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17• Hémoculture

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Plan du chapitre 2• Objectifs


1• Contextes
2• Objectifs 1- Réaliser un prélèvement de qualité
1-Réaliser un prélèvement de qualité
2-Choisir des conditions de culture appropriées C'est le préalable essentiel à tout examen de bacté-
3-Détecter précocement la croissance bactérienne riologie. Le prélèvement de sang pour hémoculture
4- Effectuer des investigations spécifiques doit satisfaire à plusieurs critères ou exigences.
5- Interpréter les résultats * Eviter les contaminants et travailler en
sécurité
• L'antisepsie de la peau doit se faire successi-
1• Contextes
vement avec de l'alcool à 70 % puis un pro-
Le sang est normalement stérile. Un état septicé- duit iodé, teinture d'iode ou polyvidone
mique ou plus généralement un "état infectieux iodée. Une a deux minutes de contact sont
grave", se caractérise par un passage répété de nécessaires pour obtenir l'effet antiseptique
microbes dans le sang. Toute fièvre d'origine indé- maximal de la polyvidone iodée. L'activité
terminée, surtout si elle est accompagnée de signes bactéricide de la teinture d'iode est plus rapi-
cliniques évocateurs d'infection, doit donner lieu à de que celle de la polyvidone iodée. Après la
la pratique d'hémocultures. Bates, en 1990, a propo- ponction veineuse le produit iodé potentiel-
sé des critères prédictifs de bactériémies. lement irritant est enlevé avec de l'alcool
à 70 %.
Tableau 1 : Prédiction de la bactériémie • La désinfection du capuchon du flacon d'hé-
d’après Bates moculture est réalisé avec de l'alcool à 70 %
Score ≥ 6 : fort risque de bactériémie ; ou un produit iodé que l'on laisse sécher
score ≤ 2 : faible risque avant usage.
Facteur de prédiction Points • La ponction veineuse est la seule méthode
Température maximale > 38°3 C 3 fiable pour prélever du sang en vue de la cul-
Maladie rapidement fatale 4 ture. Les autres sites de prélèvement notam-
Maladie terminale 2 ment les recueils de sang par cathéter aug-
Présence de frissons 3 mentent de façon significative la fréquence
Toxicomanie par voie veineuse 4
des contaminants.
Abdomen chirurgical 3
Facteur de comorbidité majeur a 3 • La pratique des prélèvements pour hémocul-
a Coma ou mort cérébrale, perforation digestive, multi- ture expose le préleveur à des risques liés au
traumatisé ou brûlé, arrêt cardio-respiratoire dans les sang du malade. La transmission des virus
24 heures, pancréatite aiguë, détresse respiratoire, des hépatites, en particulier hépatite C
insuffisance hépatique aiguë ou chronique (VHC) est le risque le plus important avant le
VIH.
Il convient de choisir des techniques de détection
sensibles et spécifiques, permettant la croissance de * Prélever une quantité de sang suffisante
micro-organismes à culture délicate, donnant des La densité des bactéries présentes dans le sang
résultats rapides et sûres à manipuler pour le person- est généralement très faible chez l'adulte. Une
nel. Que l'on utilise les méthodes visuelles clas- quantification faite par centrifugation-lyse
siques ou un automate pour détecter la positivité des (Isolator) au cours de bactériémies significatives
flacons d'hémocultures, un certain nombre de para- a montré que la densité bactérienne était infé-
mètres doivent être pris en considération. rieure à 1 UFC/ml dans des pourcentages impor-
tants d'épisodes. Il existe une relation directe
entre le volume de sang inoculé dans les flacons
d'hémoculture et le rendement de la technique.
Un volume de 20 ml de sang prélevé augmente
le pourcentage de positivité de 30%, comparati-
vement à un volume de 10 ml qui est le mini-
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mum souhaitable chez l'adulte. De la même ment, lysozyme, cellules phagocytaires et des
façon l'augmentation du volume de sang inoculé antibiotiques dans environ un tiers des cas. La
dans les flacons augmente la sensibilité de la dilution du sang dans le bouillon atténue l'effet
détection de la positivité par un automate. de ces substances. La dilution au 1/10 est celle
Chez l'enfant, la densité des bactéries dans le qui donne le meilleur résultat. Cependant une
sang est plus importante que chez l'adulte. Ainsi, dilution inférieure, jusqu'à 1/5, est encore pos-
un prélèvement de 1 à 2 ml est considéré comme sible. Quant à une dilution supérieure à 1/10, elle
satisfaisant. Ce volume peut être accru en fonc- est sans inconvénients sinon de réduire la quanti-
tion de l'âge. té de sang inoculé. Au total, plus grand est le
volume de bouillon dans le flacon, meilleur est
* Effectuer le nombre de prélèvements néces-
l'effet de dilution. Utiliser des flacons contenant
saires
un plus petit volume de bouillon pour les hémo-
Si l'on excepte les infections du système vascu- cultures de pédiatrie n'apporte pas d'avantage
laire, particulièrement les endocardites bacté- significatif.
riennes, au cours desquelles la bactériémie est
➥ Le polyanéthol sulfonate de sodium (SPS)
permanente, au cours des autres situations cli-
niques, la bactériémie peut être soit transitoire, C'est l'anticoagulant très généralement utilisé
soit intermittente. dans les bouillons pour hémoculture à une
concentration de 0,025 à 0,05 %. Le SPS favori-
Plusieurs auteurs ont analysé le nombre d'hémo-
se la croissance de la plupart des bactéries car il
cultures nécessaires pour détecter la totalité des
inhibe l'activité bactéricide du sérum, il inhibe la
épisodes bactériémiques.
phagocytose, il inactive le complément, neutrali-
Il faut en conclure que 3 ou même 2 hémocul- se le lysozyme et les antibiotiques de la famille
tures par 24 heures sont suffisantes pour isoler la des aminosides.
totalité des bactéries ou des levures responsables
Néanmoins, le SPS peut avoir un effet inhibiteur
d'épisodes bactériémiques.
sur certaines souches de Neisseria, de
Un espace de temps de 30 à 60 minutes entre Peptostreptococcus anaerobius ou de
deux prélèvements de sang a été recommandé. Streptobacillus moniliformis. Il est donc préfé-
rable d'utiliser une concentration de 0,025 % de
2- Choisir des conditions
de culture appropriées SPS. L'addition de gélatine à la concentration de
1,2 % peut neutraliser l'effet inhibiteur du SPS.
➥ Aérobiose-Anaérobiose ➥ Neutralisation des antibiotiques
Il est classique pour une même hémoculture Des résines adsorbeuses de cations ou le charbon
d'ensemencer un jeu de deux flacons, l'un incubé activé ont un certain effet neutralisant des anti-
en aérobiose, l'autre en anaérobiose. Considérant biotiques .
la diminution importante de la fréquence des
Une mesure utile et, semble-t-il, peu souvent
bactéries anaérobies, la question de savoir s'il est
prise en considération est de réaliser les prélève-
opportun de continuer à utiliser systématique-
ments pour hémocultures, "à la vallée", à distan-
ment des flacons anaérobies est aujourd'hui
ce de l'administration des antibiotiques.
posée. Il n'y a pas de réponse univoque. Il est
probable que cela puisse être possible dans cer- 3- Détecter précocement la croissance
tains services, mais pas dans d'autres comme la bactérienne
chirurgie gynécologique ou colo-rectale. De
plus, certaines bactéries aéro-anaérobies comme ➥ Durée d'incubation des flacons d'hémocul-
les Streptocoques et Entérocoques se dévelop- tures
pent plus rapidement en anaérobiose. Enfin, l'uti- Une incubation à l'étuve à 35°C pendant 7 jours
lisation de deux flacons permet de doubler le est suffisante en routine. Avec les automates une
volume de sang inoculé ce qui accroît la sensibi- durée de 5 jours a été validée. Au delà de ce délai
lité de l'hémoculture. les bactéries détectées sont généralement des
➥ Dilution du sang contaminants qui étaient présents en faible quan-
tité dans le prélèvement.
Le sang des malades contient de nombreuses
substances à activité antibactérienne : complé- Un temps d'incubation plus long peut être néces-
saire pour des micro-organismes particuliers :
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champignons, bactéries du groupe HACEK, chocolat incubée en aérobiose à 35°C est


Brucella ou Legionella ou encore pour des parfois recommandé mais peu réalisable ;
patients suspects d'endocardite et dont les prélè- • les systèmes diphasiques permettent la
vements ont été réalisés alors que le malade rece- croissance précoce de colonies sur le
vait des antibiotiques. milieu gélosé. Ceci est intéressant pour les
➥ Méthodes conventionnelles espèces bactériennes à croissance délicate ;
© Examen macroscopique des flacons • le système Signal utilise un seul flacon sur
Chaque jour ou mieux deux fois par jour, les lequel est adapté un dispositif permettant
flacons sont inspectés en vue de rechercher de signaler la surpression produite dans le
des signes témoignant d'une croissance flacon par la croissance microbienne.
visible. Avec une certaine habitude il est pos- © La centrifugation-lyse : le système Isolator
sible en fonction de l'aspect d'un flacon de Ce système permet de recueillir 8 à 10 ml de
pressentir l'identité de la bactérie en cause sang et de concentrer les micro-organismes
(Tableau 2). Il est à signaler que certaines avant d'ensemencer les milieux gélosés adap-
bactéries comme les Neisseria, les tés à la croissance de ces micro-organismes.
Haemophilus et les Campylobacter troublent La solution présente dans le tube contient de
peu ou pas le bouillon de culture et que l'usa- la saponine pour lyser les leucocytes et les
ge d'un flacon diphasique s'avère utile pour érythrocytes, du polypropylèneglycol pour
ces espèces. éviter la formation de mousse due à la sapo-
Tableau 2 : Orientation présomptive nine et du SPS comme anticoagulant.
de la bactérie responsable en fonction Après centrifugation du tube dans un rotor à
de l’aspect du flacon d’hémoculture angle fixe de 35° pendant 30 minutes à
Signe observé Bactérie en cause 3 000 g, le surnageant est éliminé et le
concentré est homogénéisé au vortex puis
Turbidité Bacilles à Gram négatif aérobies
Staphylocoque, Bacteroides
ensemencé sur différents milieux gélosés
Hémolyse Streptocoque, Staphylocoque appropriés. Isolator 1,5 est le même système
Listeria, Clostridium, Bacillus sans étape de centrifugation. Pratiqué avec
Production de gaz Bacilles à Gram négatif aérobies des tubes de 1,5 ml, il est utilisable en pédia-
anaérobies trie.
Coagulum Staphylococcus aureus Le système Isolator est très performant pour
l'isolement des micro-organismes suivants :
© Amélioration de la précocité et de la sensi- mycobactéries, levures à croissance difficile
bilité de la détection de la croissance bac- et champignons filamenteux, bactéries exi-
térienne geantes (HACEK, Bartonella, Legionella).
Plusieurs procédés ont pour objectif d'amé- Le système Isolator permet en outre de quan-
liorer la précocité et la sensibilité de la détec- tifier la bactériémie, ce qui serait utile pour
tion de la croissance bactérienne : mettre en évidence une infection sur cathéter.
• l'agitation des flacons aérobies pendant les Ce système a cependant quelques inconvé-
premières 24 heures d'incubation accélère nients. Le risque de contamination lors des
la croissance bactérienne, mais elle est dif- manipulations oblige à travailler sous hotte,
ficile à mettre en pratique si l'on ne dispo- mais surtout c'est une méthode manuelle très
se pas d'un automate ; consommatrice du temps du manipulateur, ce
• l'aération des flacons aérobies avec un dis- qui est un facteur limitant.
positif adapté favorise la croissance des ➥ Méthodes de détection automatisées
Pseudomonas ; © Les quatre systèmes commer cialisés
• la détection précoce de la croissance en actuellement en France (tableau 3)
pratiquant un examen direct au microscope • Ces systèmes ont des caractéristiques com-
du bouillon de culture avec de l'acridine munes dont les principales sont les suivantes :
orange est une technique rarement utilisée ;
- Pas de maintenance quotidienne.
• lke repiquage systématique précoce (entre
- Détection automatique des positifs.
6 et 72 h) du flacon anaérobie sur gélose
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Tableau 3 : Caractéristiques des automates actuellement commercialisés en France


Type Principe Nbre de lectur e Volume de bouillon
de détection quotidienne par flacon
Bactec 9240 mesure non invasive toutes les 10 mn 25 ml
de CO 2 par fluorescence
Vital mesure de variation toutes les 15 mn 40 ml
CO2 - H 2 et/ou pH
par fluorescence
BacT/Alert mesure du CO 2 toutes les 10 mn 40 ml
par «sensor»
indicateur de pH
Bio Argos mesure du CO 2 programmé 8 à 2 25 ml
par infra-rouge
à travers le verr e

- Détection des flacons pré-incubés. elle-même mesurée par une photodiode.


- Gestion des données. • Vital
- Connexion bi-directionnelle possible. Dans les flacons se trouve une molécule fluo-
- Statistiques et sauvegarde. rescente à l'état natif qui voit sa fluorescence
s'éteindre en présence de phénomènes biolo-
- Télémaintenance possible.
giques produits par la croissance bactérienne.
Le principe de détection de ces quatre auto- C'est la technique HFT (Homogenous
mates est la mesure directe ou indirecte du Fluorescence Technology). Cette molécule
CO2 produit dans les flacons. fluorescente n'est pas seulement sensible au
• Bio Argos CO2, la croissance est aussi détectée par
Cet appareil mesure la production de CO2 à variation du pH et modification du potentiel
travers le verre par spectrophotométrie. Pour d'oxydo-réduction. Chaque flacon dispose de
des raisons de coût, chaque appareil n'est sa propre cellule de lecture équipée d'une
équipé que d'une seule cellule de lecture. Le diode d'excitation émettant une lumière
dosage du CO 2 se fait après transfert du fla- verte. La lumière rouge émise est filtrée et
con vers un plateau de lecture. La mesure du transmise par une fibre optique vers un
CO2 est prise "à la volée" pendant trois compteur de photons.
secondes pendant la rotation du flacon. L'évaluation de ces systèmes a donné lieu à
• BacT/Alert de nombreuses études. La Société Française
de Microbiologie a formulé des recomman-
Le principe est d'incorporer dans chaque fla-
dations visant à prévenir les nombreux biais
con un détecteur colorimétrique" CO2 sen-
qui peuvent se rencontrer dans les travaux
sor" de coloration verte. Le sensor est séparé
visant à évaluer ces automates.
du bouillon par une membrane semi-per-
méable qui ne laisse passer que le CO2. La 4- Effectuer des investigations spécifiques
production du CO2 entraîne une diminution
du pH et le sensor devient jaune. Le virage de ➥ Recherche de mycobactéries
couleur est interprété par réflectométrie, Mycobacterium avium-intracellulare (complexe
chaque lecture compare la variation de cou- MAC) est la mycobactérie la plus fréquemment
leur à la précédente, chaque flacon dispose rencontrée au cours du Sida. Le diagnostic de
de sa propre cellule de lecture. l'infection repose sur la mise en évidence de la
• Bactec 9240 bactérie par hémocultures ou accessoirement
Le principe est également basé sur l'existence dans la moelle osseuse ou des prélèvements
d'un sensor sensible aux variations de pH. Le biopsiques. D'autres mycobactéries, plus rares,
CO2 produit abaisse le pH, cette décroissance M. kansasii ou M. tuberculosis peuvent être iso-
est mesurée par une coloration fluorescente lées d'hémocultures dans ce contexte.
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Plusieurs méthodes sont appropriées pour détec- tement. Elles peuvent nécessiter une incu-
ter les mycobactéries par hémocultures. Se bation des flacons d'au moins 14 jours, ce
reporter au chapitre consacré aux Mycobactéries. qui est supérieur à la durée usuelle de l'in-
➥ Autres micro-organismes cubation des flacons placés dans un auto-
mate.
Les méthodes destinées à cultiver des micro-
organismes ayant des exigences nutritives parti- • Streptocoques déficients (Abiotrophia) -
culières doivent être mises en œuvre sur des cri- Certaines souches de streptocoques du
tères cliniques rigoureux. groupe viridans exigent du pyridoxal pour
leur croissance. Ces souches peuvent être
© Bactéries à croissance lente et/ou difficile trouvées comme responsables de bactérié-
D'une façon générale, il apparaît que les mies ou d'endocardites. Elles se caractéri-
méthodes de détection automatisées de la sent par une croissance en bouillon et une
croissance bactérienne sont plus rapides que absence de croissance en milieu gélosé. Le
les méthodes conventionnelles mais elles ne besoin en pyridoxal est mis en évidence par
sont pas plus sensibles que la méthode la croissance sur gélose au sang additionnée
Isolator. Ces bactéries à croissance lente de 0,001 % de pyridoxal ou par un test de
et/ou difficile exigent pour leur culture des satellitisme autour d'une strie de S. aureus.
conditions particulières. Elles peuvent être
• Bartonella (Rochalimaea) - Ces bactéries
détectables par des automates. Nous résu-
retirées de l'ordre des Rickettsiales sont
mons ci-dessous les données concernant la
responsables de bactériémies, d'angioma-
culture de ces bactéries.
toses et de pélioses bacillaires chez des
• Brucella - Certaines souches sont exi- malades infectés par le VIH. Leur culture
geantes en CO2. Le sang est inoculé en sur milieu acellulaire est lente et délicate.
flacon diphasique type Castaneda, incubé Le culot d'un tube Isolator est ensemencé
6 semaines à 37°C. Les subcultures se sur gélose au sang de lapin ou de mouton
feront sur gélose Trypticase Soja addition- incubée en atmosphère de 5 % de CO2
née de 5% de sérum de boeuf ou sur pendant 6 semaines. La PCR est particuliè-
Brucella agar- incubée en atmosphère de rement intéressante pour des bactéries qui
5 % de CO 2. mettent plusieurs semaines pour donner
• Campylobacter - Culture à 37°C en micro- des colonies.
aérophilie dans une atmosphère de © Endocardites à hémocultures négatives
5 % de CO2 sur milieu de Skirrow, Butzler
Des procédures recommandées pour le dia-
ou Karmali incubés 72 heures.
gnostic étiologique des endocardites infec-
• Legionella - Culture sur milieu BCYE tieuses ont été publiées par l'Association
incubé à 37°C en atmosphère enrichie de pour l'Etude et la Prévention de l'Endocardite
5% de CO2. Observation pendant 10 jours. Infectieuse. Elles sont reproduites plus loin.
• Mycoplasme - Ureaplasma - Culture en Au cours des endocardites infectieuses, les
bouillon PPLO ou gélose A3 incubé en hémocultures peuvent rester négatives dans
micro-aérophilie à 37°C et observé 3 jours. plus de 10 % des cas, même si elles sont pré-
• Leptospira - Recueil du sang sur tube levées avant toute antibiothérapie. Une étude
hépariné et ensemencement en tubes de nationale a montré l'intérêt dans ces situa-
milieu Tween-Albumine ou EMJH incubés tions de rechercher la preuve sérologique
à 30°C à l'obscurité. Observation hebdo- d'une infection à Chlamydia ou à Coxiella
madaire des cultures au microscope à fond burnetii. Cependant l'existence de réactions
noir pendant deux mois. sérologiques croisées entre Chlamydia et
• Groupe HACEK - Haemophilus aphro - Bartonella a été décrite.
philus, Actinobacillus actinomycetemco - La responsabilité de Bartonella
mitans, Cardiobacterium hominis, (Rochalimaea) dans les endocardites qui, il y
Eikenella corrodens et Kingella kingae a peu, auraient été considérées comme
sont des espèces responsables d'endocar- "à hémocultures négatives" a été mise en évi-
dites bactériennes qui se développent len- dence récemment.
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Une autre cause d'endocardites à hémocul- encore trop souvent négatives dans les infec-
tures négatives pourrait être la courte durée tions fongiques disséminées.
usuelle (5 à 7 jours) d'incubation des flacons Les milieux biphasiques sont classiquement
dans les automates. Cette durée est probable- considérés comme les meilleurs pour la
ment insuffisante pour détecter toutes les croissance des champignons. Le milieu
souches à croissance lente et difficile. Aussi "Brain Heart Infusion" (BHI) apparaît
il conviendrait que le biologiste soit systéma- comme le meilleur pour la détection des
tiquement informé de toute suspicion d'endo- levures.
cardite infectieuse de façon à prolonger le Le développement des automates a constitué
temps d'incubation des flacons de ces un progrès par rapport aux procédés tradi-
malades ou procéder à des repiquages de ces tionnels de détection des fongémies. Mais
flacons. c'est aussi l'adaptation des milieux à la crois-
© Levures et moisissures sance fongique qui a considérablement amé-
Les champignons sont de plus en plus fré- lioré la rapidité de détection des fongémies et
quemment responsables d'infections nosoco- la fréquence d'isolement des champignons
miales et communautaires. Les facteurs de (tout particulièrement des levures) dans l'hé-
moculture.
prédisposition des patients concernés sont :
l'immunodépression, l'utilisation d'antibio- Le milieu Bactec Fungal Medium améliore
tiques à large spectre, de cathéters veineux la sensibilité de détection de la croissance
centraux, en particulier pour l'administration des espèces difficiles (C. neoformans, C. gla -
brata, Fusarium, Penicillium marneffei et
de solutions d'hyperalimentation. Les résul-
autres champignons filamenteux). Ce milieu
tats récents indiquent que la détection des
comporte du chloramphénicol et de la tobra-
fongémies constituent un des examens-clés
mycine, inhibant la croissance des bactéries
du diagnostic des mycoses invasives, comme habituellement retrouvées au cours des septi-
les candidoses. cémies bactério-fongiques, ainsi qu'un agent
Bien qu'il existe peu d'études incluant un lytique conduisant au relargage des champi-
nombre suffisant d'isolats fongiques permet- gnons endocellulaires.
tant de l'affirmer, il y a toutes les raisons de Le système Isolator de lyse-centrifugation
penser que les facteurs critiques influençant est aujourd'hui la meilleure méthode de
la détection des bactériémies, jouent égale- détection des fongémies, en particulier pour
ment un rôle décisif pour la mise en éviden- la mise en évidence de Histoplasma capsula -
ce des fongémies. Ainsi, la répétition des pré- tum et de Cryptococcus neofomans. Il
lèvements, le volume de sang mis en culture convient également au diagnostic des fongé-
par rapport au volume de milieu, la formula- mies à Malassezia furfur, aux fusarioses et
tion du milieu et les conditions d'incubation pénicillioses.
(aération, température et durée) sont des fac- Le choix d'un procédé et d'un milieu d'hémo-
teurs influençant l'efficacité des hémocul- culture doit prendre en compte différents élé-
tures. La température optimale de culture ments, tels que la taille du laboratoire, la pro-
varie de 27°C à 30°C pour les champignons portion et le nombre de malades à risques.
filamenteux, à 37°C pour les levures. De Ainsi, il est nécessaire de rappeler que les
même, la durée d'incubation est variable, de Candida spp. restent des espèces fongiques
2 à 3 jours pour la plupart des levures, à 3 à majoritairement retrouvées, et de loin, en
6 semaines pour les champignons dimor- pathologie fongique. Pour ces espèces, les
phiques. A noter que parmi les levures, différents systèmes d'hémoculture (conven-
Crytococcus neoformans, Candida glabrata tionnels, Bactec ou Isolator) présentent des
et Candida krusei demandent généralement efficacités sensiblement équivalentes.
une incubation plus prolongée pour être
détectés que Candida albicans, Candida tro - 5- Interpréter les résultats
picalis ou Candida parapsilosis. Néanmoins,
malgré l'optimisation de ces variables dans Les données épidémiologiques montrent que
les meilleures méthodes d'hémoculture Staphylococcus aureus et Escherichia coli sont les
actuellement en usage, ces dernières restent deux espèces les plus souvent isolées en situation de
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pathogénicité. La fréquence d'isolement des Bibliographie


Staphylocoques à coagulase négative (SCN) s'est
BATES D.W., COOK F., GOLDMAN L., LEE T.H. -
accrue considérablement au cours des deux dernières Predicting bacteremia in hospitalized patients. A
décennies, mais seulement 10 à 20 % de ces isolats prospective validated model. Ann. Intern. Med. 1990
ont une signification clinique. La majorité des SCN ; 113 : 495-500.
isolés par hémoculture sont des contaminants, ce qui BEEBE J.L., KONEMAN E.W. - Recovery of uncom-
pose parfois des problèmes difficiles d'interprétation. mon bacteria from blood : association with neoplas-
tic disease. Clin. Microbiol. Rev. 1995 ; 8 : 336-5.
D'autres micro-organismes ont vu leur fréquence
d'isolement par hémocultures s'accroître : BISMUTH M., COURCOL R. - Les automates d'hé-
mocultures en 1994. La Lettre de l'infectiologue 1994
Enterococcus, Levures, Mycobactéries. En ; 9 : 423-31.
revanche, la fréquence d'isolement des bactéries MAINARDI J.L., VANDENESCH F., CASALTA J.P., et
anaérobies reste faible notamment chez les enfants. al. Recommandations pour le diagnostic microbiolo-
L'identification des micro-organismes isolés par gique et l'étude anatomopathologique des valves
cardiaques au cours des endocardites infectieuses.
hémoculture permet de préjuger de leur signification
Bull. Soc. Fr. Microbiol. 1995 ; 10 : 12-5.
clinique. S. aureus, E. coli, les Enterobacteriaceae,
MATHIEU D., NGUYEN J., GRENIER B., VERON M.
P. aeruginosa et Candida albicans sont en situation - Recommandations pour l'évaluation des automates
de pathogénicité dans plus de 90 % des cas. Au pour hémocultures. Bull. Soc. Fr. Microbiol. 1994 ;
contraire, les Bacillus, Corynebacterium et 9 : 179-83.
Propionibacterium sont responsables de bactérié- MERMEL L.A., MALI G. - Detection of bacteremia in
mies significatives dans moins de 5 % des cas. Le adults : consequences of culturing an inadequate
problème se complique avec les Streptocoques du volume of blood. Ann. Intern. Med. 1993 ; 119 : 270-
2
groupe viridans, les Enterococcus et les SCN.
REIMER L.G., WILSON M.L., WEINSTEIN M.P. -
Pour attribuer une signification clinique à une hémo- Update on detection of bacteremia and fungemia.
culture il est dangereux de se baser sur le fait que les Clin. Microbiol. Rev. 1997 ; 10 : 445-65.
deux flacons (aérobie et anaérobie) ou seulement l'un WEINSTEIN M.P. - Current blood culture methods
des flacons est positif. En effet, des études de corré- and systems : clinical concepts, technology and
lations clinico-biologiques ont montré que dans la interpretation of results. Clin. Infect. Dis. 1996 ; 23 :
moitié des cas pour les pathogènes et le tiers des cas 40-6.
pour les contaminants, il y a croissance dans les deux WEINSTEIN M.P., TOWNS M.L., QUARTEY S.M. et
al. - The clinical significance of positive blood cul-
flacons, alors que 49 % des pathogènes et 68 % des tures in the 1990s : a prospective comprehensive
contaminants ne poussent que dans un seul flacon. evaluation of the microbiology, epidemiology and
En pratique, la signification clinique d'un micro- outcome of bacteremia and fungemia in adults. Clin.
organisme isolé par hémoculture est d'autant plus Infect. Dis. 1997 ; 24 : 584-602.
probable qu'il sera retrouvé dans des prélèvements
successifs. C'est répéter que la réalisation d'une seule
hémoculture isolement est insuffisante, car elle sera
d'interprétation difficile puisque la majorité des
micro-organismes isolés sont des opportunistes et
non des bactéries pathogènes spécifiques.
En conclusion, la variété des micro-organismes pou-
vant être trouvés dans le sang s'est accrue à mesure
que la proportion de malades immunodéprimés aug-
mentait. Les espèces en cause sont nombreuses et ont
des exigences nutritives variées qui font que le
milieu de culture universel n'existe pas. Le choix des
espèces à rechercher et donc le choix du milieu de
culture repose donc sur les données probabilistes,
donc sur des critères cliniques.
90 17• Hémoculture

Annexe ➥ Nombre et type d’hémocultures


* En l’absence de traitement antibiotique dans
Recommandations pour le diagnostic les jours précédents, il est recommandé de
microbiologique et l’étude réaliser une première série de trois hémocul-
anatomo-pathologique des valves cardiaques tures dans un intervalle de 24 heures, le
au cours des endocardites infectieuses temps minimum espaçant deux hémocultures
Microbiologistes : Mainardi J.L., Vandenesch F., devant être d'une heure. Compte tenu des
Casalta J.P., N'Guyen J., Benoît C., Tissot-Dupont risques de contamination, les hémocultures
H., Maugein J., Weber M., Bouvet A., Etienne J. ne doivent pas être prélevées au travers d'un
Anatomopathologistes : Loire R., Vissuzaine C., cathéter. Le même protocole est proposé
Bruneval P. pour les enfants.
Association pour l'Etude et la Prévention de * Le lendemain, si ces hémocultures demeu-
l'Endocardite Infectieuse. CHU Bichat-Claude rent stériles, il est recommandé d'effectuer
Bernard. 46, rue Henri Huchard. 75877 Paris deux à trois autres hémocultures en diversi-
Cedex 18. fiant les milieux et les techniques pour favo-
riser la croissance de micro-organismes plus
Les procédures recommandées pour l'amélioration
exigeants. Ainsi, le système de lyse-centrifu-
du diagnostic étiologique des endocardites infec-
gation "Du Pont Isolator" (Merck Clevenot)
tieuses concernent les examens suivants :
permet à la fois de libérer des micro-orga-
- les hémocultures sur milieux usuels aéro- et nismes intra-cellulaires, de les concentrer et
anaérobie qui sont pratiquées dans tous les cas. de les ensemencer sur des milieux plus per-
Elles permettent en effet la multiplication de la formants. Ce système est indiqué pour l'iso-
plupart des souches de streptocoques, staphylo- lement des levures, des champignons et de
coques et entérocoques responsables de la majo- bactéries à croissance difficile comme
rité des cas d'endocardites infectieuses ; Bartonella (ex-Rochalimea). Pour la
- les hémocultures sur milieux spéciaux qui sont recherche des bactéries pathogènes intra-cel-
recommandées pour la détection de micro-orga- lulaires comme Coxiella burnetii, deux tubes
nismes plus exigeants ou à développement intra- de sang (10 ml) prélevés sur héparine peu-
cellulaire ; vent être confiés au Centre de Référence des
- les examens sérologiques qui peuvent compléter Rickettsies de Marseille. L'acheminement
ces recherches ; pourra être réalisé à température ambiante
- enfin les techniques microbiologiques et anato- par courrier rapide.
mopathologiques d'étude des valves cardiaques * Si le malade a reçu des antibiotiques, l'usage
et des prothèses. des milieux contenant des résines absor-
bantes est recommandé.
1- Hémocultures ➥ Volume
Il existe lors des endocardites infectieuses une bacté- Environ 7 à 10 ml de sang veineux dans chaque
riémie constante qui permet de réaliser des hémocul- flacon pour 70 à 100 ml de bouillon, soit 14 à
tures quelle que soit la température du patient. Pour 20 ml de sang par hémoculture. En fait, le volu-
améliorer la fréquence des isolements bactériens lors me de sang ensemencé dans chaque flacon doit
des endocardites infectieuses, il apparaît particuliè- correspondre à 10% du volume du milieu sauf
rement important d'adresser les hémocultures au indication contraire du fabricant.
laboratoire de bactériologie avec les informations ➥ Milieux
cliniques pertinentes : porte d'entrée supposée de
* Hémocultures conventionnelles ou système
l'agent pathogène, caractéristiques cliniques et évo-
automatisé : pour chaque hémoculture, un
lutives de la maladie, permettant de choisir les tech-
flacon pour culture aérobie et un flacon pour
niques de culture les mieux adaptées aux micro-
culture anaérobie doivent être ensemencés.
organismes suspectés.
Les milieux utilisés doivent permettre l’iso-
lement des bactéries les plus souvent respon-
sables d’endocardites (streptocoques, entéro-
coques et staphylocoques). Ils doivent conte-
17• Hémoculture 91

nir de l’hémine et du nicotinamide-adénine- milieu gélosé Columbia supplémenté par


dinucléotide qui favorisent la croissance des 5 % de sang de mouton pour la recherche des
germes du groupe HACCEK des radicaux streptocoques. Une strie de staphylocoque
thiols apportés par exemple par la L-cystéine permet de visualiser les colonies satellites de
utiles à la croissance de certains strepto- Streptococcus adjacens et de S. defectivus.
coques déficients (Streptococcus adjacens et L'incubation est réalisée pendant 2 à 5 jours
S. defectivus) et aussi des Legionella, ainsi sous CO2 pour les milieux de repiquages des
qu'un certain nombre de vitamines, comme la flacons aérobies et en anaérobiose pour ceux
vitamine B6 sous forme de pyridoxal et la des flacons anaérobies. Enfin une sub-cultu-
vitamine K3. re sur un milieu liquide peut être proposée,
* En cas d'utilisation des systèmes de type par exemple sur milieu coeur-cervelle, de
Isolator, les culots de centrifugation peuvent Todd-Hewitt enrichi en chlorhydrate de pyri-
être ensemencés rapidement sur des milieux doxal (10 mg/ml), ou de Rosenow.
adaptés aux bactéries les plus exigeantes - au septième jour d'incubation, une colora-
comme certaines souches de streptocoques, tion de Gram et des sub-cultures peuvent être
de Lactobacillus, ou de Campylobacter, en réalisées sur des milieux gélosés "chocolat-
incubant les milieux dans les atmosphères isovitalex" pour permettre la croissance des
appropriées. La culture de Bartonella sur bactéries du groupe HACCEK ; l'incubation
milieu acellulaire peut être obtenue en ense- est réalisée pendant 5 jours sous 5-10% de
mençant la totalité d'un tube Isolator sur des CO2 ou en anaérobiose selon le flacon d'ori-
milieu gélosés "chocolat isovitalex" et en gine.
incubant ces milieux à 30°C en atmosphère L'intérêt d'une sub-culture à la fin de la période
humide contenant 5% de CO2. Le système d'incubation n'est pas démontré.
Isolator présente par ailleurs un intérêt pour
la culture de la plupart des levures : le milieu 2- Sérologies bactériennes et fongiques
de Sabouraud (utilisé en tube et sans visser
Si les hémocultures sont négatives après 3 jours d’in-
complètement le bouchon) peut être conser-
cubation, il est recommandé de faire les examens
vé plusieurs semaines permettant la culture
sérologiques suivants :
des champignons à croissance lente. Dans
des contextes particuliers, comme ceux évo- - Chlamydia psittaci, C. pneumoniae, C. trachomatis
cateurs de tuberculose ou de légionellose, - Brucella
l'ensemencement de milieux spéciaux, préci- - Legionella
sés au chapitre des valves, est recommandé.
- Mycoplasma pneumoniae
➥ Température
- Bartonella (ex-Rochalimea)
La température d'incubation des flacons doit être
- Candida (voire selon le contexte Aspergillus,
de 35-37°C.
Histoplasma). Pour la détection des anticorps vis
➥ Durée d’incubation à vis de Candida ou Aspergillus il est recomman-
Elle doit être prolongée pendant quatre semaines, dé d'utiliser deux techniques utilisant des prin-
y compris en cas d'utilisation d'un système auto- cipes différents : une technique de précipitation
matisé d'hémocultures. Dans ce dernier cas, il (électrosynérèse, immuno-électrophorèse) et une
pourra être nécessaire de ré-enregistrer les fla- technique de type IF ou ELISA. Par ailleurs, la
cons d'hémocultures. détection d'antigène circulant par méthode immu-
➥ Coloration de Gram et sub-cultures nologique est réalisée par certains laboratoires.
En cas d’hémocultures négatives, que l'on utilise - Coxiella burnetii. Concernant cette sérologie, il
ou non un système automatisé d'hémocultures, il est nécessaire de déterminer par immunofluores-
est recommandé de réaliser cence les titres des anticorps contre les antigènes
de phase I et de phase II. En cas d'endocardite de
- dès le troisième jour d'incubation, une
la fièvre Q, le taux d'anticorps contre l'antigène
coloration de Gram et une sub-culture des
de phase I est supérieur à 800 en IgG. Des infor-
flacons aérobies et anaérobies sur milieu
mations complémentaires peuvent être données
gélosé "chocolat-isovitalex" pour la culture
par le Centre de Référence des Rickettsies.
des bactéries du groupe HACEK et sur
92 17• Hémoculture

3- Techniques d'études 5. Ensemencement et durée d’incubation des


des valves cardiaques milieux suivants :
➥ Prélèvement * milieu gélosé "chocolat" additionné d'iso-
vitalex incubé sous 5 % de CO2 pendant
En per-opératoire, aucun tamponnement d’anti-
10 jours. Un tel milieu résiste beaucoup
septique ne doit être effectué sur la valve car-
mieux à la dessiccation s'il est utilisé sous
diaque. La valve sera recueillie dans un pot stéri-
forme de milieu gélosé en pente dans un
le ne contenant aucun liquide et doit parvenir en
tube. Autrement, pour éviter le dessèche-
totalité au laboratoire de Bactériologie.
ment des milieux gélosés, il est préférable
➥ Analyse au laboratoire de Bactériologie d'utiliser un système de jarre dont le fond
1. A l’arrivée en bactériologie, la valve est est recouvert de papier absorbant humidi-
déposée dans un mortier stérile sur un champ fié ; l'enrichissement en CO2 peut être réa-
stérile ou dans une boite de Pétri stérile (faci- lisé au moyen d'une bougie ou d'un systè-
lite l'observation). L'opérateur porte un me Gaspak.
masque et travaille de préférence sous hotte. L'incubation doit être réalisée à 37°C, mais
Il faut repérer les différents types de lésion une seconde boîte identique ou un milieu
comme les perforations, calcifications ou gélosé au sang doit être ensemencé et incu-
végétations. La formation des techniciens de bée sous 5 % de CO2 pendant 45 jours
laboratoire pour apprendre à reconnaître les entre 28 et 32°C pour favoriser la crois-
lésions peut se faire avec les anatomopatho- sance de Bartonella.
logistes ou les chirurgiens. Une description * deux milieux gélosés à 5% de sang incubés
écrite ou dessinée de la valve peut être pro- l'un sous O2, l'autre sous CO2 pendant
posée, voire une photographie. 10 jours permet une meilleure croissance
2. La valve doit être coupée au niveau de la des streptocoques par rapport aux milieux
végétation. Un fragment est destiné à l’ana- gélosés chocolats. L'apport de CO2 favori-
tomopathologie, l’autre à la bactériologie. se la croissance de Streptococcus mutans,
3. Sur le fragment de végétation destiné à l’ana- S. anginosus et S. constellatus.
tomopathologie et avant son envoi, il est * milieu gélosé "Columbia" contenant 5 %
recommandé de réaliser trois empreintes sur de sang et incubé sous H2 pendant 10 jours
lames. Les lames sont séchées et fixées à pour la culture de certains streptocoques et
l'éthanol. Une coloration de Gram, une colo- des bactéries anaérobies.
ration de Ziehl-Neelsen, voire une coloration * milieu gélosé "BCYE" additionné de 10 %
de Giemsa ou à l'acridine-orange peuvent de sérum de veau foetal (SVF) décomplé-
être effectuées. Ces colorations permettent menté et incubé dans une jarre sous CO 2 à
de mettre en évidence la plupart des bactéries 35-37°C pendant 10 jours (le SVF favori-
et les mycobactéries. Une lame colorée à se notamment la croissance de Legionella
l'acridine-orange peut être secondairement micdadei et de L. bozemanii).
colorée par une autre coloration (de Gram, de
Giemsa.....). Le tissu destiné à l'anatomo- * milieu de Lowenstein ou de Middlebrook
pathologiste peut être alors placé dans un conservé 6 semaines à 35-37°C pour la
fixateur (formol dilué au 1/10) surtout si culture des mycobactéries.
l'examen anatomo-pathologique doit être dif- * un milieu liquide légèrement réducteur,
féré (nocturne, week-end...). enrichi et faiblement gélosé favorise la
4. Le fragment de végétation destiné à la bacté- multiplication in vitro des bactéries qui au
riologie est dilacéré dans un mortier à l'aide sortir de l'organisme ont besoin d'une
d'un pilon ou au moyen d'un "potter" en pré- atmosphère réduite en oxygène et d'un
sence d'environ 1 ml de bouillon coeur-cer- support pour leur multiplication. L'un des
velle. Il est recommandé de faire une colora- milieux suivants est préconisé :
tion de Gram sur le broyat, d'ensemencer les - milieu coeur-cervelle gélosé à 1 % et
milieux de culture définis ci-après et de enrichi de 1 à 3 % d'isovitalex
congeler à – 80°C le résidu de broyat.
17• Hémoculture 93

- bouillon glucosé tamponné additionné les thrombus, les aspects de perforation ou


du contenu d'un tube "viande-foie (VF)" de déchirure (dégénératifs ou infectieux).
et enrichi de 1 à 3 % d'isovitalex Noter l'existence éventuelle d'une colleret-
- milieu de Schaedler semi-gélosé enrichi te de tissu cardiaque fibreux sur l'anneau
de 1 à 3 % d'isovitalex. d'insertion prothétique qui soit prélevable
Ce milieu liquide est incubé à 35-37°C pen- pour l'histologie.
dant 1 mois. • Prothèse mécanique
6. En présence d’une endocardite sur prothèse : Noter surtout la présence de thrombus.
- si une végétation est présente, il faut faire Noter l'existence éventuelle d'une colleret-
l'analyse bactériologique comme précé- te de tissu cardiaque fibreux sur l'anneau
demment, d'insertion prothétique qui soit prélevable
- en l’absence de végétation, il faut deman- pour l'histologie.
der au chirurgien d'individualiser à part le Pour l'ensemble de ces différents types de
tissu pathologique prélevé au niveau de la prélèvement, une photographie macrosco-
désinsertion de la prothèse. Ce tissu doit pique peut être utile.
être analysé comme une végétation. Sur la © Analyse histologique
prothèse, il est conseillé d'ajouter du
Faire des prélèvements orientés sur les
bouillon glucosé tamponné et de réaliser
lésions constatées (végétation, perforation,
une première coloration de Gram. A la
48ème heure d'incubation, faire une colora- déchirure, thrombose... ) ou inclure en totali-
tion de Gram et ensemencer les différents té les prélèvements de petite taille en les
milieux comme pour une valve native. répertoriant sur le schéma ou une photogra-
phie Polaroïd de la valve.
7. Dans tous les cas, congeler le reste du broyat
de la valve ou un fragment de végétation à Fixer les prélèvements dans le formol dilué
– 80°C. Pour permettre la culture de bacté- au 10 e.
ries intracellulaires, il est possible d'adresser Coloration systématique : hématoxyline-
à l'Unité des Rickesttsies de Marseille, la éosine-safran (HES).
valve ou un fragment qui a été congelé En cas d'infiltration inflammatoire définis-
immédiatement à – 80°C, le transport étant sant le processus d'endocardite, faire les
réalisé dans de la carboglace. colorations complémentaires suivantes :
➥ Etude anatomopatholgique des valves car- - coloration de Gram,
diaques
- coloration de Grocott et/ou PAS,
Quand l'analyse bactériologique a été effectuée,
- coloration de Giemsa pour certaines bacté-
les tissus valvulaires restants sont fixés dans du
ries notamment du genre Bartonella,
formol au 10 e et adressés au laboratoire
d'Anatomie Pathologique. Sur la feuille de trans- - coloration de Machiavello pour
mission, le bactériologiste doit noter l'aspect des Chlamydia et les rickettsies.
lésions qu'il a prélevées et que le pathologiste ne A partir des blocs d'inclusion en paraffine
pourra plus retrouver (à moins qu'un dessin ou stockés, peuvent être faites, à la demande
une photographie n'ait été réalisée . dans les laboratoires spécialisés, des études
© Analyse macroscopique des prélèvements d'immunofluorescence ou d'hybridation in
• Valve native situ pour la détermination d'agents patho-
gènes particuliers tels les rickettsies.
Noter la taille du prélèvement adressé, sa
composition (tissu valvulaire, cordages, © Résultats de l'étude histopathologique
piliers). L'endocardite est définie par l'infiltration
Décrire la présence éventuelle de végéta- inflammatoire de la valve. Il faut préciser
tion, d'ulcération, de perforation, de l'intensité de l'infiltrat inflammatoire et sa
thrombus, de rupture de cordages. composition : polynucléaires, macrophages,
lymphocytes. De la formule inflammatoire,
• Bioprothèse de valve
peut se dégager la notion d'évolutivité
Noter, outre les classiques végétations et inflammatoire des lésions : - présence de
94 17• Hémoculture

polynucléaires correspondant à des lésions 4- Conclusion


actives ; - absence de polynucléaires avec
présence de macrophages et de fibrose, cor- L'endocardite infectieuse reste une pathologie non
respondant à des lésions cicatricielles. exceptionnelle dans les centres de chirurgie car-
Cependant, il n'y a pas de stricte corrélation diaque. Bien que le laboratoire de Bactériologie soit
anatomo-bactériologique : la présence de le partenaire principal impliqué dans le traitement
quelques polynucléaires n'est pas toujours des prélèvements valvulaires, la contribution du
synonyme de persistance de bactéries et l'ab- laboratoire d'Anatomie Pathologique est importante
sence de polynucléaires n'élimine pas la per- pour :
sistance de bactéries intracellulaires dans les - l'analyse macroscopique des lésions permettant
macrophages. Il se surajoute parfois des une bonne orientation des prélèvements bactério-
lésions contribuant au diagnostic : foyers de logiques,
nécrose valvulaire, thrombose inflammatoi- - confirmer le diagnostic d'endocardite par la pré-
re... sence d'une inflammation. Cet élément devient
Caractérisation histopathologique des bacté- fondamental lorsque le bactériologiste doute de
ries par l'utilisation de colorations spéciales : la réalité pathologique des bactéries isolées. Le
souvent les bactéries pyogènes abondantes résultat de l'étude histopathologique contribue
sont visibles sous forme de petites colonies alors à la détection d'éventuelles contaminations,
dès la coloration HES. Dans d'autres situa- - conserver les prélèvements en vue d'études en
tions, les agents pathogènes ne sont mis en immunofluorescence ou en hybridation in situ.
évidence que par l'utilisation de colorations
spéciales. Certaines bactéries ne sont détec-
tées qu'en situation intracellulaire et ce fait
doit être noté car il oriente vers certains types
de bactéries.