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TP N°3 - TECHNIQUES DE NUMERATIONS DES SPORES ET DE DILUTION

1. Objet de la numération.

L’expression de la concentration en spores susceptible d’exprimer le potentiel d’inoculum est


nécessaire, à chaque dois qu’on voudra réaliser des inoculations.

Des expériences nt montré que pour obtenir une infection optimale, la concentration en spores varie
d’une espèce à l’autre. Alors qu’il faut 10 spores pour une espèce comme Ascochyta chrysanteni, par
contre il faut 5.000 spores pour obtenir le même effet avec Ascochyta pisi.

D’où la nécessité de considérer la concentration en spores et donc d’avoir le moyen d’utiliser


toujours avec exactitude l quantité nécessaire à chaque inoculation. Cette concentration s’exprime
toujours en n spores/ml et elle est déterminée à l’aide de cellules hématiques.

2. Principe de l’hématimètre.

La technique de numération repose sur le comptage direct au microscope ; les spores à compter sont
obtenues dans un volume déterminé. Nous rappelons que cette technique a été originalement
utilisée en médecine pour la numération des globules du sang (hématies et leucocytes). Ce qui a
donné le nom d’hématimètres aux cellules de numération.

La numération des spores est réalisée sur la surface de la cellule délimitée par un quadrillage dont le
volume de chaque rectangle es défini par la profondeur des stries du quadrillage. Les spores sont
comptées une fois la sédimentation faite.

Le quadrillage peut varier d’une cellule à l’autre, mais dans tous les cas, le nombre de spores est
défini par le volume de chaque cellule.

3. Types d’hématimètres.

Il existe de nombreux types de cellules à numération. Cellule de Malassez, de Thoma, de Neubauer


(voir figures), qui différent par le mode de quadrillage et le dispositif supportant la lamelle. Le choix
du type du quadrillage est surtout affaire du goût ou de disponibilité pour nous.

3.1. Principales caractéristique des cellules utilisées.

Cellules Malassez Neubaurer

Caractéristique

- Lamelles 22 x 22 mm 22 x 22 mm
- Trace sur cellule
- Surface quadrillage Double Simple
- Profondeur

0,2 mm
Quadrillage de la cellule de Malassez montrant 100 carreaux et
caractéristiques des dimensions pour avoir le volume de 1 mm3 = 10-3
ml

Carreaux au niveau desquels sont réalisés les comptages


Caractéristique des lames utilisées.

- Les lames ont un tracé sr cellule double.


- Les lamelles correspondantes soit de : 22 X 22mm.
- profondeur de la cellule à numération ; 0,2 ± 0,002mm.
- Surface du quadrillage total : 5mm²
- Volume total correspondant : 5 X 0,2 = 1 mm³
-
2.2. Fiabilité des mesures et sources d’erreurs.

Dans l’expression de la concentration en spores diverses causes d’erreurs peuvent rendre aléatoires
les résultats obtenus. Il faut donc opérer en tenant comptes de certain risque qui peut provenir :

- Du liquide extracteur
- Agitation
- Hématimètre lui-même
- Matériel de manipulation pipette, lamelle
- De la manipulation.

En opérant dons les même conditions pour des même objectifs, ces risque peuvent être très
sensiblement diminués.

4. Manipulation.

4.1. Le comptage des spores sera effectué à partir d’une culture d’Aschochyta pisi âgée e 21
jours.
4.2. Obtention e la solution mère :

Prendre un tube à essai puis ajouter une qualité d’eau distillée, bien agiter pour récupérer un
maximum de spores puis filtrer et récupérer la suspension de spores dans n tube à essai si elle est
trop concentrer effectuer une première dilution.

4.3. Réalisation du comptage.

 Avant de passer au comptage proprement dit, une étude de la cellule Malassez mise à votre
disposition est nécessaire pour déterminer en pratique toutes ses caractéristiques.
 Ceci fait, bien agiter pour homogénéiser la suspension de spores et pipeter ne goutte qu’il
faudra déposer sur la surface de la cellule présentant le quadrillage.
 Appliquer une lamelle en empêchant toute formation de bulle d’air qui modifierait le
volume.
 Pour effectuer le comptage, répéter le quadrillage de la cellule avec faible grossissement (X
10) et attendre que spores soient immobilisées.
 Passez à un plus fort grossissement sans modifier la hauteur du statif porte lame et terminer
la mise au point par la vie micrométrique.
 Effectuer alors le comptage des spores uniquement dans les grands carrés qui sont délimités
et qui renferment des petits carrés.

Pour compter, il faut suivre une marche méthodique. Employer un grossissement du 200 à 400 et
diaphragmer assez fortement le condenseur. Dans chaque grand carré compter par tranche
horizontale on verticale et en suivant les traces de la figure (2).
5. Dilution.

Pour l’obtention d’une concentration en spores donnée, à une dilution à partir de la concentration
mère s’effectue selon la formule suivant :

C₁ x V₁ = C₂ x V₂ où C₁ = Concentration Initiale

v₁ = Volume de la concentration à diluer


C₂ = Concentration finale.

v₂ = Volume fin de la concentration en spores désiré.


TP N° 4 TECHNIQUE D’INOCULATION, NOTATION ET EVALUATION DE
L’INTENSITE D’UNE MALADIE

1. Principe

Après avoir isolé un champignon pathogène sur un milieu de culture convenable, la vérification du
postulat de Koch, nécessité de tester sa pathogénicité. Ceci vient du fait que la présence d’un
champignon au niveau d’une plante n’est pas toujours un indice de pathogénicité (cas des
saprophytes). Ceci doit être vérifié par les méthodes d’inoculation. Donc l’inoculation doit être
définie comme l’introduction de l’inoculum (pathogène) vivant au niveau de la plante hôte.

Par ailleurs, et d’une manière générale, les inoculations sont nécessaires pour différentes autres
raisons.

 Pour prouver la pathogénicité de l’organisme isolé.


 Pour étudier le cycle biochimique de l’agent pathogène.
 Pour la gamme d’hôtes
 Pour étudier la spécialisation parasitaire.
 Pour étudier l’action des conditions de l’environnement sue la développement de la maladie.
 Pour étudier la résistance d’une plante hôte à un pathogène donné.

La pathogénicité d’un agent pathogène quelconque n’est vérifié que si l’expérimentation réponde
aux principes de Kock à savoir ;

- Isolement de l’organisme en culture pure à partir de l’organe malade et identification.


- Inoculation de l’organisme dans une autre plante identique mais saine.
- Reproduction des mêmes symptômes observés, (et don reproduction de la maladie).
- Ré isolement de l’organisme à partir de la plante inoculée et vérification de l’identité du
même organisme.
-

2. Travail à effectuer.

2.1. Préparation de la suspension des spores et inoculation.

La quantité de spores apportée à la plante pour réalisation de l’infection constitue l’inoculum. Cette
suspension de spores est préparée d’une culture de champignon qui sont développé sur un milieu
spécifique : milieu Mathur pour : Ascochyta pisi, agent de l’Anthracnose du pois.

La concentration en spores de notre inoculum sera de 10⁶ spores/ml, qu’il faudra déterminer à partir
une suspension mère concentrée.

- Inoculation proprement dite :

La suspension de spores (inoculum) préparée est l’largement pulvérisée sur toutes les parties des
plantules.

- Conditions expérimentales ;
La maladie étant le produit d’une interaction entre l’hôte le pathogène et les conditions de
l’environnement. De ce fait les plantules inoculées doivent être placées dans des conditions de
température, lumière et humidité favorisant le développement du pathogène sur la plante.

Dans notre cas, les conditions expérimentales devront être :

- Une température 20 – 23°C


- Une humidité saturante pendant les 72 heures qui suivent l’inoculation.

Les terrines doivent être recouvertes d’un film plastique. De plus les plantules doivent recevoir une
pulvérisation d’eau très fréquente durant le test.

2.2. Notation et expression de la maladie.

Afin d’évaluer le degré d’attaque ou la pathogénicité d’un champignon, il est nécessaire de procéder
à un comptage qui soit porter sur :

- Le nombre de plantules atteintes.


- Le nombre de folioles attaquées.
- Le nombre de tâches nécrotiques.

Le système de notation adoptée en phytopathologie varient en fonction des symptômes, des organes
touchés, etc…

0. Immunité totale.
1. Assez nombreuses taches sur tiges, la plante sur vit.
2. Rares tâches petites
3. Assez nombreuses tâches moyennes avec zones d’accroissement visibles, la plante sur vit
rarement.
4. Nombreuses tâches étendues sur tiges, beaucoup de flétrissement des feuilles, la plantes
meurt dans beaucoup de cas.
5. Infection généralisée ; les plantes sont mortes à la notation.

Calcul de l’indice d’attaque(Raynal, 1972) :

IAM (indice d’attaque moyen)= (somme) des degrés d’attaques/Nombre total de plantules

Cet indice nous permet de faire une classification.

C₁ ˂ 1 Souches à virulente ou variété très résistante.

1˂ C ≤ 2 Souche peu virulente assez résistante.

2˂ C ≤ 3 Souche assez virulente assez sensible.

3˂ C ≤ 4 Souches virulente u variété sensible.

4˂ C ≤ 5 Souche très virulent ou variété très sensible.