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Procédure de laboratoire MFLP-98

Novembre 2020

Direction générale des produits de santé et des aliments

Ottawa

Détection d’E. coli O157:H7 dans les produits alimentaires par la méthode VIDAS® UP E. coli O157
(incluant H7)

Comité des méthodes microbiologiques


Division de l’évaluation microbiologique
Bureau des dangers microbiens, Direction des aliments,
Direction générale des produits de santé et des aliments, Santé Canada
Localisateur postal : 2204E
Ottawa (Ontario) K1A 0K9

Contacter le comité des méthodes microbiologiques : hc.mmc-cmm.sc@canada.ca

1. Application

Cette méthode s’applique à la détection rapide d’Escherichia coli O157 (incluant H7) afin de
déterminer la conformité aux exigences des articles 4 et 7 de la Loi sur les aliments et drogues
et/ou d’autres règlements fédéraux pertinents. Les résultats positifs doivent être confirmés à
l'aide d'une méthode de culture.

Cette méthode a été validée pour l’utilisation avec les viandes crues transformées, les viandes
crues non transformées, les aliments (viande et volaille) prêts-à-manger fermentés, les produits
de viande et de volaille prêts-à-manger soumis à un traitement thermique et les légumes-feuilles.
Cette version de la méthode remplace la méthode MFLP-98, datée de mai 2018.

Note : Bien que cette méthode ne soit approuvée que pour certains types de produits alimentaires,
listés ci-dessus, il est présumé que cette méthode puisse être utilisée pour d’autres types de
produits. Afin de s’assurer de la validité de cette méthode sur des produits différents de ceux
spécifiés ici, il est impératif de valider la méthode selon les critères du Compendium de
Méthodes. Il est requis que ces résultats de validation soient envoyés au Comité des Méthodes
Microbiologiques (CMM) pour que la section Application puisse être modifiée afin d’inclure ce(s)
nouveau(x) type(s) de produit(s), si les résultats obtenus rencontrent les normes du CMM (se
référer à la section ‘Élaboration de méthodes’ du Volume 1 du Compendium de Méthodes).

2. Principe

La méthode VIDAS® UP E. coli O157 (incluant H7), aussi connue comme la méthode technologie
de phage d’E. coli (ECPT), est un test automatisé fondé sur la technique d’immuno-analyse
enzymatique par fluorescence (Enzyme-Linked Fluorescent Assay [ELFA]) à utiliser avec la
gamme d’instruments VIDAS®. Le cône à usage unique (SPR®) sert à la fois de phase solide et
de système de pipetage. L’intérieur du SPR® est recouvert de protéines recombinantes de fibre

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caudale de phage pour la fixation des E. coli O157, y compris H7. Tous les réactifs nécessaires à
un essai sont prêts à l’emploi et pré-répartis dans une cartouche à chambres multiples scellée.

Toutes les étapes de l’analyse sont réalisées automatiquement par l’instrument VIDAS®. Le
milieu réactionnel subit une succession de cycles d'aspiration/refoulement dans le cône. Une
partie du bouillon d’enrichissement est distribuée dans la cartouche de réactifs. Les E. coli O157
présents, y compris H7, se fixent sur les protéines recombinantes de phage qui recouvrent la
paroi du cône. Les éléments non fixés sont éliminés au cours des étapes de lavage. Par la suite,
les conjugués à la phosphatase alcaline aspirés dans le cône (puis refoulés) vont se fixer sur les
E. coli O157, y compris H7; elles-mêmes immobilisées sur les protéines de phage de la paroi du
cône. Une étape finale de lavage élimine le conjugué non fixé.

Lors de l'étape finale de révélation, le substrat (4-méthyl-ombelliferyl phosphate) est aspiré puis
refoulé dans le cône SPR®. L’enzyme du conjugué catalyse la réaction d’hydrolyse de ce substrat
en un produit fluorescent (4-méthyl-ombelliferone) dont l’intensité est mesurée à 450 nm. À la fin
du test, les résultats sont calculés automatiquement par l’instrument. Une valeur d’essai,
comparée à des références internes (seuils), et une interprétation (positif, négatif), sont établies
pour chacun des échantillons.

3. Définition des termes

Voir l’annexe A du volume 1.

4. Prélèvement des échantillons

Voir l’annexe B du volume 1.

5. Matériel et équipements spéciaux

Note : Le superviseur du laboratoire est responsable de s’assurer que l'analyse décrite dans cette
méthode soit réalisée en accord avec la Norme Internationale intitulée ISO/IEC 17025 (la version
la plus récente) : «Exigences générales concernant la compétence des laboratoires
d'étalonnages et d'essais ».

Les milieux suivants sont offerts sur le marché et doivent être préparés et stérilisés selon les
directives du fabricant. Voir également l'annexe G du volume 1 pour la formulation des milieux
individuels.

Note : Le laboratoire est responsable de s’assurer de l’équivalence de toutes variations de formulation


des milieux énumérés ici si elles sont utilisées (qu'il s'agisse d'un produit disponible sur le marché
ou fabriqué à partir d'ingrédients). Il serait apprécié que les résultats d'équivalence soient
transmis à l'éditeur du Compendium de méthodes en vue d'une modification de la méthode.

1) Instrument VIDAS® (mini VIDAS ou VIDAS 30)

2) Trousse VIDAS® UP E. coli O157(ECPT) 30T (numéro SKU : 30122) contenant les réactifs
nécessaires ainsi que les standards et les contrôles pour l’analyse de 30 échantillons

3) VIDAS® Heat and Go, un bain-marie (95-100°C), ou un système équivalent

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4) Milieu d’enrichissement

 Eau peptonée tamponnée (EPT)

5) Autres matériel et instruments

 Stomacher et sacs à stomacher, mélangeur ou équivalent


 Pipette calibrée pour distribuer 500 μL avec embouts jetables
 Incubateurs capables de maintenir 41,5 °C
 Vancomycine

Note : Chaque laboratoire a la responsabilité de s'assurer que les incubateurs et les bains-marie soient
maintenus aux températures recommandées. Les dispositions suivantes s'appliquent aux étapes
de la méthode reliées à la croissance seulement. Lorsqu'une température ≤ 37 °C est
recommandée dans le texte de la méthode, cette température peut-être ± 1,0 °C, par exemple, 35
± 1,0 °C. Toutefois, lorsque des températures plus élevées sont recommandées, il est impératif
que la température des incubateurs ou des bains-marie ne varie pas plus de 0,5 °C, parce qu'une
température plus élevée pourrait être létale pour les micro-organismes qu'on cherche à isoler.

6. Marche à suivre

Effectuer l’analyse en suivant les instructions ci-dessous :

6.1 Manipulation des échantillons

6.1.1 Au laboratoire, avant l’analyse, à l’exception des aliments de longue


conservation, réfrigérer ou congeler les aliments comme leur conservation
l’exige. Laisser dégeler les échantillons congelés dans un réfrigérateur ou
pendant une période et à une température empêchant la croissance ou la
destruction microbienne.

6.1.2 Analyser les unités d’échantillonnage le plus tôt possible après leur réception au
laboratoire.

6.2 Préparation pour l’analyse

6.2.1 Avoir sous la main de l’eau peptonée tamponnée stérile, préalablement chauffée
à 41,5 ± 0,5°C.

6.2.2 Nettoyer la surface de travail avec un désinfectant approprié.

6.3 Préparation de l’échantillon

Afin que l'unité d'analyse soit vraiment représentative, prélever des portions à différents
endroits de chaque échantillon solide.

6.4 Procédure pour 25 g à 65 g de viande crue (transformée ou non), des aliments


(viande et volaille) prêts-à-manger fermentés et les produits de viande et de volaille
prêts-à-manger soumis à un traitement thermique

6.4.1 Placer de façon aseptique 25 g de l’échantillon dans un sac de type Stomacher.

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6.4.2 Ajouter 225 mL d’eau peptonée tamponnée. Pour des unités d’analyses autre
que 25 g, jusqu’à 65 g, maintenir un ratio de 1 portion d’échantillon pour 9
portions d’eau peptonée tamponnée.

6.4.3 Mélanger pendant 2 min dans un mélangeur de type Stomacher.

6.4.4 Incuber à 41,5 ± 0,5 °C pendant 7 à 24 h (viande crue transformée, viande crue
non-transformée) ou 18 à 24 h [aliments (viande et volaille) prêts-à-manger
fermentés et les produits de viande et de volaille prêts-à-manger soumis à un
traitement thermique)].

6.5 Procédure pour 66 g à 375 g de viande crue (transformée ou non)

6.5.1 Placer de façon aseptique X g de l’échantillon dans un sac de type Stomacher.

6.5.2 Ajouter respectivement 3X mL d’eau peptonée tamponnée avec vancomycine


(8 mg/L).

6.5.3 Mélanger pendant 2 min dans un mélangeur de type Stomacher.

6.5.4 Pour les échantillons jusqu’à 75 g, incuber pendant 8 à 24 h à 41,5 ± 0,5 °C. Pour
les échantillons au-dessus de 75 g, incuber à 41,5 ± 0,5 °C pendant 10 à 24 h.

6.6 Procédure pour les légumes-feuilles

6.6.1 Placer de façon aseptique 25 g de l’échantillon dans un sac de type Stomacher.

6.6.2 Ajouter 225 mL d’eau peptonée tamponnée avec vancomycine (8 mg/L).

6.6.3 Mélanger pendant 2 min dans un mélangeur de type Stomacher.

6.6.4 Incuber à 41,5 ± 0,5 °C pendant 8 à 24 h.

6.7 Analyse

6.7.1 Sortir la trousse VIDAS® UP E. coli O157 (ECPT) 30T du réfrigérateur. Ne


prélever que les réactifs nécessaires à l'analyse et les laisser atteindre la
température ambiante en les laissant reposer pendant au moins 30 min. Utiliser
une cartouche et un cône SPR® pour chaque échantillon, contrôle et standard à
analyser. Après avoir sorti les cônes nécessaires, s’assurer de refermer
soigneusement le sachet.

Note : Les composantes de différents lots ne peuvent être mélangées et ne peuvent être utilisées au-
delà de la date de péremption.

Note : Lorsqu'un nouveau lot de trousse est utilisé, les spécifications (c.-à-d. la courbe maîtresse
d’étalonnage du fabricant) doivent d'abord être entrées dans le système à l'aide de la carte
d'entrée de lot comprise dans chaque trousse. L’étalonnage, à l’aide du standard fourni dans la
trousse, doit être effectué chaque fois qu’un nouveau lot de réactifs est ouvert. Il doit ensuite être
effectué tous les 14 jours. Veuillez consulter la notice d’accompagnement du produit pour obtenir
plus de renseignements sur l’entrée des données du protocole VIDAS® PTC, les données
d’entrée de lot et l’étalonnage.

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6.7.2 Après l’incubation, homogénéiser le bouillon d’enrichissement.

6.7.3 Procédure pour 25 g à 65 g de viande crue (transformée ou non), des


aliments (viande et volaille) prêts-à-manger fermentés et les produits de
viande et de volaille prêts-à-manger soumis à un traitement thermique

6.7.3.1 Préparer l’échantillon pour l’essai VIDAS® en utilisant un bain-marie (ou


équivalent) ou en utilisant le VIDAS® Heat and Go.

6.7.3.2 Si le VIDAS® Heat and Go est utilisé, transférer 0,5 mL du bouillon


d’enrichissement dans le puit d’échantillon sur la cartouche. Chauffer
pendant 5 ± 1 min (consulter le manuel d’utilisation VIDAS® Heat and
Go). Retirer la cartouche et laisser refroidir pendant 10 min.

6.7.3.3 Si un bain-marie est utilisé, transférer 1 à 2 mL du bouillon


d’enrichissement dans un tube. Fermer hermétiquement le tube.
Chauffer à 95-100 °C pendant 5 ± 1 min. Laisser refroidir le tube (ne
pas mélanger). Transférer 0,5 mL du bouillon d’enrichissement bouilli
dans le puit d’échantillon sur la cartouche VIDAS®.

6.7.3.4 Procéder à l'étape 6.7.6.

6.7.4 Procédure pour 66 g à 375 g de viande crue (transformée ou non)

6.7.4.1 Transférer 2 à 3 mL du bouillon d'enrichissement dans un tube. Fermer


hermétiquement le tube. Chauffer dans un bain-marie (ou équivalent) à
95-100 °C pendant 5 ± 1 min. Laisser refroidir le tube (ne pas
mélanger). Transférer 0,5 mL du bouillon d’enrichissement bouilli dans
le puit d’échantillon sur la cartouche VIDAS®.

6.7.4.2 Procéder à l'étape 6.7.6.

6.7.5 Procédure pour les légumes-feuilles

6.7.5.1 Préparer l’échantillon pour l’essai VIDAS® en utilisant un bain-marie (ou


équivalent) ou en utilisant le VIDAS® Heat and Go.

6.7.5.2 Si le VIDAS® Heat and Go est utilisé, transférer 0,5 mL du bouillon


d’enrichissement dans le puit d’échantillon sur la cartouche. Chauffer
pendant 5 ± 1 min (consulter le manuel de l’opérateur VIDAS® Heat and
Go). Retirer la cartouche et laisser refroidir pendant 10 min.

6.7.5.3 Si un bain-marie est utilisé, transférer 1 à 2 mL du bouillon


d’enrichissement dans un tube. Fermer hermétiquement le tube.
Chauffer à 95-100 °C pendant 5 ± 1 min. Laisser refroidir le tube.
Mélanger le bouillon d’enrichissement bouilli et transférer 0,5 mL dans
le puit d’échantillon sur la cartouche VIDAS®.

6.7.5.4 Procéder à l'étape 6.7.6.

Note : Ne pas faire chauffer le standard ni les contrôles.

6.7.6 Placer le cône et la cartouche dans l'instrument. S’assurer que les étiquettes

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colorées indiquant le code de l’essai sur le cône correspondent à celles sur la


cartouche de réactifs.

6.7.7 Démarrer l’analyse suivant les instructions dans le manuel d’utilisation.

6.7.8 Une fois l’analyse terminée, retirer les cônes et les cartouches de l’instrument.
Jeter les cônes et les cartouches dans un contenant pour matériel contaminé
selon les règlements locaux en vigueur.

6.8 Interprétation

Dès l’essai terminé, le système informatique analyse automatiquement les résultats. Un


résultat dont la valeur d’essai est supérieure ou égale à 0,04 indique la présence
présumée d’E. coli O157 dans l’échantillon.

6.9 Confirmation

À partir du bouillon d'enrichissement non-chauffé, procéder avec les étapes


d'ensemencement de géloses et de confirmation telles que décrites dans la méthode de
culture (i.e., MFHPB-10).

7. Références

7.1 ISO/IEC 17025:2005. Exigences générales concernant la compétence des laboratoires


d’étalonnages et d’essais.
7.2 Comité des méthodes microbiologiques. 2014. Isolement d’Escherichia coli O157:H7/NM
dans les aliments et les échantillons environnementaux prélevés sur les surfaces (MFHPB-
10). Volume 2, Compendium de méthodes, Santé Canada, Ottawa.

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