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I / Les différentes méthodes pour purifier les différentes sous

populations lymphocytaires avec leurs fonctions et leurs


proportions dans le sang , organe lymphoïde primaire et secondaire 
 
       1 – Etude phénotypique des sous-populations lymphocytaires
 
              a – Généralités
 
Les lymphocytes au repos présentent une apparence uniforme. Ce sont des cellules rondes à
noyau volumineux et dense et à cytoplasme peu abondant. Malgré ces caractéristiques
morphologiques communes, les lymphocytes peuvent être divisés en sous-populations
cellulaires aux caractéristiques fonctionnelles très différentes. On peut en effet différencier
ces sous populations lymphocytaires en étudiant l’expression de protéines membranaires
propres à chaque type de lymphocyte. Ainsi, les lymphocytes B et T peuvent être distingués
par des anticorps reconnaissant des régions conservées des récepteurs pour l’antigène
présents sur ces deux types cellulaires. Les lymphocytes T peuvent eux-mêmes être
subdivisés en lymphocytes T auxiliaires et cytotoxiques sur la base de leur expression
membranaire en protéine CD4 ou CD8.
 
b – Analyse des sous populations lymphocytaires par cytométrie en flux
 
La cytométrie en flux a permis de faire des progrès considérables dans l’étude des
différentes sous-populations lymphocytaires. Cet appareil est utilisé pour identifier, voire
pour étudier les propriétés fonctionnelles, de sous populations cellulaires à l’intérieur d’une
population cellulaire hétérogène. L’identification des cellules repose sur l’utilisation
d’anticorps monoclonaux marqués par un fluorochrome et spécifiques d’une protéine
membranaire propre à la cellule à analyser. La première étape de la réaction consiste donc à
incuber une population cellulaire avec un anticorps marqué qui se fixe spécifiquement sur
une sous population cellulaire donnée. Après lavage dans une solution saline, les cellules
sont analysées par cytométrie en flux. Dans cet appareil, les cellules sont aspirées dans une
gaine liquide. Cette gaine liquide se termine par un fin capillaire ne permettant le passage
que d’une cellule à la fois et donc d’analyser les cellules une par une. La cellule ainsi isolée
passe devant le faisceau d’un rayon laser. Le passage de la cellule devant le faisceau laser à
plusieurs conséquences. La première est d’induire une déviation du faisceau et la seconde
est d’exciter les fluorochromes fixés aux anticorps et donc aux cellules à détecter et ainsi
d’induire l’émission d’une fluorescence. Des photomultiplicateurs détectent les déviations
du faisceau laser qui renseigne à la fois sur la taille et la granulosité des cellules. Ils détectent
aussi les émissions de fluorescence indiquant la présence de l’anticorps sur la cellule et
renseignent donc sur l’expression des divers molécules de surface présentes sur les sous
populations lymphocytaires. Certains cytomètres sont également équipés d’un trieur de
cellule. Ce dispositif permet de séparer et d’isoler la sous population lymphocytaire afin de
faciliter son étude ultérieure. Lorsque les cellules sont marquées avec un seul anticorps
fluorescent, les résultats du cytomètre sont généralement exprimés sous forme
d’histogramme représentant en abscisse l’intensité de fluorescence et en ordonné le
nombre de cellules analysées. Si au moins deux anticorps sont employés pour marquer les
cellules (chacun des fluorochromes ayant des spectres d’émission différents), les résultats
sont alors exprimés sous la forme d’un nuage de point avec en abscisse l’intensité de
fluorescence du premier fluorochrome et en ordonné l’intensité de fluorescence du second.
L’analyse par cytométrie en flux est couramment utilisée en immunologie. Par exemple, cet
appareil a joué un rôle dans l’identification des sous populations lymphocytaires atteintes au
cours de l’infection par le virus HIV.
 

 
c – Méthodes physiques de séparation et d’analyse des sous populations lymphocytaires
 
Bien que le cytomètre en flux soit particulièrement bien adapté à l’isolement d’un nombre
restreint de cellules, lorsque l’on désire séparer rapidement une grande quantité de cellules
les méthodes de séparation mécanique sont bien plus adaptées. Une méthode simple et
élégante pour séparer des populations cellulaires consiste à utiliser des anticorps marqués
par des billes magnétiques. Après incubation des cellules avec l’anticorps celui-ci se fixe
spécifiquement sur une protéine membranaire présente à la surface des cellules à séparer.
Les cellules sont alors déposées sur une colonne sur laquelle est appliqué un puissant
champs électrique. A ce niveau, les cellules ayant fixé l’anticorps voient leur migration
interrompue alors que les cellules non marquées migrent au travers de la colonne et sont
éliminées. La colonne est alors lavée plusieurs fois avec une solution saline pour éliminer
toute les cellules non fixées puis le champ magnétique est interrompu et les cellules qui
étaient fixées migrent sur la colonne et sont récupérées.

Des méthodes encore plus simples peuvent être utilisées cependant la pureté de la
population cellulaire à séparer est moins bonne. Ainsi, la technique du panning consiste à
fixer sur une boîte de Pétri un anticorps spécifique d’une molécule de surface présente sur la
cellule à séparer. La suspension cellulaire est déposée dans la boîte et incubée quelques
heures à 37°C. Les cellules à séparer se fixent sur l’anticorps et se retrouvent donc
accrochées au fond de la boîte de Pétri. Après plusieurs lavages en solution saline pour
éliminer les cellules non fixées, il ne reste plus qu’à récupérer les cellules adhérentes. Une
technique alternative consiste à éliminer les cellules indésirables en incubant la suspension
cellulaire avec des anticorps monoclonaux spécifique de la molécule de surface présente sur
ces cellules et d’ajouter à la suspension du complément qui détruira les cellules sur
lesquelles se sont fixées les anticorps.
 
d– Cluster de différenciation
 
La conclusion principale de l’étude des sous populations lymphocytaires est que des
lymphocytes exprimant des combinaisons particulières de protéines membranaires
représentent en fait soit des cellules à des étapes de différenciation différente, soit des
cellules ayant des propriétés fonctionnelles différentes. Pour ces raisons, ces molécules de
surface ont été appelées antigènes de différenciation. Lorsqu’un groupe d’anticorps
monoclonaux permet de reconnaître le même antigène de différenciation, on dit qu’ils
définissent des clusters de différenciation et sont noté CD suivit d’un nombre définit de
façon arbitraire. Ces clusters de différenciation sont à l’origine de la nomenclature actuelle
des molécules de surface permettant de distinguer les différentes sous populations
lymphocytaires.
 
       2 – Etude fonctionnelle des sous populations lymphocytaires
 
         a – Réaction de prolifération lymphocytaire
 
Pour permettre une immunité adaptative, après stimulation par un antigène, les rares
lymphocytes spécifique de cet antigène présents dans l’organisme doivent proliférer
intensément avant de se différencier en cellule effectrice. Cette étape initiale de
prolifération permet de générer assez de cellules effectrices pour faire face à l’agression
antigénique. Le nombre de cellules qui prolifèrent à la suite d’une stimulation antigénique
étant relativement faible et donc difficilement détectable, le système de mesure doit
d’abord être calibré en utilisant des mitogènes polyclonaux. Ces substances ont pour
propriété d’induire la prolifération des lymphocytes quelle que soit leur spécificité
antigénique. Certains mitogènes agissent seulement sur les lymphocytes T (Concavaline A,
Phytohemagglutinine), sur les lymphocytes B (LPS) ou indifféremment sur les deux
populations (Pokeweed).
 
Les mitogènes polyclonaux induisent les mêmes mécanisme de prolifération que ceux induits
par l’antigène. En effet, à l’état basal, le lymphocyte est une cellule au repos bloquée en
phase G0 du cycle cellulaire. Lorsque ces cellules sont activées soit spécifiquement par
l’antigène, soit de manière polyclonale par les mitogènes, les cellules passe au stade G1 et
progressent ensuite rapidement dans le cycle cellulaire. Dans la plupart des études, la
prolifération lymphocytaire est mesurée par l’incorporation de thymidine tritiée dans l'ADN
des cellules en division. Ce type de test est couramment utilisé en clinique humaine pour
mesurer si chez les patients ayant une suspicion de déficit immunitaire, les lymphocytes T
sont capables de répondre à une stimulation antigénique spécifique ou non.
Lorsque la culture lymphocytaire a été optimisée en utilisant la réponse proliférative aux
mitogènes polyclonaux, il devient alors possible de détecter la prolifération des lymphocytes
T spécifiques de l’antigène in vitro en mesurant l’incorporation de thymidine tritiée en
réponse à l’antigène vis à vis duquel les lymphocytes T du donneur ont été préalablement
sensibilisés. Ce test permet l’évaluation de la réponse des lymphocytes T de type CD4+
auxiliaires. Cette méthode est un test global qui ne renseigne en rien sur les capacités
fonctionnelles des cellules répondeuses.
 
 
       b  – Mesure des fonctions effectrices des lymphocytes T
 
Les cellules effectrices sont détectées par les effets qu’elles induisent sur des cellules cibles
présentant des peptides antigéniques spécifique à leur surface ou par la sécrétion de
cytokines particulières agissant spécifiquement sur les cellules cibles. La mesure de ces
fonctions effectrices est à la base de tests biologiques permettant d’évaluer aussi bien la
spécificité du lymphocyte T pour l’antigène que l’activation des fonctions effectrices de la
cellule T.
 
 Réaction de cytotoxicité cellulaire
 
Les lymphocytes T CD8+ activés tuent toute cellule qui exprime à sa surface des complexes
CMH de classe I/peptides susceptibles d’être reconnus par le récepteur de l’antigène du
lymphocyte T (TcR). Ainsi, la fonction des lymphocytes T CD8+ peut être déterminée en
utilisant un simple test de cytotoxicité in vitro. Dans ce test, des cellules cibles, généralement
des macrophages syngéniques sont incubés avec l’antigène contre lequel ont souhaite
déterminer l’intensité de la réponse cytotoxique essentiellement médiée par les
lymphocytes T cytotoxiques CD8+. Le macrophage exprime alors à sa surface des complexes
CMH de classe I/peptides spécifiques du TcR porté par le lymphocyte T CD8+. Les
macrophages sont alors incubés avec du Chrome 51. Ce traceur radioactif diffuse dans les
cellules vivantes et y reste emprisonné. Les cellules cibles ainsi préparées sont mise au
contact de la suspension cellulaire contenant les cellules T CD8+ effectrices. Si la suspension
contient des lymphocytes T cytotoxiques dont le TcR est spécifique du complexe CMH de
classe I/peptide, ces cellules vont s’activer et détruire la cellule cible. La cellule cible libère
alors en mourant le Chrome 51 dans le milieu de culture. Le dosage de ce radioélément
reflète donc les fonctions effectrices des lymphocytes T cytotoxiques.
 

 Mesure des cytokines produites par les sous-populations


lymphocytaires
 
Les fonctions des cellules T CD4+ impliquent plus des phénomènes d’activation que des
phénomènes de cytotoxicité à l’encontre de cellules cibles porteuses de complexes CMH de
classe II/peptide spécifique. Lorsque les lymphocytes T CD4+ rencontrent à la surface d’une
CPA un complexe CMH de classe II/peptide, le lymphocyte s’active et prolifère. Cette
prolifération peut être mesurée par l’incorporation de thymidine tritiée. Après cette étape
de prolifération, vient une étape de différenciation. Schématiquement, les lymphocytes T
CD4+ peuvent se différencier en cellules Th1 ou Th2. La différence entre les deux population
cellulaire vient du profil de cytokines sécrétée par ces deux types de cellules. Les
lymphocytes T CD4+ de type Th1 produisent de l’IL-2 et de l’interféron-g alors que les
lymphocytes T CD4+ de type Th2 produisent de l’IL-4, de l’IL-5, de l’IL-10 et de l’IL-13. Ces
cytokines vont exercer leurs effets sur d’autres types cellulaires. Ainsi, les cytokines Th1 sont
de puissants inducteurs de la réponse à médiation cellulaire et vont notamment induire
l’activation des macrophages et des lymphocytes T CD8+, alors que les cytokines Th2 vont
plutôt stimuler l’immunité à médiation humorale en favorisant l’activation et la
différenciation des lymphocytes B. Ainsi, la mesure des cytokines produites au cours de la
réponse lymphocytaire T CD4+ renseigne sur le type de réponse immunitaire induite après la
stimulation antigénique.
 
 Méthodes biologiques
 
Les cytokines peuvent être détectées par leur activité biologique sur des cellules dont la
prolifération dépend de la présence de ces médiateurs solubles. Ces test n’ont plus qu’un
interêt historique.
 Méthodes Immunochimique
 
Le test le plus spécifique et le plus couramment utilisé pour doser les cytokines dérive de la
méthode ELISA et est appelé ELISA sandwisch. Dans cette technique, un premier anticorps
spécifique de la cytokine à doser est fixé au fond d’un puits en plastique. Cet anticorps est
appelé anticorps de capture. Le surnageant de la culture lymphocytaire contenant la
cytokine à doser est alors ajouté dans le puits. La cytokine se fixe alors sur l’anticorps. Après
plusieurs lavages à l’aide d’une solution saline, un deuxième anticorps lui aussi spécifique de
la cytokine mais reconnaissant un autre épitope sur la molécule est ajouté. Cet anticorps est
marqué par une enzyme et est appelé anticorps de révélation. Si la cytokine est présente,
elle va former un pont entre les deux anticorps, l’ensemble formant un complexe stable
accroché au fond de la plaque. La détection de ce complexe et donc la présence de cytokines
dans le milieu de culture sera révélée en ajoutant dans le puits le substrat de l’enzyme fixée
sur l’anticorps de révélation, substrat qui sera alors converti en un produit coloré.

Une alternative à cette technique consiste non plus à détecter la cytokine elle-même mais à
mesurer le nombre de cellules produisant cette protéine. Cette méthode est appelée
ELISPOT. Dans cette technique, ce sont les cellules elles-mêmes que l’on dépose dans le puits
recouvert d’un anticorps spécifique de la cytokine à doser. Après une courte période
d’incubation, les cytokines produites par la cellule sont captées par les anticorps au contact
de la cellule. Après lavage, on incube la plaque avec l’anticorps de révélation et on ajoute le
substrat. La production de cytokine est détectée par des petites taches au fond du puits. La
numération de ces taches rapportée au nombre de lymphocytes T déposé dans le puits
indique le % de cellules produisant cette cytokine. Enfin, assez récemment est apparue une
technique permettant de détecter les cytokines produites par les cellules T en utilisant la
cytométrie en flux. Les cellules à analyser sont fixées puis perméabilisées de façon
transitoire à l’aide d’une solution de Saponine. Un anticorps spécifique de la cytokine et
marqué par un fluorochrome est incubé avec la suspension de cellules perméabilisées. Les
pores membranaires permettent aux anticorps de diffuser dans la cellule et de se fixer sur la
cytokine. Après un lavage dans un tampon ne contenant pas de Saponine, les pores de la
membrane plasmique se referment emprisonnant les complexes cytokine/anticorps
fluorescent. Il ne reste plus alors qu’à analyser la fluorescence des cellules par cytométrie en
flux pour connaître le % de cellules produisant la cytokine.
 
 Méthodes Moléculaires
 
Une approche un peu différente pour mesurer la production de cytokine par une cellule ou
un tissu consiste à déterminer la présence et le niveau d’expression des ARN messagers
codant cette cytokine. Ceci peut être réalisé par hybridation in situ ou par Northern blot.
Toutefois, ces techniques s’avèrent peu sensibles. Un des moyens permettant d’augmenter
la sensibilité de détection des ARN messagers codant une protéine consiste à utiliser la
méthode de Reverse Transcriptase -Polymérase Chain Réaction (RT-PCR). La Reverse
Transcriptase est une enzyme utilisée par certains virus à ARN pour convertir l’ARN viral en
ADN complémentaire. Dans la méthode de RT-PCR, les ARN messagers sont convertis en
ADNc par la reverse transcriptase. L’ ADNc choisit est alors amplifié sélectivement par
réaction de polymérisation en chaîne en utilisant un couple d’amorces spécifiques. Lorsque
les produits de la réaction d’amplification sont analysés par électrophorèse en gel
d’agarose/BET, l’ADN amplifié peut être visualisé comme une bande de taille déterminée. La
quantité d’ADN amplifié est proportionnelle à la quantité d’ARN messager présent au
départ. La quantité des ARN messagers de cytokine est généralement déterminée en
comparant l’intensité de la bande obtenue avec celle obtenue après amplification, dans les
mêmes conditions, d’un gène « rapporteur » dont l’expression est constante dans toutes les
cellules. Des techniques plus quantitatives utilisant un plasmide compétiteur (PCR
compétitive), des amorces fluorescentes (procédé TaqMan ou Lightcycler) ou des PCR-ELISA
sont actuellement en cours de développement.
 

  III / structure des immunoglobuline , TCR, CMH I, CMH II

les TCR :

Structure :

Chaque chaîne du récepteur des cellules T est un membre de la superfamille des


immunoglobulines (Ig), et possède :

 un domaine Ig N-terminal variable (V)


 un domaine Ig constant (C),
 un domaine transmembranaire
 un court domaine cytoplasmique C-terminal.

La partie variable de la chaîne alpha possède trois domaines hypervariables


ou complimentarity determining regions (CDR)), tandis que la chaîne bêta en compte
quatre.

 CDR3 est le principal CDR impliqué dans la reconnaissance de l’antigène présenté


 CDR1 de la chaîne alpha interagit avec le côté N-terminal du peptide
 le CDR1 de la chaîne bêta interagit avec le côté C-terminal.
 On pense que CDR2 reconnaît le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH).
 Il a été montré que le CDR4 de la chaîne bêta n'intervient pas dans la
reconnaissance de l’antigène, mais interagit avec les superantigènes.

Fonction :

La formation du locus TCR est semblable au phénomène conduisant a la formation


des récepteurs des cellules B et des anticorps. La chaîne alpha du TCR est générée par une
recombinaison VJ, tandis que la chaîne bêta subit une recombinaison VDJ. De même, la
chaîne gamma est issue d’une recombinaison VJ et la chaîne delta VDJ. Les zones de
jonction entre les segments V, (D,) et J correspondent au domaine codant CDR3. La
combinaison unique des segments VDJ ainsi que l’addition aléatoire de nucléotide pendant
la recombinaison est la clef de la diversité des spécificités possibles pour les récepteurs des
cellules T.

Figure :

Les BCR :

Structure :

Le récepteur des cellules B est divisé en deux parties1 :

 Le fragment de liaison au ligand: une immunoglobuline membranaire de l'un des


isotypes (IgD, IgM, IgG, IgA ou IgE). Cette immunoglobuline de membrane est
identique aux immunoglobulines sécrétées à l'exception de quelques acides aminés,
situés en C-term des chaines lourdes, qui leur permettent de s'ancrer à la membrane
plasmique.
 Le fragment de transduction du signal: formé d'un hétérodimère Ig-α/Ig-β (CD79),
relié par des ponts disulfures. Les deux protéines constituantes de l'hétérodimère
sont transmembranaires, et leur partie intra-cytoplasmique possède un motif ITAM
(immunoreceptor tyrosine-based activation motif), phosphorylé par des kinases
associées au BCR (Blk, Fyn, Lyn, ...) lors de leur activation. Des phosphatases (SHP-1,
SHIP, ...) sont chargées de limiter cette signalisation. La phosphorylation permet
l'ancrage de protéines adaptatrices, entrainant une cascade de signalisation.'

Fonction :
Les BCR sont des récepteurs membranaires caractéristiques des lymphocytes B, qui leurs
procurent la propriété de reconnaitre directement des peptidiques antigéniques présent à la
surface de l’agent pathogène et ceci de manière spécifique. A la surface du lymphocyte B, les
BCR sont toujours accompagnés d’un dimère Igα-Igβ.

Il est important de préciser que chaque LB n’exprime qu’un seul type de BCR en plusieurs
exemplaires, et qu’il l’acquiert lors de son développement dans la moelle osseuse.

Les gènes codant pour les BCR contiennent des exons qui codent pour la partie
transmembranaire de l’immunoglobuline, on observera donc un épissage qui sélectionnera
cette partie transmembranaire, afin qu’ils puissent être exprimés en surface des cellules B.

On précise ici que quand les différentes classes d’immunoglobulines sont sous formes
membranaires, elles existent toutes sous formes monomériques.

Figure :

MHC de type I :

Structure :

Les molécules du CMH de classe I sont composées de deux chaînes polypeptidiques, une
chaîne α longue et une chaîne β courte appelée β2-microglobuline (Figure 2). La chaîne α
possède quatre régions.

 Une région cytoplasmique, contenant de sites de phosphorylation et de liaison à des


éléments du cytosquelette.
 Une région transmembranaire contenant des acides aminés hydrophobes permettant
à la molécule d’être ancrée à la membrane cellulaire.
 Un domaine de type immunoglobuline hautement conservé α3 qui se lie à la
molécule CD8.
 Un domaine hautement polymorphe formé par les domaines α1 et α2 et qui forment
le site de liaison du peptide. La β2-microglobuline s’associe avec la chaîne α et
permet à la molécule de maintenir sa structure tridimensionnelle.
Fonction :

Figure :

MHC de classe 2 :

Structure :

Les molécules du CMH de classe II sont composées de deux chaînes polypeptidiques α et β


de taille sensiblement égale (Figure 6). Les deux chaînes sont constituées de 4 régions:

 Une région cytoplasmique, contenant de sites de phosphorylation et de liaison à des


éléments du cytosquelette
 Une région transmembranaire contenant des acides aminés hydrophobes permettant
à la molécule d’être ancrée à la membrane cellulaire
 Un domaine α2 hautement conservé et un domaine β2 hautement conservé auquel
se lie la molécule CD4
 Un site de liaison au peptide hautement polymorphe formé par les domaines α1 et
β1.

Fonction :

Figure :
III / Exemple de méthodes FACS  :

L'analyseur-trieur de cellules (Fluorescence-activated cell sorter: FACS)

Le FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) est un appareil qui permet de réaliser une
cytométrie en flux sur une population de cellules, de les analyser et de les trier en
différentes sous-populations grâce à leurs marqueurs de surface qui sont souvent identifiées
par des anticorps monoclonaux marqués à la fluorescéine. Chaque cellule est analysée et
triée individuellement. Ces appareils mesurent la dispersion de la lumière, le volume et la
fluorescence . Les paramètres de tri (taille, granulosité, intensité de fluorescence, etc.) sont
définis par le manipulateur.

En pratique, les cellules de l'échantillon sont marquées avec des réactifs fluorescents
détectant des molécules membranaires. Ces cellules sont alors introduites dans une
chambre à partir de laquelle des gouttes, renfermant chacune une cellule, vont tomber et
passer devant un faisceau laser. Grâce à des filtres appropriés et un jeu miroirs et de
photomultiplicateurs, l'appareil enregistre l'intensité de la fluorescence de chaque cellule
passant devant la source laser. Le système mesure la diffusion de la lumière aux petits angles
(FSC: forward angle light scatter), à angle droit (RSC: right angle scatter) et l’intensité de la
fluorescence pour au moins deux longueurs d'ondes différentes (rouge et verte), ce qui
permet de détecter simultanément deux marqueurs de surface. Les gouttes peuvent
peuvent être chargées électriquement et déviées de de leur trajectoire sous l’impulsion d’un
champ électrique. Par conséquent, le FACS permet une analyse multiparamétrique en
déterminant pour chaque cellule la taille (diffusion de la lumière aux petits angles), la
granulosité (diffusion de la lumière à angle droit) et l'intensité de fluorescence avec trois
fluorochromes différents. On peut ainsi collecter une population cellulaire définie selon les
paramètres choisis et mesurés. Cette technique permet ainsi le tri de populations cellulaires
en fonction de leur expression de certains antigènes de surface qui seront marqués par des
anticorps de différentes spécificités couplés à différents

fluorochromes. C'est le cas par exemple de l'analyse des populations de thymocytes. Ainsi,
avec 1 ml de sang total on peut dénombrer les cellules T CD4+ , HLA-DR+ ou CD8+ , CD25+ ,
etc.

Par exemple, dans le cas de l’dentification et de tri des sous-populations lymphocytaires,


une suspension de leucocytes est incubée avec un anticorps monoclonal marqué dirigé
contre les cellules CD4 auxiliaires (helper). L’échantillon lavé est alors introduit dans la
chambre des échantillons du FACS et les cellules sont forcées à travers un ajutage par un jet
de tampon. Par une vibration étudiée sur le bout de l’ajutage l’écoulement de l’échantillon
se casse en gouttelettes. La taille des gouttelettes peut être réglée de telle sorte que
chacune d’elle ne contient qu’une seule cellule. Les cellules passent devant un rayon laser
qui excite le colorant fluorescent qui sera contrôlé par un détecteur de fluorescence. Les
gouttelettes qui émettent un signal fluorescent approprié seront chargées électriquement
dans un champ de très haut voltage entre le détecteur et la plaque de déflection et sont
séparées dans des tubes de collection. Les cellules CD4 helpers seront ainsi séparées des
autres leucocytes sur la base de la fluorescence de l’anticorps anti-CD4 fixé.

Les résultats sont présentés sous la forme d'histogrammes (Figure 47) représentant le
nombre (n) des cellules en fonction de l'intensité de la fluorescence verte (Fv) et rouge (Fr)
et aussi de la taille (s) de chaque cellule sur une échelle logarithmique arbitraire de quatre
décades de 10 à 104 . La détermination du seuil permet de distinguer les cellules positives ou
négatives exprimant ou n'exprimant pas l'antigène étudié.