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Georgette N. Kiethega
Université de Montréal
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1
Dédicace
Je dédie ce travail à feues Marie Françoise Ilboudo et Sawadogo Fatimata,
2
Remerciements
Nous remercions les membres du jury pour avoir accepté de juger ce travail.
3
Présentation de L’I.M.T.S.S.A.
4
moléculaire pour la caractérisation des souches, techniques utilisables pour tester
l’efficacité du nouveau vaccin anti-méningococcique A+C couplé à l’anatoxine
diphtérique.
L’I.M.T.S.S.A. accueille régulièrement des étudiants étudiants pour des stages de Maîtrise,
de DEA et de Thèse de doctorat.
5
Sommaire
Présentation de l’I.M.T.S.S.A…………………………………………………………..Page 4
1. Introduction…………………………………………………………………………. Page 10
2. Revue bibliographique……………………………………………………………….Page 11
2.1. Epidémiologie du paludisme………………………………………………………Page12
2.2 Taxonomie et génome……………………………………………………………...Page12
2.3. Cycle de développement de Plasmodium falciparum……………………………...Page13
2.3.1. Cycle chez l’anophèle ou développement sporogonique………………………...Page13
2.3.2. Cycle chez l’homme………………………………………………………….. …Page 14
2.3.3. Cycle sanguin sexué ou gamétocytogénèse ………………………………….. ...Page 15
2.4. Protéines de la gamétocytogénèse et leurs fonctions………………………………Page16
2.4.1. Le gène pf11-1……………………………………………………………………Page 16
2.4.2. Le gène pfs16…………………………………………………………………….Page 17
2.4.3. Le gène pfg27/25………………………………………………………………....Page 17
2.4.4. Les protéines Pfs48/45 et Pfs230 ………………………………………. ………Page 17
2.4.5. Le gène pfs77………………………………………………………………….. ..Page 17
2.4.6. Le gène pfg377 …………………………………………………………………..Page 18
2.4.7. La protéine -tubuline II………………………………………………………... Page 18
3. Matériel et Méthodes……………………………………………………………. …..Page 21
3.1. Matériel…………………………………………………………………………….Page 21
3.2. Méthodes ………………………………………………………………………. …Page 21
3.2.1. Préparation des inserts……………………………………………………………Page 21
3.2.1.1. Extraction d’ADN génomique de Plasmodium falciparum 3D7………………Page 21
3.2.1.2. PCR spécifique de pfs16 et pfg27/25……………………………………….. ...Page 21
3.2.1.3. Purification du produit PCR ………………………………………………… ..Page 22
3.2.1.4. Migration des amplicons……………………………………………………… Page 22
3.2.1.5.Clonage des gènes pfs16 et pfg27/25 dans le vecteur d’expression eucaryote
pIZ/V5-His……………………………………………………………………………..Page 22
3.2.1.6. Transformation d’E. coli JM109 …………………………………………….. Page 23
3.2.1.7. Criblage des clones bactériens recombinants par PCR ………………………..Page 23
3.2.1.8. Amplification et purification du vecteur recombinant dans E. coli JM109…...Page 23
3.2.1.9. Vérification des inserts par séquençage………………………………………..Page 24
6
3.2.1.10. Amplification et purification du vecteur recombinant dans E. coli JM109… Page 24
3.2.2 .Culture de cellules MimicTM……………………………………………………...Page 25
3.2.2.1. Mise en culture des cellules MimicTM………………………………………… .Page 25
3.2.2.2. Test de sensibilité à la zéocine ……………………………………………….. Page 25
3.2.2.3. Transfection stable des cellules MimicTM…………………………………….. Page 26
3.2.2.4. Clonage des cellules MimicTM transfectées………………………………….. ..Page 26
3.2.3 Contrôle de l’expression des cellules MimicTM transfectées……………………..Page 27
3.2.3.1. Vérification par PCR spécifique de l’intégration des gènes pfs16 et pfg27/25. Page 27
3.2.3.2. Analyse de l’expression des protéines sur gel de polyacrylamide……………. Page 27
3.2.3.3. Analyse de l’expression des protéines sur le bio analyseur…………………. Page 28
3.2.3.4. Purification de Pfg27/25 et Pfs16 par F.P.L.C ……………………………. . ..Page 28
4. Résultats et Discussion ………………………………………………………….. ... .Page 30
4.1. Amplification des gènes codant pour les protéines Pfs16 et Pfg27/25 par PCR spécifique
à partir de l’ADN 3D7 de Plasmodium falciparum…………………………………… Page 31
4.2. Clonage des gènes pfs16 et pfg27/25 dans le vecteur d’expression eucaryote
pIZ/V5-His…………………………………………………………………………. …Page 32
4.3. Séquençage des gènes pfs16C-His, pfs16N-His, pfg27/25C-His et
pfg27/25N-His …………………………………………………………………….. …..Page 33
4.4. Expression des protéines recombinantes Pfs16 et Pfg27/25 dans
les cellules Mimic transfectées…………………………………………………… ….. Page 34
4.4.1. Amplification par PCR spécifique des gènes pfs16 et pfg27/25 dans
l’ADNg des cellules transfectées…………………………………………………….….Page 34
4.4.2. Résultats obtenus sur gel de polyacrylamide………………………………….. ..Page 35
4.4.3. Résultats obtenus sur le bio analyseur…………………………………………... Page 36
4.4.4. Purification de Pfs16 et Pfg27/25 par F.P.L.C…………………………………...Page 37
6. Conclusion et Perspectives ……………………………………………………….. ..Page 40
Références bibliographiques……………………………………………………………Page 42
Annexes …………………………………………………………………………….…..Page 48
7
Abréviations
8
Introduction
9
1. Introduction
Le paludisme est la maladie parasitaire la plus répandue dans le monde. Il cause 300 à
500 millions de cas cliniques et est responsable de 2 à 3 millions de victimes par an surtout
des enfants de moins de 5 ans (OMS, 2000) .C’est une des plus grandes maladies infectieuses
dans le monde tout comme le SIDA et la tuberculose.
Des quatre espèces de Plasmodium infectant l’homme (P. falciparum, P. vivax, P.
malariae, P. ovale), Plasmodium falciparum est la seule mortelle et responsable de la quasi-
totalité des décès. Le paludisme sévit essentiellement en Afrique Subsaharienne, ainsi que
dans certaines régions de l’Amérique du sud, de l’Asie orientale et de l’Océanie. Les
infections persistantes et récurrentes de P. falciparum sont dues à sa capacité à développer
une importante variation antigénique en plus de son polymorphisme génétique.
Son incidence due à sa résistance aux antipaludiques majeurs, l’échec des moyens de
luttes anti-vectoriels du à la résistance des vecteurs de P. falciparum aux différents
insecticides orientent la recherche vers de nouvelles cibles thérapeutiques(Wernsdorfer et al.
, 2003). Le séquençage du génome de la souche 3D7 de P. falciparum (Gardner et al., 2002),
le développement de technologies de transfections stables (Crabb et al., 1997; Skinner-
Adams., 2003) procurent l’opportunité d’exprimer des gènes de P. falciparum et facilitent les
différentes approches chimio-prophylactiques ou vaccinales.
Le principal objectif de cette étude est d’exprimer deux protéines de la
gamétocytogénèse de P. falciparum Pfs16 et Pfg27/25 qui apparaissent 30 heures après
invasion des érythrocytes par les mérozoïtes quand les jeunes gamétocytes ne sont pas encore
morphologiquement différentiables (Lobo et al., 1994 ;Dechering et al., 1997). Il s’agit donc
de cloner les deux gènes pfs16 et pfg27/25 dans un plasmide d’expression eucaryote pIZ/V5-
His. Le système d’expression permet d’exprimer des protéines recombinantes avec une
étiquette 6xHis dans des cellules d’insectes MimicTM.
Les protéines recombinantes obtenues seront purifiées et utilisées pour produire des
anticorps monoclonaux anti-Pfs16 et anti-Pfg27/25. Ces anticorps seront par la suite utilisés
comme traceurs des stades précoces de la gamétocytogénèse dans l’étude des mécanismes
10
Revue bibliographique
11
2 .1. Epidémiologie du paludisme
Le paludisme sévit dans plus de 100 pays (figure 1) et 90% des malades se retrouvent
en Afrique sub –tropicale.
2.2.Taxonomie et génome
P. falciparum est un microorganisme unicellulaire appartenant à l’embranchement des
Eucharyota, à l’ordre des Apicomplexa, à la famille des Hemosporidae et au genre
Plasmodium. Son génome d’une taille d’environ 24 Mb est réparti sur 14 chromosomes et
est constitué d’environ 5300 gènes. Ces 5300 gènes codent pour une multitude de protéines
(Lasonder et al., 2002; Florens et al., 2002) dont les fonctions demeurent inconnues pour
nombre d’entre elles.
12
Figure 2 : Cycle de développement de Plasmodium falciparum
Lors d’un repas sanguin sur un individu infecté, l’anophèle femelle ingère des
gamétocytes mâles et femelles. Ceux-ci parviennent dans l’estomac du moustique et se
transforment en gamètes. Les micro-gamètes mâles subissent un processus d’ex-flagellation à
la suite duquel les gamètes femelles ou macro-gamètes sont fécondés. Il en résulte un zygote
qui se transforme en une forme allongée mobile appelé ookinète. Celui-ci s’implante sous la
paroi stomacale en formant l’oocyste sphérique au sein duquel s’effectuent plusieurs mitoses.
L’oocyste mûr éclate et libère dans l’hémolymphe les sporozoïtes, éléments mobiles et
haploïdes qui passeront ensuite au niveau des glandes salivaires. Les sporozoïtes seront
injectés avec la salive lors d’une piqûre infestante.
13
2.3.2. Cycle chez l’homme
2.3.2.1. Cycle exo-érythrocytaire
Les sporozoïtes injectés transitent dans la circulation sanguine et envahissent très vite
les hépatocytes. Ils vont se transformer en masses multi nucléées appelés schizontes. Ces
derniers une fois mûrs éclatent et libèrent de nombreux mérozoïtes qui envahissent les
érythrocytes
2.3.2.2. Cycle intra -érythrocytaire
Dans l’érythrocyte, les mérozoïtes se différencient en anneau puis en trophozoïtes. Les
trophozoïtes donneront naissance aux schizontes qui éclatent pour libérer de nombreux
mérozoïtes qui rapidement réinfectent des érythrocytes sains et le cycle continue : c’est le
cycle sanguin asexué.
14
Figure 3 : jeunes trophozoites
Stade III : A ce stade (figure 5), les gamétocytes sont en forme de sphère
segmentée généralement au 7ème jour de culture. La différenciation en gamétocytes mâle et
femelle a lieu avec l’apparition de protéines sexuelles Pfg377, Pfs77 et l' tubuline II
(Severini et al. , 1999). On peut noter à ce stade, la présence de nombreux ribosomes et de
vésicules endoplasmiques chez le gamétocyte femelle.
15
Stade IV : Au 10ème jour de culture (figure 6), les gamétocytes sont
fusiformes et orientés vers les pôles de la cellule.
16
2.4.2. Le gène pfs16
Le gène pfs16 est localisé sur le chromosome 4 du génome de P. falciparum (NF54).
Il est constitué de 641pb (Accession Number : M64705) codant une protéine de 16,6 kDa
localisée sur la membrane de la vacuole parasitophore (Moelans et al., 1991; Baker et al.,
1994; Bruce et al., 1994). Elle apparaît très tôt au cours de la gamétocytogénèse aux stades I
et II. C’est le premier marqueur du début de la gamétocytogénèse, le signal de la
différenciation sexuée (Bruce et al., 1994; Dechering et al., 1997 ; Dechering et al.,1999 ;
Niederwieser et al., 2000). Cette protéine n’est pas indispensable à la transcription des autres
protéines de la gamétocytogénèse mais joue un rôle dans la différenciation en gamétocytes
mâle et femelle et dans la production des gamétocytes (Kongkasuriyachai et al., 2004).
2.4.3. Le gène pfg27/25
Le gène pfg27/25 est localisé dans la région sub-télomérique du chromosome 13 de la
souche 3D7 de P. falciparum (Sharma et al., 2003 ; Sallicandro et al., 2000). Il est constitué
de 2108 pb (Accession Number : X84904) codant une protéine de 217 acides aminés.
Pfg27/25 est une protéine cytoplasmique très hydrophile de 27 kDa ( Alano et al., 1991). Sa
transcription apparaît aux stades I et II et disparaît dans les derniers stades de la
gamétocytogénèse (Lobo et al., 1994). Elle joue un rôle important dans la maturation des
gamétocytes (Laura G .Pologe., 1994; Alano et al.,1995b ; Alano et al., 1996; Lobo et al.,
1999).
2.4.4. Les protéines Pfs48/45 et Pfs230
Pfs48/45 et Pfs230 sont deux protéines exprimées dans les derniers stades de la
gamétocytogénèse et chez le gamète. Les gènes codant ces deux protéines sont situés
respectivement sur les chromosomes 13 et 2 de la souche 3D7 de P. falciparum.
Pfs48/45 est une protéine membranaire de 45/48 kDa, essentielle à la fertilité des
gamètes (Kocken et al., 1993; Van Dijk et al., 2001).
La lyse in vitro de gamètes de P. falciparum, dépendante du système du complément
serait liée à la présence d’anticorps anti-Pfs230 (Healer et al., 1997).
2.4.5. Le gène pfs77
Le gène pfs77 est localisé au niveau du chromosome 6 de P . falciparum (Souche
3D7A); il est constitué de 2157 pb codant une protéine hydrophile de 77 kDa présente
uniquement chez le gamétocyte femelle (Baker et al., 1995).
17
2.4.6. Le gène pfg377
Le gène pfg377 localisé sur le chromosome 12 de P . falciparum (Souche 3D7) code
une protéine de 377 kDa, très hydrophile spécifique du gamétocyte femelle et qui est
exprimée dans les derniers stades de la gamétocytogénèse (Alano et al., 1995a; Severini et
al., 1999; Menegon et al., 2000). Elle joue un rôle dans la rupture de l’érythrocyte au cours de
la maturation des gamétocytes chez le moustique.
2.4.7. La protéine -tubuline II
L’-tubuline II est une protéine spécifique au gamétocyte mâle (Rawlings et al., 1992;
Guinnet et al., 1996) exprimée dès le stade III de la gamétocytogénèse. Elle se trouve au
niveau de l’axonème, ce qui suggère un rôle dans l’ex-flagellation et dans la mobilité du
parasite.
18
Matériel et Méthodes
19
Nous avons utilisée pour cette étude la démarche suivante (ci-dessous) :
11. Culture des cellules Mimic TM 12.Transfection stable des cellules MimicTM.
20
3. Matériel et Méthodes
3.1. Matériel
Le matériel biologique utilisé est le suivant : sang parasité, souche 3D7 de P. falciparum,
cellules d’insectes MimicTM, cellules d’E. coli JM109.
3.2. Méthodes
Pour extraire l’ADNg de la souche 3D7 P. falciparum, une culture d’hématies avec
une parasitémie d’environ 2 à 4 % a été utilisée suivant le protocole du kit « E.Z.N.A.® Blood
DNA Kit » d’Omega Bio-tek et l’ADN g obtenu est conservé à –20°C.
La PCR a pour but d’amplifier in vitro les deux gènes d’intérêt. Deux couples
d’amorces spécifiques ont été utilisés pour chaque gène. Ils ont été choisis selon les critères
suivants et synthétisés pour les besoins de l’étude :
- présence du site de restriction de HindIII ou EcoRI ,
- posséder un ATG au sein de la séquence d’initiation de la transcription Kosak, pour une
meilleure transcription des gènes pfs16 et pfg27/25 dans le plasmide.
- encadrer toute la séquence codante de chaque gène,
- présence d’une étiquette 6xHis en C ou en N terminal.
Les gènes pfs16 et pfg27/25 ont été amplifié selon le programme suivant:
hybridation 54°C 30 s.
élongation 72°C 40 s.
21
3.2.1.3. Purification du produit de PCR
Le kit de purification de Roche « High Pure PCR Product Purification » a été utilisé
pour purifier les amplicons et l’ADN pure est déposé sur gel d’agarose .
La migration sur gel a pour but de visualiser le résultat de la PCR, de quantifier l’ADN
et de déterminer la taille de l’amplicon en paire de bases en utilisant pour référence le
marqueur de taille « Smart Ladder » d’Eurogentec. Un gel agarose à 1% est utilisé dans du
tampon TAE 1X. La révélation au BET se fait dans une chambre UV .
22
3.2.1.5.1. Réaction de digestion
Les enzymes de restriction HindIII et EcoRI sont utilisées pour digérer le plasmide
pIZ/V5-His et les amplicons : pfs16-NHis , pfs16-CHis , pfg27/25-NHis , pfg27/25-CHis. Les
produits digérés sont purifiés sur colonne Roche à partir du kit « High Pure PCR » et
quantifiés sur gel agarose 1% en présence du marqueur de taille « Smart Ladder ».
Les clones de cellules E.coli recombinants positifs sont mis en culture dans du milieu
LB Low salt supplémenté de zéocine à 40 µg / mL, toute la nuit à 37°C sous agitation. Les
cultures d’une nuit sont purifiées en utilisant la méthode par centrifugation du Kit
« Wizard®Plus SV Minipreps DNA Purification System » de Promega .
23
3.2.1.9.Vérification des inserts par séquençage
Nous avons utilisé le kit ABI PRISM® BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction de Applied Biosystems pour le séquençage de l’ADN plasmidique. La méthode
utilisée est une variante de la technique de séquençage de Sanger. En effet le réactif de
séquençage utilisé contient :
- des ddNTP couplés à quatre fluorochromes différents dérivant de dichloro-
rhodamine (A-Dye Terminator [R6G], C-Dye Terminator [ROX] , G-Dye Terminator
[R110], T-Dye Terminator [TAMRA] ).
- des dNTPs (dATP, dCTP, dITP, dUTP )
- du MgCl2+
-du tampon Tris-HCl, pH 9
- et la Taq polymérase.
La réaction de séquençage se fait selon le programme suivant :
Deux clones recombinants positifs ayant la totalité de la séquence des gènes pfs16 et
pfg27/25 (C1 pIZ/V5-Hispfg27/25C-His et C3 pIZ/V5-Hispfs16C-His) sont mis en culture
dans du milieu LB Low salt supplémenté de zéocine 40 µg/mL et incubés sous agitation à
37°C toute la nuit. Le Kit « Wizard® Plus Midipreps DNA Purification system » de Promega
est utilisé ensuite pour purifier les plasmides. La purification est vérifiée sur gel agarose 1%.
24
3.2.2. Culture des cellules MimicTM
La zéocine est un antibiotique de la famille des Bléomycines. Elle est toxique pour les
les cellules de mammifères (Mulsant et al., 1988;Drocourt et al., 1990 ). La zéocine activée
s’intercale dans l’ADN cellulaire et le coupe entraînant la mort de la cellule.
TM
On cultive les cellules Mimic en présence de concentrations décroissantes de
zéocine pour déterminer la concentration létale.
25
3.2.2.3.1. Préparation des cellules MimicTM
Pour la transfection, les cellules MimicTM doivent être à une concentration de 9.105
cellules/2mL ou à 2.106 cellules /2mL, adhérentes, avoir une viabilité supérieure à 95% et
confluentes à 95%.
26
3.2.3. Contrôle de l’expression des cellules MimicTM transfectées
Les différents clones cellulaires sont récupérés pour l’analyse de l’expression de Pfs16
et Pfg27/25 .
L’ADNg des cellules transfectées a été extrait et purifié à l’aide du kit « QIAmp®
DNA Mini and QIAamp DNA Blood Mini Kit Handbook ». Il est ensuite amplifié par PCR
spécifique des gènes pfs16 et pfg27/25 et déposé sur gel d’agarose 1%. Les clones positifs
sont récupérés et analysés sur gel de polyacrylamide.
27
3.2.3.4 . Analyse de l’expression des protéines recombinantes Pfs16 et
Pfg27/25 sur bio- analyseur
L’analyse a été faite avec le surnageant obtenu à partir de lysat des clones de cellules
MimicTM recombinants positifs sur Agilent 2100 bioanalyzer avec le kit «200 Plus
LabChip® ».
Préparation de la puce
Agilent Technologies
1-3 G
4-6 1
G
7-9 G
10
G DS
Protein LabChip®
Les puits G sont remplis avec une solution de « gel-dye mix » , le puits « DS » avec
une solution de dénaturation et le puits avec le marqueur de taille.
Les échantillons sont déposés dans les puits 1-3 , 4-6 , 7-9 et 10 .
28
Il en reste 2 qui vont interagir avec les atomes d’azote du cycle de la chaine latérale
de deux molécules d’hisdidine. A pH acide, les résidus histidine commencent à être réduits
et ne pourront plus se lier au Ni 2+.
La variation de concentration à 500 mM d’imidazole permet d’éluer les
protéines. L’imidazole va entrer en compétition avec les molécules d’histidine pour le Ni2+.
Les différentes fractions correspondants aux pics d’absorbance sont récupérées pour être
analysées sur gel de polyacrylamide.
29
Résultats et Discussion
30
4. Résultats et Discussion
4.1. Amplification des gènes codants pour les protéines Pfs16 et Pfg27/25
par PCR spécifique à partir de l’ADN 3D7 de P. falciparum
Nous avons amplifié chaque gène avec une étiquette 6xHis en C-terminal et en N-
terminal. La figure 10 ci-dessous correspond au gel d’agarose permettant d’analyser les
résultats de l’amplification in vitro en présence du marqueur de taille « Smart Ladder ».Nous
avons des bandes à 686 pb correspondant aux amplicons pfg27/25 et des bandes à 512 pb
correspondant aux amplicons pfs16.
Smart Ladder
pfg27 Nhis
pfg27 Chis
pfs16 Nhis
pfs16 Chis
1 2 3 4 5
686 pb
512 pb
31
d’anticorps monoclonaux. Du fait de sa petite taille, elle n’influera pas sur la fonction
protéique.
686pb
512pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Les séquences obtenues sur le séquenceur 3100ABI PRISM® ont été analysées à l’aide
du logiciel Vector NTI.
32
Parmi tous les clones séquencés, C3 pIZ/V5-Hispfs16CHis, C4 pIZ/V5-
Hispfs16 CHis, C4 pIZ/V5-Hispfs16NHis, C1 pIZ/V5-Hispfg27/25CHis et C4 pIZ/V5-
Hispfg27/25NHis présentent une séquence conforme à celle de référence. La figure 12 est un
exemple d’électrophorégramme obtenu. Nous avons une subtitution d’une base T par une
base A en position 189 par rapport à la séquence du gène pfs16 de référence.
Chaque base est identifiée par un fluorochrome différent : vert pour A, noir pour G, rouge
pour T et bleu pour C. La substitution d’une base T par une base A en position 189 est
signalée par un encadré rouge.
Le séquençage du gène pfs16 de la souche 3D7 a révélé une mutation ponctuelle par
rapport à la souche de référence NF54 (Accession Number : M64705). Il s’agit de la
substitution d’une base T par une base A en position 189, ce qui correspond à une mutation
d’une Leucine CTA en une Glutamine CAA et une délétion en position 354 et 357 des
codons ATA AAG codant l’Isoleucine et la Lysine. Ces différences ont été vérifiées à trois
reprises sur des amplicons différents issus de différentes extractions d’ADNg de P.
falciparum. Ce polymorphisme de pfs16 a déjà été noté par Niederwieser en 2001.
Il avait décrit des mutations entre les souches NF54 (Accession Number : M 64705)
et 7G8 (Accession Number : AF177633).
33
4.4. Expression des protéines recombinantes Pfs16 et Pfg27/25 dans les
cellules Mimic transfectées
Les tests d’expression ont été effectués à partir de 12 clones (6 clones de cellules
MimicTM pIZ/V5-His pfs16CHis et 6 clones de cellules MimicTM pIZ/V5-His pfg27/25CHis )
de la première transfection et 10 clones (4 clones de cellules MimicTM pIZ/V5-His pfs16CHis
et 6 clones de cellules MimicTM pIZ/V5-His pfg27/25CHis ) de la deuxième transfection.
4.4.1. Amplification par PCR spécifique des gènes pfs16 et pfg27/25 dans
l’ADNg des cellules MimicTM transfectées
Nous avons obtenus au total 6 clones positifs pour les cellules transfectées avec le
gène pfs16 et 10 clones positifs pour les cellules transfectées avec le gène pfg27/25.
La figure 13 est un exemple d’analyse de nos résultats par électrophorèse sur gel d’agarose.
Smart ladder
C2Pfg27/25T1
C3Pfg27/25T1
C4Pfg27/25T1
C6Pfg27/25T1
C1Pfg27/25T1
C2Pfg27/28T2
C5Pfg27/25T1
C1Pfg27/25T2
C2Pfs16T1
C1Pfs16T1
C3Pfs16T1
C4Pfs16T1
C7Pfs16T2
C5Pfs16T1
C6Pfs16T1
512 pb 686pb
686 pb
686pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
34
4.4.2. Résultats obtenus sur gel de polyacrylamide
La migration des lysats cellulaires sur gel de polyacrylamide a donné des bandes non
spécifiques avant et après coloration . Nous obtenu le gel présenté sur la figure 14 avec 6
TM
clones positifs du gène pfs16 , les cellules Mimic sauvages et 6 clones positifs du gène
pfg27/25.
Marqueur de taille
C3pfg27/25T1
C4pfg27/25T1
C5pfg27/25T1
C6pfg27/25T1
C2pfg27/25T2
C9pfg27/25T2
C11pfs16T2
C3pfs16 T1
C4pfs16T1
C5pfs16T1
C1pfs16T2
C3pfs16T2
SSSAUVAGE
Mimic TM
30 kDa
15 kDa
35
4.4. 3. Résultats obtenus sur le bio analyseur
Le kit 200 Plus Labchip® d’Agilent est utilisé pour l’analyse de protéines de 14 à 200
kDa à partir d’un lysat cellulaire ou de protéines purifiées. La figure 15 est obtenue en
TM
superposant les électrophorégrammes du clone C5 pfs16 et des cellules Mimic sauvages.
Nous avons un pic à 15 ,5 kDa qui n’apparaît pas sur l’électrophorégramme des cellules
MimicTM sauvages et qui correspond à la taille attendue pour la protéine Pfs16.
C5 Pfs16
15,5kDa
14,4kDa
Cellules MimicTM
36
les purifier par F.P.L.C. Le bio analyseur a une sensibilité intéressante compte tenu du
facteur de dilution élevé de l’ordre de 1/22 de la prise d’essai.
37
Toutes les fractions correspondants aux pics d’absorbance ont été recueillies à environ
50mM d’imidazole . Nous avons des pics d’absorbance variant de 300 à 700 mAU pour les
clones de cellules transfectées avec pfs16 et des pics variant de 300 à 400 mAU pour les
clones de cellules transfectées avec pfg27/25 .
La purification par F.P.L.C a permis de voir que certains clones semblent présenter une
meilleure expression que d’autres.
Les deux protéines Pfs16 et Pfg27/25 exprimées dans les cellules Mimic jouent un rôle
important au cours de la gamétocytogénèse de P. falciparum (Lobo et al.,1999 ;
Kongkasuriyachai et al.,2004). Les gènes codant ces deux protéines ont été clonés dans des
systèmes procaryotes (Alano et al.,1991 ; Baker et al.,1994).
Cette étude a permis l’obtention de protéines recombinantes dans un système
eucaryote. Ce système d’expression a été choisi pour de nombreuses protéines de P.
falciparum qui subissent des modifications post-traductionnelles proches de celles qui ont lieu
dans les cellules d’insectes ( Kocken et al.,1993). La plupart des protéines ne sont actives in
vivo qu’après avoir subi des modifications post-traductionnelles telles que les méthylations,
les acétylations, les sulfonations, les phosphorylations, l’addition de lipides, les
glycosylations, la formation de ponts disulfures etc .Ces modifications ont lieu pour la plupart
dans le réticulum endoplasmique et dans l’appareil de Golgi pour donner une protéine mature.
Dans une communication parue en 1997, Nirbhay Kumar pose l’hypothèse d’une
phosphorylation de la protéine Pfg27/25.
Dans un système procaryote il est peu probable d’obtenir la protéine mature car les
modifications post-traductionnelles telles que glycosylation et phosphorylation sont rarement
réalisées chez les bactéries.
TM
Les différentes techniques utilisées pour le contrôle de l’expression des cellules Mimic
transfectées, à savoir l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide, le bio analyseur et la
F.P.L.C seront optimisées avec d’autres techniques telles que le western-blot afin de
sélectionner les clones ayant une meilleure expression.
38
Conclusion et perspectives
39
5. Conclusion et perspectives
TM
Nous avons exprimées les protéines Pfs16 et Pfg27/25 dans des cellules Mimic .
Plusieurs clones cellulaires positifs ont été obtenus. Les clones de cellules MimicTM
performants seront sélectionnés et utilisés pour la production de ces deux protéines. Nous
obtiendront après purification une quantité importante de protéines Pfs16 et Pfg27/25. Ces
protéines seront utilisées pour produire des anticorps monoclonaux anti-Pfs16 et anti-
Pfg27/25. Ces anticorps monoclonaux serviront d’une part pour l’identification des stades
précoces de la gamétocytogénèse de P. falciparum, éléments totalement indifférenciables des
formes asexuées et d’autre part pour la quantification des gamétocytes en fonction des
différents produits ou techniques d’induction de la gamétocytogénèse. Ils constitueront un
outil intéressant dans les études in vitro des mécanismes régulateurs du cycle de
développement du parasite dans le cadre de la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques et
vaccinales. Il est impératif d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques ou vaccinales car le
paludisme demeure un problème de santé publique.
40
Références bibliographiques
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46
ANNEXES
47
Annexes
Protocoles
Ils ont été choisis selon les critères suivants et synthétisés pour les besoins de l’étude :
- présence du site de restriction de HindIII ou EcoRI (en rose),
- posséder un ATG (en rouge) au sein de la séquence d’initiation de la transcription
Kosak (en gras) pour une meilleure transcription des gènes Pfs16 et Pfg27/25 dans le
plasmide,
- encadrer toute la séquence codante de chaque gène,
- présence d’une étiquette 6xHis (en bleue) en C ou en N terminal.
48
Gène pfg27/25
pfg27/25-D-HindIII
5’ CCAAGCTTGGGATGGCAAGTAAGGTACAAAAGGATAG 3’
pfg27/25-CHis-EcoRI
5’ CGGAATTCCGGTCAATGGTGATGGTGATGATGAATATTGTTGTGATGTGG 3’
pfg27/25-DHis-HindIII
5’ CCAAGCTTGGGATGGCACATCATCACCATCACCATAGTAAGGTACAAAAGG 3’
pfg27/25-C-EcoRI
5’ CGGAATTCCGGTCAAATATTGTTGTGATGTGGTTC 3’
Gène pfs16
pfs16-D-HindIII
5’ CCAAGCTTGGGATGGCAAATATTCGAAAGTTCATA 3’
pfs16-CHis-EcoRI
5’ CGGAATTCCGGTCAATGGTGATGGTGATGATGAGAATCATCTCCTTCGTC 3’
pfs16-DHis-HindIII
5’CCAAGCTTGGGATGGCACATCATCACCATCACCATAATATTCGAAAGTTCAT
A 3’
pfs16-C-EcoRI
5’ CGGAATTCCGGTCAAGAATCATCTCCTTCGTC 3’
49
Purification du produit de PCR
Réactions de digestion
Pour chaque insert, la réaction de digestion est :
- 15 µL de chacun des amplicons
- 1 µL d’enzyme de restriction (10U/µL) Hind III Roche
- 1 µL d’enzyme de restriction (10U/µL) EcoRI Roche
- 2 µL de tampon de digestion B 10X Roche
- 1 µL d’H2O ultra-pure
Volume total 20 µL
50
Réaction de ligation
Réaction de transformation
Après avoir repéré au marqueur sur les boites de culture une dizaine de colonies,
prélever sous la hotte chaque colonie avec une pointe de 10 µL et la mélanger dans 10 µL
d’H20 ultra-pure dans un tube PCR, mettre ensuite la pointe dans un tube de 1,5 mL contenant
1 mL de milieu LB Low Salt.
Chauffer le tube de PCR à 99°C pendant 10 mn puis ajouter à ce lysat bactérien :
- 5 µL de Tampon 10X
51
- 4 µL de MgCl2+ à 25 mM
- 1 µL de dNTPs à 10 mM
- 1 µL d’amorce D à 16 µM
- 1 µL d’amorce C à 16 µM
- 0,5 µL de Taq Eurogentec à 5U/µL
- 27,5 µL de H2O ultra-pure
Volume total 50 µL
Amplification et purification des plasmides
Les clones positifs sur PCR sont cultivés sur LB low salt additionné de zéocine à
40µg/Ml toute une nuit.
- Centrifuger les cultures d’une nuit à 3000 rpm pendant 10 mn à 4°C, éliminer le
surnageant, reprendre le culot dans 250 µL de solution de resuspension cellulaire.
- Transférer le mélange dans les tubes de 1,5 mL.
- Ajouter 250 µL de solution de lyse, inverser les tubes 4 fois et attendre jusqu’à lyse
complète des cellules puis ajouter 10 µL de protéase alcaline, inverser les tubes 4 fois,
incuber pendant 5 mn.
- Ajouter 350 µL de solution de neutralisation, inverser 4 fois le tube et centrifuger à
13000 rpm, pendant 15 mn.
- Récupérer le surnageant et le passer sur une colonne de silice.
- Centrifuger la colonne pendant 1 mn.
- Ajouter sur la colonne 750 µL de solution de lavage (préalablement dilué dans de
l’éthanol 95%) et centrifuger à 13000 rpm pendant 1mn.
- Ajouter de nouveau 250 µL de solution de lavage, centrifuger à 13000 rpm pendant 2
mn.
- Mettre la colonne dans un nouveau tube de 1,5 mL et éluer l’ADN plasmidique avec
80 µL H2O ultra-pure laisser 1 mn puis centrifuger à 13000 rpm pendant 1 mn.
Conserver l’ADN plasmidique à -20 °C.
52
Volume final de 20 µL
Précipitation des produits de séquençage
Mélanger la réaction de séquençage avec :
- 2 µL d’acétate de sodium 3M pH 4,6
- 2 µL d’EDTA 125 mM
- 50 µL d’éthanol 100% et laisser 15 mn à température ambiante.
- Centrifuger à 13000 rpm pendant 30 mn, reprendre le culot avec 100 µL d’éthanol
70%.
- Centrifuger à 13000 rpm pendant 15 mn, laisser sécher le culot à température
ambiante.
- Reprendre le culot sec avec 10 µL de formamide pour dénaturer les structures
secondaires, laisser 10 mn à température ambiante puis agiter pendant 15 mn.
- Transférer le mélange dans une plaque de séquençage de 96 puits
- Chauffer à 96°C 2 mn pour dénaturer l’ADN et immédiatement après chauffage
refroidir pour éviter toute renaturation à 4°C.
Les milieux de culture sont préparés suivant le manuel « Growth and Maintenance of
Mimic Insect Cells™ » de Invitrogen.
Dans 500 mL de « Grace’s Insect Medium » supplémenté d’acides aminés, ajouter 10
% de sérum de veau fœtal, de la gentamycine à 1 mg/mL (milieu Mimic). Aliquoter 4 mL de
milieu ainsi préparé dans une flasque de 25 cm2. Décongeler les cellules Mimic™ conservées
dans de l’azote liquide et les laver avec 4 mL de milieu Mimic pour éliminer le DMSO qui
53
inhibe la croissance cellulaire. Centrifuger à 1000 rpm pendant 5 mn, reprendre le culot de
cellules avec 1 mL de milieu Mimic et le rajouter aux 4 mL de milieu de la flasque de
25cm 2 . Répartir les cellules dans la flasque et incuber à 27°C en absence de CO2 et en
atmosphère humide. Observer les cellules au microscope inversé 24 heures après et noter
l’adhérence et la confluence.
Récupérer les cellules après 48 heures d’incubation et les remettre dans une flasque de
75 cm2 contenant 10 mL de milieu Mimic neuf , incuber à 27°C. Diviser ensuite les cellules
tous les 2 jours pour avoir en permanence des cellules Mimic confluentes et adhérentes.
Test de sélection à la zéocine
Récupérer les cellules par pression du milieu à l’aide d’une pipette, les transférer dans
des tubes stériles et centrifuger à 1000 pendant 10 mn. Reprendre les cellules de chaque tube
dans 2 mL de milieu Mimic. Diluer au ½ la suspension cellulaire dans du Bleu Trypan
colorant vital et compter le nombre de cellules blanches à partir de 10 µL de ce mélange à la
cellule de Malassez. Aliquoter 500 µL à 2.105cellules/mL de suspension dans 8 puits d’une
plaque de culture cellulaire Multiwell™ 24 puits et incuber à 27°C jusqu’à ce que les
cellules soient confluentes et adhérentes à la plaque. Ajouter ensuite dans chaque puits, 500
µL de milieu Mimic et des concentrations décroissantes de zéocine : 800 µg/mL, 700 µg/mL,
600 µg/mL, 500 µg/mL, 400 µg/mL, 300µg/mL, 200 µg/mL, 100µg/mL et incuber 1 semaine
à27°jusqu’àlamorttotaledescellules.
Transfection stable des cellules MimicTM
Protocole 1
54
Prendre la plaque de culture de 6 puits contenant les cellules MimicTM, retirer le
milieu et vérifier l’adhérence et la confluence au microscope inversé, laver ensuite les cellules
avec 2 mL de milieu « Grace’s Insect » non supplémenté puis retirer le milieu de lavage.
Dans chaque tube de transfection, ajouter 800 µL de milieu « Grace’s Insect » non
supplémenté, mélanger doucement et répandre goutte à goutte la solution sur les cellules
MimicTM. Placer ensuite la plaque dans un sac plastique scellé avec un essui tout imbibé d’eau
pour éviter l’évaporation et incuber à 27°C toute la nuit.
Protocole 2
- Décoller les cellules MimicTM transfectées dans une flasque de 75 cm2 à la pipette et
les transférer dans un tube de 50 mL.
- Centrifuger à 1600 rpm pendant 5 mn.
- Reprendre le culot cellulaire dans 2 mL de milieu Mimic.
- Compter les cellules à la cellule de Malassez.
- Diluer les cellules à des concentrations d’ environ 104 , 103 , 102 cellules/mL dans
une plaque de 6 puits avec du milieu Mimic additionné de zéocine à 500µg/mL.
- Incuber à 27°C jusqu’à ce que des clones apparaissent.
- Réensemencer le reste des cellules MimicTM confluentes dans une flasque de 25 cm 2
contenant du milieu Mimic additionné de zéocine à 500 µg/mL puis en flasque de 75 cm2
contenant du milieu Mimic additionné de zéocine à 500 µg/mL jusqu’à confluence et les
congeler en azote liquide.
55
- Le clonage cellulaire s’effectue en récupérant à l’aide d’une pipette de 100, les
clones visibles à l’œil nu.
- Transférer chaque clone récupéré dans une plaque de 96 puits avec du milieu Mimic
additonné de zéocine à 500 µg/mL.
56
- Placer la colonne dans un nouveau tube collecteur, laver avec 500 µL de « Buffer »
AW1 et centrifuger à 8000 rpm pendant 1 mn.
- Placer la colonne dans un nouveau tube collecteur, laver avec 500 µL de « Buffer »
AW2 et centrifuger à 13000 rpm pendant 3 mn.
- Placer la colonne dans un tube de 1,5 mL et éluer l’ADN avec 200 µL d ‘H2O ultra-
pure
- Incuber à température ambiante pendant 5 mn et centrifuger 1mn à 8000 rpm.
Conserver l’ADN à -20°C.
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Persulfate à 150 mg/mL 100 µL 50 µL
Temed commercial 10 µL 10 µL
Révélation du gel
Après électrophorèse SDS PAGE, le kit « BDTM Universal His Tag Western Blot kit »
est utilisé pour la détection spécifique des protéines recombinantes avec une étiquette 6xHis
telles que Pfs16 et Pfg27/25.
- Fixer le gel avec 100 mL de la solution de fixation Tris-Glycine pendant une heure.
- Laver le gel avec 100 mL d’eau ultra-pure pendant 10mn, répéter l’opération une
fois.
TM
- Incuber sous agitation le gel dans 25 mL du réactif « In vision His Tag In gel
Stain ».
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- Laver le gel avec 100 mL de tampon phosphate 20 mM, pH 7,8 pendant 10mn,
répéter l’opération.
- Révéler le gel sur Lumi-Imager de Roche.
- Prendre une photo du gel.
Solution de gel
- Mélanger 25 µL de « dye concentrate® » avec 650 µL de « gel matrix® ».
Solution de décoloration
- Prendre un tube contenant 650 µL de « gel matrix® ».
Vortexer ces deux solutions puis les transférer dans des colonnes et centrifuger à 5200
rpm pendant 15S
Solution de dénaturation
Ajouter 7 µL de DTT dans 200 µL de tampon d’échantillon et vortexer pendant 5 s.
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Préparation de la puce
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Milieux
Low Salt LB
- 1% Tryptone
- 5% Yeast Extract
- 0,5% Nacl
pH 7,5
- Low Salt LB
- 15 g/L d’Agar
Autoclaver
Milieu de congélation
Solutions et tampons
Solution de lyse
- 50 mM Tris
- 150 mM NaCl
- 1 % de Nonidet P-40
pH 7,8
Buffer 5X SDS-Page
- Glycérol 50 %
- -mercaptoéthanol 15 %
- SDS 15 %
- Bleu de bromophénol 1,5 %
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PBS
- NaCl 137 mM
- KCl 2,7 mM
- Na2HPO4 10 mM
- KH2PO4 1,8 mM
Ajuster le pH à 7,4
Autoclaver
Tampon de transfert
- Tris 0.3 %
- Glycine 1.44 %
- Méthanol 10 %
pH 8.3
TBS-T
- TBS 10X
- Tween 20 0,1 %
pH 8
Solution de fixation
- Ethanol 100 mL
- Acide acétique 20 mL
Compléter avec de l’eau ultra-pure à 200 mL
Tampon Séparation :
- Tris-HCl à 1,5 M
pH 8,8
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SMART LADDER
Zéocine
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Définitions
Gène :
Enzyme de restriction : enzyme reconnaissant des sites particuliers sur l’ADN et qui coupe
la molécule au niveau de ces sites ou plus loin.
Bactéries compétentes : bactéries dont la membrane est fragilisée pour faciliter l’entrée
du plasmide.
Clone : le clone correspond à un grand nombre de molécules ou de cellules identiques
provenant d’un seul ancêtre (cellule ou molécule).
Clonage : sur le plan moléculaire, isoler et amplifier un gène d’intérêt et sur le plan
cellulaire, isoler une cellule pour en obtenir un grand nombre de copies identiques.
Maturation des protéines : ce sont des modifications post-traductionnelles qui ont lieu
dans le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi telles que :
- méthylation, acétylation
- sulfatation
- phosphorylation
- addition de lipides
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- glycosylation
- formation de ponts disulfures
Ces modifications peuvent être d’une grande importance en ce qui concerne la fonction de la
protéine.
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