J P i n c e m a i l 1, 2, M M e u r i s s e 3, R L i m e t 1 e t J O D e f r a i g n e 1,2
Méthodes d’évaluation du stress
oxydatif chez l’homme: importance en matière de prévention ments nécessaires pour limiter au maximum l’effet nocif des Mots clés: stress oxydatif - mesure EOA. La vie moderne nous confronte toutefois à la pollution, à l’exposition prolongée au soleil et à différentes radiations, à l’absorption d’alcool ou de médicaments, au tabagisme qui “Tous les individus ne possèdent un état de stress oxydatif sont autant de situations qui provoquent dans notre identique. En déterminant son profil antioxydant aussi tôt organisme des réactions chimiques de type radicalaires dans que possible dans sa vie, des précautions peuvent dès lors des proportions non prévues par la Nature et qui affaiblissent être prises pour retarder chez l’homme l’apparition d’un nos défenses antioxydantes. Plusieurs grandes études grand nombre de maladies liées au vieillissement”. épidémiologiques ont mis en évidence que de faibles taux R Cutler, Genox Corporation, Baltimore, USA. sanguins en antioxydants ou oligoéléments (vitamines C et E, sélénium) sont étroitement associés avec une incidence plus élevée de maladies cardiovasculaires et de cancers. De très Introduction nombreuses études expérimentales et épidémiologiques Le stress oxydatif se définit comme étant un déséquilibre montrent également qu’un apport complémentaire en profond de la balance entre les prooxydants et les antioxy- vitamines antioxydantes ou en sélénium permet de réduire dants en faveur des premiers, ce qui conduit à des dégâts l’incidence du cancer, des maladies cardiovasculaires et de cellulaires irréversibles. La réduction univalente de l’oxygène l’athérosclérose. résulte en la formation d’espèces oxygénées activées (EOA) dont font partie les radicaux libres (anion superoxyde, radical hydroxyle), le peroxyde d’hydrogène et l’oxygène singulet. L’établissement du statut antioxydant: Toutes ces espèces sont potentiellement toxiques pour l’orga- une réalité nisme car elle peuvent inactiver des protéines, induire des cassures au sein de l’acide désoxyribonucléique (ADN) avec Sur base de toutes ces données, il apparaît de plus en plus pour conséquence une altération du message génétique, qu’établir le statut antioxydant d’un individu sera susceptible dégrader les sucres, oxyder les lipoprotéines et initier des d’apporter au médecin généraliste qui est en première ligne processus de peroxydation lipidique au sein de la membrane avec les patients des informations importantes en matière de cellulaire en s’attaquant aux acides gras polyinsaturés. En prévention. Depuis quelques années, les techniques de situation normale, les EOA sont produites en permanence par dosage se sont considérablement affinées tandis que notre organisme (rôle physiologique) mais un système plusieurs firmes ont développé et commercialisé des kits efficace de défenses antioxydantes (vitamines, enzymes, d’analyse standardisés de sorte qu’il est actuellement oligoéléments) permet de réguler cette production afin de possible d’évaluer en routine le statut antioxydant d’un prévenir tout dégât cellulaire excessif. individu. La plupart de ces techniques reprises dans la figure 1 sont toutefois encore méconnues des médecins généra- Une alimentation saine et équilibrée (légumes, fruits, listes. poissons, huile de soja) doit théoriquement être suffisante pour apporter à notre organisme les antioxydants et oligoélé- • Peroxydes lipidiques et sous – produits Les acides gras polyinsaturés (RH) comme les acides 1 Service de Chirurgie Cardiovasculaire, linoléique ou arachidonique sont les cibles privilégiées des 2 Centre de Recherche Expérimentale du Département de Chirurgie (CREDEC), 3 EOA et plus particulièrement des radicaux libres. Dans une Service de Transplantation d’Organes - CHU de Liège première étape, ils se transforment en peroxydes lipidiques
MS 95 - Avril 1999 M E D I S P H E R E C A N C E R O L O G I E
Figure 1: Aperçu des méthodologies permettant d’évaluer
en évidence la présence de MDA et d’HNE dans les lipopro- l’état de stress oxydatif chez l’homme. téines oxydées. A l’aide de techniques ELISA, de nombreux chercheurs ont pu mettre en évidence une relation étroite entre un taux sanguin élevé d’anticorps dirigé contre des LDL oxydées et la progression de l’athérosclérose carotidienne ainsi qu’avec le développement de problèmes coronariens dans la phase de posttransplantation. Chez les patients diabétiques, des taux élevés de ces anticorps ont également été observés, démontrant ainsi la présence d’un stress oxydatif dans ce type de pathologie.
• Protéines oxydées Les modifications des structures primaire, secondaire et tertiaire des protéines par les EOA sont à la base de la formation de dérivés protéiques carbonylés via plusieurs mécanismes incluant la fragmentation et l’oxydation des acides aminés. En présence de dinitrophénylhydrazone (DNPH), ces dérivés carbonylés peuvent être en évidence (ROOH) qui peuvent être mesurés au niveau plasmatique dans des échantillons biologiques par spectrophotométrie, avec un kit commercial. Sous l’action de métaux de transition par technique HPLC ou via des anticorps mono-et (fer, cuivre), les peroxydes lipidiques se décomposent ensuite polyclonaux. Récemment, une méthode ELISA quantitative, en toute une série de sous–produits dont font partie les sensible et applicable en routine dont les résultats se aldéhydes. La malonedialdéhyde peut se mesurer par une corrèlent parfaitement avec ceux obtenus par méthode méthode de chromatographie liquide à haute performance spectrophotométrique, a été mise au point. (HPLC). Toutefois, son estimation reste un indice peu représentatif de la présence d’une peroxydation lipidique puisqu’elle ne représente qu’un pourcent des produits de Figure 2: Taux de 8–épi–PGF2α, un marqueur de la peroxy- décomposition des peroxydes lipidiques. Plus sensible et dation lipidique, trouvés dans les urines de fumeurs et de beaucoup plus spécifique est la mesure d’un autre aldéhyde, non fumeurs. Graphique adapté de Reilly et al. Circulation 94:19-25, 1996. le 4–hydroxynonénal (HNE) provenant de la dégradation des peroxydes d’acides gras de la famille ω–6. Tout comme la MDA, le HNE se mesure en routine par une méthode HPLC.
• Isoprostanes L’interaction des EOA et plus particulièrement du radical hydroxyle avec l’acide arachidonique conduit à la formation d’isoprostanes dont la prostaglandine 8–épi–PGF2α est la plus représentative. Celle-ci est produite dans le sang et puis ensuite excrétée dans l’urine où elle est dosée par spectro- métrie de masse. Chez les fumeurs, ce test a permis de montrer sans équivoque la présence d’un stress oxydatif particulièrement important (figure 2). Le développement récent d’une méthode radioimmunologique beaucoup simple d’application et très rapide va contribuer à populariser ce dosage encore trop peu connu.
• Anticorps anti-LDL oxydées
Le dommage oxydatif provoque des changements dans la • Oxydation de l’ADN structure des lipoprotéines de faible densité (“low density Les EOA peuvent réagir avec la guanine, base constitutive de lipoprotéines” ou LDL) qui sont riches en acides gras polyin- l’ADN, pour la transformer en 8-hydroxy–2’ déoxyguanosine saturés. La peroxydation induite dans les LDL par les EOA (8-OH2DG) qui est capable d’induire des mutations provoque in situ la formation d’aldéhydes (MDA et HNE) qui spécifiques pouvant conduire au développement du cancer. peuvent à leur tour oxyder les LDL. Ces LDL modifiées sont Récemment, des chercheurs britanniques ont développé reconnues par les macrophages au sein desquels elles s’accu- l’essai “COMET” qui permet de mesurer les cassures dans mulent en formant des cellules spumeuses (“foam cells”). En l’ADN de simples cellules comme les lymphocytes. Après s’accumulant dans l’espace interstitiel, ces cellules contri- avoir été déposées sur un gel d’agarose, les cellules sont buent au développement de l’athérosclérose. lysées avec un détergent puis traitées avec une solution à haute concentration en sels. Ces opérations permettent de Au début des années 90, des anticorps monoclonaux ont été former des nucléotides, ce qui a pour conséquence que l’ADN mis au point dans les laboratoires de recherche pour mettre contenant des cassures et soumis à une électrophorèse
M E D I S P H E R E migrera vers une anode sous la forme d’une queue de comète. (adaptation), soit diminué lorsque l’intensité du stress Après coloration, les gels sont examinés en microscopie oxydatif est trop importante. fluorescente. L’intensité relative de la fluorescence mesurée dans la queue de la comète est directement proportionnelle à Les antioxydants de petit poids moléculaire sont facilement la fréquence de cassures dans l’ADN. Ce procédé d’analyse dosables en routine par des méthodes spectrophotométriques très rapide peut être appliqué sans difficulté pour des études (acide ascorbique, glutathion) et HPLC (ubiquinone, en routine. Avec cette méthode, des dégâts oxydatifs au vitamines A et E, β–carotène). Depuis quelques années, il niveau de l’ADN ont pu être observés chez des travailleurs existe des kits commerciaux permettant la mesure en routine manipulant des produits carcinogènes et chez des patients de la SOD et de la GPx dans les globules rouges. Tout souffrant d’un diabète insulino-dépendant. Depuis peu, un kit récemment, a été commercialisé un premier dosage immuno- ELISA a vu le jour, ce qui permettra de rendre le dosage en logique permettant l’analyse en routine de la glutathion routine de l’ADN oxydé encore plus facile. peroxydase plasmatique.
Le sélénium est un élément essentiel à l’état de trace
Figure 3: Taux plasmatiques en antioxydants et en (oligoélément) qui ne possède pas à proprement d’activité sélénium avant et après une prise journalière d’une capsule de Quatral® (Christiaens-Pharma, Belgique) antioxydante. Il est toutefois considéré comme tel puisqu’il pendant un mois chez 13 patients à risque de développer participe à la constitution et à la régulation de la GPx, enzyme des maladies cardiovasculaires (diabétiques, hyperlipidé- qui participe à la destruction des peroxydes lipidiques. Le miques) sélectionnés parmi la clientèle d’un médecin sélénium se dose dans le sérum ou le plasma par diverses généraliste. Chaque capsule de Quatral® comprend: 800 µg techniques comme la fluorescence par rayons X, l’émission de de vitamine A (100 % AJR), 100 mg de vitamine C (160 % particules induite par rayons X (PIXE), la chromatographie en AJR), 30 mg de vitamine E (300 % AJR), 100 µg de sélénium (130 % AJR) et 15 mg de zinc (100 % AJR). Les taux phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse et plasmatiques de vitamines A et de sélénium sont respecti- l’absorption atomique avec correction Zeeman, cette dernière vement exprimés en µg/100 ml et µg/l tandis que ceux des technique ayant l’avantage de pouvoir être utilisée en vitamines C et E le sont en µg/ml. Les taux de vitamines C routine. et E ainsi que de sélénium sont significativement augmentés suite à la prise de cet apport complémentaire en antioxy- Evaluer le taux d’antioxydants plasmatiques et de sels dants: vit C: 4,19 ± 3,23 vs 8,60 ± 4,05 µg/ml (* p < 0,002) ; vit E: 16,85 ± 3,41 vs 20,29 ± 3,75 µg/ml (** p < 0,02) ; minéraux (sélénium mais aussi le cuivre et le zinc qui font sélénium: 69,03 ± 14,82 vs 91,49 ± 15,37 µg/l partie du site actif de la SOD) est donc simple à réaliser et (*** p < 0,005). AJR: apport journalier recommandé. permettra au médecin généraliste d’évaluer très vite si des déficiences en ces substances existent et, par conséquent, de les corriger. La figure 3 montre l’incidence d’un apport complémentaire en antioxydants proche des apports journa- liers recommandés (AJR) sur le statut antioxydant du plasma.
• Capacité antioxydante globale
Dans le cas d’un stress oxydatif, chaque antioxydant est affecté à des degrés divers. Il est dès lors intéressant de disposer de méthodes permettant d’évaluer de manière plus globale la capacité antioxydante globale (CAG) d’un échantillon biologique.
La technique consiste à mettre en contact un système in vitro
générant des EOA avec une cible (acide gras, sonde fluores- cente) dont la destruction oxydative est suivie en fonction du temps par spectrophotométrie ou luminescence. Si cette réaction est réalisée en présence d’un échantillon de plasma, les antioxydants présents dans celui-ci vont interagir avec les EOA, et ce n’est qu’après leur consommation complète, que l’oxydation de la cible pourra démarrer. Le temps de latence • Antioxydants et oligoléléments (temps avant le démarrage de l’oxydation) sera donc Le plasma humain est riche en antioxydants de petite taille de directement proportionnel à la quantité d’antioxydants types hydrophyle (acide urique, acide ascorbique (Vit C), présents dans l’échantillon plasmatique. glutathion, bilirubine) et lipophyle (α–tocophérol (Vit E), rétinol (Vit A), β–carotène, ubiquinone). Les globules rouges Sur des globules rouges, il est aussi possible d’évaluer leur sont par contre très riches en enzymes antioxydantes comme résistance in vitro à un stress oxydatif en les soumettant à un la superoxyde dismutase (SOD), la catalase et la glutathion système produisant des EOA de manière constante. A peroxydase (GPx). De très nombreuses études chez l’animal intervalles réguliers, le taux d’hémolyse est mesuré comme ont montré que les antioxydants de petite taille sont généra- marqueur in vitro du dommage oxydatif. Le temps de latence lement consommés lors d’un stress oxydatif tandis que le avant le démarrage de l’hémolyse sera directement propor- taux d’enzymes antioxydantes est soit augmenté par tionnel à la quantité d’antioxydants présents dans les expression moléculaire en cas de faible stress oxydatif érythrocytes. Avec cette technique, il a été montré que les
M E D I S P H E R E défenses antioxydantes des globules rouges chez des Indépendamment de cette action, les PMNs peuvent aussi personnes âgées étaient significativement diminuées en s’activer sous l’action de stimuli extérieurs comme les comparaison avec des sujets jeunes puisque le temps corres- fragments de protéines, les cytokines, les endotoxines, les pondant à 50% d’hémolyse est de 69 ± 14 minutes chez les fragments du complément qui sont libérés en grande quantité sujets âgés contre 109 ± 12 minutes dans la population plus dans l’organisme au cours de différentes situations patholo- jeune. giques (e. g. traumatisme crânien). Les produits de cette activation sont cette fois libérés dans le milieu extracellulaire • Bilan ferrique et ils s’attaquent dès lors à des tissus ou organes sains, Le fer joue un rôle capital dans l’initiation et la propagation déclenchant ainsi un phénomène inflammatoire aigu. Une des réactions radicalaires en permettant la formation des élévation des taux plasmatiques de MPO et d’élastase sera EOA. Dans des conditions physiologiques, la transferrine donc le reflet d’une intense activation leucocytaire, et, par possède une capacité de fixation importante en fer conséquent, la preuve indirecte que des EOA ont été puisqu’elle est saturée à +/- 30 % avec ce métal de transition produites dans ces situations pathologiques. Ceci a été de sorte qu’il n’est pas possible de trouver du fer libre (à l’état montré dans le SDRA et chez les patients soumis à une actif) dans le sang de sujets en bonne santé. A ce titre, la circulation extracorporelle lors de pontages coronariens. Des transferrine est considérée comme un antioxydant important. tests spectrophotométriques et immunologiques pouvant être En situations pathologiques, le fer peut toutefois être libéré de ses protéines de transport (ferritine, lactoferrine) sous utilisés en routine existent pour ces deux enzymes. l’action des EOA et se retrouver dans le sang sous une forme libre capable d’initier des réactions radicalaires.
Une méthode de dosage utilisant la bléomycine permet de Conclusions
mettre en évidence ce fer libre, ainsi que cela a été montré La difficulté des dosages mais aussi l’utilisation de dans le liquide synovial de patients souffrant d’arthrite techniques parfois sophistiquées et uniquement manipulées rhumatoïde et dans le sang de patients soumis à une CEC. par des chercheurs qualifiés ont confiné pendant très Parallèlement, le pourcentage de saturation en fer de la longtemps les travaux sur le stress oxydatif dans les labora- transferrine augmente pour atteindre des valeurs largement toires de recherche. L’introduction récente de méthodes supérieures à 50%. La détermination de ces deux paramètres faciles à doser en routine donnera donc d’excellentes indica- spécifiques et sensibles mais aussi rapides et adaptées pour tions sur l’état de stress oxydatif d’un individu. des dosages de routine permet aux laboratoires de recherche et privés de proposer au monde médical, et plus particuliè- rement aux médecins généralistes, une large batterie de tests • Activation des neutrophiles permettant d’évaluer le statut antioxydant d’un individu. Ceci Les polymorphonucléaires (PMNs) ou neutrophiles jouent un permettra de déceler la présence éventuelle d’un déficit en rôle important dans la défense de l’organisme puisqu’ils antioxydants et de le corriger avec un apport complémentaire assurent la phagocytose et la destruction de microorganismes approprié. Sensibiliser le médecin généraliste à ces étrangers. La cytotoxicité de ces cellules s’expliquent par leur capacité à générer intracellulairement de grandes quantités techniques de mesure du stress oxydatif est donc primordial d’EOA mais aussi à libérer à partir de leurs granules des dans le cadre de la prévention contre certaines maladies (le enzymes protéolytiques (élastase, collagénase) et de la cancer ou l’athérosclérose) où le stress oxydatif semble jouer myéloperoxydase (MPO). un rôle important. ❏
