Remerciements 

On tient à vraiment remercier notre deux chers professeurs

Mr khattabi et Mr Elhilali pour leurs efforts, encadrement de toute
la classe et spécialement pour l’expérience enrichissante et pleine
d’intérêts qu’elles nous avons fait vivre durant toutes les séances de
travaux pratiques de la microbiologie.
On les remercie également pour toute leur soutenance,
encouragements et compréhension de tout le monde.
 Sommaire

Introduction……………………………………………………………………
……3
Séance n° 1.........................................................................................................4
Mise en évidence de la présence de microorganismes dans différentes biotopes
............................................................................................................................4
Séance n° 2 : Techniques d’ensemencement, d’isolement.................................8
Séance n° 3 : coloration de Gram.....................................................................13
Séance n° 4 et 5 : Analyse de l’eau..................................................................15
Conclusion………………………………………………………………………
…….21
 Introduction

La microbiologie est une sous-discipline de la biologie consacrée à l'étude des micro-

organismes. Autrement dit c’est la science ayant pour objet l’étude des microbes (micros :
petit, bios : vie) .Ce terme englobe sans distinction tous les micro-organismes vivants.

Les micro-organismes constituent un monde, fait d’unités cellulaires vivantes, vastes et

complexes. Cette considération est due au lien entre ces êtres vivants et les maladies. Le
développement de visualisation a permis de connaître les données structurelles, métaboliques
et les diverses actions de ces micro-organismes.

Dans nos séances de travaux pratiques, on a essayé d’appliquer et déterminer quelques

importantes opérations pour pouvoir mieux comprendre la microbiologie :

La première séance a eu comme grand titre : la mise en évidence de le présence des micro-
organismes dans différentes biotopes, puis dans la deuxième séance on a vu les différentes
techniques d’ensemencement et d’isolements, dans la troisième on a établit la coloration
Gram et dans la quatrième et cinquième séances, on a bien fait une analyse d’eau.

En suite de notre rapport on va essayer de bien développer et expliquer toutes ses expériences
et établir les différents résultats de chacune de ces opérations.
 Séance n° 1
Mise en évidence de la présence de
microorganismes dans différentes
biotopes

I. Le but de la manipulation
  Introduction générale sur les manipulations de microbiologie et leur intérêt.
 D’apprendre, à manipuler dans des conditions stériles.
 De faire connaissance avec les formes vivantes microscopiques.
 De prouver leur existence dans les différents milieux naturels.

II. Matériels 

Les tubes à essai  Bec Bunzen 

La boite de pétri  L’étaleur

Autoclave l’anse
III. Mode opératoire

 Préparation du milieu de culture

Un milieu de culture est un support qui permet la culture de cellules, de bactéries, de levures,

de moisissures afin de permettre leur étude. En principe, les cellules trouvent dans ce milieu
les composants indispensables pour leur multiplication en grand nombre, rapidement, mais
aussi parfois des éléments qui permettront de privilégier un genre bactérien ou une famille.

 La composition du milieu de culture

Glucose source de carbone et ATP=10g

Extrait de viande Source des protéines
Peptone Source d’azote 10 g
Agar solubiliser le milieu.15g
Eau distillée source d’eau.1000ml

 La procédure de préparation
 On pèse des quantités suivantes:
 Glucose…………….…….4g
 Extrait de viande…….......4g
 Peptone…………………..4g
 Agar……………………...6g
 On les met dans 400 ml d’eau distillée
 On chauffe le mélange jusqu'à ébullition sur une plaque chauffante.
 On le met dans l’autoclave pour la stérilisation (pendant 20 min à l’autoclave)
 Après refroidissement on fait couler le milieu de culture dans des boites à pétri.

 Mise en évidence de la présence de microorganismes dans différents

biotopes 
 a. sur le corps humain

A l’aide d’un antiseptique, on lave notre main et ensuite on touche la surface du milieu nutritif
gélose et on répète l’opération avec la main préalablement lavée à l’eau de robinet puis
l’incubation des boites à pétri à 30 °C pendant 24 h.

b. sur l’objet

On touche la surface du milieu nutritif par notre stylo et on fait l’incubation 30 °C pendant
24 h

 Résultats et interprétations 

Après incubation pendant 24 h à une température de 30°C

 Eau de robinet : présence de certaines microorganismes ça renseigne sur la potabilité
de l’eau de point de vue microbiologique, puisque c’est une exigence d’après les
normes ;
 Antiseptique : moins de présence des microorganismes qu’avec l’eau distillée
 Stylo : présence des microorganismes
 Séance n° 2 : Techniques
d’ensemencement, d’isolement

1-Techniques de l’ensemencement 

L’ensemencement consiste à déposer dans un milieu neuf des germes prélevés dans un milieu
de culture mère. Le transport est en général effectué avec une anse ou une pipette Pasteur.

1 / Ensemencement avec une anse

 prendre les précautions nécessaires pour travailler dans de bonnes conditions d’aseptie
(nettoyage paillasse, mains ...)
 veiller à travailler dans la zone stérile autour du bec Bunsen
 tenir le tube contenant la culture mère dans la main gauche, déboucher près de la
flamme et garder le coton dans la main.
 flamber l’ouverture du tube.
  stériliser l’anse en le portant au rouge dans la flamme du bec Bunsen, la laisser
refroidir dans la zone stérile.
 prélever et repiquer rapidement dans le tube contenant le milieu de repiquage :

 repiquage dans un milieu liquide : repiquer ce qui est prélevé à

l’intérieur de la boucle

 repiquage sur milieu solide : repiquer en déplaçant en zig zag l’aiguille

sur la surface de l’agar, du fond du tube vers l’ouverture, en prenant
soin de ne pas érafler la gélose
 repasser dans la flamme l’aiguille à ensemencer en le portant au rouge. L’aiguille est
prête pour un nouvel ensemencement.
 flamber l’ouverture des tubes, flamber légèrement les cotons, boucher.
2 / Technique d'ensemencement avec la pipette Pasteur

Les manipulations se différencient des précédentes par quelques détails :

 la pipette est passée rapidement dans la flamme.

 l'effilure est cassée à la pince dans la zone stérile.

 on aspire les bouillons de culture (éviter que le bouillon de culture souille le coton,
danger d'infection pour le manipulateur, pas plus que la salive du manipulateur, danger
d'infection pour la culture)

 on souffle pour ensemencer dans le tube stérile.

 la pipette ne sert qu'une fois

2-Techniques d’isolement 

Pour étudier les microorganismes, il est indispensable de les isoler et d'en faire une culture
pure. Deux techniques sont alors utilisées :
 La méthode des stries
 La méthode des dilutions

1) Méthode des stries 

  Cas d'un ensemencement en surface à partir d'un prélèvement
liquide ou solide :

 prendre les précautions habituelles pour un ensemencement (n’ouvrir que le temps

nécessaire à l'exécution des stries et n'entrebailler alors la boite que devant un bec Bunsen)

 porter l'anse au rouge dans la flamme du bec, la laisser refroidir dans la zone stérile et avec
l'autre main entrouvrir la boite de culture (solide) ou le tube (liquide)

 prélever une colonie ou une goutte de suspension avec l'anse, refermer la boite ou le tube et
prendre la boite vierge

 ensemencer de la façon suivante :

              

 partir de 1 en ensemençant selon le sens des flèches jusque vers 2. Flamber l'anse, la laisser
refroidir et repartir perpendiculairement à la direction précédente 1-2 jusque vers 3.

 les boites de Pétri sont mises en position renversée à l'étuve à 30°C. Observer après 24 à 48
heures selon le cas (la position renversée permet à l'eau de condensation de s’évaporer).

 Résultats obtenus

Après l’incubation à 30 °C :

2) Méthode des dilutions :

 Cas d'un ensemencement en surface par étalement d'un milieu liquide :

 Cette technique permet, après un étalement sur milieu solide, d'évaluer le nombre de
colonies par ml de suspension. Elle peut permettre également, si l'on ne dispose pas de
lame à numération, la détermination du nombre de cellules par unité de volume ou du
nombre de cellules présentes dans une colonie.

 les dilutions sont faites dans de l'eau distillée ou dans un liquide physiologique de type
Ringer

 numéroter des tubes à essai de 1 à 10, chaque tube contient 1 ml de liquide de dilution

 dans le tube 1, à l'aide d'une pipette stérile, ajouter 0.1 ml de la suspension fournie, rincer
la pipette trois fois.

 homogénéiser par aspirations successives et souffler la dilution 1, en prélever 0.1 ml et

verser dans le tube 2. Ainsi de suite jusqu'à l'obtention de la dilution n°10.

 Fabrication de l'étaloir en verre 

 à la flamme d'un bec Bunsen, plier la partie capillaire à environ la moitié de sa longueur de
façon à en faire un angle de 120°
 procéder de même pour plier à la moitié le segment précédent de façon à ce qu'il fasse un
angle aigu

 replier de la même façon l'extrémité vers le haut sur un demi-centimètre environ

 l'étaloir est maintenu dans un flacon d'alcool

 déposer sur une boite de Pétri contenant un milieu nutritif gélosé, 0.1 ml de chacune des
dilutions indiquées

 étaler avec l'étaloir de façon uniforme par un mouvement de balayage et de rotation sur
l'ensemble de la surface de la gélose (ne pas ratisser la surface de la gélose).

 laisser sécher les boites 10 min, les déposer ensuite à l'étuve, après les avoir retournées,
observer 24 heures plus tard.

 compter les colonies apparues aux dilutions de 3-300 colonies, faire la moyenne des
chiffres obtenus en ramenant tout à la même dilution. Evaluer alors le nombre de colonies
par ml de suspension donnée.
Séance n° 3 : coloration de Gram
1- La coloration de Gram
C’est la coloration de base en bactériologie qui permet de distinguer les bactéries en Gram
positif et en Gram négatif, cette distinction est fondamentale pour leur identification. En effet,
le violet de gentiane se fixe sur des composants cytoplasmiques et après ce temps de
coloration, toutes les bactéries sont violettes. Chez les bactéries à Gram négatif, la paroi, riche
en lipides, laisse passer l'alcool (ou le mélange alcool + acétone) qui décolore le cytoplasme
alors que, chez les bactéries à Gram positif, la paroi constitue une barrière imperméable à
l'alcool et le cytoplasme demeure coloré en violet.

2- Réactifs
Violet de gentiane phénique
Lugol (iodo-iodure de potassium)
Alcool à 95% (ou mélange alcool absolu+ 1/5ème d’acétone)
Safranine (ou Fuchsine phéniquée de ziehl)

3- Mode opératoire
1. Réaliser un frottis et le fixer à la flamme
2. Verser le Violet de Gentiane sur la lame ; laisser en contact 1 minute
3. Jeter le colorant et finir de la chasser par la solution de Lugol ; laisser agir le Lugol
environ 1 min
4. Jeter le Lugol et faire couler de l’alcool sur la préparation ; rincer immédiatement à
l’eau
5. Recouvrir la préparation de Safranine, laisser agir environ 1 min. laver abondamment.
6. Sécher au dessus de la flamme d’un bec Bunsen.

4- Résultats
A l’issue de cette coloration, on peut distinguer :
 Des bactéries colorées en violet foncé ; elles ont gardé le violet, ‘le gram’ elles sont
dites ‘Gram positif’ ;
 Des bactéries colorées en rose ou rouge pâle ; elles ont perdu le violet, ‘le Gram’
elles sont dites ‘gram négatif’.
Séance n° 4 et 5 : Analyse de l’eau
1-Introduction

L’eau étant destinée à la consommation humaine particulièrement, doit satisfaire aux normes
de qualité de l’eau potable, afin de vous assurer de la qualité de l’eau que vous consommez,
vous pouvez soit consulter des sources fiables soit faire l’analyse bactériologique votre eau
par des laboratoires d’analyse. Afin d’améliorer la santé publique, toute eau est destinée à la
consommation humaine, y compris celle contenue dans les puits individuels, des prélèvements
d’eau sont tout de même nécessaires pour pratiquer une analyse bactériologique qui sera
soumise à une procédure stricte.
Pour que l’eau soit considérée comme potable, elle doit répondre à un certain nombre de
critères :
Qualité microbiologique suffisante, avec en particulier absence de bactéries
pathogènes.
Qualité chimique suffisante : les ions minéraux doivent être à des concentrations
comprises entre certaines valeurs fixées réglementairement.

2-Les milieux utilisés

 Milieux liquides contenant du lactose

 Milieux solides contenant du lactose
Deux catégories de milieux sont à distinguer suivant leur effet :
Milieu non inhibiteurs 
Milieu sélectif
3-Isolement et identification

 Test biochimiques pour la caractérisation des entérobactéries

 Milieu citrate de Simmons
 Ce milieu est un exemple de milieu synthétique, c'est à dire de milieu dont la composition,
qui est complexe, est connue exactement tant qualitativement que quantitativement

Mode
Aspect du milieu Aspect du milieu Caractères
d’ensemencemen Résultats
avant utilisation après utilisation recherchés
t
La pente est Utilisation du  Pas de virage de
ensemencée par citrate comme l'indicateur de
une strie seule source de pH : il n'y a pas
longitudinale, carbone eu alcalinisation
réalisée à l'anse, et le milieu ne
à partir d'une présente pas de
suspension de la culture. La
culture solide en souche est
eau distillée citrate de
stérile. Simmons
Il est important
de ne pas
apporter de
substrats
carbonés. Ainsi
l'ensemencement
à partir d'une
souche pure
fournie en
bouillon nutritif
ou en eau
peptonée est
impossible.

Mettre à l'étuve
pendant une
semaine à 37°C
  Eau peptonée
Mode
Aspect du milieu Aspect du milieu Caractères
d’ensemenceme Résultats
avant utilisation après utilisation recherchés
nt
ensemencer le L'addition Apparition
milieu liquide de réactif de d’une
Incuber pendant Kovacs montre coloration
24h à 37C la production rouge qui
d'indole par un introduit la
anneau rouge. présence
d’indole

 Milieu Shigella-Salmonella
La fermentation du lactose se traduit par une teinte rouge de la colonie
La production d’H2S se traduit par un noircissement du centre de la colonie
Aspect du milieu Aspect du milieu Mode Caractères Résultats
avant utilisation après utilisation d’ensemenceme recherchés
nt
Isolement par la Le milieu Colonie rouge
contient
méthode des signifie la
du lactosepouva
cadrans. nt être fermenté. fermentation de
Le milieu
Incuber 18 à 24 lactose
contient du
h à 37°C thiosulfate Pas de centre
pouvant donner
noir : H2S –Pas
du H2S
de production
de H2S
  Milieu Hajna-Kligler

Le milieu de Hajna-Kligler est un milieu complexe, qui permet la recherche de plusieurs

caractères biochimiques. Il est très utilisé dans l'identification des Enterobacteriaceae.

Mode
Aspect du milieu Aspect du milieu Caractères
d’ensemencemen Résultats
avant utilisation après utilisation recherchés
t
Ensemencer Utilisation du Bactérie de
glucose
abondamment la type
Utilisation du
surface par lactose fermentatif du
Production H2S
stries serrées ou glucose et
Production de
par inondation, gaz lactose + : culot
Recherche de la
puis le culot par jaune et pente
LDC
simple piqûre, à jaune.
l'aide de la
même pipette
boutonnée. µ
Mettre à l'étuve
24h à  37°C
  Mannitol-mobilité
Ce milieu permet l’étude de la dégradation du mannitol qui est un produit de dégradation du
mannose
Mode
Aspect du milieu Aspect du milieu Caractères
d’ensemencemen Résultats
avant utilisation après utilisation recherchés
t
 Ensemencer Mannitol Caractère
Mobilité
par piqûre mannitol
Nitrate
centrale à réductase milieu  jaune :
l’aide d’un fil Mannitol +
droit.
 Incuber 24 h à
37C
R : ce milieu est
utilisable
uniquement
pour les
bactéries
fermentatives

 Identification des bactéries

D’après la table ci-dessous, on déduit que ces caractères biochimiques correspond celles des
caractères de E.colis.
Caractére GLUCOS
LACTOSE H2S INDOLE CITRATE MOBILITE
Bactéries E
E.colis + + - + - +-
Citrobactéri + + + + + +
e
Klebseila + + - +- + -
Entérobacter + + - - + +
Shigella +- - - +- - -
Salmonella +- + + - +- +
Conclusion
Les micro-organismes sont des êtres vivants de tailles microscopiques (invisible à l’œil nu). Il
s’agit de trois grands groupes :
les protistes
les bactéries
les virus
 
Et pour conclure, on peut dire que  La microbiologie concerne l’étude d’organisme très
nombreux et très varié, c’est pourquoi seul les espèces d’intérêt médical ou industriel sont
étudiées, cela veut dire que de très nombreuses espèces restes peu connues ou même
inconnues.