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Programme des travaux pratiques d’immunologie

Médecine- Troisième année


2010-2011
1. Initiation au travail de laboratoire
Tests d’agglutination :
• Hémagglutination : Groupage sanguin
• Agglutination passive du latex

2. Tests d’agglutination de bactéries : Test de Widal pour le diagnostic de la typhoïde

3. Test ELISA

4. Travaux dirigés : Exercices


Instructions générales pour
les travaux pratiques d’Immunologie Fondamentale
Matériel indispensable
- Blouse de laboratoire en coton, manches longues, arrivant au genou
- Gants de latex usage unique, non stériles (25 paires en moyenne)
- Un rouleau de papier cuisine (un/binome)
- Marqueurs permanents noirs, pour écriture sur verre, grosseur F
- Matériel d’écriture (certaines séances nécessitent du papier millimétré)
- Calculatrice

Mesures de sécurité:
- Porter en permanence la blouse et les gants pendant toute la séance de travaux
pratiques
- Considérer tout spécimen biologique comme potentiellement infectieux: éviter tout
contact avec la peau ou les muqueuses, jeter judicieusement (voir ci-dessous) et nettoyer tout
épanchement accidentel
- Ne pas manger, boire ou mastiquer du chewing-gum au laboratoire
- Eviter de toucher avec vos gants à tout objet en contact potentiel avec la bouche
- Jeter chaque type de déchet de manière adéquate:
o Ejecter les cônes de pipette automatique directement dans le cristallisoir
contenant de l’eau de Javel à 30% (l’eau de Javel est le meilleur désinfectant)
o Verser tous les liquides biologiques dans un cristallisoir contenant de l’eau de
Javel à 30%
o Remplir ou rincer tout le matériel de laboratoire à usage unique ou multiple
ayant contenu du matériel biologique avec de l’eau de Javel à 30% et incuber pour 1 minute
au moins
o Jeter le matériel de laboratoire à usage unique (tubes et plaques en
plastiques…), désinfecté à l’eau de Javel, dans les sacs poubelle
o Laver le matériel à usage multiple, désinfecté, très abondamment à l’eau de
robinet. Savonner, rincer à l’eau de robinet puis à l’eau distillée, retourner pour sécher sur du
papier cuisine propre
- Après avoir terminé, nettoyer la paillasse à l’eau et au savon, la rincer et la sécher.
- Enlever les gants, les jeter dans les poubelles, et se laver toujours les mains pour 30
secondes au moins avant de quitter le laboratoire.
Rédaction d’un rapport scientifique
Un rapport scientifique est la conclusion logique et essentielle qui complète un travail
scientifique. Ce dernier pourrait être une expérience réalisée en une séance de travaux
pratiques, un mémoire de fin d’études ou même une thèse de doctorat étalée sur plusieurs
années ! Dans tous les cas, l’organisation générale du rapport reste la même.

Le rapport est destiné à satisfaire deux objectifs :


- Répondre à la problématique qui a nécessité le travail en exposant le travail effectué et
sa valeur
- Permettre au lecteur de refaire ce travail, soit pour le vérifier, soit pour l’appliquer à
d’autres problématiques.

Le rapport doit donc être à la fois explicite, objectif, instructif, concis et précis. Afin
d’assurer ces critères, tout rapport scientifique doit être impérativement organisé en cinq
sections :
1. Introduction :
- Problématique
- Objectif du travail
- Principe du travail
2. Matériel et Méthodologie
3. Résultats
4. Conclusion

Dans ce qui suit, nous exposons les directives générales concernant les différentes sections
d’un rapport scientifique de Travaux Pratiques :

1. Introduction

1.1. Problématique
Cette section place le travail dans son contexte : elle résume ce que l’on sait du sujet et relie
les différents éléments de ce savoir entre eux.
Prenons pour exemple le test de Wright pour le diagnostic de la brucellose. Dans la section
«Problématique » on rappelle en quoi consiste la brucellose, ses signes cliniques, ses
indicateurs biologiques et l’importance d’un diagnostic de laboratoire précoce et fiable pour la
confirmation du diagnostic clinique et pour le traitement.
Cette section est rédigée au temps présent et elle est appuyée par une bibliographie.

2.2. Objectif du travail


Cette section doit indiquer le but de l’expérience, c’est-à-dire pourquoi elle a été choisie et
réalisée, ce que l’on cherche à savoir.
Prenons toujours l’exemple du test de Wright. Dans la section « Objectif » on indique si le
patient dont on teste le sérum présente les signes cliniques de l’infection (fièvre, fatigue…), le
début d’apparition de ces signes, et les raisons pour lesquelles le médecin traitant suspecte
une brucellose. Ensuite on se propose de rechercher, dans le sérum du patient, les anticorps
spécifiques de la bactérie brucella qui confirmeraient le diagnostic d’une brucellose active.

Cette section doit être rédigée au temps présent.


2- Principe

Cette section indique comment ces anticorps sont recherchés selon la technique utilisée dans
le test. Toujours dans le même exemple du diagnostic de la brucellose, le principe du test de
Wright repose sur l’agglutination de bactéries du genre brucella, préalablement tuées, fixées
et colorées, en présence d’anticorps spécifiques en quantité suffisante. Cette agglutination
peut être visible à l’œil nu. La quantité d’anticorps étant cruciale au diagnostic, on indique
que l’on recherche également le titre du sérum en testant différentes dilutions de ce dernier.

Cette section doit être également rédigée au temps présent.

3- Matériel et Méthodologie

3.1. Matériel
Il comporte essentiellement les réactifs spécifiques à ce test :
- Le sérum test (on indique ici son numéro)
- Les contrôles positif et négatif sélectionnés
- Les bactéries : origine commerciale et numéro de référence si connus
- Les tampons utilisés : nature, molarité et pH
Il ne faut pas mentionner dans le rapport les solutions d’usage usuel, récipients, équipement,
etc…

3.2. Méthodes :
Cette section est destinée à permettre au lecteur d’évaluer les conditions de l’expérience, et
par conséquent de faire sa propre interprétation des résultats, ainsi que de répéter l’expérience
dans les mêmes conditions si nécessaire. Elle indique donc les étapes de la procédure de
manière quantitative et objective, en donnant les éléments suivants :
- Les dilutions de sérum testées et le nombre de points expérimentaux, le volume, le
tampon et le récipient. Ex : 6 dilutions de sérum test de 1:2 en 1:2, allant de 1:20 à
1:640, dans 0,5 ml de PBS, dans un tube à hémolyse.
- Les contrôles
- Le volume et la concentration des bactéries rajoutées
- La durée et la température d’incubation
- La durée et la vitesse de centrifugation
- Le mode de lecture : agitation des tubes et observation à l’œil nu de l’état libre ou
agglutiné des bactéries.
- La méthode d’estimation des résultats : (Ex : ++++ indique que 100% des bactéries
sont agglutinées, +/- indique que 25% des bactéries sont agglutinées).

Il ne faut pas dans cette section détailler la façon de faire les dilutions ou les « trucs » de
manipulation, tels que pipetage, calcul des dilutions, homogénéisation, fermeture des tubes,
etc…).

Cette section est rédigée au passé composé actif (Nous avons dilué le sérum ….) ou, encore
mieux, passif (le sérum a été dilué…).
4- Résultats

Cette section décrit ce qui a été observé à la fin de l’expérience. Elle doit en premier lieu
démontrer la validité de l’expérience en donnant les résultats des contrôles positif et négatif et
en indiquant si ces résultats sont conformes à ceux escomptés. Seulement alors on peut
s’assurer que l’expérience s’est déroulée dans les bonnes conditions de qualité et que les
résultats sont fiables.

Ensuite, on indique les résultats de l’ensemble du test. Ceci peut être fait de différentes
manières, généralement à l’aide d’un texte rédigé, de tableaux, de graphes, de diagrammes, de
photos, etc… Tous ces éléments graphiques doivent être impérativement numérotés, titrés et
légendés.

Ex : Dans le test de la brucellose, on peut reporter les intensités d’agglutination sous forme de
(+) ou (-) en fonction de la dilution de sérum dans un tableau, introduit par une phrase courte,
titré et légendé.

Comme la section « Méthodologie », cette section est rédigée au passé composé actif (Nous
avons dilué le sérum ….) ou, encore mieux, passif (le sérum a été dilué…).

5- Conclusion

Cette section doit indiquer la ou les interprétations possibles des résultats de l’expérience,
les limites de cette interprétation, et éventuellement les recommandations pour affiner dans
le futur la réponse à la problématique.

Ex : Un titre de sérum anti-brucella de 80 est équivoque : Il peut indiquer une brucellose au


début ou à la fin. Il faut corréler les résultats de l’expérience avec l’évolution clinique du
patient et répéter ce test dans une quinzaine de jours : un titre croissant indique un état
évolutif de la maladie, alors qu’un titre décroissant indiquera un début de convalescence.

Cette section doit être rédigée au temps présent.


Test de groupage sanguin
But du test
Déterminer le groupe sanguin pour les systèmes ABO et Rhésus par la recherche des
agglutinogènes A, B et D à la surface des globules rouges.

Principe du test
Les globules rouges portant un agglutinogène donné sont agglutinés lorsqu’ils sont mis en
présence d’anticorps spécifiques de cet antigène. Les anticorps utilisés dans ce test sont
monoclonaux, donc monospécifiques, assurant l’absence de réactivité croisée.
L’agglutination peut être mise en évidence dans des tests qualitatifs, réalisés sur des plaques
de verre ou d’opaline.

Protocole expérimental
- Désinfecter le bout du majeur à l’aide d’un coton imbibé d’alcool à 70
- Appuyer avec le pouce sur le bout du doigt pour retenir la circulation sanguine
- Piquer le bout du majeur vivement avec la lancette stérile
- Recueillir 5 gouttes de sang dans les 5 puits de la plaque de verre destinée au test en
touchant légèrement avec le doigt
- Ajouter une goutte de réactif différent à proximité de chacune des gouttes de sang
- A l’aide d’un cure-dent ou d’un agitateur à usage unique, mélanger les réactifs de
chaque puits en décrivant un cercle de 2-3 cm de diamètre
- Imprimer à la plaque un mouvement rotatif pendant quelques minutes (jusqu’à 10
minutes) et noter les agglutinations.

Résultats et interprétation

Le groupe sanguin pour le système ABO peut être déterminé per référence au tableau suivant :

Agglutination avec Agglutination avec Agglutination avec


anti-A anti-B (anti-A + anti-B)
Groupe O - - -
Groupe A + - +
Groupe B - + +
Groupe AB + + +
Généralement, ces agglutinations sont rapides et nettes. Par contre, l’agglutination avec les
anticorps anti-D est beaucoup plus difficile à mettre en évidence. Dans certains cas, elle est
même inexistante. Un test de Coombs est alors nécessaire pour trancher le diagnostic.
Tests d’agglutination directe de bactéries

Introduction
Quand un individu subit une infection par des micro-organismes pathogènes, il développe
une réponse immunitaire spécifique, cellulaire et humorale, afin de neutraliser l’intrus et de
l’éliminer. L’un des mécanismes de cette réponse est la production d’anticorps spécifiques
des antigènes du micro-organisme infectant. Le délai d’apparition de ces anticorps, leur titre
et leur persistance dans le sérum de l’individu dépendent de plusieurs facteurs, tels que
l’immunogénicité de l’organisme, sa voie d’entrée, l’amplitude de l’infection, ainsi que la
susceptibilité génétique et l’état physiologique général de l’individu. Ils dépendent
également de l’éventuelle exposition préalable au micro-organisme (infection antérieure ou
vaccination).

Test de Widal et Félix pour le diagnostic de la fièvre typhoïde

Principe
Les Salmonelles sont des bactéries Gram négatif de la famille des entérobactéries. Elles
contiennent essentiellement les antigènes suivants:
- un antigène somatique O, de nature glucidique et correspondant à l’endotoxine. Cet
antigène est stable à la chaleur (résiste à un réchauffement à 100 C pour 2.5 hrs) et résistant à
l’alcool. Il n’est pas non plus détruit par le formaldéhyde, mais quand la bactérie est fixée
par le formaldéhyde, les anticorps anti-O ne peuvent plus l’agglutiner.
- un antigène H, présent dans toutes les souches flagellées de Salmonelles, de nature
protéique. L’antigène H est conservé lors d’un traitement par le formaldéhyde. Par contre, il
est détruit par l’alcool à 96º. De plus, quand la bactérie est exposée à la chaleur, le flagelle se
détache.
- un antigène d’enveloppe Vi, présent seulement chez certaines souches (bacille
d’Eberth et paratyphi C), et de valeur diagnostique faible.

L’infection par des Salmonelles peut provoquer une fièvre typhoïde (infection par
Salmonella typhi) ou paratyphoïde (infection par Salmonella paratyphi A, B ou C). Chez les
sujets atteints de fièvre typhoïde ou paratyphoïde et chez les sujets vaccinés, ces antigènes
entraînent la production d’anticorps spécifiques dont le taux sérique évolue en fonction du
temps selon la courbe suivante:
Titre d’Ac

N.B. Cette courbe est importante à connaître pour l’interprétation du séro-diagnostic.


Le séro-diagnostic de Widal et Félix se fait en mettant en présence, dans des conditions
appropriées, le sérum à étudier, à différentes dilutions, avec des suspensions de
Salmonelles :
- suspensions alcoolisées, enrichies en antigène O, pour la recherche d’anticorps anti-O
- suspensions formolées, enrichies en antigène H, pour la recherche d’anticorps anti-H.

Mode opératoire

Vous disposez des réactifs suivants :


- 5 ml de suspension de Salmonella typhi alcoolisées, donc enrichies en antigène O
(TO)
- 5 ml de suspension de Salmonella typhi formolisées, donc enrichies en antigène H
(TH)
- NaCl 0.9%
- 0.25 ml de sérum test (noter le numéro du sérum).

Détermination du titre su sérum

1- Préparer deux séries de 5 dilutions de sérum chacune, allant de 1/10 à 1/160, en


procédant comme suit :
- Préparer deux séries de tubes à essai, de 6 tubes chacune. Marquer l’une
d’elles O1 à O6 et l’autre H1 à H6. Pour chaque série :
- Dans le 1er tube, introduire 0.9 ml de NaCl
- Dans les autres tubes, introduire 0.5 ml de NaCl
- Dans le 1er tube, introduire 0.1 ml de sérum, mélanger et transférer 0.5 ml
dans le 2ème tube
- Mélanger et répéter cette procédure jusqu’au 5ème tube ; mélanger et jeter 0.5
ml de solution.
N.B. Le dernier tube ne contient que du NaCl et sera le témoin d’absence d’agglutination
spontanée des bactéries.

2- Introduire dans chaque tube de la 1ère série 0.5 ml de suspension de Salmonelles «TO»
3- Introduire dans chaque tube de la 2ème série 0.5 ml de suspension de Salmonelles
«TH»
4- Mélanger les réactifs dans chaque tube, puis incuber pour une heure au bain-marie à
45°C
5- Centrifuger les tubes à 2000 tours/min pour 5 minutes
6- Remettre les culots en suspension en administrant un coup sec au fond de chaque tube
et noter immédiatement s’il y a ou non une agglutination en comparant l’aspect des bactéries
resuspendues avec celui du tube no. 6. En déduire les titres d’Ac anti-O et anti-H.
N.B. Pour la détermination des titres, tenir compte des dilutions finales de sérum, qui vont de
1/20 à 1/320.

Résultats et interprétation

Un diagnostic précis de l’infection repose à la fois sur les données cliniques et sur les
résultats des tests de laboratoire. Les agglutinines sont produites lentement au cours de la
phase aiguë de l’infection et jusqu’à la convalescence. Leur titre augmente considérablement
entre les deux phases.
- L’élévation du titre entre deux spécimens de sérum, testés à quelques jours
d’intervalle, accompagnée des signes et symptômes typiques de la maladie chez le patient
constituent ensemble la meilleure base pour un diagnostic positif.
- Si seuls des anticorps anti-H sont mis en évidence, le sujet a été probablement exposé
à des salmonelles depuis un certain temps, soit naturellement, soit par vaccination. Il se peut
également qu’il soit atteint de typhoïde, mais qu’il ait reçu un traitement à base de
chloramphénicol qui empêche l’apparition d’anticorps anti-O.
Test ELISA pour la détection des anticorps anti-thyroglobuline

La thyroïdite de Hashimoto

La thyroïdite de Hashimoto est une maladie auto-immune atteignant généralement la femme


d’âge mûr, due à la production d’auto-anticorps et/ou de cellules TDTH auto-réactives
spécifiques d’antigènes thyroïdiens. La réponse DTH est caractérisée par une intense
infiltration cellulaire de la glande thyroïde. La réaction inflammatoire qui s’ensuit entraîne un
goitre, c’est-à-dire un élargissement visible de la glande thyroïde. Le sérum des malades
atteints de thyroïdite de Hashimoto contient généralement des auto-anticorps spécifiques d’un
nombre de protéines thyroïdiennes, dont la thyroglobuline, protéine cellulaire impliquée dans
la fixation de l’iode. La liaison des anticorps à leur cible cellulaire inhibe la fixation de
l’iode, conduisant à une production diminuée d’hormones thyroïdiennes (hypothyroïdie).

Recherche des anticorps anti-thyroglobuline par ELISA

1. Principe
La technique d’ELISA est l’une des techniques les plus utilisées dans le dosage
immunologique d’anticorps car un grand nombre de déterminations sensibles peuvent être
effectuées dans un temps relativement court et de manière économe.

Dans le dosage des anticorps anti-thyroglobuline par ELISA, les puits de microtitration sont
recouverts d’antigène purifié, la thyroglobuline, à concentration constante et optimale. Les
sites réactifs résiduels du plastique sont bloqués par incubation avec du tampon PBS
(phosphate buffered saline) contenant du lait écrémé. Le lait est utilisé comme source riche en
protéines non spécifiques.

Après blocage, différents sérums humains à tester sont incubés purs en duplicata. Le contrôle
positif consiste en une sérum standard dont la concentration en anticorps anti-thyroglobuline
est exprimée en unités internationales par millilitres (UI/ml). Une courbe étalon est réalisée
avec différentes dilutions de ce sérum standard. Le contrôle négatif consiste en un sérum
dépourvu d’anticorps anti-thyroglobuline.

Après incubation des sérums humains et lavage, la liaison des anticorps est mise en évidence
par l’addition d’anticorps de mouton anti-Ig humaines couplés à la péroxydase, suivie par
celle d’un substrat chromogène de la péroxydase, le tétraméthylbenzidine (TMB). La
transformation du substrat en un produit coloré, proportionnelle à la quantité d’enzyme dans
le puits, et par conséquent à celle des anticorps anti-thyroglobuline, est déterminée par lecture
de la densité optique à 450 nm, à l’aide d’un spectrophotomètre.

La concentration d’anticorps anti-thyroglobuline dans chaque sérum est déduite par


extrapolation de la densité optique qui lui correspond sur la courbe étalon.

2. Matériel et méthodologie

Matériel
- « Strips » d’une plaque de microtitration recouverts de thyroglobuline et bloqués avec du
PBS contenant 3% (m/v) de lait écrémé.
- Tampon de lavage : PBS contenant 0.05% de Tween 20 (PT). Le tween 20 est un
détergeant qui sert à diminuer la liaison des protéines non spécifiques du sérum au
plastique, par augmentation de la tension de surface. Le tampon PT est contenu dans une
pissette et placé près de l’évier.

- Tampon de dilution et d’incubation : PBS contenant 0.05% de Tween 20 et 3% (m/v) de


lait écrémé (PTL). Ce tampon se trouve dans un tube à hémolyse sur le portoir.

- Sérums (dans des tubes eppendorf, sur le portoir):


 Sérum test (noter son numéro)
 Sérum standard (contrôle positif) contenant 1000UI/ml d’anti-
thyroglobuline
 Sérum de contrôle négatif.

- Anticorps de mouton anti-Ig humaines, couplés à la péroxydase (MAH-POX). Ces


anticorps sont dilués dans du PTL et prêts à l’emploi. Ils se trouvent dans un tube à
hémolyse sur le portoir.

- Substrat de la péroxydase, tétraméthylbenzidine (TMB). Ce substrat doit être préparé


extemporanément.

- Solution stop: HCL 3N. L’addition de l’acide arrête la réaction enzymatique et


transforme le produit bleu en un produit jaune dont la densité optique est lisible à 450 nm.

Méthodologie

1- Lavage des strips :


Vider la plaque au-dessus de l’évier en la retournant vivement. A l’aide de la pissette de PT
(tampon de lavage), laver les puits en les remplissant à ras-bord et en les retournant
vivement. Faire trois lavages. Tapoter énergiquement la plaque retournée contre un kleenex
pour la vider totalement.

2- Incubation des sérums humains :

Plan de la plaque :
A2 Sérum test
Sérum étalon 1000 UI/ml A1

Sérum étalon 500 UI/ml B1 B2 (duplicata)

Sérum étalon 250 UI/ml C1 C2 Sérum de contrôle négatif

Sérum étalon 125 UI/ml D1 D2 (duplicata)

Sérum étalon 62.5 UI/ml E1 E2 Anticorps secondaire seulement

Sérum étalon 31.25 UI/ml F1 F2 (duplicata)

Sérum étalon 15.6 UI/ml G1 G2 Blanc


Sérum étalon 7.8 UI/ml H1 H2 (duplicata)
Pour réaliser les différentes dilutions du sérum étalon :
- Dans le puits A1, introduire 100 µ l de sérum étalon
- Dans les puits B1 à H1 introduire 50 µ l de PTL
- Transférer 50 µ l de A1 en B1, mélanger
- Répéter jusqu’en H1
- Jeter les 50 µ l excédentaires de H1

Dans les autres puits :


- A2 et B2 : introduire 50 µ l de sérum test
- C2 et D2 : introduire 50 µ l de sérum de contrôle négatif
- E2, F2, G2 et H2 : introduire 50 µ l de PTL

Incuber la plaque, recouverte de Kleenex, 30 minutes à température ambiante, sur la paillasse

3- Incubation des anticorps anti-Ig humaines

- Laver les strips trois fois comme précédemment.

- Distribuer 50 µ l de MAH-POX dans tous les puits sauf dans G2 et H2.

- Distribuer 50 µ l de tampon PTL dans les puits G2 et H2.

-Incuber la plaque, recouverte de Kleenex, 20 minutes à température ambiante, sur la


paillasse.

4- Révélation de la réaction :

- Laver les strips trois fois comme précédemment.

- Obtenir le substrat TMB.

- Distribuer 50 µ l de TMB dans tous les puits.

- Observer le développement de la couleur bleue pour 10 minutes.

- Arrêter la réaction en rajoutant 50 µ l de HCL 3N dans tous les puits. La couleur tourne au
jaune.

- Lire la densité optique à 450 nm.

5- Vérification des contrôles :

- Les puits A1 à H1 ont reçu différentes dilutions de ½ en ½ du sérum étalon. Leur densité
optique devrait être décroissante.
- Les puits C2 et D2 ont reçu le contrôle négatif qui ne contient pas d’anticorps anti-
thyroglobuline. Leur densité optique devrait être très faible.
- Les puits E2 et F2 ont reçu l’anticorps secondaire seul qui ne devrait pas se lier en l’absence
d’anticorps humains. Ils correspondent au bruit de fond qui devrait être négligeable.
- Les puits G2 et H2 ont reçu seulement du substrat, jamais mis en contact avec l’enzyme : ils
correspondent au blanc

6. Calculs et Interprétation :

- Calculer la moyenne de densité des puits A2 et B2 (sérum test) et de celle des puits C2
et D2 (contrôle négatif).
- Retrancher la densité moyenne du contrôle négatif de celle des puits A1 à H1 (contrôle
positif) et de la densité moyenne du sérum test.
- Sur du papier millimétré, tracer la courbe étalon de D.O. en fonction des unités
internationales du sérum de contrôle positif.
- En extrapolant la densité optique du sérum test sur la courbe étalon, déterminer la
concentration de ce dernier en anticorps anti-thyroglobulines

N.B. La présence des anticorps anti-thyroglobuline est fortement suggestive d’un désordre
auto-immun, presque toujours associé à une thyroïdite de Hashimoto. Par contre leur
absence ne permet pas d’infirmer le diagnostic.
Préparation des cellules mononucléées du sang

Introduction

De nombreuses expériences réalisées par des immunologistes nécessitent l’obtention de


leucocytes, principalement des lymphocytes, pour des études ultérieures in vitro ou in vivo.
La source de lymphocytes humains la plus communément utilisée est le sang périphérique et
l’une des méthodes les plus simples pour leur purification est l’utilisation d’un milieu de
séparation appelé Ficoll Isopaque.

Principe de séparation des cellules mononucléées sur Ficoll Isopaque:

Le Ficoll Isopaque est un liquide de densité (d = 1,077) inférieure à celle des globules rouges
et des neutrophiles mais supérieure à celle des cellules mononucléées (lymphocytes et
monocytes). Lorsque du sang entier collecté sur anti-coagulant est déposé au-dessus d’une
couche de Ficoll dans un tube et que l’ensemble est soumis à l’action de la gravité, les
cellules sanguines se séparent: les globules rouges et les neutrophiles se déposent dans le fond
du tube au-dessous du Ficoll, alors que les lymphocytes et les monocytes surnagent.

Mode opératoire

Vous disposez des réactifs suivants:


- 1,5 ml de sang humain frais collecté sur anti-coagulant (héparine)
- 4 ml du Ficoll Isopaque
- Tampon PBS

- Marquer votre nom sur le tube de Ficoll (près du bord supérieur)


- Diluer le sang humain au tiers dans du tampon PBS
- Maintenir le tube de Ficoll incliné à 45° et déposer doucement le sang dilué le long de la
paroi du tube afin de maintenir les deux phases séparées.
- Redresser doucement le tube, le boucher à l’aide de parafilm et centrifuger 15 minutes à 1700
rpm
- Retirer le tube avec précaution de la centrifugeuse. En le maintenant au niveau de vos yeux,
identifier les différentes phases et localiser la couche de cellules mononucléées à l’interphase
- Introduire la pipette Pasteur dans le tube jusqu’à l’interphase. En décrivant des mouvements
de va et vient, retirer les cellules mononucléées et les déposer dans un autre tube
- Rajouter 6 ml de tampon PBS aux cellules mononucléées et centrifuger 7 minutes à 1200
rpm.
- Se débarasser du surnageant. Casser le culot cellulaire et laver les cellules encore une fois
avec 6 ml de PBS.
- Reprendre le culot dans 0,5 ml de PBS et compter les cellules comme décrit ci-dessous.
Comptage des cellules à l’aide d’un hémocytomètre

Les cellules sont comptées à l’aide d’un hémocytomètre. Celui-ci est formé d’une lame
épaisse de verre, munie d’un plateau central coupé en deux par un sillon transversal. Chaque
demi-plateau central est quadrillé finement par gravage et constitue une chambre de
comptage. La lame est recouverte d’une lamelle qui repose sur deux plateaux latéraux de la
lame, surélevés de 0.1 mm par rapport au plateau central et qui délimite donc la hauteur de la
chambre de comptage à 0.1 mm. Nous utilisons un hémocytomètre de type Naubaeur,
quadrillé comme suit :

Longueur de 5
carrés = 1 mm

Largeur de 5 carrés = 1 mm

Le volume du centre de la croix de quadrillage = 1 x 1 x 0.1 = 0.1 mm3 = 10-4 ml

La viabilité cellulaire est déterminée par exclusion de colorant, en utilisant le bleu Trypan.
Ce colorant est exclus par la membrane plasmique des cellules vivantes, dont le cytoplasme
reste alors non coloré. Cependant, lorsque la cellule est morte, la membrane endommagée
laisse passer le colorant librement vers l’intérieur et son cytoplame devient bleu.

Mode opératoire:

Vous disposez des réactifs et matériels suivants :


- Suspension de cellules sanguines mononucléées lavées
- 50 µ l de bleu trypan dans un tube eppendorf
- hémocytomètre de type Naubaeur et lamelle de verre
- Préparer l’hémocytomètre: humecter votre doigt d’alcool et le passer sur les deux
plateaux latéraux délimitant les chambres de comptage de l’hémocytomètre. Déposer la
lamelle sur l’hémocytomètre et appuyer légèrement pour la coller.
- Prélever 50 µ l de cellules à compter à l’aide d’une pipette automatique et mélanger au
bleu Trypan
- Prélever un échantillon du mélange et l’introduire lentement dans l’une des chambres de
comptage de l’hémocytomètre jusqu’à la remplir, sans qu’elle ne déborde
- Attendre 10 secondes, positionner l’hémocytomètre sur le microscope optique, fermer le
diaphragme du microscope et faire la mise au point
- Compter les cellules vivantes (claires) et les cellules mortes (bleues) dans les carrés des
4 coins et le carré central.
- Estimer la concentration de cellules vivantes et celle des cellules mortes par ml de sang,
selon la formule suivante:
- Concentration /ml = nbr moyen de cellules/carré x 25 x 104 x 2

- Estimer la viabilité cellulaire:


- Pourcentage de viabilité = (cellules vivantes/cellules totales) x 100