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Analyse d’échantillons alimentaires pour la

présence d’organismes génétiquement modifiés

Module 8

Caractéristiques des systèmes PCR qualitatifs


décrits dans le manuel

M. Querci, M. Mazzara

WORLD HEALTH ORGANIZATION ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE


REGIONAL OFFICE FOR EUROPE BUREAU REGIONAL DE L’EUROPE

WELTGESUNDHEITSORGANISATION ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ


REGIONALBÜRO FÜR EUROPA ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
Caractéristiques des systèmes PCR qualitatifs décrits dans le manuel 2

Table des matières

Module 8

Caractéristiques des systèmes PCR qualitatifs décrits dans le


manuel

CARACTERISTIQUES DES SYSTEMES PCR QUALITATIFS DECRITS DANS LE MANUEL 3


PCR SPECIFIQUE AUX PLANTES 3
DETECTION DU GENE LECTINE 3
DETECTION DU GENE ZEIN 3
METHODE DE CRIBLAGE : DETECTION DU PROMOTEUR CAMV 35S ET DU TERMINATEUR NOS 4
DETECTION DU PROMOTEUR CAMV 35S 5
DETECTION DU TERMINATEUR NOS 5
PCR SPECIFIQUE AUX OGM 7
DETECTION SPECIFIQUE DE LA CASSETTE GENIQUE CTP/EPSPS DANS LE SOJA ROUNDUP
READY® 7
DETECTION DU GENE SYNTHETIQUE CRYIA(B) DU MAÏS BT-176 7
DETECTION SPECIFIQUE DE LA CASSETTE PROMOTEUR E35S/EXON-INTRON HSP70 DU MAÏS
MON810 9

REFERENCES 11

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Caractéristiques des systèmes PCR qualitatifs décrits dans le manuel 3

Caractéristiques des systèmes PCR qualitatifs décrits dans le


manuel
Dans le cadre de cette formation, différents systèmes de détection seront utilisés :
1) des amorces spécifiques aux plantes seront utilisées pour confirmer la présence
et la qualité (amplifiabilité) de l’ADN extrait des échantillons ; 2) la méthode dite « de
criblage », basée sur la détection spécifique des séquences régulatrices les plus
courantes, du promoteur 35S et du terminateur nos. Ces deux méthodes seront
appliquées suivant un protocole PCR simple. Enfin, les amorces spécifiques aux
OGM seront utilisées dans la technique dite de « PCR nichée » pour la détection et
l’identification sélectives des différentes lignées transgéniques. Ce chapitre contient
une brève introduction aux différents systèmes utilisés pour la détection et la
caractérisation du soja Roundup Ready®, du maïs MON810 et du gène cryIA(b)
contenu dans le maïs Bt-176. Pour de plus amples informations concernant les
séquences et la composition des amorces, cf. la module 9.

PCR spécifique aux plantes

Détection du gène lectine

Pour identifier l’ADN du soja, on utilisera les amorces GMO3 et GMO4 (Meyer et al.,
1996), qui amplifient un fragment du gène lectine (Le1), spécifique du soja.
Comme indiqué ci-dessus, l’objectif consiste à confirmer la présence et la qualité de
l’ADN issu d'échantillons contenant du soja, où la qualité de l’ADN vise ici
l’amplifiabilité par PCR. Les amorces GMO3 et GMO4 utilisées dans ce test sont
issues de la PCR nichée (la seconde PCR de soja) présentée par Meyer et Jaccaud
(1997) sur l’ADN issu d'aliments traités. Le produit escompté est un amplicon de 118
bp.

Détection du gène zein

Les amorces ZEIN3 et ZEIN4 (Studer et al., 1997) spécifiques du gène zein du maïs
(Ze1, codant une protéine 10-kb) seront utilisées pour confirmer la présence et la
qualité de l’ADN issu des échantillons contenant du maïs. Comme pour le gène
lectine, les amorces ZEIN3 et ZEIN4 ont été conçues initialement en tant qu’amorces

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Caractéristiques des systèmes PCR qualitatifs décrits dans le manuel 4

internes (PCR secondaire) dans un système de PCR nichée en vue de détecter


l’ADN du maïs issu d'aliments transformés. Si l’ADN cible extrait est présent, intact et
amplifiable, on peut s'attendre à l’amplification d’une bande de 277 bp.

Méthode de criblage : détection du promoteur CaMV 35S et du


terminateur nos
La détection du promoteur 35S et du terminateur nos par PCR constitue la méthode
dite « de criblage » en vue de l’identification d’aliments d’origine végétale
génétiquement modifiés. L’utilisation du promoteur 35S et du terminateur nos en tant
que séquences cibles permet de détecter la plupart des aliments génétiquement
modifiés, étant donné qu’ils sont présents jusqu’à présent dans quasiment toutes les
plantes génétiquement modifiées approuvées par l’UE (Hemmer, 1997). Les
caractéristiques de certaines lignées de maïs approuvées pour être commercialisées
dans l’UE sont listées dans le Tableau 1 à titre d’exemple. Les amorces spécifiques
au promoteur 35S et au terminateur nos employées dans le cadre de la formation ont
été utilisées pour valider une méthode PCR de détection du soja Roundup Ready®
et le maïs Maximizer (Bt-176) dans des fractions d’aliments transformés (Lipp et al.,
2001).

Tableau 1. Caractéristiques de certaines lignées de maïs transgénique dont la mise


sur le marché dans l'UE est autorisée

Gène(s)
Nom Société Nature Promoteur Terminateur
introduit(s)
35S bar 35S
Lignée 176 Ciba-Geigy Bt, bar PEPC cryIA(b)/int.9 PEPC 35S
CDPK cryIA(b)/int.9 PEPC 35S

Lignée Bt-11 Novartis Bt, pat 35S cryIA(b)/int. IVS6 nos

Lignée T25 AgrEvo pat 35S pat 35S

Lignée E35S cryIA(b)/int.hsp70 -


Monsanto Bt
MON810 E35S cryIA(b)/int.hsp70 -

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Détection du promoteur CaMV 35S

Ce promoteur régule l’expression génique d’un grand nombre de plantes


transgéniques, par exemple le soja Roundup Ready® et la lignée de maïs Bt-176.
Les amorces p35S-cf3 et p35S-cr4 seront utilisées en vue de sa détection
spécifique (Lipp et al., 2001). L’amplicon escompté est un fragment de 123 bp
comme indiqué ci-dessous à la Figure 1, où les amorces p35S-cf3 et p35S-cr4 ont
été placées dans la région correspondante de la séquence du promoteur CaMV 35S.

ID A18053_3; parent: A18053


AC A18053;
FT promoteur 396..1779
FT /note="séquence promoteur 35S3 résultant du virus
FT de la mosaïque du chou-fleur isolé CabbB-JI"
SQ Séquence 1384 BP;

nnnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnn nnnnnnnnn


1140
ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag
1200
acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga catctccact gacgtaaggg
1260 p35S-cf3
atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc
1320 p35S-cr4
atttggagag gacacgctga aatcaccagt ctctctctat aaatctatct ctctctctat
1380
aacc
1384
//

Figure 1. Séquence partielle du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-


fleur (CaMV) et sites d’hybridation des amorces p35S-cf3 et p35S-cr4

Détection du terminateur nos

Les amorces HA-nos118-f et HA-nos118-r (Lipp et al., 2001) sont utilisées pour
détecter le terminateur nos. Le terminateur nos est présent dans le soja Roundup
Ready® et d'autres lignées de plantes transgéniques (par ex. lignée de maïs Bt-11).
L’amplification du terminateur nos entraînera la production d’un fragment d’ADN de
118 bp. Dans la Figure 2, les amorces HA-nos118-f et HA-nos118-r ont été placées
à l’intérieur de la séquence de la partie transgénique du soja Roundup Ready®.

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Soja Roundup Ready® de Monsanto


Séquence de la partie transgénique selon le brevet WO 92/04449

HA-nos118-r >
151 nnnnnnnnnn nnnnnnnnga tccccgatct agtaacatag atgacaccgc

201 gcgcgataat ttatcctagt ttgcgcgcta tattttgttt tctatcgcgt


< HA-nos118-f
251 attaaatgta taattgcggg actctaatca taaaaaccca tctcataaat

301 aacgtcatgc attacatgtt aattattaca tgcttaacgt aattcaacag

351 aaattatatg ataatcatcg caagaccggc aacaggattc aatcttaaga

/ /

1601 gatccaggtg tcgccttcct tacggatcct ggcgcccatg gcctgcatgg

1651 ccttgcccgt attgatgacg tcctcgcctt ccagaaggcc ggtgatgcgc


GM09 >
1701 gtttcaccgc tcgcgagacc gccgaacatg aaggaccggt gggagatcga

1751 cttgtcgccg ggaatgcgga cggttccgga aaggccagag gatttgcggg

1801 cggttgcggg ccggctgctt gcaccgtgaa gcatgcaggc tgtagccact

1851 gatgctgaaa tcctaaagga acaaaacttt tgcataaaaa ttgaatcttt

1901 tttcaaaacc aacatagaat ttgctgaatt tttcagtttt ttagatccaa


GM08 >
1951 aaacaagaaa acttgaagat ttaggaactt ggggtttatg gaaattggaa

2001 ttgggattaa gggtttgtat cccttgagcc atgttgttaa tttgtgccat


p35S-cr4 >
2051 tcttgaaaga tctgctagag tcagcttgtc agcgtgtcct ctccaaatga
< GM07
2101 aatgaacttc cttatataga ggaagggtct tgcgaaggat agtgggattg
< GM05 < p35S-cf3
2151 tgcgtcatcc cttacgtcag tggagatatc acatcaatcc acttgctttg

2201 aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg

2251 ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag gcatcttcaa cgatggcctt

2301 tcctttatcg caatgatggc atttgtagga gccaccttcc ttttccacta

2351 tcttcacaat aaagtgacag atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt

2401 ccggatatta ccctttgttg aaaagtctca catcg

Figure 2. Séquence de la partie transgénique du soja Roundup Ready® de


Monsanto selon le brevet WO 92/04449

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PCR spécifique aux OGM


Les amorces d’amplification utilisées pour l’identification du soja Roundup Ready®,
du maïs Bt-176 et du maïs MON810 ont été choisies pour leur capacité à détecter
d’une manière spécifique la structure génétique insérée respectivement dans les
génomes du soja Roundup Ready®, du maïs Bt-176 et du maïs MON810.

Détection spécifique de la cassette génique CTP/EPSPS dans le soja Roundup


Ready®

Les paires d’amorces GMO9/GMO5 et GMO8/GMO7 ont été conçues en vue de la


détection spécifique du transgène de soja Roundup Ready® par PCR nichée (Meyer
et Jaccaud, 1997). Les amorces externes GMO9 et GMO5 sont complémentaires de
la séquence d’ADN correspondant au gène EPSPS CP4 et au promoteur CaMV 35S.
L’amplification d’ADN avec ces deux amorces entraîne un amplicon de 447 bp. Les
amorces internes, GMO8 et GMO7, sont complémentaires du gène pétunia epsps et
du promoteur CaMV 35S. L’amplification d’ADN avec ces amorces internes entraîne
un fragment de 169 bp, comme indiqué à la Figure 2.

Détection du gène synthétique cryIA(b) du maïs Bt-176

Les paires d’amorces CRYIA1/CRYIA2 et CRYIA3/CRYIA4 ont été conçues pour la


détection spécifique du gène synthétique cryIA(b) par PCR nichée (Studer et al.,
1997). Les amorces externes CRYIA1 et CRYIA2 ainsi que les amorces internes
CRYIA3 et CRYIA4 sont complémentaires de la séquence d’ADN du gène cryIA(b).
Comme indiqué à la Figure 3, les deux amorces externes (CRYIA1/CRYIA2)
délimitent un fragment de 420 bp, tandis que les amorces CRYIA3/CRYIA4
produisent un fragment de 189 bp.

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ID I41419 standard; ADN; UNC; 1947 BP.


AC I41419;
………
DE Séquence 3 du brevet US 5625136.
………
RA Koziel M.G., Desai N.M., Lewis K.S., Kramer V.C., Warren G.W., Evola
S.V.,
RA Crossland L.D., Wright M.S., Merlin E.J., Launis K.L., Rothstein S.J.,
RA Bowman C.G., Dawson J.L., Dunder E.M., Pace G.M., Suttie J.L.;
RT "Séquence d’ADN synthétique ayant une activité insecticide améliorée
dans le maïs";
RL Brevet N° US5625136-A/3, 29-AVR-1997.
………
FT source 1..1947
FT /db_xref="taxon:12908"
FT /organisme="non classifié"

SQ Séquence 1947 BP; 412 A; 729 C; 528 G; 278 T; 0 autre;


atggacaaca accccaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag
60
gtggaggtgc tgggcggcga gcgcatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg
120
agcctgaccc agttcctgct gagcgagttc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg
180
gtggacatca tctggggcat cttcggcccc agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc
240
gagcagctga tcaaccagcg catcgaggag ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg
300
gagggcctga gcaacctgta ccaaatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac
360
cccaccaacc ccgccctgcg cgaggagatg cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc
420
ctgaccaccg ccatccccct gttcgccgtg cagaactacc aggtgcccct gctgagcgtg
480
tacgtgcagg ccgccaacct gcacctgagc gtgctgcgcg acgtcagcgt gttcggccag
540
cgctggggct tcgacgccgc caccatcaac agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc
600
ggcaactaca ccgaccacgc cgtgcgctgg tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggt
660
cccgacagcc gcgactggat caggtacaac cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg
720
ctggacatcg tgagcctgtt ccccaactac gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg
780
agccagctga cccgcgagat ttacaccaac cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc
840
cgcggcagcg cccagggcat cgagggcagc atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg
900
aacagcatca ccatctacac cgacgcccac cgcggcgagt actactggag cggccaccag
960
atcatggcca gccccgtcgg cttcagcggc cccgagttca ccttccccct gtacggcacc
1020 CRYIA1 amorce avant PCR ext.
atgggcaacg ctgcacctca gcagcgcatc gtggcacagc tgggccaggg agtgtaccgc
1080
accctgagca gcaccctgta ccgtcgacct ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg
1140 CRYIA3 amorce avant PCR interne (nichée)
agcgtgctgg acggcaccga gttcgcctac ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg
1200

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taccgcaaga gcggcaccgt ggacagcctg gacgagatcc cccctcagaa caacaacgtg


1260 CRYIA4 amorce inverse PCR interne (nichée)
ccacctcgac agggcttcag ccaccgtctg agccacgtga gcatgttccg cagtggcttc
1320
agcaacagca gcgtgagcat catccgtgca cctatgttca gctggattca ccgcagtgcc
1380
gagttcaaca acatcatccc cagcagccaa atcacccaga tccccctgac caagagcacc
1440 CRYIA2 amorce inverse PCR externe
aacctgggca gcggcaccag cgtggtgaag ggccccggct tcaccggcgg cgacatcctg
1500
cgccgcacca gccccggcca gatcagcacc ctgcgcgtga acatcaccgc ccccctgagc
1560
cagcgctacc gcgtccgcat ccgctacgcc agcaccacca acctgcagtt ccacaccagc
1620
atcgacggcc gccccatcaa ccagggcaac ttcagcgcca ccatgagcag cggcagcaac
1680
ctgcagagcg gcagcttccg caccgtgggc ttcaccaccc ccttcaactt cagcaacggc
1740
agcagcgtgt tcaccctgag cgcccacgtg ttcaacagcg gcaacgaggt gtacatcgac
1800
cgcatcgagt tcgtgcccgc cgaggtgacc ttcgaggccg agtacgacct ggagagggct
1860
cagaaggccg tgaacgagct gttcaccagc agcaaccaga tcggcctgaa gaccgacgtg
1920
accgactacc acatcgatca ggtgtag

Figure 3. Gène cryIA(b) optimisé inséré dans le maïs Bt-176 : séquence du gène
cryIA(b) SEQ ID N° 3 selon le brevet US N° 5625136 et Accès à la Banque de Gènes
N° 141419

Détection spécifique de la cassette promoteur E35S/exon-intron hsp70 du


maïs MON810

Les paires d’amorces mg1/mg2 et mg3/mg4 ont été conçues pour la détection
spécifique de la cassette E35S/exon-intron 1 hsp70 par PCR nichée (Zimmermann et
al., 1998). Cette construction génique est spécifique au maïs MON810. Les amorces
externes mg1 et mg2 s’hybrident respectivement à la séquence du promoteur E35S
et de la région intron 1 de la hsp70, tandis que les amorces internes sont
respectivement complémentaires de la séquence d’ADN du promoteur E35S et de la
région exon 1 de la hsp70. Comme indiqué à la Figure 4, les deux amorces externes
(mg1/mg2) produisent un fragment de 401 bp, tandis que les amorces mg3/mg4
produisent un fragment de 149 bp.

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intron hsp70

exon 1 hsp70

Plant P-E35S intron 1 hsp70


ADN

401 bp exon 2 hsp70


mg1 149 bp mg2

mg3 mg4

Figure 4. Représentation schématique d’une partie de la cassette du maïs MON810, y


compris le promoteur CaMV 35S amélioré et l’intron hsp70 du maïs, et position relative des
amorces mg1, mg2, mg3, et mg4 (modifié par Zimmermann et al., 1998)

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Références
Hemmer, W. (1997). Foods Derived from Genetically Modified Organisms and
Detection Methods. Biosafety Research and Assessment of Technology Impacts
of the Swiss Priority Program Biotechnology – Report 2/97, 61 pages.
http://www.bats.ch/bats/publikationen/1997-2_gmo/index.php (Dernière
connection Janvier 2010)

Lipp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G. and
Anklam, E. (2001). Validation of a method based on polymerase chain reaction
for the detection of genetically modified organisms in various processed
foodstuffs. European Food Research Technology 212, 497-504.

Meyer, R., Chardonnens, F., Hubner, P. and Luthy, J. (1996). Polymerase chain
reaction (PCR) in the quality and safety assurance of food: detection of soya in
processed meat products. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -
Forschung A 203, 339-344.

Meyer, R. and Jaccaud, E. (1997). Detection of genetically modified soya in


processed food products: development and validation of a PCR assay for the
specific detection of Glyphosate-Tolerant Soybeans. Proceedings of the EURO
FOOD CHEM IX Conference, Interlaken, Switzerland, Event No. 220 1, 23–28.

Studer, E., Dahinden, I., Lüthy, J. and Hübner, P. (1997). Nachweis des
gentechnisch veränderten “Maximizer"-Mais mittels der Polymerase-
Kettenreaktion (PCR). Mitteilungen aus dem Gebiet der Lebensmittel und
Hygiene 88, 515–524.

Zimmermann, A., Liniger, M., Lüthy, J. and Pauli, U. (1998). A sensitive detection
method for genetically modified MaisGardTM corn using a nested-PCR system.
Lebensm.-Wiss. U.-Technol. 31, 664-667.

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