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Module d’immunologie -Faculté de médecine d’Alger- Abdelmoumene Hacen

2017/2018

TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES

UTILISANT UN MARQUEUR
People hate what they dont understand.
-Martha Kent-

Plan du cours
I. INTRODUCTION .....................................................................................................................2
Classification des méthodes d’immunomarquage……………………………………………… 2
II. IMMUNOFLUORESCENCE (IF) ................................................................................................2
-Définition ............................................................................................................................................2
-Intérêt de l’immunofluorescence………………………………………………………………… 3
-Deux méthodes d’immunofluorescence : ……………………………………………………………………………….3
1. IF directe (IFD)………………………………………………………………………………..4
2. IF indirecte (IFI)……………………………………………………………………………….4
-Méthode de double marquage…………………………………………………………………...6
III. ENZYME LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY (ELISA) ...............................................................6
-Définitions………………………………………………………………………………………….7
-Dosage des antigènes :………………………………………………………………………….8
1. ELISA sandwich………………………………………………………………………………8
2. ELISA directe………………………………………………………………………………… 8
3. ELISA par compétition……………………………………………………………………….9
Dosage des anticorps : ………………………………………………………………………….10
1. ELISA indirecte…………………………………………………………………………….. 11
2. ELISA par compétition…………………………………………………………………… 11
IV. DOSAGE RADIO IMMUNOLOGIQUE………………………………………………………11
-Définition………………………………………………………………………………………11
-Deux méthodes : ………………………………………………………………………………12
1. Radio Immuno Assay (RIA)………………………………………………………………12
2. Immuno Radio Metric Assay (IRMA)……………………………………………………12
V. BIBLIOGRAPHIE………………………………………………………………………………………………………………12

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I. INTRODUCTION :
Lorsqu’un antigène est son anticorps spécifique sont mis en contact, des complexes
immuns se forment. Ceux-ci peuvent être quantifier à des techniques qui se basent
sur l’utilisation d’un marqueur (traceur) qui peut être fluorescent, enzymatique,
radioactif ou luminescent.
Faut préciser que les techniques d’immunodosage sont divisées en deux types :
•Techniques homogènes : effectuées sur phase liquide et ne nécessitant
pas un lavage.
• Techniques hétérogènes : effectués sur une phase solide (pour la
fixation) et nécessite un lavage pour éliminer les éléments qu’on voulait
fixer ou combiner mais qu’ils ne le seront pas. Toutes les techniques qu’on
verra dans ce cours sont hétérogène.
Classification des méthodes d’immunomarquage :
Techniques Traceur
Immunofluorescence (IF) Fluorescent
ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Enzymatique
Assay)
RIA (Radioimmunoassay) Radioactif
IRMA (immunoradiometric assay)
Chimiluminescence Luminescent

II. IMMUNOFLUORESCENCE :
Définition : L’immunofluorescence est une méthode d’immunodosage utilisée
pour localiser les antigènes en se servant d’anticorps et de marqueurs
fluorescents. Un composé fluorescent (FLUOROCHROME = FLUOROPHORE)
est un composé qui a la
propriété d’émettre de la lumière
(à une certaine longueur d’onde
λ) quand il est exposé à une
autre lumière dont la λ est plus
courte.
Petite explication : Une lumière
est un rayonnement possédant
une énergie et une longueur
d’onde λ. λ est inversement
proportionnel à l’énergie du
rayonnement càd moins une
lumière possède de l’énergie
plus sa λ est grande.
Quand un composé fluorescent est exposé à une lumière (λ1 E1), il absorbe une
partie de l’énergie de cette lumière de sorte que la partie restante (E2) peut être

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émise avec une énergie plus faible évidement mais avec une plus grande
longueur d’onde λ2, c’est pour ça qu’on a dit qu’un fluorochrome est existé par
une lumière avec une plus faible λ que la sienne.

La procédure a été décrite par Coombs et consiste à marquer des anticorps avec
des fluorochromes aboutissant ainsi à un anticorps conjugué sans qu’il y’ait
changement remarquable dans l’activité de l’anticorps.
Le marquage se fait par un couplage facile entre le fluorochrome er le
groupement amine libre de l’anticorps grâce à la grande affinité que possèdent
ces marqueurs pour les protéines (c’est pour ça qu’il est facile)

Il y’a plusieurs sortes de fluorochromes pouvant donner plusieurs couleurs, mais


les plus utilisés sont :
• Fluorescéine aussi appelée Fluorescéine Isothyocinate (FITC) : C’est le
plus utilisé de tous les fluorochromes. Il émet une lumière de couleur
verdâtre.
• Phycoérythrine (PE) : Emet une couleur rouge.
• Rhodamine : Emet une couleur rouge.
La visualisation de la fluorescence se fait à l’aide d’un microscope fluorescent.
Ce microscope est doté d’une source de lumière ultra-violette (UV) qui sera projeté
sur notre échantillon marqué, ceci nous permettra de voir nos anticorps fluorescents
du fait des phénomènes d’absorption et d’émission de lumière décrits en haut.

Intérêt de l’immunofluorescence : Identification des antigènes cellulaires,


membranaires, intracytoplasmiques ou nucléaires sur des cellules en suspension ou
des coupes tissulaires.
Deux méthodes d’immunofluorescence : Il y’a deux procédures employant
les anticorps fluorescents : l’immunofluorescence directe (IFD) et
l’immunofluorescence indirecte (IFI).

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1. Immunofluorescence directe (IFD) : Elle utilisée pour identifier la présence


d’un antigène précis dans un tissu ou une suspension de
cellules/microorganisme par la mise en évidence du complexe immun Ag-Ac
fluorescent. Elle implique que le tissu ou le microorganisme cible (contenant l’Ag
recherché) interagi directement avec les anticorps fluorescent. Autrement dit,
l’anticorps fluorescent est directement fixé sur la préparation antigénique. Après
un moment de l’introduction des
anticorps fluorescents (le temps pour
que les complexes immuns se forment
si notre antigène est présent dans
l’échantillon), on lave notre
préparation pour éliminer les anticorps
fluorescents qui sont restés libres càd
sans se combiner à leurs antigènes
car les laisser ainsi donnera de faux
résultats. Après le lavage, la lecture
s’effectue au microscope fluorescent.

Application de l’IFD :
• En Anatomopathologie : Recherche de dépôts d’immunoglobulines, de
composants du
complément ou d’immuns complexes dans des biopsies tissulaires.
• Phénotypage des populations lymphocytaires B et T et des sous-
populations de lymphocytes TCD4+ et TCD8+
• Diagnostic direct en : bactériologie (ex : Chlamydiae…), parasitologie (ex :
toxoplasmose…)

2. Immunofluorescence indirecte (IFI) : Cette procédure implique en un premier


temps la réaction entre l’antigène recherché et un anticorps spécifique non
marqué (anticorps primaire). Après un moment (le temps nécessaire pour la
formation des complexes immuns), on lave notre préparation pour éliminer les
anticorps libres qui pourront fausser les résultats. Ensuite, cette réaction est
suivie par une autre réaction entre le premier anticorps (non fluorescent) et un
anticorps fluorescent anti-immunoglobuline ultérieurement ajouté (anticorps
secondaire), càd que le premier anticorps va jouer le rôle d’antigène pour le
second. On lave encore une fois pour éliminer les anticorps anti-Ig fluorescents
libres.
L’ajout des anti-Ig va donc nous révéler si le premier anticorps c’est bel et bien
fixer à son antigène ou non. Autrement dit, cette fixation va nous révéler la
présence et d’antigène cellulaire et d’auto-anticorps/anticorps contre un tissu
donné.

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Avantage : Elle est utilisée plus communément car elle est 4 à 10 fois plus
sensible que la méthode directe. L’explication de cette grande sensibilité dépend
de ce qu’on cherche par cette méthode :

a. Si l’élément recherché est un antigène :


Lorsqu’un anticorps joue le rôle d’antigène, ce
sont ces fragments Fc qui représente le
déterminant antigénique de cet anticorps, donc
les anti-Ig se liront au fragment Fc de l’anticorps
antigénique. Autrement dit, un anticorps primaire
peut lier plusieurs anticorps fluorescents secondaires.

Prenont l’exemple d’un antigène faiblement exprimé (en petite


quantité) : Dans ce cas, utiliser la méthode indirecte donne de
meilleurs résultats que la directe, car dans cette dernière, pour chaque
deux épitopes il’y a un seul anticorps fluorescent et comme l’antigène
est en faible quantité, le signal fluorescent sera faible et difficilement
décelable. Par contre, dans la méthode indirecte, pour chaque
anticorps primaire lié à son antigène (et qui lui-même joue le role d’un
antigène secondaire), il y’a deux ou plusieurs anticorps anti-Ig
fluorescents liés à lui. De ce fait, le signal fluorescent est plus grand et
facilement décelable par rapport à la méthode directe.

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b. Si l’élément recherché est un anticorps :


Ceci est beaucoup plus utiliser pour rechercher les dépôts
d’immunoglobuline dans les tissus lors des maladies auto-immunes.
L’exemple le plus fréquent est le Lupus érythémateux disséminés
(LED) ou LES (s pour systémique).
Petite vue sur cette maladie : il s’agit d’une maladie chronique auto-
immune, qui survient lorsque le système immunitaire s’attaque aux
cellules de l’organisme et les détruit.
Le LED touche les femmes 10 fois plus que les hommes. Il peut
toucher de nombreuses parties du corps, dont les articulations, la
peau, les reins, le cœur, etc. C’est la raison pour laquelle on parle de
lupus disséminé ou « systémique ».
On trouve dans les tissus atteints du malade des dépôts d’Ig dirigés
contre les cellules de ce tissu. Ces dépôts sont révélés par la méthode
indirecte. On comprend l’avantage de cette méthode dans le fait qu’on
peut utiliser un seul type d’anticorps fluorescents pour déceler la
présence de dépôts d’Ig dans n’importe quel tissu car comme on le
sait, les Ig possèdent tous une région variante qui diffère d’un
anticorps à un autre, et une région constante qui est la même chez
tous les anticorps. L’anticorps fluorescent se lira à la région constante
de l’Ig qui représente l’anticorps primaire non marqué (on a déjà dit
qu’un anticorps peut jouer le rôle d’antigène et que son épitope se
situe dans le fragment Fc (région constante)). De ce fait on peut utiliser
un seul clone d’anticorps fluorescents pour rechercher les dépôts d’Ig
dans plusieurs tissus.
Applications de l’immunofluorescence indirecte :
➢ Technique de choix dans le diagnostic immunologique des maladies auto-
immunes :
• Recherche et titrage des auto-Ac circulants.
• Typage des sous-populations de lymphocytes T et des
lymphocytes B par marquage de leurs antigènes de surface.
➢ En microbiologie : Sérodiagnostic de la syphilis
➢ En parasitologie : Sérodiagnostic de la toxoplasmose, leishmaniose.

Remarque : Les anti immunoglobulines proviennent sont obtenus après


immunisation d’animaux avec les γglobulines d’origine humaine.

Méthode de double marquage : Elle rend possible l’identification de plusieurs


complexes Ag-Ac différents en utilisant plusieurs marqueurs fluorescents dans la

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même réaction, elle permet donc un double, triple ou un quadruple marquage et


plus (selon le nombre d’antigènes recherchés). Le marquage peut être par la
méthode directe ou indirecte. Exemple : On cherche dans un échantillon deux
sortes d’antigènes A et B différents, on procède par exemple par la méthode
directe, on utilise alors des anticorps spécifiques à ces Ag et on les marque
chaque un par un marqueur différent (Fluorescéine pour les anti-A et la
Rhodamine pour les anti-B). On lave la préparation et on observe avec le MF.

La méthode de double marquage est plus souvent utilisée lorsque la lecture est
effectuée en cytométrie en flux qui est une technologie permettant la mesure
simultanée de plusieurs caractéristiques physiques d'une particule (cellule) en
suspension. C’est une technique extrêmement rapide et précise dans ces résultats.
Elle nous fournit plusieurs beaucoup d’information sur les cellules étudiées, on citera
par exemple : la taille relative, la granularité ou sa complexité interne relative et son
intensité relative de fluorescence.

III. ENZYME LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY (ELISA)


Les enzymes ont été introduites dans les immuno-dosage dès 1970
comme alternatives aux radio-isotopes (qu’on verra après) et constituent
actuellement un des marqueurs les plus utilisés pour déceler la présence
d’anticorps ou antigènes.
Définition : L’ELISA est une méthode quantitative qui permet la
détection et la quantification des complexes immuns en utilisant une
enzyme fixée directement ou indirectement sur ces complexes immuns.
Ces enzymes vont interagir avec des substrats spécifiques à eux qu’on
ajoute, de cette réaction résultera un produit coloré. L’apparition de la
coloration indiquent que les complexes immuns se sont bel est bien
formés. La mesure de l’intensité de la coloration permet de déterminer la
concentration du réactif qu’on cherche à doser.
Les enzymes les plus utilisées sont :
• La peroxydase du raifort.
• - La galactosidase d'E. coll.
• - La phosphatase alcaline d'intestin de veau ou d'E. coli.

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Dosage des antigènes :


1. ELISA sandwich : Dans cette technique, les anticorps primaires qui
doivent être en excès sont immobilisés (fixés) dans un support solide.
Ensuite on ajoute un échantillon contenant des quantités inconnues de
l’antigène qu’on cherche à doser (et qui doit être multi déterminés càd
plusieurs sortes d’épitopes) et on le laisse réagir avec nos anticorps
fixés (formation de complexes). Après avoir laver la préparation, on
ajoute un second anticorps marqué par une enzyme et qui se lira à
notre antigène par un autre épitope. On attend un peu le temps que les
2ème complexes immuns se forment, l’antigène se trouve donc coincé
entre les deux anticorps ou en « sandwich ». On lave encore pour
éliminer les seconds anticorps non liés. Enfin, on ajoute un substrat qui
réagit avec l’enzyme de marquage en produisant un produit coloré
qu’on va mesurer. La concentration de la molécule à doser est
proportionnelle à l’intensité du signal (intensité de la couleur).

2. ELISA directe : Elle est dite directe car la


totalité de notre antigène à doser est
directement fixée sur le support solide (paroi
du tube ou la cupule d’une microplaque).
Ensuite on ajoute des anticorps (spécifiques
de notre antigène) et marqué par une
enzyme.
Les Ac doivent être en excès afin de s’assurer
que chaque Ag se lie à son anticorps.
On attend la formation des complexes
immuns, puis on lave.
En dernier on ajoute le substrat pouvant réagir
avec notre enzyme de marquage et on
mesure la coloration de notre mélange.
L’intensité de la couleur mesurée est
proportionnelle à la concentration de
l’antigène.
Remarque : Dans l’échantillon B de cette
figure, il n’y a pas eu coloration car les
anticorps utilisés ne sont pas spécifiques de
l’antigène fixé dans le support solide.

3. ELISA par compétition : C’est une méthode quantitative un peu


complexe qui nécessite plusieurs étapes et plusieurs tubes et qui

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s’appuie sur la mesure de la diminution de la coloration en fonction de


la quantité d’Ag non marqué ajouté.
Procédure : D’abord et avant de mesurer la quantité d’antigène dans
l’échantillon de notre patient, on procède à une expérience qu’on
prendra pour référence à notre dosage. On attache à la paroi de
plusieurs tubes des quantités constantes et similaires d’anticorps,
c’est-à-dire que la [AC] dans le tube 1 est égale à celle dans le tube 2
égale à celle du tube 3 ….
De la même façon, on met dans chaque tube une concentration
connue d’Ag spécifique et marqué enzymatiquement aux anticorps
fixés dans les tubes, c’est-à-dire que la
[Ag*] dans le tube 1 est égale à celle dans
le tube 2 et à celle dans le tube 3 … On
laisse un moment le temps que les
complexes immuns se forment puis on
ajoute la substance dont l’interaction avec
l’enzyme de marquage produit une
coloration (on connait déjà ça). On mesure
l’intensité de la coloration (qui est jusqu’ici
égale dans tous les tubes et considérée
comme maximum). Maintenant on va
ajouter dans chaque tube des
concentrations connue et croissantes du
même antigène mais non marqué, c’est-à-
dire que la [Ag non marqué] dans le tube 1
est supérieure à celle dans le tube 2 et celle
du tube 2 supérieure à celle du 3 …. Le Le
but de cette expérience de référence et de
tracer un graphe qui qui mesure la
diminution de l’intensité de la coloration en
fonction de la concentration de l’Ag non
marqué ajouté. Comment cela est-ce
possible ? Réponse : Lorsque on ajoute
une quantité connue d’Ag non marqué
dans un tube (tube 1 par exemple), il y’aura
compétition entre l’Ag non marqué et l’Ag
marqué qui rappelons-le et fixé aux
anticorps. L’Ag marqué va se détacher de
l’Ac cédant ça place au non marqué. Le
marqué se trouve donc libre dans la
solution. On lave notre tube pour enlever
l’enlever (le marqué) et c’est ainsi que la
coloration diminue dans le 1er tube. On
mesure cette diminution et on obtient ainsi le premier segment de notre
courbe qui correspond à la valeur connue d’Ag non marqué sur l’axe
des [Ag non marqué]. On fait la même chose avec les tubes restant,
c’est-à-dire lavage, traçage des segments suivants et précision de la
[Ag non marqué] …. Jusqu’à ce que la coloration devienne nulle dans
le dernier tube (qui contient la plus grande quantité d’Ag non marqué
comparé aux autres tubes). De ce fait on obtient une courbe complète

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dite courbe de référence (courbe standard). Au fait, le vrai but de


l’expérience de référence et de pouvoir mettre les valeurs de la [Ag non
marqué] sur l’axe des axis vu que les concentrations sont connue, on
aura plus qu’à choisir un barème et les positionner. Ceci nous
permettra de doser la [Ag] dans l’échantillon du patient par
comparaison (qui rappelons-le n’a pas encore été touché).
C’est là qu’on va commencer notre vrai dosage. On procède de la
même façon décrite pour l’échantillon du patient et on dessine la
courbe de la diminution de la couleur en fonction de la [Ag non
marqué], on prend la dernière valeur qui représente la concentration de
l’Ag dans le sérum du patient.
La concentration de l’antigène à doser est inversement
proportionnelle à l’intensité du signal mesuré, car plus il y’a d’antigène
non marqué (à doser), plus ils prendront les places des marqués, et
plus ces derniers seront éliminés par le lavage, donc la coloration
diminue à chaque augmentation de [Ag] non marqué.
Cette méthode s'applique à tous les antigènes quelle que soit leur taille,
y compris les haptènes.

Dosage des anticorps :


1. ELISA indirecte : C’est la technique la plus utilisée en pratique.
Dans cette méthode, on fixe des antigènes dans un support solide.
On leur ajoute des anticorps primaire (non marqués) spécifiques
qu’on cherche à doser et on attend le temps que les complexes
immuns se forment. Normalement l’antigène doit être en excès pour
s’assurer que tous les anticorps primaires sont liés. Après un
moment on ajoute un second anticorps marqué enzymatiquement
dirigé contre l’anticorps primaire (anti-Ig). On attend que les
seconds anticorps se combinent aux Ac primaires. On lave la
préparation pour éliminer les 2nd anticorps non liés.
Enfin on ajoute un substrat pouvant réagir avec l’enzyme de
marquage, il résulte de l’interaction un produit coloré dont on
mesurera l’intensité (de la coloration) pour déterminer la
concentration de notre anticorps primaire.
Comme déjà décrit dans l’ELISA par compétition, ceci se fait en
effectuant d’abord une expérience de référence en utilisant des
concentrations connues d’anticorps primaires afin de dessiner un
graphe de l’intensité de la coloration en fonction de la [Ac primaire].
Ensuite on utilise le sérum du patient à doser de la même façon que
celui de référence, on dessine la courbe du patient et on la compare
à celle de référence pour obtenir [Ag primaire] du patient. La
concentration de l’antigène primaire est proportionnelle à
l’intensité du signal mesuré (coloration).

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2. ELISA par compétition : Elle ressemble dans son principe à


l’ELISA par compétition qu’on a déjà vu (qui permet le dosage des
Ag du patient). La différence est que celle-ci permet le dosage des
anticorps du patient et non pas les antigènes. Autrement dit, on
inverse les Ac et les Ag entre les deux expériences et on raisonne
avec la même logique. On commencera donc par fixer une quantité
limitée d’antigènes au support solide, on ajoute une quantité
constante et connue d’anticorps marqués enzymatiquement
ensuite on ajoute les non marqués …etc. Le reste du raisonnement
est exactement le même (expérience de référence, courbe
standard, on refait la même pour l’échantillon du patient, courbe du
patient, comparaison de courbe … etc).

IV. DOSAGE RADIO IMMUNOLOGIQUE (RIA : RADIO IMMUNO


ASSAY :
Définition : Technique quantitative permettant le dosage d’un antigène
en utilisant un traceur radioactif, le plus utilisé est l’isotype radioactif I125.
Le signal est mesuré par un compteur appelé compteur gamma (γ). Le
résultat de la radioactivité est exprimé en coups/min (cpm).
La première technique radio immunologique à été mise en place en 1960
par deux endocrinologistes (S. A. Berson et Rosalyn Yalow) pour
déterminer le niveau des complexes insuline/anti-insuline chez un patient
diabétique. Cette technique a ensuite prouvé sa valeur pour le dosage des
hormones, protéines sériques, drogues, vitamines etc.
Pour bien réaliser l’importance de cette technique, il faut savoir la
concentration de ces éléments dans les liquides biologiques (protéines,
hormones …) est bien trop petite pour qu’elle soit détectable par n’importe
quelle autre méthode quantitative connue avant l’apparition de l’IRA qui a
rendu ceci possible. Mais, avec le développement de cette technique et
l’augmentation du nombre de celles utilisant les isotopes radioactifs, les
staffs techniques et l’environnement sont devenus exposés à de grandes
quantités de radioactivité générée par les laboratoires de recherches et
d’analyses, ce qui a poussé les scientifiques à penser à d’autres

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techniques qui utilisent le même principe de l’RIA, qui soient plus sécurisés
et souvent moins couteux, ce qui a amené au développement de l’ELISA.
L’ELISA et l’RIA ont donc le même principe sauf que la première utilise des
enzymes comme marqueurs, et la seconde des isotopes radioactifs. Cette
dernière est alors de moins en moins utilisée.
Deux méthodes d’RIA :
1. RIA (Radio Immuno Assay) : Méthode par compétition : en quantité
limitée d’Ac. Elle est similaire à l’ELISA par compétition qui dose les
antigènes sauf que l’RIA utilise la radio activité.
La radioactivité liée est inversement proportionnelle à la
concentration de la molécule à doser.
2. 2-IRMA (Immunoradiometric Assay) : Méthode sandwich. En excès
d’Ac, similaire à l’ELISA sandwich sauf que celle-ci utilise la radio
activité au lieu de la coloration enzymatique.
La radioactivité liée est directement proportionnelle à la
concentration de la molécule à doser.

V. BIBLIOGRAPHIE :
➢ Cour Officiel De la Faculté De Médecine D’Alger 2017/2018.
➢ Immunology & Serology in Laboratory Medicine, 5th Edition
By : MARRY LOUISE TURGEON.
➢ JANEWAY’S IMMUNOBIOLOGY, 9TH EDITION By : KENNETH
MURPHY & CASEY WEAVER.
➢ Atlas de poche d’immunologie par : Gerd-Riidiger Bunnester
et Antonio Pezzutto.
➢ Immunology A SHORT COURSE, 7TH EDITION By : Richard
Coico and Geoffrey Sunshiine.
➢ Biochimie clinique 2ème édition coordonné par :Pierre
Valdiguié

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