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Structure d'un cosmide Mode d'emploi d'un cosmide

Dr MECHAI Abdelbasset
Chromosomes artificiels

Les chromosomes artificiels (ou minichromosomes) sont des structures qui copient les
chromosomes de la cellule hôte eucaryote et se répartissent régulièrement lors des divisions,
comme les chromosomes naturels.

de pBR 322 il a reçu l'origine bactérienne de


réplication (colE1) et le gène de résistance à
l'ampicilline

des chromosomes de levure il a reçu une origine de


réplication chromosomique : Autonomous
Replication Site (ARS), qui assure la reproduction
de l'ADN dans une cellule de levure ; une région
centromérique chromosomique (CEN).

Il a aussi deux régions télomériques d'origine


chromosomique qui protégeront les extrémités du
minichromosome après recombinaison

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Chaque partie du pYAC porte un marqueur de
sélection utilisable dans la levure

allèle u+ qui confère le phénotype [ura+] à un mutant (u-)


allèle a+ qui confère le phénotype [ade+] à un mutant (a-)
allèle h+ qui confère le phénotype [his+] à un mutant (h-)
allèle t+ qui confère le phénotype [trp+] à un mutant (t-)

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Chromosomes artificiels

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NB

Le YAC est un vecteur navette puisqu'il peut se répliquer aussi bien dans une cellule
de levure que dans une cellule bactérienne. A l'état natif c'est un plasmide circulaire qui
comporte de l'ADN de deux origines

Le premier contient t+, ARS et CEN ainsi qu'un télomère

a+ (fin) CEN ARS t+ AmpR Ori pBR TEL


Une double digestion du
YAC par BamHI et Sma le second contient u+ et un télomère
libère trois fragments
u+ a+ (début)
TEL

le troisième uniquement h+.

h+

Ces fragments étant de taille différente on peut les séparer par électrophorèse sur gel
d'agarose et récupérer les deux premiers que l'on mélange avec des gros fragments à
intégrer ayant des extrémités cohésives compatibles
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Le minichromosome recombinant

Après action de la ligase on a un minichromosome recombiné qui a perdu


h+ mais qui possède encor t+ et u+.

Par contre il a perdu a+ car ce gène est maintenant interrompu par


l'ADN étranger

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Sélection des cellules recombinantes

Il faut choisir une souche de levure portant des mutations qui


inactivent les gènes a, h, t et u. Elle présentera 4 auxotrophies [ade-,
ura-, his-,trp-].

Après avoir reçu un pYAC natif ou un minichromosome, les cellules


transformées seront devenues [trp+, ura+, his+, ade+],

et si elles ont reçu un minichromosome recombiné elles seront [his-, ade-


,trp+,ura+]. La combinaison de ces 4 marqueurs permet de distinguer ce
qu'a reçu chaque clone cellulaire.

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Les vecteurs d'eucaryotes supérieurs
Les vecteurs de transfert de l'ADN dans les cellules d'eucaryotes supérieurs sont les virus. Les
principaux sont les virus de la vaccine, le virus SV40, les adénovirus, les baculovirus et les
rétrovirus.

Les retrovirus sont des virus à ARN qui pénètrent à l'intérieur de la cellule eucaryote,
convertissent leurs génomes en ADN par la transcriptase inverse.

L'ADN est ensuite intégré dans le génome hôte grâce à l'intégrase virale.

longues séquences répétées terminales LTR (Long Terminal Repeat).

la séquence gag qui code une glycoprotéine de structure

La séquence pol codant la transcriptase inverse

la séquence int responsable de la biosynthèse d'une intégrase qui intervient dans


l'insertion de l'ADN viral dans ADN cellulaire,

La séquence env qui code une protéine de l’enveloppe virale.


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Les cellules réceptrices

I- Récepteurs bactériens

01 elles doivent être de bons récepteurs pour l'ADN donneur

02 elles doivent si possible être bien connues au point de vue génétique,

03 elles doivent se cultiver facilement, être robustes et peu exigeantes, avoir de


bons paramètres de développement.

04 Il est préférable qu'elles ne soient pas pathogènes et ne fassent pas


apparaître de substances toxiques dans le milieu.

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Escherichia coli

Les avantages

01 Cette espèce, parfaitement connue au point de vue génétique

02 permet l'utilisation d'un très grand nombre de vecteurs, tant


bactériophages que plasmides

Les inconvénients

le caractère entéropathogène de certaines souches, le fait qu'elle


01
libère dans le milieu des substances toxiques (aminés, indole)

02 incapable de réaliser les maturations post-traductionnelles (glycosylation,


carboxylation, phosphorylation) qui sont nécessaires pour l'activité
biologique ou la stabilité de nombreuses protéines eucaryotes.
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Bocillus subtilis

Les avantages

Cette espèce est un peu moins bien connue qu'Escherichia coli au


01
niveau génétique et les vecteurs utilisables sont moins nombreux.

02 elle est Gram+, ne possède pas d'endo-toxines et est bonne excrétrice.

De plus, les protéines synthétisées ne contiennent pas de résidu


03
méthionine C-terminal,

Les inconvénients

01 manque de stabilité des souches transformées.

02 la présence d'une activité proléolytique qui peut être gênante pour les
produits formés.
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3. Récepteurs eucaryotes

3.1. Saccharomyces cerevisiae

01 elle possède de nombreux vecteurs.

Elle ne présente aucun des inconvénients mentionnés pour Escherichia


02
coli ou Bacillus subtilis.
Elle est apte à assembler les polypeptides et à réaliser des
03
modifications post-traductionnelles, en particulier la glycosylation.

04
Son caractère eucaryote la rend en principe parfaitement apte à une
transformation par de l'ADN eucaryote.

4. Cellules animales ou végétales

Leur utilisation se heurte à des problèmes multiples. La plupart des


difficultés sont liées à la culture de ces cellules, mais également à la
complexité du génome et des régulations.
LES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE

1. Séquençage des acides nucléiques

La connaissance de l'organisation de l'ADN a nécessité le développement de


méthodes permettant le séquençage des acides nucléiques

Les études ont d'abord concerné des fragments d'ADN puis des gènes entiers et
enfin l'intégralité d'un chromosome.

Le premier acide nucléique qui fut séquencé est l'ARNtAIa de levure en 1964.

L'obtention des fragments d'ADN s'est effectuée par l'emploi d'enzymes qui
coupent l'ADN en des sites spécifiques, les endonucléases de restriction.

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la méthode de Sanger

La methode met en œuvre une étape de dénaturation des deux brins

une hybridation avec une amorce marquée radioactivement et une élongation par
une ADN polymérase en présence de didésoxyribonucléosides triphosphate
(ddNTP).

Ces molécules peuvent être normalement incorporées dans un brin d'ADN en


élongation grâce à leur extrémité 5' triphosphate mais ne peuvent former de liaison
phosphodiester avec le nucléoside triphosphate suivant.

Lorsqu'une faible quantité d'un ddNTP est présente (ddATP par exemple) en plus
des quatre dNTP nécessaire pour la polymérisation (dATP, dCTP, dGTP et dTTP),
plusieurs fragments marqués sont générés

Ils correspondent tous à fragments portant un résidu ddATP à l'extrémité 3'. En


répétant l'expérience pour les autres ddNTP et en séparant les différents fragments
d'ADN de chaque réaction de polymérisation par électrophorèse sur gel de
polyacrylamide (séparation selon la taille des séquences), il est possible de déduire la
séquence du fragment d'ADN de départ.
la méthode de Sanger

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2. Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)

Mise au point dans les années 80, la technique de réaction polymérisation en


chaîne ou PCR (pour Polymérisation Chain Reaction) a ouvert de nouvelles voies
dans l'étude et l'analyse acides nucléiques et des gènes.

Cette technique permet d'amplifier en nombre très élevé de copies une séquence
particulière d'ADN (ou parfois d'ARN), ce qui facilite grandement son étude et son
exploitation.

La PCR est basée sur le même principe de réplication que celui qui est
naturellement utilisé par les cellules pour dupliquer l'ADN. Les brins d'ADN
matrice sont obtenus par chauffage (dénaturation)

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La PCR nécessite :

les deux amorces nucléotidiques complémentaires des


séquences qui encadrent la cible à amplifier ;

de faibles quantités d'ADN (moins de 1 µg)


possédant la séquence cible à amplifier ;

l'ADN polymérase ;

un mélange des quatre dNTP {dATP,


dTTP, dCTP et dGTP)

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La technique PCR

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Réalisation pratique de la PCR

 Une dénaturation thermique (94 °C, 5 min) du fragment d'ADN (matrice),

 Une hybridation des amorces sur les brins matrice est effectuée a une température
bien précise.

 Cette étape est très importante car, selon la température choisie, la spécificité
d'hybridation basée sur l'appartement A/T, G/C sera plus ou moins bonne

 l'ensemble est amené à la température de 72 °C, température optimale de


fonctionnement de l'ADN polymérase Taq.

 Cette polymérase est extraite de la souche Thermus aquaticus, une bactérie qui vit dans
des sources chaudes. Elle reste stable à 94 °C, température de déna-turation de l'ADN,
ce qui autorise plusieurs cycles PCR sur le même échantillon .

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3.Techniques d'hybridation des acides nucléiques

L'une des techniques majeures dans l'analyse d'un gène est la technique de
transfert selon Southern du nom de son inventeur, E.M. Southern.

L'ADN séparé est transféré du gel d'électrophorése sur un filtre de nitrocellulose


ou une membrane de nylon.

Une sonde d'ADN connu (ADN marqué radioactivement par exemple) est mise
au contact de la réplique et hybridée par complémentarité aux fragments
d'ADN étudiés.

L'autoradiographie de la membrane révèle des bandes corres-pondant aux


fragments d'ADN qui se sont hybrides avec la sonde.

Cette technique est intéressante pour mettre en évidence les remaniements


génétiques (délétions par exemple), l'organisation des gènes les uns par
rapport aux autres sur un chromosome et donc la disposition des groupes de
gènes fonctionnellement
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la technique de transfert selon Southern
Expression des facteurs transférés

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- Stabilité

Le vecteur doit être stable, c'est-à-dire qu'il doit bien se


perpétuer dans la descendance de la cellule hôte.

Certains plasmides montrent une instabilité


ségrègationnelle : ils ne se répartissent pas correctement
dans les cellules filles. Cette situation se rencontre avec
des plasmides présents en petit nombre de copies.

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Réplication

Le vecteur doit avoir une bonne réplication

Il faut privilégier les vecteurs qui permettent


l’obtention d’un grand nombre de copies du
gène transféré

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Transcription

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Traduction
La traduction doit également être très efficace, ce qui
dépend de la fixation au ribosome et d'une bonne séquence
de lecture

Le site de fixation au ribosome est différent chez les


organismes procaryotes et eucaryotes

Le site compatible avec le gène transféré doit être introduit


dans le vecteur.

Une bonne lecture dépend de l'interprétation de la bonne


séquence de triplets (il existe 3 séquences, décalées chacune
d'un nucléotide)
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Facteurs post-traductionnels

La protéine synthétisée doit être opérationnelle et facilement


récupérable

Les activités protéasiques de l'hôte doivent être absentes ou bien


connues et contrôlées

L'activité d'une protéine dépend de modifications post-


traductionnelles qui ne peuvent être réalisées dans tous les hôtes

la présence et la nature du codon d'initiation va entraîner


l'adjonction d'un résidu méthionine en position C- terminale sur les
protéines produites, ce qui peut nuire à leur activité

Il peut arriver que la protéine fabriquée se révèle toxique pour l'hôte
: il faut alors trouver un biotype résistant (par mutagénèse) ou, en cas
de résultat négatif, changer de souche réceptrice.
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Excrétion

La récupération de la protéine dépend essentiellement


d'une bonne excrétion, propriété variable selon les hôtes

L'excrétion peut être obtenue spontanément par utilisation de


récepteurs microbiens à fortes activités exocellulaires

Chez les bactéries Gram-, il est fréquent que les protéines


s'accumulent en granules insolubles dans le cytoplasme
ou dans l'espace périplasmiquc.

De même, la levure Kluyveromyces lactis utilisable


comme récepteur forme fréquemment des corps d'inclusion
difficiles à renaturer.
Expression par formation de protéines mixtes

L'ensemble promoteur signaux de contrôle nécessaire à l'expression


peut être obtenu en utilisant la séquence complète d'un gène
puissamment exprimé dont on retire la séquence de structure pour la
remplacer par celle du gène étranger
Certains vecteurs favorisent l'expression par leur aptitude à
permettre la synthèse de protéines mixtes

le plasmide pEX2, qui porte le promoteur phagique cro associé au


gène lacZ d'Escherichia coli, permet la synthèse de protéines de
fusion : β-galactosidase-protéine X

Elle est utilisée pour permettre l'expression de gènes eucaryotes, et


plus particulièrement eucaryotes supérieurs (généralement animaux),
transférés dans une cellule procaryote.

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Figure 25 : Expression par formation de protéines mixtes
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CHAPITRE IV:
Les protéines
recombinantes

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1. Biosynthèse de l'insuline

II s'agit d'un des premiers cas d'exploitation pratique du génie génétique.


L'insuline est une hormone pancréatique qui a une utilisation médicale
très importante pour le traitement du diabète

L'insuline est un polypeptide composé de deux chaînes (chaîne A


composée de 21 acides aminés, donc codée par 63 bases, et chaîne B
de 30 acides aminés, donc codée par 90 bases) réunies par des ponts
disulfure .

Le gène insuline code pour un polypeptide appelé prépro-insuline. Ce


polypeptide se compose d'une séquence signal impliquée dans
l'excrétion et d'un précurseur : la pro-insuline.

Dans la pro-insuline, les chaînes A et B sont séparées par un polypeptide


composé de 35 acides aminés, polypeptide qui est éliminé au moment de
la transformation en insuline.

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méthode d'Itakura
fait intervenir les étapes suivantes:

synthèse séparée par traduction inverse de séquences d'ADN correspondant aux


peptides A et B et contenant à chaque bout des sites de restriction ;

introduction séparée de ces séquences dans des plasmides pBR322, vecteur


d'expression contenant le promoteur et une partie de la région codante lacZ, ainsi que
le site de fixation au ribosome (on peut aussi utiliser le promoteur trp) ;

introduction des vecteurs dans Escherichia coli ;

culture des deux souches obtenues avec production des 2 protéines mixtes
β-gal-A et β-gal-B (ou selon le cas. trp-A et trp-B) ;

isolement des peptides A et B par voie chimique (bromure de cyanogène) et


synthèse de l'insuline.

Cette insuline est commercialisée depuis 1982. Il faut signaler qu'il existe de
nombreuses autres méthodes de fabrication.
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Technique d'Itakura

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2. la somatostatine (SRIF)

La somatostatine, peptide composé de 14 acides aminés

est une hormone de l'hypotalamus utilisée dans le traitement du


nanisme

Production de la somatostatine (SRIF)

Itakura a réussi à synthétiser une chaîne d'ADN artificiel comportant


les codons correspondant à cette séquence d'acides aminés.

la chaîne d'ADN est précédée par la séquence reconnue par l'enzyme
de restriction Eco RI et le codon méthionine et suivie par des codons
d'arrêt et la séquence reconnue par l'enzyme de restriction Bam HI

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2. la somatostatine (SRIF)

Cet ADN synthétique est fixé dans le plasmide pBR


322 accroché à une partie du gène de structure de la β-
galactosidase.

Ce plasmide peut être introduit dans un clone


d'Escherichia coli et s'y maintenir (20 à 30 plasmides par
cellule).

La cellule produit alors une protéine hybride : fragment


de β-galactosidase, méthionine, somatostatine.

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2. la somatostatine (SRIF)

Le bromure de cyanogène possède la propriété de


détruire la méthionine et de libérer la somatostatine.

Il est possible de produire ainsi jusqu'à 1 mg de


somatostatine par litre de culture bactérienne :

c'est la quantité de cette hormone qui peut être extraite


d'environ 5 millions de cervelles de mouton.

Cette hormone, commercialisée depuis 1985 peut être


également produite par d'autres procédés.

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