Diapositiva 1.

La pérdida de inocuidad de un producto puede ser debido a la presencia de microorganismos

patógenos, los cuales pueden albergar en diferentes partes de nuestro entorno, es por ello que es
importante realzar los controles microbiológicos, ya que estos nos permiten obtener información
sobre la presencia o no de microorganismos en el producto. Además, con estos controles podemos
identificar qué clase de microorganismo se trata.

El análisis microbiano de productos farmacéuticos, materias primas empleadas, agua, aire,

equipamiento o material de empaque, son vitales para minimizar el tipo y número de
microorganismos presentes. Sabemos que los medicamentos se encuentran constituidos por
componentes como almidón, azucares etc., brindando un ambiente propicio rico en nutrientes
para el crecimiento de los microorganismos.

Con varias tecnologías diferentes disponibles en el mercado, el microbiólogo tiene que tomar una
decisión difícil, y a veces costosa, al seleccionar el método óptimo. Es por ello que en este
seminario abordaremos las diferentes ventajas y usos que ofrecen los métodos microbiológicos
rápidos, así como también se explicaran algunos de los tipos de RMM y algunos criterios para la
selección de estos métodos.

Diapositiva 2.

Los métodos microbiológicos convencionales, incluidos los que se encuentran establecidos y

descritos en la farmacopea europea (Ph. Eur.), japonesa y estadounidense (USP), han servido
durante mucho tiempo para garantizar la producción de productos microbiológicamente seguros.
Por ejemplo, se ha verificado con éxito una amplia gama de métodos microbiológicos utilizando
métodos de recuento en placa para enumerar e identificar microorganismos (dentro de un margen
de error aceptado). Sin embargo, los métodos convencionales tienen limitaciones. Estas
limitaciones incluyen el tiempo necesario para producir un resultado, el cual se relaciona con el
período de incubación requerido para los métodos convencionales, ya que dependen del agar
como medio de crecimiento, o para que los microorganismos crezcan en el cultivo de caldo. Dichos
métodos son relativamente lentos y los resultados solo están disponibles después de un período
de incubación (entre 2 y 10 días, según la aplicación). Otra limitación es la incapacidad de muchos
métodos para recuperar todos los microorganismos que podrían estar presentes en una muestra.

Una limitación adicional es la capacidad de cultivo y la cuestión de los microorganismos viables,

pero no cultivables (VBNC). Muchas bacterias, aunque mantienen la actividad metabólica, no son
cultivables debido a su fisiología, rigurosidad o mecanismos de adaptación al medio ambiente.

Diapositiva 3.

Estas preocupaciones con las limitaciones de los métodos convencionales, así como las
posibilidades que ofrecen los avances tecnológicos, condujeron a una nueva generación
emergente de métodos microbiológicos rápidos. Los RMM incluyen cualquier técnica o proceso
microbiológico que aumente la velocidad o la eficiencia de aislar, cultivar o identificar
microorganismos en comparación con los métodos convencionales, pero según la FDA los RMM,
se basan en tecnologías que pueden ser marcadores celulares basados en el crecimiento, la
viabilidad o los sustitutos de un microorganismo (es decir, a base de ácido nucleico, a base de
ácido graso). Los RMM se automatizan con frecuencia, y muchos se han utilizado en laboratorios
clínicos para detectar microorganismos viables en muestras de pacientes. Según los informes,
estos métodos poseen una mayor sensibilidad para detectar cambios en la matriz de la muestra
(por ejemplo, subproductos del metabolismo microbiano), en condiciones que favorecen el
crecimiento de microorganismos.

Estos métodos tienen como objetivo, proporcionar resultados de prueba más sensibles, exactos,
precisos y reproducibles en comparación con los métodos convencionales basados en el
crecimiento.

Diapositiva 4.

Los RMM se pueden aplicar a una variedad de pruebas microbiológicas, que incluyen materias
primas, agua, productos intermedios, productos finales y monitoreo ambiental. Existe una gama
suficiente de RMM para proporcionar una evaluación de la calidad microbiológica en toda una
operación de producción. Además, Los RMM también pueden ser utilizados por investigación y
desarrollo. Por ejemplo, para comprender mejor las formulaciones de productos en términos de si
es probable que los microorganismos sobrevivan o no.

Los RMM se utilizan esencialmente como alternativas a cuatro tipos principales de

determinaciones microbiológicas convencionales:

 (p. Ej., Mediciones de turbidez de enriquecimiento del crecimiento). Por ejemplo, para
determinar si Escherichia coli está en una muestra de agua.
 (p. Ej., Métodos de recuento en placa para determinar la carga biológica de una muestra)
 (por ejemplo, ¿qué nivel de endotoxina hay en la muestra?)
 (p. Ej., Caracterización bioquímica y morfológica).

Diapositiva 5.

Algunas de las ventajas que ofrecen los métodos rápidos, tenemos el tiempo para producir los
resultados, lo cual permite tomar acciones correctivas más rápidas. Otra ventaja importante es el
rendimiento. La mayoría de los sistemas rápidos permiten volúmenes más altos que el método
tradicional. En entornos con volúmenes considerables de materias primas, lotes en proceso y
productos finales para probar, un alto rendimiento puede conferir una ventaja importante para
mantener el tiempo de actividad de fabricación.

Otras ventajas incluyen la eficiencia laboral y la reducción de errores. La reducción de errores es

uno de los mayores beneficios potenciales de la enumeración rápida. Si bien algunos métodos
requieren una intervención humana adicional y, por lo tanto, crean un mayor potencial de errores,
otros automatizan los procesos más propensos a errores.

diseñar procesos más robustos que puedan reducir las oportunidades de contaminación y también
ayudan a desarrollar un proceso de acción correctiva y preventiva más eficiente.

Además, al considerar un RMM, el nuevo método debe ofrecer un mayor nivel de garantía de
calidad. Es necesario que haya un beneficio claro y demostrable al adoptar el método alternativo.

Ejemplos de esto incluyen:

● la capacidad de tomar decisiones comerciales críticas más rápidamente;

● la detección de microorganismos "objetables";

● recuperación de números microbianos más altos o precisos;

Debido a estas ventajas, los RMM son áreas de considerable inversión por parte de los vendedores
y atraen el interés de los microbiólogos.

DEMAS DIAPOSITIVAS

17.5 Tipos de métodos microbiológicos rápidos

La RMM o los métodos alternativos se pueden clasificar en varios medios. Una forma es basada en
la tecnología o aplicación. Aquí, según la Ph. Eur., Los métodos pueden agruparse en seis
categorías.

17.5.1 Métodos basados en el crecimiento

Los métodos basados en el crecimiento son aquellos en los que generalmente se logra una señal
detectable después de un período de subcultivo (por ejemplo, métodos electroquímicos). Estos
métodos generalmente implican la medición de parámetros bioquímicos o fisiológicos que reflejan
el crecimiento de microorganismos. Estos métodos tienen como objetivo disminuir el tiempo en el
que se puede detectar microorganismos en crecimiento activo.

 Microbiología de impedancia: es una técnica microbiológica, que se se basa en la

medición de un parámetro eléctrico, la impedancia, entre un par de electrodos
sumergidos en un medio de cultivo inoculado, con el fin de cuantificar los
microorganismos presentes en la muestra.
el cambio en la conductancia del medio se debe a los productos metabólicos generados
por el crecimiento de microorganismos. Sustancias débilmente cargadas son
transformadas en productos terminales altamente cargados. Por ejemplo, la ruptura de
proteínas en aminoácidos, de lípidos en acetatos o de carbohidratos en lactatos. Todos
estos productos finales metabólicos portan grandes cargas eléctricas, son más pequeños y
por lo tanto muestran una mayor movilidad que las sustancias originales. En el caso de
bacterias, la mayor contribución a los cambios de conductancia del medio proviene de la
actividad proteolítica, mientras que el metabolismo de los carbohidratos es de menor
importancia.

El procedimiento que emplea, se basa en la medición del Tiempo de Detección de Umbral

(TDU). Después de que se inocula un medio de cultivo con una alícuota de la muestra de
 interés, se espera que los microorganismos crezcan y se multipliquen hasta alcanzar una
concentración determinada. Este valor es el que produce una señal detectable de
impedancia, en un determinado momento del tiempo (el TDU).
 ● La detección de dióxido de carbono. Tales métodos despliegan un sensor de dióxido de
carbono colorimétrico interno. El sensor se puede colocar dentro de una botella de medio
(separado del medio por una membrana semipermeable). Como el dióxido de carbono es
producido por metabolismo microbiano se difunde a través de la membrana, se disuelve
en agua en el sensor y genera hidrógeno iones, que dan como resultado un cambio de
color detectado por un detector colorimétrico. La luz emitida por el detector se refleja en
el sensor hacia un fotómetro. La señal de voltaje resultante es proporcional a la intensidad
de la luz reflejada y a la concentración de dióxido de carbono en la botella de medios.
 Las pruebas bioquímicas: permiten determinar las características metabólicas de las
bacterias objeto de identificación. Algunas de estas pruebas son técnicas rápidas, ya que
evalúan la presencia de una enzima preformada y su lectura varía entre unos segundos
hasta unas pocas horas. Utilización de sustratos bioquímicos: Determina la capacidad de
un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de amoniaco por acción del
enzima ureasa.
 El uso de imágenes digitales y auto fluorescencia para la detección rápida y el recuento
de micro colonias. Este método resuelve el problema de los métodos de cultivo en los que
la visualización de colonias requiere varios días. El método rápido utiliza láseres para
escanear microorganismos que crecen en filtros de membrana con imágenes ópticas
utilizando una cámara digital. Esta técnica permite la detección y enumeración de micro
colonias en unos pocos días. Una ventaja de esta técnica es que los microorganismos
permanecen viables para su identificación después las colonias se vuelven visibles.
 Tinción fluorescente y recuento de microcolonias mediante excitación láser. Este método
es similar al descrito anteriormente
 La técnica de la PCR es una herramienta muy importante para la detección de ADN de
bacterias y hongos causantes de infecciones oculares. Permite amplificar el material
genético del agente etiológico y facilita su observación, obteniéndose los resultados en
menor tiempo que con las técnicas convencionales.