où en plus de lřinfection, lřinflammation (allergie) domine
aussi : TENDANCE ASTHMATIQUE.

7.6.4.2.4. Crachats nummulaires (forme arrondie)

Ils flottent, conservent une forme arrondie dans le crachoir : se


rencontrent dans lřasthme bronchique.

7.6.4.2.5. Crachats séreux


Cours de Biologie Clinique | 333

Sont très liquides, spumeux ; se voient dans lřœdème pulmonaire où


ils sont même teintés de sang, rouillés ; dans les rhinites catarrhales ou
allergiques (aiguës ou chroniques), rhinorrhée.

7.6.4.2.6. Expectoration sanglante ou hémorragique

Plus ou moins constituée de sang pur ou dilué. Cřest de lřhémoptysie


de causes diverses : stase pulmonaire dřorigine cardiaque, néoplasie,
tuberculose.

7.6.4.2.7. Expectoration rouillée

Crachat muqueux ou muco-purulent avec des filets de sang. Se


rencontre dans la tuberculose et dans la pneumonie.
7.6.4.2.8. Crachats en gelée de groseille

Ils se présentent sous forme de grappe rouge ou gri : on les rencontre


dans les carcinomes pulmonaires.

7.6.4.2.9. Expectoration anthracosique

Ce sont des crachats muco-purulents, noirâtres. On les rencontre dans


les pneumoconioses ou anthracosilicoses des mineurs.
N.B. Ne pas confondre les crachats sanglants dřavec du sang des
épistaxis, pharyngé ou venant des gencives (gingivorragie).

7.6.4.3. Examen microscopique des crachats

BUT PRINCIPAL : rechercher et identifier les microbes.


On utilise diverses techniques comme celles employées pour dřautres
humeurs (urines, suc gastrique, L.C.R…).

7.6.4.3.1. Homogénéisation des crachats

Le but est dřextraire les B.K. dřun grand volume des crachats au lieu
de se contenter à les rechercher sur une petite parcelle. Lřhomogénéisation
est à pratiquer dans le cas où lřexamen direct sřest avéré négatif, alors que la
présomption de T.B.C persiste.

7.6.4.3.2. Procédure
Cours de Biologie Clinique | 334
A 10 ml de crachat, ajouter 20 ml de solution dřantiformine (mélange
dřhypochlorite de soude et de soude caustique).
Bien agiter et laisser reposer une demi-heure. Lřantiformine détruit la
matière organique et lřon obtient ainsi une solution claire.
Ajouter 30 ml dřeau distillée.
Agiter
Centrifuger pendant une heure à 2000 tours par minute.
Le culot est étalé en couche épaisse et collé sur une lame par un peu
dřalbumine dřœuf.
Fixer et colorer selon les méthodes appropriées, puis lire au
microscope.

7.7. ANALYSE D’UN CALCUL URINAIRE« TESTS


COURANTS »

7.7.1. Tests courants

7.7.1.1. Recherche des oxalates (Urines acides)

A un petit grain de calcule réduit en poudre au fond dřun tube à


centrifuger, ajouter 1 ml dřHCI à 5%. Mélanger avec la baguette de verre.
Centrifuger.
Reprendre le surnageant clair. A cette solution claire, ajouter goutte à
goutte une solution dřAcétate de Na Saturée jusquřau moment où le pH est
de lřordre de 4,5. Mesurer le pH avec un papier indicateur (Merck pH 3,8-
5,4.
En présence dřoxalate, il se forme un fin précipité dřoxalete de
calcium.
Réactifs : - HCI 5% ml HCI concentré dans 100ml E.D.
-Acétate saturé dans lřE.D
-Papier indicateur pH 3,8 à 5,4.

7.7.1.2. Recherche des urates

A un petit grain de poudre de calcul, on ajoute 1ml de NaOH 0,1N.


Mélanger avec une baguette de verre. Centrifuge et décanter le surnageant.
Cours de Biologie Clinique | 335
Ajouter goutte à goutte le réactif de Folin pour lřacide urique, jusquřà
la neutralité.
Sřil se forme une coloration bleue, il y a des urates. En général, il
suffit de 2 à 4 gouttes pour se trouver à la neutralité (2 à 3 gouttes de réactif
de Folin).

7.7.1.3. Recherche de l’Acide Urique (Urine acides)

- prendre un petit fragment de calcul pulvérisé


- le mettre dans une petite capsule de porcelaine
- ajouter 2 à 3 gouttes dřacide nitrique (HNO3) 1/10
- chauffer pour évaporer sur une petite flamme (veilleuse)
- on obtient une coloration rouge qui vire au bleu-violet en ajoutant
une goutte dřammoniaque diluée au 1/10.

7.7.1.4. Recherche des phosphates

Attaquer un petit fragment de calcul par lřacide nitrique à 10% -


chauffer ; reprendre + 1ml de solution et ajouter le réactif molybdique
(dosage du phosphore) + = jaune.

7.7.2. Tests fréquents

7.7.2.1. Mode opératoire général : Décrire la couleur, le poids, la


consistance, le volume, lřétat de la surface et puis pulvériser dans un mortier
pour analyses chimiques.

7.7.2.2. Matériel : -Une plaque blanche avec 12 cavités ou godets.


-Une plaque noire avec 3 cavités (pour calcium).

7.7.2.3. Réactifs : 1°-Na2CO3 20%

2°-Acide phosphotungstique (voir réactifs pour acide urique


sanguin) : dans un ballon jaugé de 1 litre, mettre :
-150ml H2O
-H2SO4 concentré : 16,8ml
-Bouillir doucement à reflux pendant 2 heures.
-Refroidir et amener à 1 L avec de lřeau distillée.
3°-Ammonium molybadate (voir phosphatases) : dans un ballon dřun
litre (jaugé), mettre :
-Molybdate dřammonium: 25g
-H2SO4 10N: 300ml
Cours de Biologie Clinique | 336
-Dissoudre le molybdate
-Compléter à 1 litre avec H2O distillée
4°-NH4OH concentré p.a. ou NH3 concentré.
5°-NaCN : dans un ballon dř1litre, mettre :
- NaCN : 60g
- Na2CO3 anhydre : 20g
- Amener à 1 litre avec H2O distillée
- Garder au frigo.
N.B. : Purifier le NaCN si la couleur bleue disparaît ou devient
brunâtre.
6°-Sodium Nitroprussiate 5% : A préparer extemporanément ; jeter
quand la couleur disparaît.
7°-HNO3 concentré.
8°-NH4SCN 3%
9°-HCl 10%
10°-Colorant jaune Titan (Clayton Yellow)
- 0,1g de colorant, amené à 100ml
- 3 gouttes de NaOH 20%
-Na Oxalate saturé : 5g de Na2C2O4 et amener à 100ml.
11°-NaOH 20%
12°-Nessler (réactif de …) Ŕ voir dosage de lřurée sanguine
13°-MnO2 poudre p.a.
14°-BaCl2 : 5g%
15°-NaNO3 : 0,1g% : préparation extemporanée
16°- « Couling reagent » : N-1 naphtol-éthylène-diamine-
dihydrochloride : 0,1g% : préparation extemporanée
17°-Chloroforme pur
18°-Acide acétique concentré
19°-Acide sulfurique concentré

7.7.2.4. Procédure

Faire sécher le calcul à la température du laboratoire pendant 24


heures et peser ;
Examen MACROSCOPIQUE : couleur, forme, taille, aspect de la
surface (avec une loupe).
N.B. : Taille longueur et épaisseur.
- noter la consistance
- pulvériser dans un mortier
- exécuter les tests de routine sur la plaque blanche, sauf pour le
calcium pour lequel on utilise la plaque noire.
Cours de Biologie Clinique | 337

Analyses Manipulations Résultats


1. Urates - quelques grains de calcul Couleur bleue foncée =
- 1 goutte de Na2CO3 +
- 2 gouttes de réactif pour
acide acide urique (Folin) Bleu pâle = Nég.
2. Phosphates - quelques grains de calcul Précipité jaune = positif
-5gttes molybdate endéans les 5ř
ammonium
3. Fer - quelques grains de calcul Couleur rouge = +
- 3 gouttes dřacide nitrique
- 3 gouttes du NH4 SCN
4. Cystine - quelques grains de calcul Couleur rouge = Nég.
- 1 goutte de NH3 Orange = +
- 1 goutte de NaCN
- attendre 5ř
- 2 gttes de Nitroprusside Na
Dissoudre 25mg de calcul pulvérisé dans 2ml de HCl 10% dans un
tube Baxter.
Mélanger pendant 2ř
Puis successivement :
5. Carbonate Observer solution Effervescence = +
hypochlorique du calcul
6. Calcium - 3 gouttes de surnageant
- 4 gouttes de Na Oxalate Précipité blanc = +
- 3 gouttes NH3
7. Magnésium - 3 gouttes de surnageant Précipité rouge-
- 3 gouttes de NaOH sang= +
- 1 goutte de colorant Titan Autres couleurs
= Nég.
8. Ammoniac - 3 gouttes de surnageant Précipité jaune-orange
- 3 gouttes de NaOH =+
- 4 gouttes de Nessler
9. Sulfate - 3 gouttes de surnageant Précipité blanc = +
- 4 gouttes de BaCl2
10. Oxalate a) à la solution hydrochlorique Lâché bulles air dřair
calcul restant, ajout qlqes explosivement = +
grains Mn02
b) à la solution hydrochlorique
calcul restant, ajout gtte à gtte Précipité fin dřoxalate
1 solution dřacétate Na saturée de Ca.
jsqu pH 4,5.

7.7.3. Tests spéciaux pour calculs urinaires plus rares


Cours de Biologie Clinique | 338
N.B. : A effectuer si lřon ne trouve aucune réponse positive par les
tests de routine ou si lřon songe à un calcul plus rare.

Analyses Manipulations Résultats


1. Xanthème - quelques grains de calcul Reste jaune orange
- les dissoudre dans le HNO3 avec NH40H ajouté
- sécher au B.M. =+
- ajouter 3 gouttes de NH4OH
2. Indigo quelques grains de calcul Couleur
- 5 gouttes de chloroforme bleue = +
3. -quelques grains pulvérisés Jeu de couleur
Cholestérol - 5 gouttes de cloroforme finissant par le vert
-10gttes acid. acét.concentré = +
anhydre)
-1goutte dřacid. sulfuriq.
concentré.
4. - quelques grains de calcul
Sulfonamide - 2 gouttes HCI
- 2 gouttes NaNO2
- 3 gouttes NH4 sulfamate Couleur
- 3 gouttes « Couling reagent » rouge = +
Enregistrer les résultats comme suit :
Nom du patient :…………………………… Date :…………………
Origine du calcul :………………………….
Consistance :………………………………..
Couleur :…………………………………….
Taille :……………………………………….
Forme :……………………………………….
Surface extérieure :………………………….
Poids :………………………………………..
Résultats dřanalyses chimiques :……………………………………..
………………………………………………………………………...
Conclusion et suggestions du Médecin Biologiste……………………
………………………………………………………………………...
Signature du Médecin Biologiste.

FIN
ANNEXES :

Afin de rendre le présent syllabus « plus pratique sur le plan


professionnel », nous présentons, à titre documentaire, les annexes ci-
Cours de Biologie Clinique | 339
dessous, afin que le Praticien de laboratoire, qui qu’il soit et où qu’il se
trouve, dispose d’un outil de travail suffisamment utilitaire.

Tandis que, pour une meilleure compréhension de la


Parasitologie et de la Microbiolgie, le lecteur devrait se référer aux
syllabus et aux ouvrages spécialisés y afférents.
Cours de Biologie Clinique | 340

A. TABLEAUX DE CONVERSION
Tableau XXV : CONVERSION DES UNITES TRADTIONNELLES (U.T.) EN
UNITES S.I. (SYSTEME INTERNATIONAL)
Réf. Biochimica Clinica, Vol. 12, p.p 1357-1420, Décembre 1988.

Unités Traditionnelles : U.T. Multiplier par Unités S.I.

Acide urique ............. mg/dl ou % ...... … 59,5 .... …….. μmol/L


: ........... mg/L ...... …. 5,95 .... …. μmol/L
Albumine ................. g/dl ou % ..... ….…. 149 .... …. μmol/L
................. g/L ...... ….…. 14,9 .... ….….…. μmol/L
................. g/dl ou % ...... ….… 10 .... ….…. g/L (UT)
Amylase .................. U. Somogyi ...... …. 1,85 .... ….….…. UI/L (UT)
Bicarbonates(Rés.Alc) .. mEq/L ...... ….…. 1 .... ….….…. mmol/L
Bilirubine ............... mg/dl ou % ...... …. 17,1 .... ….…. μmol/L
............... mg/L ...... ….…. 1,71 .... ….….…. mmol/L
Calcium .................. mEq/L ...... ….…. 0,5 .... ….…. mmol/L
............... mg/dl ou % ...... …. 0,25 .... ….…. mmol/L
Chlorures ................ mEq/L ...... 1 .... ….…. mmol/L
Cholestérol .............. mg/dl ou % ...... ….0,0259... ….…. mmol/L
Créatinine ............... mg/dl ou % ...... …. 88,4 ..... ….…. μmol/L
CTFF ..................... mcg/dl ou % ..... ….0,179 ... ….…. μmol/L
Fer ...................... mcg/dl ou % ..... ….0,179 ... ….…. μmol/L
Globulines ............... g/dl ou % ...... ….…10 ..... ….….…. g/L (UT)
Glucoses ................. mg/dl ou % ...... …. 0,0555 .. ….….… mmol/L
................. g/L ...... ….…. 5,55 ... ….….…. mmol/L
Hémoglobine ............. g/dl ou % ...... ….…0,155 ... ….….… mmol/L
.............. g/L ...... ….….…0,0155 .. ….….…. mmol/L
Lipides Totaux ........... mg/dl ou % ..... …. 0,01 .... ….…. g/L (UT)
Magnésium ................ mg/dl ou % ...... …. 0,411 ... ….…. mmol/L
Phosphatase .............. U.Sigma F ....... …. 16,7 ..... ….…. UI/L (UT)
Phosphore(phosphate) mg/dl ou % ...... …0,323 .. ….….. mmol/L
potassium ................ mEq/L ........ ….….1 ....... ….…. mmol/L
protéines ................ g/dl ou % ...... ….…10 ....... ….…. g/L (UT)
Réserve alcaline ......... mEq/L .......... …. 1 ....... ….…. mmol/L
Sodium ................... mEq/L .......... ….…1 ....... ….…. mmol/L
TransaminaseGO-GP U.Sigma F ....... …. 0,48 .... ….…. U.I./L (UT)
Urée ..................... mg/dl ou % ...... 0,167 ... ….…. mmol/L
..................... g/L ............ ….….16,7 ..... ….…. mmol/L
Urique (Acide) Voir acide urique
Triglycérides ............ mg/dl ........... …. 0,0124 .. ….….…. mmol/L
(Tripalmitine) mg/dl ........... …. 0,0113 (Triolein) mmol/L
17-Céto ou oxostéroïdes.mg(24H) ......... 3,472 ... ….…. μmol (24H)
17-Hydroxy .............. mg ........... …. 2,76 .... ….…. μmol
Oestriol ................ μg ........... …. 3,472 ... ….…. nmol
Thyroxine ............... μg/dl ........... …. 12,9 ..... ….…. nmol
............... g/L ........... …. 1,29 .... ….…. nmol

Tableau XXVI : CONVERSION DES UNITES S.I. EN UNITES TRADITIONNELLES (U.T.)


Réf. Revue de Médecine de TOURS - Juin 1978 (Prof. MOURAY)

Unités S.I. Multiplier par UT


Cours de Biologie Clinique | 341
Acide urique ............. μmol/L .......... …. 0,0168... ….….…. mg/dl ou %
Albumine ................. μmol/L .......... …. 0,069... ….….….. g/L
Amylase .................. UI/L .......... ….….…. 0,54 .... ….….…. U.Somogyi
Bicarbonates (Rés. Alc) .. mmol/L .......... ….…. 1 .... ….…. mEq/L
Bilirubines .............. μmol/L .......... …. 0,058 .. ….….. mg/dl ou %
Calcium .................. mmol/L .......... ….…. 2 ...... ….…. mEq/L
Chlorures ................ mmol/L .......... ….….…. 1 ...... ….….…. mEq/L
Cholestérol .............. mmol/L .......... ….….…. 38,6 ..... ….….…. mg/dl ou %
Créatinine ............... μmol/L .......... ….….…. 0,011 .. ….….…. mg/dl ou %
CTFF ..................... μmol/dl ......... ….….…. 5,58 ... ….….….. mcg/dl ou %
Fer ...................... μmol/L .......... ….….…. 5,58 .... ….….…. mcg/dl ou %
Globulines ............... g/L .......... ….….…. 0,1 .... ….….…. mg/dl ou %
Glucoses ................. mmol/L .......... ….…. 0180 .... ….….…. g/L
Hémoglobine .............. mmol/L .......... ….…. 1,612 .. ….….…. g/dl ou %
Lipides Totaux ........... g/L ......... ….….…. 100 ....... ….….…. mg/dl ou %
Magnésium ................ mmol/L .......... ….…. 2,43 .... ….….…. mg/dl ou %
phosphatase ............…… UI/L .......... ….…. 0,06 .... ….….…. U.Sigma/ml
Phosphore (phosphate) .... mmol/L .......... ….…. 3,1 ..... ….….…. mg/dl ou %
potassium ................ mmol/L .......... ….…. 1 ....... ….….…. mEq/L
protéines ................ g/L .......... ….…. 0,1 ..... ….….…. mg/dl ou %
Rés. alc. (Bicarbonates).. mmol/L .......... ….…. 1 ....... ….….…. mEq/L
Sodium ................... mmol/L .......... ….…. 1 ....... ….….…. mEq/L
Transaminase GD - GP .... UI/L .......... ….…. 2,084 ... ….….…. U.Sigma/ml
Urée ..................... mmol/L .......... ….…. 0,06 .... ….…. g/L
Urique (Acide)............ μmol/L .......... ….…. 0,0168... ….…. mg/dl ou %

B EXAMENS PARASITOLOGIQUES
Principaux protozoaires intestinaux de l'homme

Les dessins ont été exécutés d'après l'Atlas de Bailenger et figurent au grossissement de 1000 X, sauf le
kyste du Balantidium dessiné à l'échelle X 450.
1. Entamoeba coli, 20 à 30 microns; kyste à 8 noyau, 10 à 25 microns.
2. Entamoeba histolytica, 15 à 30 microns; kyste à 2 ou 4 noyaux, 5 à 15 microns, contenant un bâtonnet épais à extrémités
arrondies.
3. Trichomonas intestinalis, 10 à 20 microns.
4. Chilomastix mesnili, 10 à 20 microns, kyste à 7 ou 8 microns.
5. Giardia-lambliade face et profil, 10 à 20 microns; kyste ovoïde à stries médianes, contenant 2 à 4 noyaux, 8 à 12
microns.
6. Balantidium coli, 50 à 100 x 40 à 60 microns. Le kyste représenté au grossissement x 450 a comme dimensions 50 à 60
microns.
Les principaux oeufs des parasites de l'homme grossis 650 x
Cours de Biologie Clinique | 342

1. Trichuris trichura ou Trichocéphales : oeuf ovoïde à deux bouchons muqueux opposés; brun orange, aspect en citron.
2. et 3 Ascaris lombricoïdes : oeufs ovoïdes mamelonnés, brun noirs

-2 : mise au point sur la coque


-3 : mise au point sur le centre de l'oeuf.
4. Taenia saginata ou sodium : oeuf sphérique à six crochets et à coque épaisse et brune striée radicalement.
5. Hymenolepis nana : coque incolore hyaline, sphérique membrane externe mince, membrane interne, deux
épaississements polaires d'où partent des filaments.
6. Schistosoma haematobium : oeuf ovoïde, volumineux à éperon terminal.
7. Schistosoma mansoni : oeuf ovoïde, volumineux à éperon latéral.
8. Clonorchis sinensis : oeuf à clapets avec pôle operculé rétréci et appendice avec pôle élargi, embryonné.
9. Dibothriocephalus latus : oeuf à clapet, ovoïde avec opercule large, convexe, non embryonné.
10. Fasciola hepatica ou douve du foie : Oeufs à coque ovoïde à clapet à opercule convexe, non embryonné.
11. Enterobius vermicularis ou oxyure : oeuf à coque épaisse, lisse, asymétrique, embryonné.
13. Ascaris lombricoïdes : Oeuf à coque épaisse, lisse symétrique, masse centrale brune, segmentée,
dépourvu de sa coque mamelonnée.
14. à 16. Ankylostoma duodénale : Oeufs à coque mince, symétrique, segmenté ou embryonné.

- 14 : à deux cellules
- 15 : à quatre cellules
- 16 : embryonné : l'embryon se développe dans les selles conservées 24 à 48 heures à la température ambiante.

C QUELQUES TECHNIQUES DE COLORATIONS BACTERIENNES

A° Coloration par la méthode de GRAM


A pour but de différencier les germes en Gram négatifs et Gram positifs, ceci a comme avantage de
poser le diagnostic différentiel étiologique rapide dans certains cas.

I. Principe de la réaction
Les dérivés de triphénylméthane (le plus souvent Violet de Gentiane) forme un complexe Violet de
Gentiane-Iode qui reste dans la paroi des cellules en présence d'alcool chez certaines bactéries, alors appelées Gram
positifs ou alcoolo-résistantes, et qui disparaît chez d'autres appelées alors Gram négatifs ou alcoolo-sensibles.

II. Réactifs
1. Violet de Gentiane ou Cristal violet en solution aqueuse à 1 %
2. Bicarbonate de soude en solution aqueuse 5 %.
NB : On peut y ajouter du merthiolate (antiseptique) à la concentration de 1/20.000.
3. Solution de Lugol:
Cours de Biologie Clinique | 343
-Iodure de potassium .... 2 g
-Iode .......……............ 1 g
-Eau distillée .......... 200 ml
4. Acétone .................... 300 ml
Ether ....................…. 100 ml
5. Fuchsine phéniquée diluée à raison de 5 volumes pour 95 volumes d'eau.

III. Technique
1. Etaler soit 2 gouttes de cullot urinaire, soit une particule du crachat directement ou après
homogénéisation; soit tout autre produit biologique.
2. Laisser sécher à l'air, sans chauffer, avant de fixer.
3. Fixer l'étalement en passant lentement le porte-objet 3 fois dans la petite flamme
veilleuse du bec Bunsen, frottis au-dessus. Contrôler la température, qui doit rester douce, au dos de la main.
4. Laisser refroidir la lame et couvrir de Violet de Gentiane ou cristal violet, et ajouter 5
gouttes de bicarbonate, en le distribuant à travers le colorant.
5. Laver à l'eau.
6. Couvrir de Lugol pendant 60 secondes au moins : c'est le Mordançage.
L'iode se complexe avec le Violet de Gentiane.
7. Laver à l'eau du robinet à grande eau.
8. Sur la lame mouillée, laisser tomber l'acétone-éther jusqu'à l'écoulement clair du
décolorant : c'est la décoloration.
Eviter d'employer trop de décolorant.
9. Laver rapidement à l'eau.
10. Recouvrir de fuchsine pendant 10 secondes.
11. Laver et sécher.

Résultats : les germes Gram + sont colorés en bleu violet, tandis que le Gram- et le fond de la
lame sont roses.
Germes Gram + Germes Gram -

Staphylocoque Gonocoque
Streptocoque Méningocoque
Pneumocoque Pneumo-Bacille de Priëdl nder
Bacille diphtérique Bacille d'Eberth
Bacille tétanique Colibacilles

B° Coloration par la méthode de Ziehl (perfectionnée par Neelson)

I. Principe de la méthode
Les bacilles appartenant au genre Mycobactérium, (bacille de Koch de
la tuberculose, bacille de Hansen de la lèpre, etc...) ont, contrairement aux
autres germes, la propriété de résister à la décoloration par l'alcool et l'acide
nitrique ou chlorhydrique ; lorsqu'on les a colorés en rouge par la fuchsine
phéniquée.
Diverses analyses chimiques ont permis d'isoler un acide gras non
saturé complexe, l'acide mycolique, qui forme avec la fuchsine un complexe
Alcoolo-Résistant.

II. Réactifs
1. Solution saturée de fuchsine basique dans l'alcool
éthylique ...........................…………… 105 ml
Solution de phénol à 5 %................. …... 895 ml
2. Alcool éthylique 95 % ................... ……... 97 ml
HCl concentré ........................... …….…... 3 ml
3. Bleu de méthylène ...................... ……… 0,3g
Alcool éthylique à 95 % ..............……… 30 ml
Cours de Biologie Clinique | 344
Eau distillée .......................………….…... 100 ml.

III. Technique
1. Etaler, sécher et fixer à la chaleur comme dans Gram.
2. Placer sur le pont à coloration et couvrir de fuchsine de Ziehl pendant
20 minutes.
On raccourcit cette étape à 5 minutes, en chauffant à plusieurs reprises
sur une flamme jusqu'à apparition de vapeurs, sans faire bouillir le colorant.
3. Laver à grande eau.
4. Décolorer à l'alcool-acide jusqu'à ce que ce dernier s'écoule clair.
5. Colorer le fond et les bacilles non acido-résistants au moyen de bleu
de méthylène pendant 30 secondes.
6. Laver à l'eau et laisser sécher à l'air.

IV. Résultats
Les bacilles acido-résistants sont rouges, les autres bactéries et le fond
sont bleus.
NB : Examiner les plaques avec beaucoup de soin et de patience.
Quand le résultat est négatif par la méthode directe, il peut être utile de
rechercher les bacilles de Koch après homogénéisation des crachats.

D TECHNIQUE DE LA GOUTTE EPAISSE

1° Dégraisser la peau à l'éther. Attendre l'évaporation complète avant de faire la


piqûre.

2° Piquer la peau avec un instrument stérile pour chaque patient. Les aiguilles
pour injection ou aiguille de Francke passées à la flamme conviennent
parfaitement.
Cette précaution de stérilité est importante en vue d'éviter le SIDA et le virus
de l'hépatite B.

3° Déposer sur la partie moyenne de la lame une ou deux gouttes de sang l'une
à côté de l'autre. Avec le coin d'un porte-objet, mêler les gouttes pour en faire
un étalement homogène sous forme d'un cercle de 10 à 12 mm de diamètre. La
quantité de sang utilisée doit être telle que la réparation ne forme pas de
craquelures en séchant et ne se détache pas au cours de la coloration.

4° Mettre une marque d'identification, par exemple étiquette, à la face


inférieure de la lame ; avec nom et numéro du malade.

5° Faire la coloration aussi vite que possible. Un délai de plusieurs heures


empêche une bonne hémolyse des globules rouges.
Cours de Biologie Clinique | 345
- Coloration des gouttes épaisses par le Giemsa
1. Recouvrir la lame pendant 30 minutes avec le Giemsa dilué à raison de 15
gouttes pour 10 ml d'eau distillée tamponnée.
2. Laver avec précaution à l'eau courante, sans diriger le jet d'eau directement
sur la goutte épaisse, afin d'éviter que celle-ci, non fixée à l'alcool, ne se
détache de la lame. Ne jamais sécher avec un papier buvard.
3. Laisser sécher à l'air ou dans un jet d'air.
4. Rechercher les plasmodiums à l'immersion. Rechercher les microfilaires au
faible grossissement. Déterminer leur espèce à l'immersion.

- Coloration des gouttes épaisses par la méthode rapide de Field


1. Attendre que la goutte épaisse préparée comme ci-dessus soit bien sèche.
2. Tremper la lame dans la solution n° 1 pendant 5 à 10 secondes.
3. Rincer la lame dans le tampon n° 2 pendant 1 à 2 secondes jusqu'au moment
où le liquide de lavage n'enlève plus de colorant.
4. Plonger la lame dans l'éosine pendant 1 à 2 secondes.
5. Rincer pendant 1 à 2 secondes dans le tampon n° 4.
6. Placer sur l'égouttoir et laisser sécher à l'air.

Les réactifs dont la préparation est décrite au chapitre "solutions pour


les techniques hématologiques" doivent être conservés dans des flacons
bouchés à l'émeri. On en verse le volume nécessaire dans des boîtes à
coloration munies de leur couvercle. Le contenu des quatre boîtes doit être
renouvelé chaque semaine (p.156).

- Interprétation et notation des résultats

L'examen d'une goutte épaisse se fait avec l'objectif à l'immersion. Il


est nécessaire de parcourir 20 à 30 champs microscopiques avant de conclure à
un examen négatif.
Cette méthode permet la découverte des parasites suivants :

- les formes érythrocytaires des plasmodiums de la malaria ;


- les trypanosomes, agents de la maladie du sommeil ;
- les spirochètes sanguicoles ou Borrelia, agents de la fièvre récurrente.
- les microfilaires.
Les résultats de l'examen seront protocolés comme suit :

1. MALARIA
Cours de Biologie Clinique | 346
On notera la présence de trophozoïtes annulaires de schizontes ou
formes en division et de gamétocytes.
En cas de découvertes de malaria par la méthode de goutte épaisse, il est
souhaitable de préparer un étalement fin, de le colorer par la méthode de May-
Grünwald et de l'examiner à l'immersion afin de déterminer la plasmodium. La
figure 13 donne les indications nécessaires à cette identification.

2. Filariose
La prescription des microfilaires sanguicoles les plus fréquentes est
donnée ci-après, en légende de la figure 4.
Dans la plupart des cas, il est possible de reconnaître une microfilaire par sa
taille et sa forme générale.

La recherche des microfilaires sanguicoles peut être également


pratiquée après enrichissement, si l'examen d'une goutte épaisse n'a pas donné
de résultat positif.

Méthode d'enrichissement

Prélever 1 ml de sang veineux dans une seringue de 2 ml. Dès la fin


du prélèvement, laisser tomber le sang goutte à goutte dans un tube à
centrifuger contenant 10 ml de réactif hémolysant. Homogénéiser et centrifuger
à 2.500 tours par minute pendant 5 minutes. Ecarter le surnageant en le versant
avec précaution. Emulsionner le culot dans le liquide restant. Le prélever avec
pipette de Pasteur et l'examiner entre lame et lamelle.
Les microfilaires sont colorées en bleu violet.

Solution utilisée
Formol à 40 % ........................... …………….5 ml
Acide acétique glacial .................. …………. ..5 ml
Sol. Saturée de violet gentiane dans l'alcool...2 ml
Eau distillée ad ...................... ……………… ...100 ml

La même recherche peut être pratiquée sur sang veineux rendu incoagulable
par le citrate ou Titriplex.
Cours de Biologie Clinique | 347
Cours de Biologie Clinique | 348

Les Microfilaires sanguicoles

1° Wuchereria Bancrofti (W.B) éléphantisias (Kwango).

- Nocturne
- Grande microfilaire, 244 à 296 microns, diamètre, 7 microns.
- Avec gaine.
- Pas de noyau terminal
- Courbes régulières, gracieuses.

2° Loa Loa (L.L.) Oedèmes fugaces, durs et douloureux ; sous-dermiques.

- Diurne
- Grande microfilaire, 250 à 300 microns, diamètre 7 microns.
- Avec gaine.
- Noyau terminal
- Aspect raide avec courbure en tôle ondulée.

3° Achantocheilonema Perstans ou Dipetalonema Perstans (A.P) :

Partout au Zaïre, asymptomatique : prurit, oedèmes fugaces asthme,


éosinophiles, etc.

- Diurne et nocturne
- Petite microfilaire, 150 microns, diamètre 4 microns
- Sans gaine
- Noyau terminal
- Pelotonnée sur elle-même.

Les microfilaires dermiques

On peut les observer dans les frottis de sérosité obtenus par


scarification dermique.

1° Onchocerca volvulus (O.V):


- onchocercose (Kasaï - Sankuru
- Uelé, Bas-Zaïre, Inga).
On peut recueillir une sérosité contenant les microfilaires par scarification
dermique, au voisinage d'un nodule d'onchocercose ; ou par dilacération d'une
filaire adulte femelle après excision ou encore par ponction à l'aiguille d'un
nodule.

- 150 à 350 microns


Cours de Biologie Clinique | 349
- Pas de noyau terminal.

2° Achantocheilonema Strepocerca (A.S)

Asymptomatique (similidoe damnosum et naevei).


- 180 à 240 microns
- Noyau terminal
- Extrémité caudale incurvée.

Trypanosomes

Les trypanosomes se reconnaissent aisément par leur forme allongée


(10 à 30 microns), leur membrane ondulante, la flagelle qui la prolonge, leur
noyau et kinétonucléus. En cas de découverte d'un trypanosome en goutte
épaisse, il convient de faire un examen à frais d'une gouttelette de dans étalée
en couche très mince entre lame et lamelle, pour repérer les trypanosomes dans
leurs déplacements et ainsi apprécier l'importance de l'infection. Il convient
également de préparer un étalement à colorer par le May-Grünwald.

Borrelia

Les Borrelia sont des spirochètes sanguicoles, d'environ 10 à 15


microns de long sur 0,2 micron d'épaisseur, avec 3 à 8 ondulations. L'examen à
frais d'une gouttelette de sang entre lame et lamelle permet d'observer leurs
mouvements par le déplacement des érythrocytes. L'observation au fond noir
les montre se déplaçant vivement dans le plasma, sans leurs spirales. A la
goutte épaisse, sont colorés en rouge pourpre.
Cours de Biologie Clinique | 350
E ORGANISATIONS INTERNATIONALES INTERESSEES
PAR L’ETABLISSEMENT D’UNE NOMENCLATURE EN CHIMIE
CLINIQUE

OMS (WHO) : Organisation Mondiale de la Santé ;

OIN (ISO) : Organisation Internationale de Normalisation ;

UICPA (IUPAC) : Union Internationale de Chimie Pure et Appliquée.

UIPPA (IUPAP) : Union Internationale de Physique Pure et


Appliquée

UIB (IUB) : Union Internationale de Biochimie.

CISH (ICSH) : Conseil International de Standardisation en


Hématologie.

FICC (IFCC) : Fédération Internationale de Chimie Clinique

AMSP (WASP) : Association Mondiale des Sociétés de Pathologie.

NCCLS : National Comitee for Clinical Laboratory


Standards, 1991
Cours de Biologie Clinique | 351

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