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Compte rendu de la visite du

service de pharmacologie
clinique de CNPV
 

Préparé par : Guizani Imen


Effectué au sein de : Centre National de
Pharmacovigilance de Tunis

Mastère Professionnel Co-Construit en technologies


cellulaires et moléculaires en bio santé
Pr2sentation DU Centre National de
Pharmacovigilance de Tunis

À partir de 2006, le centre est installé dans les anciens locaux administratifs de
la faculté de médecine de Tunis au numéro 9 de l'avenue du docteur Zouhair
Essafi à Tunis2.

Il existe différents services dont :

 Le service de recueil et d'analyse des effets indésirables ;


 Le service de pharmacologie clinique ;
 Le service régional du centre à Sousse ;
 Le service régional du sud à Sfax.
I. La chromatographie en phase liquide à haute

performance

a. Principe

Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant.


Ce mélange est introduit dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la
nature des molécules, elles interagissent plus ou moins avec la phase
stationnaire dans un tube appelé colonne chromatographique.

La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt
le système chromatographique.

Le mélange à analyser est injecté puis transporté au travers du système


chromatographique. Les composés en solution se répartissent alors
suivant leur affinité entre la phase mobile et la phase stationnaire.

En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les différents


solutés sont caractérisés par un pic. L’ensemble des pics enregistrés est
appelé chromatogramme.

b. Appareillage

Figure 1 : l’appareillage du HPLC


 Réservoir de la phase mobile
Le plus souvent ce réservoir est une bouteille en verre dans lequel
plonge un tube avec une extrémité filtrante en téflon. S’il est nécessaire
le dégazage peut se faire par agitation puis conservation du solvant sous
atmosphère d’hélium.
 Pompe
Elle délivre en continu la phase mobile. Elle est définit par la pression
qu’elle permet d’atteindre dans la colonne, son débit, et la stabilité du
flux

 Injecteur
Le type d’injecteur le plus couramment utilisé comporte une vanne à
boucle d’échantillonnage d’une capacité fixe (10, 20, 50 µL…). Cette
boucle permet d’introduire l’échantillon sans modifier la pression dans la
colonne.
Le remplissage de la boucle d’injection se fait à l’aide d’une seringue.

 Colonne
En mode analytique, les colonnes en inox ont généralement un diamètre
interne de 4,6mm. La longueur est de 5, 10, 15, ou 25cm. Le
remplissage (en silice, silice greffée ou particules polymériques) a une
granulométrie de 3, 5, ou 10µm. Le diamètre interne d’une colonne est
usuellement de 4 ou 4,6 mm. Si des substances pures doivent être
collectées en fin de chromatogramme des colonnes de gros diamètre
seront nécessaires.
Colonne en phase inversé : silice ou amine griffé généralement à
groupement Alkyles de 8 à 18 atomes de carbones
Colonne en phase normale : colonne remplie que par la silice
Figure 2 : une colonne de HPLC

 Détecteur
Le détecteur suit en continu l’apparition des solutés. Pour détecter, on
utilise différents phénomènes physico-chimiques. Le signal obtenu est
enregistré en fonction du temps. Généralement, on compare le signal
obtenu pour la phase mobile et le soluté à celui de la phase mobile
seule.
Le détecteur le plus utilisé en CLHP est un spectrophotomètre
d’absorption UV-visible (190-600 nm) relié à la sortie de colonne.

c. Lecteur des résultats


 Etalonnage
 Etalonnage externe :
On injecte successivement un même volume d’une solution étalon à plusieurs
concentrations connus pour construire une courbe d’étalonnage
 Etalonnage interne
Le principe consiste à comparer les surfaces des pics du
mélange avec un étalon pris comme référence à une concentration connu
Notre
molécule
d’intérêt

Etalon
interne

Figure 3 : exemple d’un résultat chromatographique

II. Chromatographie en phase liquide à ultra

performance ou chromatographie en phase

gazeuse couplée à une spectrométrie de

masse

Une technique couplée est la combinaison ou le couplage d'au moins


deux techniques d'analyse dans le but d'améliorer l'analyse qualitative
(identification) et quantitative d'une substance 1. Le couplage peut avoir
lieu entre deux techniques de séparation, deux techniques
d'identification ou une technique de séparation et une technique
d'identification2. Un exemple d'une technique de séparation est
la chromatographie en phase liquide à ultra performance ou la
chromatographie en phase gazeuse et un exemple d'une technique
d'identification est la spectrométrie de masse

a. Principe de spectrométrie de masse

Le spectromètre de masse comporte une source d'ionisation suivie d'un


ou plusieurs analyseurs qui séparent les ions produits selon leur
rapport m/z, d'un détecteur qui compte les ions et amplifie le signal, et
enfin d'un système informatique pour traiter le signal. Le résultat obtenu
est un spectre de masse représentant les rapports m/z, où m représente
la masse et z la valence (ou m/q, q représentant la charge) des ions
détectés selon l'axe des abscisses et l'abondance relative de ces ions
selon l'axe de ordonnées.

i. Appareillage

  L’échantillon peut être introduit directement dans la source, sous


forme gazeuse, liquide (infusion directe) ou solide (canne
d’introduction directe, dépôt sur plaque MALDI...) ou encore par
l'association à une méthode séparative (chromatographie en phase
liquide ou gazeuse)
 La source d'ionisation : elle consiste à vaporiser les molécules et à
les ioniser. Une source d'ionisation peut être utilisée soit en mode
positif pour étudier les ions positifs, soit en mode négatif pour étudier
les ions négatifs. Plusieurs types de sources existent et sont utilisés
en fonction du résultat recherché et des molécules analysées 1.
o L'ionisation électronique (EI), l'ionisation chimique (CI) et la
désorption-ionisation chimique (DCI)
o Le bombardement par atomes rapides (FAB), atomes
métastables (MAB) ou ions (SIMS, LSIMS)
o Le couplage plasma inductif (ICP)
o L'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et
la photo-ionisation à pression atmosphérique (APPI)
o L'électronébulisation ou électrospray (ESI)
o La désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI),
activée par une surface (SELDI) ou sur silicium (DIOS)
o L'ionisation-désorption par interaction avec espèces
métastables (DART)
o La désorption-ionisation sur silicium (DIOS)

 L’analyseur : il sépare les ions en fonction de leur rapport


masse/charge (m/z). Il existe des analyseurs basse résolution : le
quadripôle ou quadrupôle (Q), le piège à ions 3D (IT) ou linéaire (LIT),
et des analyseurs haute résolution, permettant de mesurer la masse
exacte des analytes : le secteur magnétique couplé à un secteur
électrique, le temps de vol (TOF), la résonance cyclotronique ionique
à transformée de Fourier (FTICR) et l'Orbitrap. Ces analyseurs
peuvent être couplés entre eux pour réaliser des expériences de
spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). En général, un premier
analyseur sépare les ions, une cellule de collision permet de
fragmenter les ions, et un second analyseur sépare les ions
fragments. Certains analyseurs, comme les pièges à ions ou le FT-
ICR, constituent plusieurs analyseurs en un et permettent de
fragmenter les ions et d'analyser les fragments directement.
 Le détecteur et système de traitement : le détecteur transforme les
ions en signal électrique. Plus les ions sont nombreux, plus le courant
est important. De plus, le détecteur amplifie le signal obtenu pour qu'il
puisse être traité informatiquement.
Figure 4: une spectrométrie de masse

b. Principe de la chromatographie en phase

gazeuse

Cette analyse consiste à injecter des composés sous forme gazeuse,


pouvant provenir de la pyrolyse ou de la thermodésorption d'un matériau
polymère, ou encore de la vaporisation d'un extrait concentré liquide. Ce
mélange de composés est entraîné par un gaz vecteur vers une colonne
chromatographique, placée dans un four thermostaté, dans laquelle
s'opère une séparation sélective. L'identification des produits élués se
fait à l'aide d'un spectromètre de masse.

i. Appareillage

L’appareil utilisé pour réaliser une analyse par chromatographie en


phase vapeur est appelé chromatographe. Il comporte plusieurs
éléments, comme indiqué sur le schéma ci-dessous :
Figure 5 : appareillage de la CPG

 Un four (type chaleur tournante) qui permet une programmation de


température ajustable de 20 °C (−100 °C pour certains systèmes)
à 450 °C et qui est également équipé d'un système de
refroidissement rapide ;
 'un système d'injection, qui va permettre d'introduire et de rendre
volatil l'échantillon à analyser. L'injection peut se faire d'une manière
manuelle ou automatique à l'aide d'un échantillonneur ;
 Une colonne (capillaire ou remplie) qui peut faire plus de 50
mètres, sur laquelle les différentes molécules de l'échantillon injecté
vont se séparer suivant leurs affinités avec la phase stationnaire ;
 Un système de détection, qui va permettre de mesurer le signal
émis par les différentes molécules et de pouvoir les identifier. Pour
l'enregistrement du signal émis par le détecteur, des logiciels sur PC
remplacent avantageusement les enregistreurs analogiques sur
papier ;
 d'un système de détendeur-régulateur pour les gaz utilisés
(hélium, dihydrogène, diazote et air comprimé). Sur les
chromatographes modernes, on trouve des systèmes électroniques
pour la régulation des gaz qui sont également purifiés par des
cartouches filtrantes

III. Conclusion

 Le couplage de CPG-MS reste plus facile et pratique que le


couplage de HPLC-MS.
 Les avantages de couplage HPLC-MS :

Les avantages sont la capacité d'injection et l'obtention d'un spectre de


masse chargé en information et le changement de polarité aisé.
L'inconvénient à 200 ou 1000 µL/min, l'encrassement du spectromètre
de masse est considérable demandant de la maintenance et la quantité
de solvants de très bonne qualité est aussi un problème pour le cout de
l'analyse.

 Les avantages de couplage CPG-MS :

 Identifier des composants organiques en scindant des mixtures


complexes
 Analyse quantitative
 Détermination du niveau de trace de la contamination organique
(niveau de ppb bas à moyen pour les liquides et niveau de
nanogramme bas pour les solides) (Dynamic Headspace Analysis)

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