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La microscopie

électronique

Faculté des Sciences, de la technologie et de la


communication - Bachelor BASV 1
TP BASV
semestre 1
Séance 3

La microscopie
électronique
Champ d’utilisation des microscopes
Suivant la dimension des échantillons à observer, il convient de choisir l’un ou
l’autre microscope suivant la limite de résolution de chacun.

Petites molécules
Atomes Macromolécules Cellules Organismes multicellulaires

Glucose Ribosome Bactérie C. elegans Nouveau né


Liaison C-C Hémoglobine Mitochondrie Globule rouge Drosophile

Microscope optique
Microscope électronique
Microscope AFM
Microscope à effet tunnel
Comparaison entre le microscope optique et électronique

Le microscope électronique est beaucoup plus récent que le MO.


Le premier ME a été construit en 1931, et il s'est répandu à partir des années 60.

La résolution d'un microscope électronique peut atteindre 2 angströms (= 0,2 nm


= 2.10 -10 m), mais généralement les meilleurs microscopes atteignent
20 angströms seulement (= 2 nm)

Le principe de fonctionnement d'un microscope électronique ressemble un


peu à celui d'un microscope optique:
- la lampe est remplacée par une cathode chauffée qui envoie un
faisceau d'électrons (à la place des photons) de relativement haute énergie dans
une enceinte sous vide
-les lentilles de verre sont remplacées par des bobines
électromagnétiques.
Composition du microscope électronique
2 types de microscopes électroniques

Les électrons
traversent la
préparation.
Pulvérisation d’or
ou de platine sur
L’image est l’échantillon.
formée par les
Déflecteur qui
électrons
permet le balayage.
primaires.

L’image est formée


par les électrons
secondaires et les
électrons
rétrodiffusés.
Microscope électronique en transmission

Le MET est basé sur l'émission de flux


d'électrons qui traversent la
préparation et donnent ainsi une
image de la structure en 2 dimensions.

Echantillon
Il est très utilisé pour obtenir des
Electrons déviés
images d'organites ou de cellules.

C'est celui qui donne la plus grande


résolution.
Microscope électronique en transmission
Suivant la densité de l’échantillon, les
électrons qui le traversent sont plus ou
moins déviés.

Echantillon
Electrons déviés

Les électrons fortement déviés n’atteignent


pas l’écran fluorescent.

 Les régions de l’échantillon plus denses


apparaissent en noir.
Microscope électronique en transmission

L’image est formée par les électrons, appelés


électrons primaires sur un écran fluorescent qui
permet l’orientation.

Une image finale est obtenue en exposant une


plaque photographique au flux d’électron

ou un phosphore de haute résolution couplé,


par de la fibre optique à une caméra.
Microscope électronique à balayage

Au niveau du MEB, il existe 2 faisceaux d’électrons qui se


déplacent de manière synchrone permettent de reconstituer
une image de surface de la coupe (ou de l'objet/animal étudié)
en 3 dimensions.

 Grâce à la diffusion ou l'émission d'électrons par la coupe


uniformément recouverte d'une couche de métal lourd, l'image
traduit le relief de cette couche.

La résolution est beaucoup


plus faible (10 nm).
Microscope électronique à balayage

 En microscopie électronique à balayage,


les électrons ne traversant pas l’échantillon.
Ce dernier subit une vaporisation d’un métal lourd
(or ou platine) à sa surface, propice à l’observation
microscopique.
Microscope électronique à balayage

Les électrons primaires, en arrivant sur l’échantillon


vont libérer des électrons secondaires, et des
électrons rétro-diffusés, qui sont analysés par
différents détecteurs .
Le nombre d’électrons secondaires varie suivant
l’angle d’incidence du faisceau.

Plus l’angle est rasant, plus le volume excité est


grand et plus la production d’électrons secondaires
est importante.
Microscope électronique à balayage
Le canon à électron

Elément de base du microscope pour arriver à l’accélération des électrons.


Deux types de canons peuvent être distingués: le canon thermoélectronique et le canon à émission de
champ (FEG).
Le canon thermoélectronique est constitué de trois éléments:
le filament (cathode), le Wehnelt et l’anode.

Les électrons sont extraits du filament, portés à une


certaine température, passent par le Wehnelt puis se
retrouvent attirés par l’anode.

Le Wehnelt possède un potentiel plus négatif (le Bias)


que la cathode ce qui permet de contrôler l’émission du
canon

Le Bias
Le canon à électron
Les canons thermoélectroniques peuvent avoir trois types de filaments:
tungstène (W), hexaborure de Lanthane (LaB6) et hexaborure de cerium (CeB6)

W LaB6

L’accélération principale des électrons est due à la haute tension


positive de l’anode.

Sur les microscopes de 200 kV ou plus, l’accélération ne peut pas se


faire en une seule étape.
Au delà de 150 kV, des accélérateurs contenant plusieurs étages
d’accélération augmentent la tension. Cette augmentation est de 40 kV
par étage.
La longueur d’onde du faisceau d’électrons

La tension appliquée au microscope électronique détermine la longueur d’onde des électrons,


et ainsi le pouvoir de résolution de l’appareil.

La relation entre la longueur d’onde d’une particule de masse m, se déplaçant avec une vitesse v,
est donnée par l’équation de De Broglie:

h λ = longueur d’onde
λ =
m*v h = constante de Plank

La vitesse d’un électron pouvant être exprimé par l’ équation de son énergie cinétique

1 2*e*U
m*v2 = e*U soit v=
2 m

h 1 h2
En substituant dans l’équation de De Broglie λ = * =
m 2*e*U 2*m*e*U
m
Comme 1 joule = 107 cm2.g/sec2 on obtient l’équation suivante

150 150
λ = Å en cas de tension élevé λ = Å
U U + 10-6*U2
La longueur d’onde du faisceau d’électrons

h
λ= λ = longueur d’onde
m*v
h = constante de Plank = 6,62 , 10-34 J

m = 9,1.10 -31 kg

e = 1,6,10-19 Coulomb
La résolution du microscope électronique

Le pouvoir de résolution est une propriété de l’instrument.


Cette valeur est absolue et théorique.
La résolution sera toujours égale ou inférieure au pouvoir de résolution.
La valeur réelle va dépendre des conditions expérimentales.
 Avec des échantillons biologiques (fragiles aux électrons), la résolution que l’on obtient peut être
considérablement inférieure au pouvoir de résolution de l’instrument.

La résolution des images de microscopie électronique est généralement limitée non pas par le pouvoir de
résolution de l’instrument mais par le contraste.
Le pouvoir de résolution des microscopes électroniques est, le plus couramment, de l’ordre de 0,2-0,3 nm,
alors que, pour la plupart des échantillons biologiques, la limite de résolution est de l’ordre de 1 à 5 nm.

Le contraste des images dépend de la nature et de l’intensité des interactions qui ont lieu entre le faisceau
d’électrons et l’échantillon.
La résolution du microscope électronique
La résolution du microscope électronique
Les aberrations des lentilles électromagnétiques

Tout comme en microscopie optique, le faisceau d’électron traversant les lentilles électromagnétiques est
sujet à toutes sortes d’aberrations:
- Les aberrations sphériques
- Les aberrations chromatiques
- Les comas
- Les astigmatismes
- Les distorsions
- Les aberrations de charge d’espace

L’aberration sphérique

De manière similaire au système optique, les électrons traversant la lentille


sur l’extérieur du faisceau sont d’avantage déviés que les électrons
traversant la lentille en son intérieur. Ces aberrations sont corrigées par la
forme des pièces polaires.

L’aberration chromatique

En optique la distance focale change avec la couleur, c’est à dire avec la


longueur d’onde. En microscopie électronique il est de même, les électrons
ne sortent pas du canon à la même vitesse. Les plus lents ont un point focal
proche de la lentille, les plus rapides auront un point focal plus éloigné.
Préparation de l’échantillon

Avant de procéder à l’observation microscopique, il convient d’appliquer divers traitements sur


l’échantillon afin d’obtenir une image avec un bon contraste.

La préparation de l’échantillon est similaire à celle


d’une observation au microscope optique.

Toutefois la qualité de la préparation doit être


supérieure pour une observation au microscope
électronique, un artefact étant beaucoup plus
visible.

De manière chronologique il convient de:


- fixer
- post-fixation

- déshydrater

- inclure

- couper en coupe extrêmement fine

- contraster
La fixation de l’échantillon

La fixation consiste à tuer la cellule sans en altérer la structure de façon significative.


Elle doit éviter toute déformation et garder l’arrangement cellulaire aussi proche du réel.

Il existe deux types de fixation: Fixation chimique


Fixation physique

La fixation chimique crée des liaisons entre les molécules existantes. Cela consiste à former un pontage
chimique, un échafaudage qui va consolider les structures.

En microscopie électronique, sont principalement utilisés deux fixateurs:

- les aldéhydes

- le tétroxyde d’osmium (OsO4)

(- le permanganate de potassium (KMnO4))


La fixation de l’échantillon

Le permanganate de potassium

Très utilisé dans les années 60-70, permet la fixation des lipides et de ce fait préserve bien certaines
membranes cellulaires. Cependant, les particules cytoplasmique ayant un contenu élevé en ARN
sont mal conservées. De plus, la fixation des chromosomes n’est pas satisfaisante.

Le tétroxyde d’osmium

Le tétroxyde d’osmium agit sur les doubles liaisons insaturées. Il aura une action ciblée sur la
membrane mais aussi sur certaines chaînes latérales des acides aminés (histidine, lysine, cystéine et
méthionine) entraînant une gélification des protéines.

O O O O
Os Os
Lipide insaturé O O
O O

O O O O
Os Os
O O O O

Le tétroxyde d’osmium est un métal lourd qui est également utilisé pour donner du
contraste à l’image
La fixation de l’échantillon

Les aldéhydes

Trois différents aldéhydes sont utilisés comme fixateur en microscopie électronique, le formaldéhyde,
l’acroléine et le glutaraldéhyde.
H H H H
H O
O O O
H H C
2 H H
H H H
H

Formaldéhyde Acroléine Glutaraldéhyde

Le formaldéhyde possède un pouvoir fixant moins fort (fixateur doux) que le glutaraldéhyde. Il
permet la liaison de deux protéines par leurs groupements amines en réduisant sa double liaison.
H H H H
O + R NH2 H
R NH OH + R’ NH2 R NH NH R’ +
H Protéine H H O
Protéine

Le glutaraldéhyde (fixateur énergétique) possède deux groupements réactifs. Il permet la liaison de


deux groupements amines.
R
NH2 + O O + H2N R’ R N N H H
R’ + 2
H H H H O
Protéine Glutaraldéhyde Protéine
La déshydratation et l’inclusion

Les échantillons sont observés sous la forme de coupes.


Les coupes devant être extrêmement fine (50-100 nm).
Il est donc important d’inclure les échantillons dans une résine pour les rendre résistants.

De manière générale, les résines d’inclusion sont hydrophobiques est nécessite une étape de
déshydratation de l’échantillon.

La déshydratation de l’échantillon est obtenue par bains successifs dans des solutions de
concentration croissante d’éthanol ou d’acétone.

La déshydratation est finalisée par un bain dans une substance apolaire tel que l’oxyde de propylène.
La déshydratation et l’inclusion

Pour obtenir une bonne qualité de coupe, l’inclusion de l’échantillon doit se faire au plus profond du
tissus.

Une résine apolaire, diluée dans un milieu de transition apolaire et volatile, va pénétrer
progressivement dans l’échantillon.

L’échantillon va passer dans des solutions de concentrations croissantes en résine jusqu’à ce qu’il
soit dans la résine non diluée.

Cette résine contenant l’échantillon est alors placée dans un petit support
(capsule de gélatine) pour débuter la polymérisation et rendre la résine
extrêmement rigide.

La polymérisation de la résine peut être induite par la chaleur d’une étuve, par
des micro-ondes ou par une réaction catalytique sous un rayonnement UV.

Exemple de résines: - méthacrylate


- résines époxy et polyester
- acrylates
- polyéthylène glycol
Exemple de protocole d’inclusion
L'ultra microtomie

Après inclusion le bloque de résine est taillé de sorte à limiter la résistance


mécanique durant la coupe.

La surface en contact avec la lame est rendue aussi petite que possible,
la taille se faisant en pyramide autour de l’échantillon.

Le bloc de résine taillé est alors placé sur le porte-échantillon de l’ultra-microtome


L'ultra microtomie

La résine est coupée à l’aide de lame de verre ou de diamant


contenant un réservoir d’eau permettant de récupérer les coupes

Les coupes sont collectées avec les grilles porte-objet et placer sur le porte-échantillon pour
l’observation microscopique
L'ultra microtomie
L'ultra microtomie
0.1 mm
La « coloration » en microscopie électronique

La « coloration » en microscopie électronique revient à augmenter le


contraste entre les différentes structures.
La « coloration » positive
But:
Cette technique permet de renforcer le contraste des préparations (coupes ultraminces
ou particules dispersées) d’échantillon transparents aux électrons, d’échantillons ne
comportant que des éléments légers (C,H,O,N) tels que les polymères et les matériaux
biologiques qui ne sont pas directement observables.

Cette technique est une post-préparation qui vient en complément des préparations de
lames minces et s’effectue sur un échantillon déjà déposé sur une grille support.

Méthode:
C’est une addition chimique de métaux lourds sur ou dans l’échantillon comportant des
sites réactifs tels que double liaison, pont éthylénique, méthylénique, terminaison alcool
ou aldéhyde.

Ex: acétate d’uranyle se fixe surtout sur les protéines et acides nucléiques, alors que
les sels de plomb se fixent sur les lipides

Action:
Elle se fait par réaction chimique d’oxyde ou des sels de métaux lourds.
La « coloration » positive
La « coloration » positive
Procédures:

Pour les coupes ultraminces de matériaux biologiques inclus dans une résine époxy on pratique le
plus souvent un double contraste faisant intervenir d’abord un sel d’uranium et ensuite un sel de
plomb. L’acétate d’uranyle est mis en solution à une concentration proche de la saturation de 0,5 à 9
% selon le solvant utilisé (eau, éthanol, méthanol). Les solutions les plus concentrées étant les plus
contrastantes.
La grille est mise en contact avec la solution pendant 5 minutes à plusieurs heures à température
ambiante ou à chaud (jusqu’à 60°C). Dès que le laps de temps choisi est atteint, la grille est
immédiatement rincée par un courant de solvant correspondant, puis à l’eau. Plusieurs rinçages sont
nécessaires pour éliminer toutes traces du contrastant non chimiquement liées aux structures. La
grille est ensuite laissée séchée quelques heures à une nuit avant d’entreprendre le 2ème contraste.
La deuxième solution utilisée est un sel de citrate de plomb obtenu par réaction de nitrate de plomb
et de citrate de sodium en solution aqueuse à pH voisin de 12. Le contraste est réalisé dans une
enceinte close (boîte de Pétri plastique) contenant des pastilles de soude pour assurer une
atmosphère sèche et basique, dépourvue de CO2. Les grilles, côté coupes, sont déposées sur des
gouttes de la suspension de contrastant pendant un temps court de 1 à 5 minutes. La grille est
ensuite rincée par un courant d’eau distillée, puis laissée séchée avant d’être observée.

Pour les particules en suspension le contraste est pratiqué immédiatement après avoir effectué la
dilution et le dépôt (voir 4.1) et avant séchage complet de la grille support. Cette dernière est
retournée sur une goutte de suspension d’uranyle, pendant 1 à 5 minutes avant d’être rincée comme
précédemment. Le contraste au plomb se fera toujours sur une grille sèche.
La « coloration » positive

Conclusion:

C’est une technique de routine pour les matériaux biologiques qui s’emploie aussi pour les
polymères.
Elle permet dans ce cas de différencier les polymères insaturés de ceux qui le sont et de définir
des phases différentes dans un polymère complexe.

Pour les matériaux biologiques les mêmes atomes lourds -osmium, uranium- peuvent être
utilisées pour la fixation chimique, le contraste négatif et le contraste positif. La différence
proviendra essentiellement du temps de réaction : plusieurs heures pour la fixation, quelques
minutes à 1h pour le contraste positif, (suivi d’un rinçage) et quelques dizaines de secondes pour
le contraste négatif (sans rinçage).
Appareil de golgi
et mitochondries
sans contraste
positif.
Appareil de Golgi et
mitochondries après
contraste positif
uranyle/plomb
La « coloration » négative

But

Cette technique consiste à renforcer le contraste d’un échantillon trop fin ou trop transparent aux
électrons pour être visualisé directement.

Méthode

Elle consiste à entourer l’échantillon d’un corps chimique dense aux électrons, ce qui permettra
d’observer les structures en clair sur fond noir.

Action

Elle est réalisée par un dépôt homogène d’une solution saline comportant un élément chimique
lourd (tungstène, uranyle, molybdate…) par ex acide phosphotungstique. Il n’y a pas de réaction
chimique spécifique entre l’échantillon et le produit déposé.

Matériaux

Cette technique s’applique à des matériaux divisés, de petites tailles, dispersés, constitués
d’éléments légers (C,O,H,N…). Elle est très utilisée pour les polymères et les matériaux
biologiques.
La « coloration » négative
La « coloration » négative

Bactériophage
La « coloration » négative

Adénovirus.
La technique d’ombrage
But

Cette technique permet de renforcer le contraste d’un échantillon très faiblement


contrasté.

Méthode

La technique consiste à déposer des particules de métaux lourds (Z élevé) sur


ou autour de l’échantillon. Le contraste de celui-ci est renforcé par un
phénomène d’ombre portée, résultant du dépôt de film métallique.

Action

Le dépôt de très faible épaisseur est réalisé par évaporation de platine, d’or, de
chrome, ou de tungstène.

Matériaux

Cette technique s’applique à des matériaux constitués d’éléments légers, divisés


ou en monocouche, en particulier des polymères, des matériaux biologiques et
des matériaux mixtes-composites.
La technique d’ombrage
La technique d’ombrage

Avantages

Cette technique permet l’étude d’échantillons divisés de très petites tailles sans contraste
comme les macromolécules.

Elle permet de voir leur conformation spatiale après étalement.

Elle est particulièrement performante pour les structures fibrillaires ou en réseau.

Elle permet une reconstruction d’image 3D.

Elle est également très intéressante pour mettre en évidence les cristaux bidimensionnels.

Elle permet de mesurer l’épaisseur de particules, ou la hauteur de marches atomiques de


croissance cristalline.
La technique d’ombrage

filament d’ADN déroulé


Comparaison coloration
négative / ombrage
La cryofracture

La cryofracture est une technique qui permet l’étude de la membrane et des


protéines membranaires (intrinsèques ou extrinsèques).

La fracture passe par des zones de moindre résistance


= au milieu de la bicouche lipidique.

Cette technique est basée sur une fixation physique de l’échantillon: congélation de l’échantillon en
présence d’un cryoprotecteur (saccharose, glycérol, DMSO,…) évitant la formation de cristaux de glace.
La cryofracture

Une fois la fracture réalisée, l’échantillon subit une étape d’ombrage par
vaporisation d’un métal lourd (ou platine) avec une incidence de 45°
La cryofracture
La cryofracture
La cryofracture

Bordure en brosse d'une cellule épithéliale de tubule proximal de rein

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La surface de fracture a été ombrée par des vapeurs métalliques opaques aux électrons
et l'ensemble recouvert d'une couche résistante de carbone transparente aux
électrons. Les structures vivantes sont ensuite détruites et seule la réplique
(moulage) est observée en microscopie électronique à transmission. On observe à
gauche le noyau et les pores nucléaires, au centre du réticulum endoplasmique et à
droite la membrane plasmique avec des vésicules de sécrétion
Le cryodécapage
Le cryodécapage permet d’observer les surfaces externes des cellules et de leurs
membranes.
Les cellules sont aussi congelées dans l’azote liquide, puis fracturées. Puis le niveau de
glace est abaissé autour des cellules par la sublimation dans le vide (=lyophilisation).
Il y a ensuite vaporisation de platine par exemple (=ombrage)
Le cryodécapage
Nomenclature en cryofracture ou cryodécapage
En cryofracture ou cryodécapage une nomenclature internationale a été instaurée pour l’interprétation des
clichés microscopique.
Face ES (surface)

Couche E (exoplasmique) Couche E

Face EF (face)

Face PF (face)

Couche P (protoplasmique) Couche P

Face PS (surface)
Cytoplasme

Couche E
Couche P
Nomenclature en cryofracture ou cryodécapage
Nomenclature en cryofracture ou cryodécapage
En résumé…
Microscopie photonique Microscopie électronique
Les microscopes

Microscope électronique Microscope électronique Microscope électronique à


en transmission (TEM) à balayage (SEM) balayage environnemental
(ESEM)

Microscope à Force Microscope à effet tunnel


Atomique (AFM) (STM)
Le microscope à effet tunnel.

Il s'agit du dernier né de la microscopie (inventé en 1981).

C'est également un microscope électronique, il donne des images


tridimensionnelles d'une surface.

Toutefois, si le MET et le MEB sont basés sur un bombardement d'électrons


qui étaient déviés, ce microscope exploite une "théorie" de la physique
quantique, l'effet tunnel.

Si on approche une fine aiguille métallique sous tension d'une surface à


quelques angströms, des électrons vont passer de l'aiguille à la surface
même s'ils n'ont pas l'énergie nécessaire. La quantité d'électrons qui passent
dépend de la distance entre celle-ci et l'aiguille, plus elle est grande moins
d'électrons passent.

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