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Dossier scientifique

Rôle du laboratoire de biologie médicale


dans le diagnostic microbiologique
des bactéries anaérobies
Yann Dumont1,2, Anne-Laure Michon1, Chrislène Laurens1, Lucas Bonzon1, Sylvain Godreuil1,2,
Hélène Jean-Pierre1,*
1 Hôpital Arnaud de Villeneuve, CHU de Montpellier, Laboratoire de bactériologie, Université de Montpellier, 191 avenue du Doyen
Gaston Giraud, 34295 Montpellier Cedex 5, France
2 UMR MIVEGEC IRD-CNRS-Université de Montpellier, IRD, Montpellier, France.
*Auteur correspondant : h-jean_pierre@chu-montpellier.fr (H. Jean-Pierre)

RÉSUMÉ
L’étude des bactéries anaérobies connaît un regain d’intérêt du fait de la description de leur importance dans les micro-
biotes et dans les processus infectieux. De nombreux outils commercialisés (milieux de transport, géloses et bouillons,
systèmes assurant l’anaérobiose) permettent à ce jour leur culture à partir des échantillons cliniques. La spectrométrie de
masse de type MALDI-TOF, éventuellement complétée par le séquençage de l’ARN 16S, a révolutionné leur identification,
y compris pour des espèces d’isolement moins fréquent, et diminué considérablement le délai de rendu des résultats. Les
techniques phénotypiques conventionnelles, s’appuyant sur une série de tests facilement utilisables en routine et peu coû-
teux (microscopie, tests biochimiques rapides et taxodisques) permettent d’identifier les principaux genres d’importance
clinique et parfois les espèces mais impliquent un délai de réponse de 48 h Étant donné l’évolution de la résistance aux
antibiotiques de certaines bactéries (Bacteroides, Parabacteroides, Prevotella, cocci à Gram positif anaérobie) il est souhai-
table de tester leur sensibilité surtout dans le cadre d’infections monomicrobiennes ou d’infections mixtes impliquant des
bactéries potentiellement résistantes. Les techniques de routine facilement utilisables et flexibles reposent actuellement
essentiellement sur les bandelettes imprégnées d’un gradient d’antibiotique. La méthode de référence (dilution en gélose)
est réservée aux laboratoires spécialisés.

ABSTRACT
Role of medical biology laboratory in the microbiological dia-
gnosis of anaerobic bacteria
There is a renewed interest in the study of anaerobes bacteria because of their role in
microbiota and in infectious processes.Various commercially available systems (trans-
port media, solid culture media and broth, systems providing suitable anaerobic envi-
ronment) allow to isolate anaerobic bacteria successfully from clinical specimens.The
MOTS CLÉS use of matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry,
◗ antibiogramme eventually supplemented by 16S rRNA gene sequencing, has revolutionized identifi-
◗ bactéries anaérobies cation of anaerobes, with quickly and accurately results even for unusual anaerobes.
◗ culture Conventional phenotypic techniques based on routinely usable and cost-effective tests
◗ identification (microscopy, rapid biochemical tests and special potency antibiotic disks) lead to an
identification of main clinically relevant anaerobes at the genus level and sometimes
KEY WORDS at the species level but is time consuming. Because significative change in resistance
◗ anaerobic bacteria patterns of many anaerobes (Bacteroides, Parabacteroides, Prevotella, anaerobe Gram
◗ antibiogram positif cocci), antimicrobial susceptibility testing (AST) is recommended, especially in
◗ culture the case of monomicrobial infections or mixed infections incriminating potentially
◗ identification resistant bacteria. Methodology for easy and flexible routine AST of anaerobic bacteria
is essentially based to date on the use of gradient strips. Agar dilution, considered as
the reference standard for AST remains reserved for specialized laboratories.
© 2018 – Elsevier Masson SAS
Tous droits réservés.

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Les bactéries anaérobies

Introduction commensaux souvent très riches en bactéries anaéro-


bies. Les échantillons prélevés par écouvillonnage de
Les bactéries anaérobies restent encore trop souvent les sites où ces microbiotes sont naturellement présents
« mal aimées » et les « laissées pour compte » dans les ne doivent pas faire l’objet d’une recherche de bacté-
laboratoires spécialisés en bactériologie. Plusieurs causes ries anaérobies : écouvillons de gorge, expectorations,
peuvent en être responsables : nature des échantillons aspirations endotrachéales ou bronchiques, écouvil-
parvenant au laboratoire, échantillons potentiellement lons vaginaux, écouvillons réalisés en superficie d’une
contaminés par de la flore commensale, coût des milieux plaie chronique sans débridement ni décontamination
de transport et des techniques d’anaérobiose, culture plus cutanée, urines (à l’exception des urines prélevées par
lente, difficultés d’identification au sein des flores mixtes ponction sus-pubienne et des urines pyéliques), selles
associant des bactéries aérobies ou aéro-anaérobies (à l’exception d’une recherche de Clostridium difficile ou
facultatives en l’absence de géloses sélectives, difficul- dans le cadre de l’entérocolite ulcéro-nécrosante du
tés d’identification du genre et de l’espèce, absence de nouveau-né). Par contre les échantillons de liquides ou
recommandations actuelles pour la réalisation en rou- de collections purulentes, d’abcès (de préférence préle-
tine de tests de sensibilité aux antibiotiques, vés soit par ponction ou aspiration à l’aiguille, soit
et, en conséquence de l’ensemble de ces en per-opératoire), les biopsies tissulaires ou
difficultés techniques, rendu tardif des osseuses, les prélèvements pulmonaires
résultats. Et pourtant les infections protégés et les prélèvements pro-
bactériennes incriminant des bacté- fonds de plaies chroniques doivent
Les avancées être mis en culture en anaérobiose.
ries anaérobies seules ou en asso-
ciation ne sont pas rares, voire technologiques Pour tout échantillon destiné à la
recherche de bactéries anaéro-
même en augmentation du fait du moléculaires actuelles bies, il faut éviter l’exposition à
nombre de plus en plus élevé de
patients présentant des comorbi- ont permis de découvrir l’oxygène et au froid. Les milieux
de transport pour anaérobies
dités (diabète, néoplasies, immu- un grand nombre de sont à privilégier, et sont même
nodépression). Les avancées tech-
nologiques moléculaires actuelles
bactéries anaérobies, obligatoires si le prélèvement a été
fait par écouvillon. Le transport se
ont permis de découvrir un grand
fait rapidement (idéalement en moins
nombre de bactéries anaérobies, la plu-
de 2 h mais reste acceptable sur milieu
part appartenant au microbiote digestif ou
de transport jusqu’à 48 h) et à température
au microbiote oral, mais aussi des pathogènes
ambiante. L’utilisation de flacons d’hémoculture doit
émergents comme Atopobium deltae ou Eisenbergiella
être réservée aux liquides a priori monomicrobiens
tayi [1]. Par ailleurs les bactéries anaérobies (surtout
(liquide articulaire, liquide d’ascite) car, dans le cadre
au sein des genres Bacteroides/Parabacteroides mais aussi
d’infections mixtes (pleurésie purulente et péritonites
des Prevotella et des cocci à Gram positif) ont acquis
par exemple), ces flacons contenant des facteurs de
des résistances aux antibiotiques, certaines espèces de
croissance peuvent donner un avantage aux bactéries
Bacteroides étant même rapportées comme multirésis-
aéro-anaérobies de culture plus rapide. Il est alors préfé-
tantes, compromettant parfois les traitements anti-infec-
rable d’utiliser des milieux de transport pour les liquides
tieux [2,3]. Ce chapitre a pour objectif de « dédramati-
(type Portagerm®). La survie des bactéries anaérobies
ser » la recherche de bactéries anaérobies au laboratoire
reste cependant possible au sein d’un pus de volume
de la culture à la réalisation de tests de sensibilité et
prélevé supérieur à 1 mL ou au sein d’une biopsie de
d’encourager les microbiologistes à s’y intéresser.
plus de 1 cm3.

Les anaérobies : Les anaérobies :


étape pré-analytique étape analytique
Avant d’entreprendre une recherche de bactéries anaé-
robies il est essentiel de s’assurer de la qualité de l’échan-
Examen direct
tillon. Les bactéries anaérobies sont abondantes voire L’examen direct par coloration de Gram peut per-
prédominantes dans les différents microbiotes commen- mettre de reconnaitre des morphologies cellulaires
saux (cavité orale, peau, tractus des voies aériennes supé- évocatrices (longs bacilles à Gram négatif effilés pour
rieures, digestif, urogénital), et la majorité des infections Fusobacterium, bacilles à Gram positif trapus à bout car-
les incriminant sont d’origine endogène, par rupture des rés pour Clostridium perfringens, filaments Gram positif
barrières cutanéo-muqueuses. Le prélèvement doit per- branchés pour Actinomyces,…) ou montrer un polymor-
mettre d’éviter une contamination par les microbiotes phisme témoignant d’une infection polymicrobienne.

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À noter que la présence d’un petit bacille à Gram posi- de leurs quantités respectives observés sur la gélose au
tif dans une urine, bien que la coloration de Gram ne sang anaérobie avec les résultats de la culture aérobie, et
soit plus réalisée systématiquement dans tous les labo- l’observation de colonies caractéristiques (Fusobacterium,
ratoires, doit faire penser à un Actinotignum qui cultive Clostridium, colonies pigmentées de certaines Prevotella
préférentiellement en anaérobiose. ou Porphyromonas,…), conduisent à suspecter ou non
la présence de bactéries anaérobies. Il faut savoir à cette
Ensemencement étape que certaines bactéries non classées dans les anaé-
robies stricts peuvent en primoculture ne cultiver qu’en
L’ensemencement doit comporter au minimum une anaérobiose : les streptocoques « du groupe milleri » et
gélose au sang (Columbia, Brucella ou Schaedler) et un notamment l’espèce S. constellatus, d’autres streptocoques
bouillon en tube ensemencé à la base en évitant l’in- (S. pyogenes, S. pneumoniae), Eikenella corrodens…
troduction d’air (type Schaedler enrichi en vitamine K1 De même certaines bactéries comme Pseudomonas aerugi-
et hémine). Il est possible pour les échantillons poly- nosa (capable de respirer les nitrates), Haemophilus influen-
microbiens d’ajouter des géloses sélectives comme par zae (qui perd sa double dépendance en anaérobiose) et
exemple une gélose Schaedler au sang additionnée de certains mycoplasmes (M. hominis, M. salivarium) peuvent
vancomycine et de néomycine. Ces antibiotiques per- cultiver sur une gélose enrichie au sang en anaérobiose.
mettent d’inhiber la croissance de la majorité des bacilles Si on suspecte la présence de bactéries anaérobies la
à Gram négatif aéro-anaérobies facultatifs et aérobies décision de poursuivre l’analyse par des identifications et
stricts et la plupart des bactéries à Gram positif et auto- éventuellement des antibiogrammes dépend de la nature
risent la culture des Bacteroides, des Prevotella et des Fuso- de l’échantillon et du polymorphisme bactérien observé.
bacterium (mais pas des Porphyromonas). Il est possible dans certains cas de signaler simplement la
présence d’une flore anaérobie polymorphe afin que le cli-
Anaérobiose nicien puisse en tenir compte dans le traitement éventuel
instauré. Cependant, il est souhaitable, en particulier dans
La mise en anaérobiose des géloses ensemencées doit
les processus infectieux développés aux dépens de la flore
être rapide dans les 15 à 20 minutes. Selon l’importance
digestive endogène (liquides péritonéaux, abcès d’organes),
du plateau technique on peut avoir recours à des sachets
d’identifier les Bacteroides du groupe fragilis et de contrôler
ou à des jarres utilisant des générateurs d’anaérobiose,
leur sensibilité aux principaux antibiotiques utilisés dans
à des systèmes d’évacuation/remplacement (Anoxomat®
ce contexte. En effet, c’est au sein de ce groupe que la
par exemple), voire à une chambre anaérobie qui reste le
résistance a le plus évolué. Dans des échantillons précieux
gold standard mais n’est pas obligatoire pour cultiver la
(hémoculture, infection ostéo-articulaire, abcès du cer-
majorité des bactéries anaérobies d’intérêt clinique. Pour
veau), ou dans le cadre d’une culture monomicrobienne
les deux premières techniques, un indicateur d’anaéro-
(quel que soit le foyer infectieux), il est important d’iden-
biose de type résazurine doit être ajouté. Pour rappel,
tifier la ou les différentes bactéries cultivées.
l’atmosphère anaérobie se définit par un mélange de
La poursuite de l’identification dépend de l’équipement
5 à 10 % d’hydrogène, de 5 à 10 % de CO2 et d’azote
du laboratoire. Si la spectrométrie de masse est dispo-
qsp 100 %.
nible (technique MALDI-TOF), les différentes colonies
Il est préférable, si on ne dispose pas de chambre anaéro-
sont répertoriées, identifiées et repiquées en parallèle
bie, de ne techniquer les géloses ensemencées qu’après
sur une gélose au sang en anaérobiose. La technique
48 h d’incubation afin de ne pas exposer à l’oxygène de
MALDI-TOF ne nécessite que très peu de matière bac-
l’air certaines bactéries de culture plus tardive et qui
térienne et le plus souvent il est possible à partir d’une
seraient alors seulement en phase de croissance expo-
colonie isolée de réaliser un fin dépôt et un repiquage.
nentielle. Après l’observation à 48 h, les géloses sont
Si les colonies sont trop fines ou mal isolées dans une
incubées à nouveau pour une durée totale d’au moins
flore mixte, il est cependant préférable de les repiquer
5 jours, voire 3 semaines dans le cadre de recherche
avant de réaliser un dépôt. Les méthodes d’extraction
d’Actinomyces. Les bouillons ne sont pas obligatoirement
des protéines par l’acide formique sont recommandées
repiqués en cas de culture sur gélose positive. Ils sont
pour certaines bactéries à Gram positif (en particulier
conservés 14 jours, permettant ainsi la culture de bac-
pour les Actinomyces). De nombreuses études témoignent
téries à croissance plus tardive comme par exemple
de la performance de cette technique de spectromé-
Cutibacterium (ex Propionibacterium) acnes.
trie de masse pour l’identification des bactéries anaéro-
bies, avec des pourcentages d’identification qui augmen-
Identification tent avec l’enrichissement des bases de données [4-8].
La première étape avant d’entreprendre une identifi- Les résultats rapides raccourcissent le délai de rendu
cation est l’observation des cultures, celle-ci pouvant de l’identification des anaérobies d’au moins 48 h. Cette
nécessiter l’aide d’une lampe loupe afin de mieux dif- technique permet aussi de faire du sous-typage pour
férencier les colonies surtout si elles sont de petite certaines espèces (Bacteroides fragilis, Clostridium difficile,
taille. La comparaison du nombre de morphotypes et Cutibacterium acnes) et d’identifier rapidement les bac-

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Les bactéries anaérobies
téries directement à partir des flacons d’hémoculture de Gram, l’étude de la mobilité entre lame et lamelle, la
[9-11]. recherche d’une catalase, d’une oxydase, d’une uréase,
Si cette technique n’est pas disponible au laboratoire (ou d’une nitrate réductase, de la production d’indole par
dans les rares cas où elle est en échec), il faut alors avoir un test rapide. On peut tester des disques (vancomy-
recours aux méthodes traditionnelles phénotypiques cine 5 μg, kanamycine 1 000 μg, colistine 10 μg et bile
après avoir fait un repiquage de chaque morphotype 1 000 μg pour les bactéries à Gram négatif, vancomy-
de colonie en parallèle sur une gélose chocolat supplé- cine 5 μg, sodium polyanéthol sulfonate (SPS) 1 000 μg et
mentée en atmosphère enrichie en CO2 et une gélose métronidazole 50 μg pour les bactéries à Gram positif)
au sang en anaérobiose afin de confirmer le caractère [12]. Ces moyens simples et peu coûteux d’identification
anaérobie. Les caractères recherchés s’appuient sur les présomptive permettent le plus souvent de se diriger
caractéristiques des colonies (taille, pigmentation brun à au sein des bactéries à Gram négatif d’intérêt clinique
noir parfois tardive de certaines Prevotella et Porphyromo- vers un genre bactérien et parfois même d’identifier une
nas, présence d’une hémolyse…), l’aspect à la coloration espèce [13] (tableau 1) mais demandent au moins 48 h

Tableau 1. Identification présomptive des principales bactéries anaérobies à Gram négatifa.


Principales bactéries
Vancomycine Kanamycine Colistine Réduction
anaérobies à Gram- Bile Catalase Oxydase Uréase Indole Pigment Mobilité
5 ␮g 1 000 ␮g 10 ␮g des nitrates
(groupes ou espèces)
Bacteroides
R R R R V - V -
du groupe fragilis
Parabacteroides R R R R V - - - -
Alistipesb R R R R V - V + -
-
Odoribacter R R R V V
Prevotella R RS V S - -+ V
Porphyromonasc S R R S V - +- +-
Tannerella R S S S V - - - -
Campylobacter R S S S -+
V V + - V
C. ureolyticus R S S S - + + + - -
C. gracilis R S S S - - + - -
Campylobacter spp. R S S S - + - + - +-
Sutterella spp. R S S R - - - + - -
Bilophila spp. R S S R + - +- + - -
Fusobacterium R S S V - - -+ V -
Leptotrichia R S S R - - - - -
Capnocytophaga spp. R S
S R S -+
- +
- V
Desulfovibrio spp. R S R V V V V V V
D. piger R S R R - - - -
D. fairfieldensis R S R R + + - +
D. desulfuricans R S R S - + - +
D. vulgaris R S R R - - + +
Selenomonas R S R S - - - - +
Centipeda periodontii R S R S - - + - +
Dialister R S R S - - - - -
Veillonellad R S S S V - - + -
a. R : résistant, S : sensible, RS : la majorité des souches sont résistantes, + : positif, - : négatif, V : variable, -+ : négatif pour la majorité
des souches, positif pour quelques, +- : positif pour la majorité des souches, négatif pour quelques.
b. L’espèce A. putredinis est non pimentée, sensible à la bile et ne fermente pas les hydrates de carbone.
c. P. catoniae est non pigmenté et résiste à la vancomycine.
d. Exceptions : V. montpellierensis et V. seminalis résistent à la colistine

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aussi de nombreuses révisions taxonomiques avec par


de délai. Ils peuvent être complétés par l’utilisation de kits exemple récemment la création du genre Peptoclostri-
commerciaux manuels ou automatisés à la recherche de
dium, du genre Clostridioides auquel est rattaché Clostri-
caractères enzymatiques et/ou de la capacité à fermen-
dium difficile ou du genre Hathewaya regroupant 3 anciens
ter certains sucres. Certaines galeries demandent une
Clostridium dont C. histolyticum [16-18]. En pratique, l’ob-
incubation en anaérobiose de 24 h., d’autres détectent
servation de spores ovoïdes ou sphériques, souvent
de manière plus rapide (4 à 6 h.) des enzymes préformés
déformantes, terminales ou subterminales orientent
mais nécessitent un fort inoculum exigeant parfois un
vers le genre, mais certaines espèces ne sporulent que
repiquage et donc un délai supplémentaire. L’identifica-
très difficilement comme C. ramosum. Il est alors pos-
tion à l’espèce est recommandée au sein du groupe fragilis
sible de réaliser un test de sporulation par chauffage à
car toutes n’ont pas les mêmes résistances aux antibio-
80 ºC 10 minutes ou par traitement à l’éthanol. Certaines
tiques. Dans le genre Fusobacterium, deux espèces d’intérêt
clinique et d’isolement fréquent, F. nucleatum et F. necropho- espèces de Clostridium prennent mal la coloration de
rum (principal responsable des phlegmons amygdaliens) Gram et apparaissent donc à Gram négatif (espèces du
peuvent être identifiés grâce à leurs caractéristiques à la complexe clostridioforme, Clostridium symbosium, Clostri-
coloration de Gram, l’aspect de leurs colonies et la dium ramosum) mais la sensibilité à la vancomycine et
production d’indole. Cependant, l’identifica- la résistance à la colistine permettent de rec-
tion à l’espèce reste difficile surtout dans tifier le Gram. Cependant certains Clostri-
les genres Prevotella, Porphyromonas et dium résistent naturellement à la vanco-
Fusobacterium du fait de la description Le genre mycine (C. innocuum, C. ramosum). Les
continue de nouveaux taxons par- colonies de Clostridium présentent
fois sans précision de leurs carac-
Clostridium , regroupe souvent des bords irréguliers et
tères enzymatiques, de l’insuffi- plus de 200 espèces sont assez larges, avec pour cer-
sance des bases de données qui taines espèces une tendance à l’en-
ne sont pas toujours mises à jour,
très hétérogènes vahissement des géloses (C. septi-
du caractère parfois peu discrimi- phylogénétiquement et cum par exemple). C. perfringens
nant des tests proposés, voire de la est facilement identifiable sur ses
morphologiquement caractères morphologiques cellu-
pauvreté des caractères positifs de
certaines bactéries. Par exemple les laires (bacille trapu à bouts carrés) et
différentes espèces de Veillonella (cocci à culturaux (colonies plates, à bords irré-
Gram négatif) ou de Dialister (coccobacille guliers et présentant une double hémo-
à Gram négatif) ne peuvent être identifiées par lyse caractéristique, mieux observée après un
des caractères phénotypiques [13]. passage de 1 heure à +4 ºC : une zone d’hémolyse
Au sein des cocci à Gram positif anaérobies (CGPA), de complète au contact de la colonie entourée d’un halo
nombreuses espèces initialement décrites dans le genre trouble de lyse incomplète). L’identification des espèces,
Peptostreptococcus ont été reclassées dans les genres Fine- en absence de spectrométrie de masse repose sur l’ob-
goldia, Parvimonas, Anaerococcus, Peptoniphilus et Gallicola puis servation de la spore et sur la recherche d’activités glu-
de nouveaux genres (Murdochiella) [14] et de nouvelles cidolytiques et protéolytiques [15] effectuées à l’aide de
espèces ont été décrits. L’identification phénotypique de kits commerciaux manuels ou automatiques.
ces espèces est peu fiable excepté par des techniques Lorsqu’on se dirige vers un bacille à Gram+ non spo-
MALDI-TOF, bien que l’enrichissement des bases de don- rulé, l’observation des caractéristiques cellulaires à la
nées ne suive pas la description des nouveaux taxons et coloration de Gram, la recherche d’une catalase, de la
qu’alors le seul recours soit l’identification génotypique. réduction des nitrates, de la production d’indole et la
On pourra cependant reconnaître sur leurs caractères sensibilité au métronidazole sont des éléments d’orienta-
cellulaires, culturaux et enzymatiques Parvimonas micra, tion importants. Un bacille diphtéroïde irrégulier ou avec
Finegoldia magna (deux CGPA d’isolement fréquent) et ramifications fera évoquer les genres Propionibacterium,
Peptostreptococcus anaerobius (sensible au SPS) [15]. Bifidobacterium et Actinomyces alors qu’un petit bacille
Quand on a affaire à un bacille à Gram positif, peu de assez régulier orientera vers un Eubacterium ou appa-
techniques faciles d’utilisation en routine autorisent renté. Le genre Propionibacterium n’a pas échappé aux
un diagnostic de genre et d’espèce. Classiquement, les changements de taxonomie [19]. Cutibacterium (ex Pro-
bacilles anaérobies à Gram positif comprennent les pionibacterum) acnes, espèce très fréquemment isolée
bacilles sporulés (Clostridium) et les non sporulés (Acti- en particulier dans les infections ostéo-articulaires sur
nomyces, Actinobaculum, Propionibacterium, Eubacterium, matériel et dans les empyèmes cérébraux post-chirur-
Atopobium et Lactobacillus pour les principaux). gicaux, a la particularité de posséder une catalase, de
Le genre Clostridium, proposé par Prazmowski en 1880, produire de l’indole et de réduire les nitrates (deux de
avec comme espèce type Clostridium butyricum regroupe ces tests positifs permettent son identification). Cutibacte-
plus de 200 espèces très hétérogènes phylogénéti- rium (ex Propionibacterium) avidum a des colonies entou-
quement et morphologiquement. Ce genre connait lui rées d’une large zone de bêta-hémolyse et ne produit

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Les bactéries anaérobies
pas d’indole. Les propionibacteries sont naturellement bolisme par chromatographie en phase gazeuse) per-
résistants au métronidazole, tout comme les Actinomyces. mettent d’identifier les bactéries d’intérêt clinique les
Le pus des actinomycoses est caractéristique avec pré- plus fréquentes, elles sont dans un certain nombre de
sence de grains blancs, jaunes ou bruns constitués par cas insuffisantes pour distinguer les espèces (cas des Pre-
l’enchevêtrement de fibrine, de polynucléaires et de votella) voire se diriger vers un genre (cas des bacilles
filaments d’Actinomyces. Les principales espèces isolées à Gram positif). Enfin pour certaines bactéries anaéro-
chez l’homme sont A. israelii, A. naeslundii, A. odontolyticus, bies, et notamment en cas d’échec de la spectrométrie
A. viscosus et A. meyeri [15]. L’espèce-type, A. israelii, est un de masse, seule l’identification génotypique est possible,
bacille à Gram positif polymorphe, filamenteux, possé- le plus souvent par séquençage du gène codant l’ARN
dant des renflements terminaux, dont les colonies sont ribosomique 16S mais qui peut être pris en défaut car
caractéristiques, irrégulières et blanches. La croissance insuffisamment discriminant (c’est le cas des espèces de
est lente, au minimum de 5 jours et jusqu’à 21 jours. Veillonella ou de Fusobacterium). D’autres gènes peuvent
Les autres espèces d’Actinomyces sont anaérobies facul- être analysés (codant pour l’ARN polymérase B rpoB, ou
tatifs (A. meyeri n’est pas ou peu aérotolérant) et poly- des protéines de choc thermique hsp par exemple) et
morphes. Ils peuvent se présenter sous la forme on peut avoir recours aussi au séquençage total qui est
d’éléments coccobacillaires chez certaines de plus en plus utilisé dans la description de
espèces (A. odontolyticus et A. meyerii), mais nouveaux taxons.
aussi sous l’aspect de fins filaments plus
ou moins ramifiés pouvant atteindre Antibiogramme
10 à 50 μm de longueur et ressem- La décision d’effectuer des tests
blant à un mycélium. Les colonies La spectrométrie de de sensibilité aux antibiotiques va
d’A. odontolyticus sont pigmentées dépendre de l’espèce identifiée,
en rouge ou brun après plusieurs masse a révolutionné du caractère monomicrobien
jours d’incubation. l’identification des ou pas de la culture et du type
Les Bifidobacterium, présents au d’échantillon. Il est important de
sein des microbiotes surtout bactéries anaérobies rappeler que les résultats des tests
intestinal mais aussi vaginal, sont de sensibilité sont indispensables
essentiellement des pathogènes pour le suivi épidémiologique de la
opportunistes et comprennent plus résistance, suivi qui permet de valider
de 40 espèces. Ces bactéries connaissent les traitements à visée anti-anaérobies.
un regain d’intérêt de par les propriétés Dans le contexte d’une infection monomi-
bienfaitrices de certaines espèces utilisées comme crobienne à bactérie anaérobie, il est nécessaire de
probiotiques. Ils doivent leur nom à leur aspect bifide à tester les antibiotiques a priori actifs et qui diffusent
la coloration de Gram mais apparaissent souvent poly- au niveau du foyer infectieux. Lorsqu’un microbiome
morphes. Ils sont anaérobies stricts (rarement microaé- mixte aéro- et anaérobie est impliqué dans le proces-
rophiles), dépourvus de catalase et réduisent les nitrates. sus infectieux, il est possible de n’étudier que les Bac-
L’identification des espèces et sous-espèces est difficile teroides du groupe fragilis qui peuvent avoir acquis des
et nécessite des techniques de séquençage [20]. Une résistances aux associations pénicillines et inhibiteurs,
espèce proche des Bifidobacterium, Alloscardovia omni- voire aux carbapénèmes et au métronidazole. Enfin
colens, donnant de petites colonies alpha-hémolytiques dans certaines infections (comme par exemple dans
sur gélose au sang, catalase négative, bien identifié par la les abcès du cerveau) plusieurs bactéries anaérobies
spectrométrie de masse, a été isolée dans divers sites peuvent être impliquées sans bactérie aérobie associée,
infectieux, principalement génito-urinaires [21]. on peut alors en fonction du nombre et des espèces
De nombreux genres bactériens sont apparentés aux tester un petit nombre d’antibiotiques ou congeler la
Eubacterium, certaines espèces d’Eubacterium y ayant culture en suivant l’évolution clinique sous traitement
été reclassées (Filifactor, Mogibacterium, Bulleidia, Pseudo- probabiliste. La méthodologie de l’antibiogramme n’est
ramibacter, Slackia, Collinsella, Holdemania, Solobacterium, pas aussi bien déterminée [22]. La technique de réfé-
Flavonifractor, Eggerthella, Paraeggerthella, Atopobium). rence proposée par le Clinical and Laboratory Standards
L’identification de ces genres et espèces n’est souvent Institute (CLSI, États-Unis) est la méthode de dilution
possible que par la spectrométrie ou par les techniques en gélose, non utilisable en routine. Des kits utilisant la
génotypiques [15]. microdilution en bouillon sont commercialisés mais ne
En conclusion de ce chapitre, il est évident que la spec- sont valides que pour les Bacteroides du groupe fragilis.
trométrie de masse a révolutionné l’identification des La méthode la plus utilisée en pratique courante est la
bactéries anaérobies. Si les techniques convention- diffusion utilisant des bandelettes contenant un gradient
nelles utilisables en routine (nous n’avons pas évoqué d’antibiotique (E-test ou MIC Evaluator). Elle n’est pas
les méthodes réservées aux laboratoires de référence parfaitement corrélée avec la technique de référence
comme l’analyse des produits terminaux du méta- (en particulier pour le métronidazole, la pénicilline G et

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l’association piperacilline-tazobactam) [23,24]. L’utilisa- Conclusion


tion des disques n’est référencée que dans le Comité de
l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie Les bactéries anaérobies ont connu et connaissent encore
(CA-SFM) de 2013. Un groupe d’experts européens tra- un bouleversement taxonomique : description continuelle
vaille actuellement dans l’objectif de la réactualiser. Selon de nouveaux taxons, reclassification de bactéries dans
les antibiotiques et les espèces la corrélation entre CMI de nouveaux genres. Ces remaniements perturbent les
et diamètres n’est pas très bonne et il faut être prudent microbiologistes et les cliniciens. Cependant de nouveaux
et ne pas hésiter à réaliser une CMI lorsque le diamètre outils permettent une identification fiable et non fasti-
est proche du seuil. Nagy et coll. ont étudié la diffusion dieuse, en particulier l’utilisation de la spectrométrie de
avec des disques en comparaison de la détermination de masse MALDI-TOF. Les moyens techniques permettant
la CMI par dilution en gélose sur 381 Bacteroides fragilis le transport, la culture, l’incubation sont facilement acces-
[25]. Ils ont conclu à une bonne corrélation pour l’imi- sibles. Il nous paraît impensable actuellement de ne pas
pénème, le méropénème, la tigécycline, la moxifloxacine rechercher les bactéries anaérobies, étant donné leur rôle
et le métronidazole, moins bonne pour les associations non négligeable dans les processus infectieux et la pos-
amoxicilline-acide clavulanique et piperacilline-tazobac- sibilité de résistance acquise compromettant l’efficacité
tam (les souches sensibles et intermédiaires présentaient thérapeutique. QQ
des diamètres identiques) et mauvaise pour la céfoxitine
bien que les souches résistantes aient été bien séparées. Liens d’intérêts : Yann Dumont déclare avoir des liens avec
Ils ont confirmé que la répartition des diamètres autour MSD France, Correvio, et Pfizer PFE France. Les autres
du disque de méropéneme permettait mieux que l’uti- auteurs déclarent ne pas avoir de liens d'intérêts.
lisation du disque d’imipénème de repérer les souches
non sauvages (porteuses du gène cfiA) avec des CMI aux
carbapénèmes augmentées. Quelle que soit la technique
Points à retenir
en diffusion utilisée (E-test ou disques) il convient de res- ◗tLes infections incriminant des bactéries anaérobies sont
pecter les règles de taille d’inoculum, de gélose à utiliser fréquentes et les échantillons prélevés dans leur contexte et
et de condition et de délai d’incubation. La gélose recom- dans le respect des conditions pré-analytiques doivent être
mandée est une gélose Brucella + 5 % de sang de mou- ensemencés en anaérobiose au minimum sur gélose au sang
ton et + vitamine K1 (1 mg/L). La lecture se fait à 48 h et bouillon d’enrichissement.
pour la clindamycine pour mieux détecter la résistance ◗tEn l’absence de chambre anaérobie, les géloses sont
inductible. Le contrôle de la qualité de l’anaérobiose est observées à 48 h et comparées aux résultats des cultures
impératif car sinon il est possible de rendre des fausses aérobies et en atmosphère CO2.
résistances au nitro-imidazolés (métronidazole). Dans ◗tL’identification par spectrométrie de masse de type MALDI-
tous les cas, un résultat intermédiaire ou résistant à ces TOF est à prioriser. En son absence, la confirmation du
caractère anaérobie et l’utilisation de tests peu coûteux
antibiotiques chez une espèce habituellement sensible
permet de se diriger vers un genre au sein des bactéries à
doit être contrôlé. Il est bien sûr recommandé de tester Gram négatif et d’identifier quelques espèces importantes en
à une fréquence définie une souche de référence (Bacte- clinique au sein des Gram positif.
roides fragilis ATCC 25285). Il est possible pour certains ◗tIl est important de vérifier la sensibilité aux antibiotiques les
bacilles à Gram négatif (en particulier les Prevotella et plus utilisés dans le traitement des infections à anaérobies car
Fusobacterium) d’effectuer une recherche de bêta-lacta- l’augmentation des résistances n’a pas épargné les bactéries
mase par un test chromogénique rapide. La positivité de anaérobies.
ce test indique une résistance aux pénicillines (pénicilline, ◗tActuellement, la technique de référence de dilution en gélose
aminopénicillines et carboxypénicillines) mais il peut être est réservée aux laboratoires spécialisés et la méthode
pris en défaut (positivité tardive, difficulté de lecture pour applicable en routine est l’utilisation des bandelettes avec
les espèces pigmentées) et ne dispense pas de la réalisa- gradient d’antibiotique en respectant les recommandations
(gélose, inoculum, anaérobiose et délai de lecture).
tion d’une CMI en cas de négativité.

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Les bactéries anaérobies

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