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Détection du nouveau coronavirus (SARS-CoV-

2) responsable de COVID-19 par la PCR en


temps réel

D R M A MAN I S S AKA
L A BORATOIRE D E B I OLOGIE M O LE CU LA IRE
I N S TITU T N AT ION AL D ’ HYGIE NE, LO M E- TOGO
Principe de la PCR en temps réel
Détection de covid-19

•PCR en temps réel

•Type mutiplexe

•3 couples d’amorces (2 gènes et un contrôle interne)


Stratégie national de détection de covid-19 (Togo)

Screening avec le gene E/N:


Détection SARS et le COVID-19 virus
(Coronavirus en general)

Confirmation avec le gene


RdRP/ORF1ab : SRAS-CoV-2 (covid-
19)
Méthodes d’extraction d’ARN

Manuelle avec différents kits:

➢QIAGEN, QIAmp Viral RNA Minikit (250 test)

➢DaAnGene Nucleic Acid Isolation or Purification


Reagent (48 tests)
Principe de l’extraction par les colonnes

•Lyse cellulaire: solution AVL et carrier RNA

•Déprotéinisation: Protéinase K

•Précipitation par alcool absolu

•Passage sur les colonnes de résine


Principe de l’extraction par les colonnes

•Lavage

•Elution

•Extraits ARN conservés à -80°C


Méthodes d’amplification et de détection de
covid-19
➢TIB Mol Biol Kit for LightMix® SarbecoV E-gene plus EAV control TIB
and Modular Wuhan CoV RdRP-gene : E-gene ; RdRp-gene et IC

➢DaAnGene Detection Kit for 2019 Novel Coronavirus (2019-nCoV) RNA


(PCR-Fluorescence Probing): N-gene ; ORF1ab-gene et IC

➢Sansure Biotech for 2019-nCoV PCR Fluorescence Probing Kit: N-gene ;


ORF1ab-gene et IC (internal control)
Préparation du mélange réactionnel (Master mix)
Réactifs Volume n=1 µl Volume n= (n+2) µl
Réactifs A 13
Réactifs B 2
Total 15
ARN 10

•Réactif A = Amorces (gènes E/N; RdRp/ORF1ab; IC); dNTPS,


Mg2+

•Réactif B = Transcriptase inverse et Taq Ploymerase


Programme d’amplification

Etapes Température Temps Cycles Observation


Rétrotranscription 50°C 30 minutes 1 ARN en ADNc
Dénaturation initiale 95°C 1 minute 1
Dénaturation 95°C 15 secondes

Hybridation 60°C 30 secondes 45 Collecte de la


fluorescence

Collecte de la fluorescence se fait à l’étape 60°C-30secondes


Thermocycleurs utilisés
Courbes d’amplification