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Biophysique pharmaceutique

SPECTROPHOTOMÉTRIE D’ABSORPTION MOLÉCULAIRE


DANS L’ULTRAVIOLET ET LE VISIBLE
La spectrophotométrie d’absorption moléculaire dans l’Ultraviolet et le Visible est l’une
des méthodes d’analyse les plus utilisées en pharmacie. Elle est basée sur l’interaction
entre un rayonnement électromagnétique du domaine de l’Ultraviolet et du visible avec
des molécules. Elle est inscrite à la Pharmacopée européenne 7e édition.

I- Radiations électromagnétiques :
1- Définition :

Une onde électromagnétique est caractérisée par la vibration d’un champ électrique ⃗E et
d’un champ magnétique ⃗H
⃗.
⃗ et H
E ⃗⃗ sont perpendiculaires entre eux, et transversales (perpendiculaires à la direction
1de propagation de l’onde).
⃗ et H
Les amplitudes de E ⃗⃗ varient sinusoïdalement avec le temps.

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La vibration se fait dans toutes les directions dans un plan perpendiculaire à la direction
⃗ et H
de propagation de l’onde lumineuse. Autrement dit ; E ⃗⃗ changent constamment de
direction de vibration, tout en restant perpendiculaires entre eux.
Une radiation électromagnétique monochromatique est caractérisée par une longueur
d’onde  bien déterminée.
2- Caractéristiques d’une radiation électromagnétique :

On peut définir une onde électromagnétique qu’est une fonction sinusoïdale par : la
longueur d’onde , la période T, la fréquence  et l’énergie E
Longueur d’onde  :

=CT

La longueur d’onde  est l’équivalent spatial d’une période T. Elle est donc la distance
parcourue par l’onde durant un temps T.

: Longueur d’onde exprimée en m, µm ou nm.


C : Célérité de la lumière dans le vide soit 3 . 10 8m/s
T : Période :

Période T :
La période est le temps au bout duquel le phénomène vibratoire est identique à lui-
même.
Fréquence  :

La fréquence pour une unité de temps est le nombre de fois que le phénomène
ondulatoire se reproduit identique à lui-même.
Si le temps est exprimé en secondes, la fréquence est mesure en Hertz (Hz).

 

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Nombre d’onde  :

En spectroscopie, le nombre d’onde est le nombre d’oscillations de l’onde par unité de


longueur. Le nombre d’onde est exprimé en cm-1. Il est utile en spectroscopie infrarouge.
Energie E :
Selon la théorie corpusculaire de la lumière, une radiation électromagnétique se
comporte comme si une énergie était concentrée dans un corpuscule appelé photon.
Chaque photon transporte un quantum d’énergie :

E : Energie en joule
h : Constante de Planck h=6,62 . 10-34 Joule.s
Fréquence (s-1) ou Hertz
Cette relation montre que l’énergie est inversement proportionnelle { la longueur
d’onde.
L’ensemble des radiations électromagnétiques se distribue en longueurs d’onde selon le
tableau suivant :
Région Longueur d’onde  (nm) Nombre d’onde  (cm-1)
UV lointain 10 à 200 103 – 50.103
UV proche 200 à 380 50 000 – 26 300
Visible 380 à 780 26 300 – 12 800
IR proche 780 à 3000 12 800 – 3 333
IR moyen 3000 à 30 000 3 333 – 333
IR lointain 30 000 à 300 000 333 – 33,3
Micro-ondes 300 000 à 109 33,3 – 0, 01

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II- Etats énergétiques d’une molécule :


1- Quantification de l’énergie :
Il faut faire la différence entre une énergie continue et une énergie discontinue.

o En mécanique classique :
L F T
⃗⃗⃗
W ⃗
F ⃗
E
L’énergie est continue, elle prend des valeurs de 0 { , parce qu’on peut varier comme
on veut. Il n’y a pas de valeurs interdites.

o En mécanique quantique :
L’énergie est discontinue, parce qu’il existe des états énergétiques qui peuvent prendre
des valeurs permises : E , E , E ….
Les autres valeurs énergétiques sont interdites.

2- Etats énergétiques d’une molécule :


Les molécules ne peuvent emmagasiner l’énergie que d’une manière discontinue :
l’énergie est quantifiée.
L’énergie totale d’une molécule est la somme de 3 énergies quantifiée et une énergie non
quantifiée : l’énergie de translation.
E E E E E
L’énergie de translation est due { l’agitation thermique, elle n’intervient pas en
spectroscopie.
L’énergie de rotation est due aux mouvements de rotation de la molécule.
L’énergie de vibration est celle des atomes les uns par rapport aux autres.
L’énergie électronique provient du changement d’orbitale d’un électron.
E E E
L’énergie électronique est très élevée par rapport { l’énergie vibrationnelle et
rotationnelle.

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Pour l’énergie électronique, les niveaux sont très éloignés ; pour l’énergie de vibration,
ils le sont beaucoup moins, de tette sorte que l’on peut observer de nombreux niveaux
énergétiques de vibration { l’intérieur d’un intervalle d’énergie électronique.
De même, les niveaux d’énergie de rotation sont encore beaucoup plus rapprochés que
ceux de vibration, si bien qu’ici, un grand nombre de niveaux d’énergie rotationnelle
existent { l’intérieur d’un seul intervalle entre deux niveaux de vibration.

Dans le domaine de l’UV-Visible c’est l’énergie électronique qui sera mise en cause.

III- Phénomène d’absorption :


Considérons une molécule caractérisée par les états énergétiques suivants : E : état
fondamental, E , et E

Cette molécule est soumise { une radiation électromagnétique d’énergie .

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Il peut ne rien se passer si est différente de


Maintenant, si la radiation possède une énergie qui correspond à la transition
électronique permise c.-à-d. lorsque , cette radiation est absorbée et la
molécule est excitée c.-à-d. elle passe de l’état fondamental { un niveau énergétique
supérieur.
Cette état ne dure pas longtemps, l’énergie acquise peut être dissipée par un certain
nombre de mécanismes : transformation en chaleur, vibration des atomes constituant la
molécule.

IV- Aspects quantitatifs :


Soit la cuve de mesure de longueur l contenant un composé absorbant à la concentration
C.

Considérons une tranche de solution d’épaisseur dx. L’intensité lumineuse qui y pénètre
est I et celle qui en sort est I+dI.
L’intensité dI est proportionnelle à :
- L’épaisseur dx.
- L’intensité lumineuse incidente I.
- La concentration C.
Dans une partie de la solution d’épaisseur dx :
I IC
k : est un facteur de proportionnalité
I
C
I
I0 est l’intensité d’entrée dans la cellule (x=0)
It est l’intensité de sortie de la cellule (x= )

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L’intégration entre ces deux limites nous donne :


I
∫ ∫ C
I

I
∫ C∫
I
I I C
I I
C
I I
Finalement, on a :
I I
On définit :
- La transmittance T : exprimée pourcentage.

- L’absorbance : appelée encore densité optique

L’absorbance est un nombre sans dimensions.


On a donc :

I I
I I
I
A
I
A C A C
Finalement :

 ℓ est la longueur de la cuve exprimée en cm


 K est une constante de proportionnalité qui dépend de la longueur d’onde de la
radiation absorbée, de la nature de la molécule et du mode d’expression de la
concentration :
- Si C est exprimée en mole/l, K est notée , appelée coefficient d’absorption
molaire et exprimée en (mol/l)-1 cm-1 et
- Si C est exprimée en g/100 ml, K est notée appelée coefficient
d’extinction spécifique et exprimée en (g/100ml)-1 cm-1 et

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Additivité de la loi de Beer – Lambert :

La loi de Beer – Lambert est additive : l’Absorbance d’un mélange de substances aux
concentrations C , C , C
A A A A

Conditions de validité de la loi de Beer – Lambert :


 La lumière incidente est monochromatique.
 La lumière incidente doit être stable et intense.
 La solution doit être limpide.
 La concentration doit être faible.
 Aucune réaction chimique ne doit se produire.
 Substance non fluorescente

V- Appareillage :

Un spectrophotomètre UV-Visible est constitué schématiquement de :


o UNE SOURCE DE LUMIERE :
C’est soit une lampe à filament de Tungstène pour des longueurs d’onde comprises entre
350 et 2500 n.m ou une lampe à à Hydrogène ou à Deutérium pour des longeurs d’onde
comprises entre 160 et 375 n.m
La lampe la plus utilisée est la lampe de Deutérium car elle fournit un rayonnement plus
intense. L’association de ces deux lampes permet de couvrir tout le spectre.

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o MONOCHROMATEUR :
Peut être un filtre (d’absorption ou interférentiel), un prisme ou un réseau de
diffraction.
N.B : Selon les exigences de la pharmacopée européenne, les analyses de contrôle des
matières premières et de préparations pharmaceutiques doivent être avec un
monochromateur à réseau de bande passante < 2 nm.

o CUVE OU CELLULE :
Elle contient de 1 à 3 ml de solution. Les cuves en plastique sont utilisées pour les
mesures dans le visible et en milieu aqueux.
Cuves en verre : pour les mesures dans le visible et en milieu aqueux ou organique.
Cuves en quartz : pour les mesures dans le domaine de l’ultraviolet.
Il est nécessaire lors de la manipulation des cellules de :
 de les saisir par leurs faces mates.
 de vérifier l’absence de bulles de gaz dans la solution.
 de vérifier l’absence de traces ou de rayures sur les faces transparentes.
 de les rincer avant chaque mesure avec la solution de l’échantillon.

o DETECTEUR :
Le détecteur photoélectrique convertit le signal lumineux en signal électrique.
Il est soit :
 Un photomultiplicateur : cellule photoélectrique associée à une série de dynodes.
 Détecteur { barette de diodes : composé d’une grande quantité de diodes (jusqu’{
2000).

VI- Applications :
1- Analyse qualitative :
Il s’agit de réaliser les spectres d’absorption de la molécule A connue dite de référence et
de la molécule B inconnue, et qu’on veut déterminer s’il s’agit de la molécule A ou non.
On obtient deux spectres d’absorption : Si les deux spectres sont homothétiques on
conclue qu’il peut s’agir de la même molécule, et si les deux spectres ne sont pas
homothétiques on conclue que les deux molécules ne sont pas les mêmes.

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Deux spectres homothétiques


La spectrophotométrie UV-Visible est utilisée également dans le contrôle de la pureté
des matières premières : la présence d’impuretés peut modifier le spectre UV-Visible et
se traduire par des changements de positions des maxima d’absorption.
La pharmacopée européenne fournit plusieurs protocoles pour la mise en évidence de
ces substances.
2- Analyse quantitative :
La spectrophotométrie est une méthode utilisée fréquemment en analyse quantitative.
C’est une méthode relative, elle implique la réalisation d’une courbe d’étalonnage
A = f (C), à partir de solutions de concentration connues. Le dosage se fait à la longueur
d’onde d’absorption maximale.

A l’aide d’une méthode statistique (régression linéaire par la méthode des moindres
carrés), on obtient l’équation d’une droite de la forme : y = a x + b
On mesure après l’absorbance de la solution de concentration inconnue, et on calcule la
valeur de sa concentration { partir de l’équation de la courbe.
Parmi les nombreuses applications de le spectrophotométrie UV-Visible :
 L’environnement : polluants de l’eau, atmosphère.
 Pharmacie : contrôle des eaux d’hémodialyse, identification et dosage des
matières premières et des produits finis.
 Agro-alimentaire.
 Biologie clinique : glycémie, urée, créatinine, cholestérol, ..etc.

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