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Cours de Microbiologie Générale

Chapitre V
Milieux de cultures bactérienne
Préparé par : Olfa KILANI FEKI

2014/2015
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I. INTRODUCTION
 La Composition et les caractéristiques des
milieux de culture diffèrent selon l’objectifs:
diagnostique, recherche, fermentation
industrielle…
 Ils peuvent être soit:
* Liquide: Le développement engendre un
trouble uniforme.
* Solide: Le développement se fait sous forme
de nappe ou de colonies isolées.

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Besoins spécifiques de croissance
 Pour qu’une bactérie puisse croitre, elle doit
trouver dans son milieu les aliments
énergétiques et constitutifs (C, O, N, H,…) et
parfois elle exigent des aliments spécifiques ou
des conditions physicochimiques spécifiques
(concentration, pH, température,…)
 Toutes les bactéries sont cultivables en milieu
liquide. La croissance sur milieu solide est une
caractéristique qui peut être perdue.
 L’isolement et l’identification nécessite
la croissance en colonies isolées
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Composition de milieux de culture
• La composition du milieu de culture solide diffère
du liquide par la présence de l’agar-agar qui est un
agent de durcissement extrait à partir d’algue
marine et qui commercialisé sous forme
de poudre. Il n’est soluble qu’a ébullition.
* Il est utilisé en agroalimentaire comme
additif alimentaire sous le code E450.
* C’est le dernier ingrédient à rajouter dans le
milieu à raison de 15 g/l après ajustement du
volume et du pH

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Les peptones
 Ce sont des composés de base dans les
cultures bactérienne.
 Ils se composent de mélange d’acide aminées
et de polypeptides.
 Résultent de la dégradation par des
enzymatiques protéolytiques (pancréatides,
pepsine et la papaïne) de matière protéique
d’origine animale ou végétale (viande de
bœuf, caséine, soja, sang,…).
 Ils constituent la principale source d’azote
pour les bactéries en culture.
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Les extraits
 Ce sont des composés obtenus par chauffage de
mixtures aqueuses de matière animale végétal ou
fongique.
 L’extrait desséché est commercialisé sous forme de
poudre.
 Extrait de levure: (Saccharomyces cerevisiae) riche en
glutamate, glucane, nucléotides et vit B.
 Extrait de viande: préparé à partir de viande sans
matière grasse suite à une dégradation enzymatique. Il
est riche en protéines, en acide aminés, en glucide et
en vitamines hydrosolubles.
 Extrait de Malt: préparé à partir de la farine de malt. Il
est riche en glucide et en maltose. Utiliser surtout
pour la culture des levures.
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Milieux de culture naturels
 Ils sont appelés aussi milieux empiriques
 Ce sont des milieux qui sont fait à base de produits
naturels, de ce fait il n’ont pas une composition
précise.
 Ils sont préparés à base d’extrait de viande ou de
levure, de peptone, de pomme de terre, de carotte,
de riz, de soja, d’amidon et même des substances
comme le sérum ou le sang.
 Exemple: Le bouillon nutritif:
Extrait de viande de bœuf………………5 g
Peptone trypsique………………………10 g
Chlorure de sodium…………………….5 g
Eau distillée (qsp)………………………..1litre
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Milieux synthétiques
 Leurs compositions est précisément définie en quantité et
en qualité.
 Ils sont utilisés en recherche pour étudier les mécanismes
de régulations, l’auxotrophie, la physiologie microbienne,…
 Quelques milieux synthétiques sont utilisés en diagnostique
comme le milieu urée-indole pour l’identification des
entérobactéries qui permet le recherche de l’uréase et de
l’indole à partir du tryptophane;
Urée……………………..……………20 g
L-tryptophane…………………………3 g
Phosphate dipotassique……………….1 g
Phosphate monotassique ……………..1 g
Chlorure de sodium………………….. 5 g
Alcool à 95°………………………….10 ml
Olfa Kilani Feki Rouge de phénol …………………….25 g
Eau distillée (qsp)……………………1Litre 8
Milieux semi-synthétiques
 Ils contiennent un mélange de produits naturels et de
produits synthétiques
 Ils sont les plus couramment utilisés dans les laboratoires
de recherche.
 Exemple: la gélose EMB ou milieu Teague-Levine:
peptone……………………..…………10 g
Phosphate dipotassique……………….2 g
Lactose ……………….………………10 g
Eosine……………..………………….. 0.4 g
Bleu de méthylène..………………….0.065 ml
Agar-agar………………………...…….15 g
Eau distillée (qsp)……………………..1Litre

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Milieux usuels
 Les milieux les plus utilisés sont ceux qui
permettent la culture de la plus large gamme de
bactéries.
 Le choix du milieu est fonction de l’origine de la
bactérie (corps humain, sol, milieu marin,...)
 En bactériologie médicale, le milieu à base d’extrait
de viande est le plus couramment utilisé. Il permet
la culture des germes commensaux.
 En bactériologie environnementale c’est plutôt les
milieux à base d’extrait de végétaux et de lait qui
sont les plus utilisés.
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Milieux spécifiques
 Ce sont des milieux qui favorisent la croissance de
la bactérie recherchée en inhibant le reste.
 Ils contiennent des agents sélectifs appelés encore
inhibiteurs tels que le cristal violet, le vert brillant,
les sels biliaires ou encore les antibiotiques.
 La concentration d’une substance peut jouer le
même rôle que l’inhibiteur.
Exemple 1: Milieu Drigalski qui contient le
cristal de violet comme inhibiteur. Il sélectionne les
germes à Gram négatifs et inhibe de façon
spécifique les bactéries à Gram positif.
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Milieux spécifiques

Exemple 2: le milieu Chapman pour l’isolement des


Staphyllococcus dont l’agent sélectif est le chlorure de
sodium à 7.5%
peptone…………………….…10 g
Extrait de viande……..……….1 g
NaCl ……………….…………75 g
Mannitol……………..………...10 g
Rouge de phénol..……………..0.025 g
Agar-agar……………………….15 g
Eau distillée (qsp)…………..…..1000 ml

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Milieux d’enrichissement
Ce sont des milieux qui contiennent un agent sélectif
qui favorise la croissance du germe recherché.
La sélection se joue sur la vitesse spécifique maximale
de croissance ce qui permet en quelques heures
d’augmenter la proportion relative des germes
recherchés

Exemple: le milieu Muller-kauffmann


Bouillon de viande………………...900 ml
Carbonate de Ca…….……..……..0.5 g
thiosulfate de Na à 50%….……….100 ml
solution iode-iodurée……………..20 ml
Vert brillant…………..……………0.01 g
Bile………….……………………...50 ml

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LA GALERIE API 20E
Galerie de 20 microtubes prêts à l’emploi permettant de
réaliser 23 tests biochimiques afin d’identifier des bacilles
Gram – appartenant à la famille des Enterobacteriacaes.
cupule

microtube contenant le milieu déshydraté


Préparation de l’inoculum

1 seule colonie

Prélèvement
d’une souche
pure

5 mL d’ED stérile

Suspension d’opacité 0,5

Souche pure sur GNi


Ensemencement de la galerie API 20 E
Introduire la suspension bactérienne dans chaque tube à l’aide d’une
pipette Pasteur stérile, pointe appuyée à l’intérieur et sur le côté
pour éviter la formation de bulles d’air

Pour certains caractères:

Remplir le tube de suspension et recouvrir


Remplir de suspension le tube et la d’huile de paraffine
cupule ADH, LDC, ODC, H2S, URE
CIT, VP, GEL
Identification de la souche

- + + + +

5 2 1 5 7 7 3 5 5

Code n°: 5 215 773 (55)

Se référer au catalogue ou au logiciel pour identifier la souche à l’aide du code obtenu