Cours  4  
Technologie  de  l’  ADN  Recombinant  
Clonage  des  genes  
 Clonage  moléculaire  
•   l’idée  principale  est  d’insérer  un  segment  d’ADN  d’intérêt  dans  une  molécule  d’ADN  qui  se  
réplique  de  manière  autonome  (appelée  vecteur  de  clonage).  

•   le  vecteur  est  ensuite  introduit  dans  un  organisme  hôte  et  cela  permet  la  produc>on  d’une  
grande  quan>té  d’ADN  d’intérêt  
 Clonage  moléculaire  

Bactéries   ADN  d’intérêt  

Vecteur  (plasmides)   Coupure  

Mul*plica*on  
=  CLONAGE  
 Principes  
ORGANISME
DONNEUR VECTEUR

Extraction et coupure de l’ADN Ou transporteur d’ADN.

en fragment contenant de un à C’est un fragment d’ADN
plusieurs fragments d’intérêt. capable de réplication autonome.

insertion individuelle de chaque

fragment d’ADN dans une molécule de vecteur

Obtention de l’ADN recombinant

Nouvelle combinaison de l’ADN d’un génome donneur (qui peut être

de n’importe quel organisme) avec l’ADN d’un vecteur qui peut être
d’origine complètement différente.
 Enzymes  de  restric@on  

•  Découverte  des  enzymes  de  restric>on  par  Werner  Arber,  

Daniel  Nathans  et  Hamilton  O.  Smith  vers  1965.  (Prix  
Nobel  1978)    

•  Enzymes  qui  coupent    l’ADN  

•  La  coupure  est  spécifique  d’une  séquence  nucléo>dique  

reconnue    
 
 Enzymes  de  restric@on  

The  enzyme  EcoRI  cuKng  DNA  at  its  recogni>on  sequence  

Different  restric>on  enzymes  have  different  recogni>on  sequences.  

 Origine  des  enzymes  de  restric@on  

Les  enzymes  de  restric>on  protègent  les  

bactéries  contre  les  bactériophages  puisque  
ces  enzymes  digèrent  l'ADN  introduit  par  
ces  virus  dans  la  cellule  bactérienne,  
bloquant  ainsi  leur  réplica>on.  
   

L'ADN  de  la  bactérie  est  protégé  car  les  sites  

de  restric>on  sont  méthylés  au  niveau  de    
certaines  bases  par  des  méthylases  et  donc    
non  reconnus  par  les  enzymes  de  restric>on.    
 
Restric@on/Methyla@on  Enzyme  
Conclusion  :  les  enzymes  de  restric>on  
sont  des  ou>ls  moléculaires  naturels  qui  
protègent  les  bactéries  des  virus  
bactériophages.  
 Enzymes de Restriction
Nomenclature
•  1°  leTre  de  dénomina>on  de  l’enzyme  en  majuscule  -­‐>  genre  de  la  
bactérie  d’où  a  été  extraite  l’enzyme.    
•  2°  leTre  et  3°  leTre  (en  minuscules)  -­‐>  l’espèce  de  la  bactérie  d’où  
l’enzyme  est  extraite.    
•  4°  leTre  écrite  en  majuscule  -­‐>  la  souche  bactérienne.  
•  1  chiffre  romain  indique  l’ordre  de  caractérisa>on  de  ces  enzymes.  

Escherischia   coli   Souche  R   Première  isolée  

 Enzymes de Restriction
Nomenclature

Escherichia colii Ry13

Eco R I 1ière enzyme trouvée chez E coli

Eco R V 5ième enzyme trouvée chez E coli

Providencia stuarti
Pst I
 Les  enzymes  de  restric@on  
Caractéris@ques:    
•  la plupart des sites sont des séquences inversées répétées (palindromes)
cas de EcoRI:
5 ’ GAATTC 3 ’

3 ’ CTTAAG 5 ’

5 ’
3’
5 ’
3’
5 ’
3’

3’
5 ’
3’
5 ’
3’
5 ’

EcoRI
PstI
SmaI

 Les  enzymes  de  restric@on  
Types  de  coupures  
•  Premier  type  :  extrémités  cohésives  à  5’  «  sortant  »:    

«  bouts  collants  »  

5’   G   AATTC   3’  
3’   CTTAA   G   5’  
EcorI  
•       Second  type  :  extrémités  cohésives  à  3’  «  sortant  »  :  
Pst1  
5’   CTGCA   G   3’  
3’   G   ACGTC   5’  

«  bouts  collants  »  
 Les  enzymes  de  restric@on  
Types  de  coupures  

•     Troisième  type  :  coupure  à  bouts  francs  

Sma1  
5’   CCC  GGG   3’  
3’   GGG  CCC   5’  
Quelques  enzymes  de  restric@on  
Vecteurs  de  clonage  
 Vecteurs  de  clonage  
ORGANISME
DONNEUR VECTEUR

Extraction et coupure de l’ADN Ou transporteur d’ADN.

en fragment contenant de un à C’est un fragment d’ADN
plusieurs fragments d’intérêt. capable de réplication autonome.

insertion individuelle de chaque

fragment d’ADN dans une molécule de vecteur

Obtention de l’ADN recombinant

Nouvelle combinaison de l’ADN d’un génome donneur (qui peut être

de n’importe quel organisme) avec l’ADN d’un vecteur qui peut être
d’origine complètement différente.
Vecteurs  de  clonage  
 Propriétés  des  vecteurs  de  clonage  
•   capables  de  réplica>on  autonome  dans  une  cellule  hôte  donnée  
(origine  de  réplica>on  de  type  procaryo>que  et/  ou  eucaryo>que)  
 
•   possèdent  un  polylinker  ou  site  mul>ple  de  clonage.  

•   Possèdent  des  propriétés  permeTant  la  sélec>on  de  la  cellule  hôte  
(résistance  an>bio>que).  
 Vecteurs  de  clonage:  
Plasmids  

Les    bactéries  con>ennent  très  fréquemment  des  éléments  ADN  extra-­‐chromosomiques:  plasmides
 
Les  plasmides  jouent  un  rôle  important  dans  l  ’adapta>on  àdes  condi>ons  changeantes  de    
l  ’environnement  (stress,  réponse  du  système  immunitaire,  interac>ons  avec  les  cellules  de  l’hôte,  
 résistance  aux  an>bio>ques  et  aux  an>sep>ques,  …)  
 
En  général  les  plasmids  sont  circulaire,  le  nombre  de  copies  par  cellule  peut  varier  de  1  à    
quelques  centaines.    
 Plasmide  comme  vecteur  de  clonage  
 
•  Pe>t,  pour  être  facilement  isoléet  introduit  
dans  les  bactéries    
•  En  général  nombre  rela>vement  élevéde  
copies  pour  des  rendements  importants  
•  Il  doit  porter  un  marquer  de  sélec>on,  en  
général,  un  marqueur  de  résistance  àun  
an>bio>que  
•  Il  doit  avoir  des  sites  de  restric>on  qui  
permeTent  l’introduc>on  d’ADN  étranger.  
Ces  sites  doivent  être  situés  dans  des  gènes  
pour  permeTre  la  sélec>on  des  
recombinants  par  rapport  aux  plasmides  
recircularisés  
 Autres  vecteurs  de  clonage:  
bacteriophage    
On  peut  aussi  cloner  des  fragments  d’ADN  dans  l’ADN  d’un  bacteriophage      
Inser@on  d’un  fragment  d’ADN  dans  
un  vecteur  
 
(Liga@on)  
 Inser@on  d’un  fragment  d’ADN  dans  un  
vecteur:  
ORGANISME
DONNEUR Liga@on   VECTEUR

Extraction et coupure de l’ADN Ou transporteur d’ADN.

en fragment contenant de un à C’est un fragment d’ADN
plusieurs fragments d’intérêt. capable de réplication autonome.

insertion individuelle de chaque

fragment d’ADN dans une molécule de vecteur

Obtention de l’ADN recombinant

Nouvelle combinaison de l’ADN d’un génome donneur (qui peut être

de n’importe quel organisme) avec l’ADN d’un vecteur qui peut être
d’origine complètement différente.
 Liga@on  
(u@lisa@on  de  l’ADN  ligase)  
La  liga@on    
Une enzyme, la ligase, est capable
de lier de façon covalente deux
molécules d’ADN en une.
La  liga@on    
Introduc@on  de  l’ADN  recombinant  dans  des  
cellules  hôtes:    
 
Transforma@on  
Transforma@on  
Transforma@on  

 Le  fragment  d’ADN  libre  d’une  bactérie  

donatrice  est  directement  introduit  dans  une  
bactérie  réceptrice  qui  fait  apparaître  une  
modifica@on  de  caractère.  
Amplifica@on  de  l’ADN  recombinant    
dans  les  cellules  hôtes  
 
 Cul@va@on  des  bactéries  transformées  en  présence  
d’un  an@bio@que  
 

 
Les  bactéries  résistantes  à  l’an>bio>que  sont  celles  qui  
ont  intégré  les  plasmides  recombinants.  
Recapitula@f:  Clonage  d’un  gène  

U>liser  une  enzyme  de  restric>on  pour  extraire  

des  fragments  d’ADN  du  génome  source.  
 
U>liser  la  même  enzyme  de  restric>on  pour  
ouvrir  un  plasmide.  
 
Intégrer  les  fragments  à  insérer  dans  le  
plasmide  avec  un  gène  de  résistance  à  un  
an>bio>que.  
 
Cul>ver  les  bactéries  puis  sélec>onner  les  
bactéries  résistantes  à  l’an>bio>que  qui  sont  
celles  qui  ont  intégré  les  plasmides  
recombinants.  
 
Mul>plier  les  bactéries  sélec>onnées  pour  
cloner  les  plasmides  recombinants.  

Banque  génomique    
Banques  genomiques  

36  
Banques  génomiques  
Banques  d’ADN  complémentaire  
(ADNc)
Banque  d’ADNc  
 Banque  d’ADNc  
1.  Isolate  mRNAs    
from  cells.

mRNA
2.  Use  reverse  transcriptase    
to  make  a  DNA  that  is  
cDNA complementary  to  each  RNA.  Use  
DNA  polymerase  to  make  the  
single  stranded  cDNA  double-­‐
stranded.
mRNA
Reverse  
transcriptase
3.  Add  each  DNA  
to  a  plasmid  and  
insert  into  E.coli  
cells.

cDNA  library
Collec>on  of  
cDNAs  in  library  
represents  DNA  
from  each  
ac>vely  
transcribed  gene.