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LES ANALYSES A HAUT DEBIT

(Génome, Transcriptome,
Protéome, Interactome)

Bérénice SCHAERLINGER
URAFPA Equipe DAC
DEFINITIONS
Génome
Ensemble du matériel génétique d’un
organisme comprenant les parties codantes
et non codantes y compris le matériel
génétique des organites.

Il peut être haploïde, diploïde ou polyploïde.

Génomique
Discipline visant à étudier le fonctionnement
d’un organisme à travers son génome.

Génomique structurale
 Génomique fonctionnelle

Source: google image


DEFINITIONS

Génomique fonctionnelle
Etude de la régulation des gènes, de leurs
fonctions et interactions.
Elle peut être faite à deux échelles:

Transcriptome
Ensemble des transcrits présents dans des
cellules appartenant à un tissu donné et
dans un contexte physiologique ou
environnemental donné.

Protéome
Ensemble des protéines présentes dans
des cellules appartenant à un tissu donné
et dans un contexte physiologique ou
environnemental donné.

Source: google image


AUGMENTATION DE LA COMPLEXITE LIEE
AU NIVEAU D’ANALYSE

Source: cours B. Charpentier


DEFINITIONS

Métabolome
Ensemble des produits des réactions
enzymatiques (métabolites) dans des cellules
appartenant à un tissu donné et dans un
contexte physiologique ou environnemental
donné.

Détection de petites molécules < 1000 Da


(toxicologie).

Interactome
Ensemble des interactions
moléculaires (protéines-protéines,
ADN-protéines etc…).

Source: google image


DEFINITIONS
Les -- omiques --
Techniques permettant d’étudier simultanément l’ensemble d’une
catégorie de constituants de cellules appartenant à un tissu donné et
dans un contexte physiologique ou environnemental donné.

Génomique structurale
Séquençage systématique
Bioinformatique (cartographie, annotation)
Techniques de localisation des gènes

Transcriptomique
Hybridation sur des matrices (arrays)
ou des puces (chips).
Génomique Séquençage à haut débit
fonctionnelle
Protéomique
Electrophorèse 2D, 2D-DIGE
Spectrométrie de masse
DEFINITIONS
Les -- omiques --

Métabolomique Interactomique
Spectrométrie infra-rouge, Co-purification
Spectrométrie de masse, Spectrométrie de masse,
RMN Crible et analyse double hybride

 Etudes à large échelles qui donnent des résultats


globaux

 Ces résultats servent souvent de bases à des


études plus ciblées.
La transcriptomique
Contrôle qualité des ARNs

ARNms correspondent à 1-3% des ARNs totaux extraits


(ARNr représentent 80% des ARNs totaux, principalement
le 28s et 18s)

-
+

Migration de l’échantillon

Electrophorèse capillaire

Source: life technologies


La transcriptomique
Contrôle qualité des ARNs

18s 28s

Source: Quiagen
La transcriptomique
Contrôle qualité des ARNs

Identification de problèmes de qualité des ARNs

Source: life technologies


La transcriptomique
Analyse par microarray
Préparation des échantillons

5’ 3’ ARNm 3’ 5’ ADNc

Polymérisation
Transcription inverse
d’un brin d’ADN
Dégradation de l’ARNm
5’ 3’ ARNm 5’ 3’ ADN
Amorce 3’ 5’ ADNc
ADNc
Transcription
de l’ARNc

5’ 3’ ARNm 3’ 5’ ARNc
3’ 5’ ADNc
La transcriptomique
Analyse par microarray
Préparation des échantillons

Longueurs d’ondes: Longueurs d’ondes:


-Excitation 550nm -Excitation 649nm
-Emission570nm -Emission670nm

Source: B. Charpentier, UL
La transcriptomique
Analyse par microarray
Préparation des puces

Surface de verre de 1-2 cm²


1 cellule= 11x11µm
107 Amorces/cellules
4.105 à 1,5.106 sondes /puces

Technique Affymetrix
= Photolithographie

Source: B. Charpentier, UL
La transcriptomique
Analyse par microarray
Préparation des puces

Amorces = 25mer

Source: D. Puthier (Université de Marseille), Université de l’Utah, fastol


La transcriptomique
Analyse par microarray
Principe de la technique

Les ARNc produits s’hybrident aux sondes liées à la plaque de verre.


Indication quantitative du niveau d’expression des transcrits.
Indication qualitative de la nature des transcrits.

Source: P.Descombes (Université de Genève)


La transcriptomique
Analyse par microarray
Principe de la technique

Source: B. Charpentier, UL; D. Puthier (Université de Marseille)


La transcriptomique
Analyse par microarray
Comment analyser les résultats obtenus

Quel seuil de variation choisir ?


Combien d’échantillons choisir ?
Problèmes liés à la variabilité individuelle des échantillons ?
Problèmes liés à des variabilités techniques ?
Source: Université de Boston, D. Puthier (Université de Marseille)
La transcriptomique
Analyse par microarray
Comment analyser les résultats obtenus

Source: D. Puthier (Université de Marseille)


Analyse par microarray
Exemple
Signification des résultats
Classification selon la nature des
échantillons
(sain vs malade, condition
physiologique, microdissection
virtuelle)

Classification selon le profil


d’expression des transcrits
(fonction cellulaire, processus
moléculaire…)

 Possibilité d’inclure des


échantillons de référence

Source: Université de Nagoya


Une brève histoire du séquençage

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Les premiers séquençage du génome:
Shotgun sequencing

Source: B. Charpentier, UL
Le séquençage à haut débit

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Le séquençage à haut débit

Source: B. Charpentier, UL
Le séquençage à haut débit
Par amplification d’ADN
Préparation des banques d’ADN

PCR en émulsion Amplification sur


phase solide
« Polony »

Séquençage Pyroséquençage Séquençage par Séquençage par


semi conducteur (454) ligation cycles
(Ion torrent) (SOLID) (Illumina)
La préparation des échantillons

GENOMIQUE STRUCTURALE TRANSCRIPTOMIQUE


5’ 3’ ARNm

Transcription inverse
Traitement Rnase
Polymérisation du 2ème
Clivage des brins brin d’ADN

5’ 3’ ADN
3’ 5’ ADNc

Clivage des brins


La préparation des échantillons

Groupement phosphate

Phosphorylation des extrémités 5’

Ajout d’une extension A en 3’

ADN à séquencer
A
A Adaptateur 1 Adaptateur 2

Ligation des
adaptateurs

Source: Illumina technology


La préparation des échantillons

ADN à séquencer

Adaptateur 1 Adaptateur 2

Source: Illumina technology


Le séquençage à haut débit
Par amplification d’ADN
Préparation des banques d’ADN

PCR en émulsion Amplification sur


phase solide
« Polony »

Séquençage Pyroséquençage Séquençage par Séquençage par


semi conducteur (454) ligation cycles
(Ion torrent) (SOLID) (Illumina)
La PCR en émulsion
La PCR en émulsion

Seulement 15% des microréacteurs


conduisent à une amplification
correcte

Une bille contient des milliers de


copies de l’ADN à amplifier

Jusqu’à 300 000 réaction en parallèle

Pontage chimique sur une lame de


verre recouverte de groupements
Immobilisation des billes amines

Dans des puits


individuels

Source: B. Charpentier, UL
Le séquençage à haut débit
Par amplification d’ADN
Préparation des banques d’ADN

PCR en émulsion Amplification PCR


par pont
« Polony »

Séquençage Pyroséquençage Séquençage par Séquençage par


semi conducteur (454) ligation cycles
(Ion torrent) (SOLID) (Illumina)
Amplification de PCR par pont
= amplification en phase solide

Source: Université d’Uppsala


Amplification de PCR par pont
= amplification en phase solide

Source: Université d’Uppsala


Amplification de PCR par pont
= amplification en phase solide

Flow chip
Résultat d’amplification dans une ligne
Il existe des millions de clusters

Source: MIT review; Illumina technology


Séquençage par détection de proton
Le séquençage à haut débit
Par amplification d’ADN
Préparation des banques d’ADN

PCR en émulsion Amplification PCR


par pont
« Polony »

Séquençage Pyroséquençage Séquençage par Séquençage par


par détection de (454) ligation cycles
proton (SOLID) (Illumina)
(Ion torrent)
Séquençage par détection de
proton

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Le séquençage à haut débit
Par amplification d’ADN
Préparation des banques d’ADN

PCR en émulsion Amplification PCR


par pont
« Polony »

Séquençage Pyroséquençage Séquençage par Séquençage par


semi conducteur (454) ligation cycles
(Ion torrent) (SOLID) (Illumina)
Le pyroséquençage

= Adenosine 5’ phosphosulfate

Source: A.Vierstraete (Université de Gand); B. Charpentier UL


Le séquençage à haut débit
Par amplification d’ADN
Préparation des banques d’ADN

PCR en émulsion Amplification PCR


par pont
« Polony »

Séquençage Pyroséquençage Séquençage par Séquençage par


semi conducteur (454) ligation cycles
(Ion torrent) (SOLID) (Illumina)
Le séquençage par ligation

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Le séquençage par ligation

1er run

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Le séquençage par ligation
Le séquençage par ligation

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Le séquençage par ligation

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Le séquençage par ligation

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Le séquençage par ligation

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Le séquençage par ligation

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Le séquençage par ligation

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Le séquençage par ligation
2nd run

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Le séquençage par ligation

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Le séquençage par ligation

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Le séquençage par ligation

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Le séquençage par ligation

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Le séquençage par ligation

3ème run

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Le séquençage par ligation

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Le séquençage par ligation

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Le séquençage par ligation

4ème run

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Le séquençage par ligation

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Le séquençage par ligation

5ème run

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Le séquençage par ligation

Source: A.Vierstraete (Université de Gand


Le séquençage par ligation

Source: A.Vierstraete (Université de Gand


Le séquençage à haut débit
Par amplification d’ADN
Préparation des banques d’ADN

PCR en émulsion Amplification PCR


par pont
« Polony »

Séquençage Pyroséquençage Séquençage par Séquençage par


semi conducteur (454) ligation cycles
(Ion torrent) (SOLID) (Illumina)
Séquençage par cycles

Source: B. Charpentier, UL
Le séquençage à haut débit

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Préparation de la banque d’ADN
(Hélicos)

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Séquençage par cycles

Avantages:

Préparation plus facile des échantillons


Pas d’erreurs de PCR
Contaminations plus faibles
Analyse de tous les échantillons
possible
Quantification absolue
Séquençage direct des ARNS

Source: A.Vierstraete (Université de Gand)


Séquenceur 3ème
génération
Biosciences

Helicos

AN (matrice)
Adaptateur

Non

Synthèse

8jrs
35000
35

97

Source: B. Charpentier, UL
Reference: Gullapalli et al. 2012
Bilan sur les méthodes
transcriptomiques
Pourquoi faire de la transcriptomique ?

Recherche de « biomarqueurs » d’une condition physiologique


(maladie, pollution, contrôle qualité).

Etude de l’effet d’un traitement.

Comment traiter les données ?

Prendre des gènes selon des critères scientifiques et étudier plus


particulièrement leur rôle, expression… dans le contexte
physiologique.

Faire ressortir des signatures moléculaires d’un état physiologique.

Comprendre les liens entre des fonctions biologiques.


Analyse de Gene Ontology
Analyse bioinformatique visant à structurer la description des gènes
indépendamment de l’espèce d’origine.

Chaque gène est qualifié selon sa localisation intracellulaire, sa


fonction moléculaire et le processus cellulaire dans lequel il est impliqué.

Source: Gene ontology consortium


Cas particuliers

Source: B. Charpentier UL
Cas particuliers
Les tilling arrays

Source: HR Chung
Cas particuliers
Les tilling arrays

Source: HR Chung
Cas particuliers
Les tilling arrays

Source: B. Charpentier UL; David et al., PNAS 2006