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ROYAUME DU MAROC

MINISTERE DE L’AGRICULTURE ET DE LA PECHE MARITIME


DEPARTEMENT DE LA PECHE MARITIME

3ème Année
Traitement et Valorisation des produits de la pêche
2020/2021

Cours d’Analyse Instrumentale


S2-4: Aspects théorique

Enseignant : K. LHICHOU
Khalid LHICHOU

Laboratoire de Contrôle Qualité des Produits


de La Pêche

e-mail: ISTPMHICH@YAHOO.fr
Plan de cours

1. Introduction générale sur la chromatographie

2. Aspect théorique de la chromatographie

3. Chromatographie gazeuse : principe et appareillage

4. Chromatographie liquide : principe et appareillage

5. Chromatographie d’ion, sur couche mince et d’exclusion

6. Spectroscopie
Composantes de chromatographie liquide
La théorie cinétique

Ø La théorie des plateaux est sans doute la meilleur théorie


permettant d’expliquer les phénomènes de séparation
chromatographique.

ü Pics gaussiens
ü Calcul du nombre de plateaux

Ø Limitations :

ü Absence de considération des phénomènes de diffusion


ü Impossibilité d’introduire tout l’échantillon dans un volume
infiniment petit
ü Absence de considération cinétique (vitesse d’échanges
entre les deux phase
ü Causes d’élargissement des pics
La théorie cinétique

Ø La théorie cinétique considère le pic chromatographique


comme représentatif de la distribution statistique des temps de
rétention des molécules d’une substance donnée sur la colonne.

Ø La théorie cinétique considère les phénomènes de diffusion et


de transfert de masse
Comment agir sur la séparation
Qu'est-ce qu'un « plateau » en chromatographie ?

Lc 1 Lc
Rs ~ 1 N Rs ~ 1 ~
4 4 H 4 h ×d
p

LC Longueur de colonne
dp Granulométrie
h Hauteur réduite d'un
plateau théorique

Un plateau théorique est un stade hypothétique pendant lequel les deux


phases d'une substance (phases liquide et vapeur) sont en équilibre.
Comment agir sur la séparation ?

´ Un nombre de plateaux (N) élevé offre :

´ Des pics étroits et pointus


´ Une meilleure détection
´ Une capacité de pics pour séparer des échantillons complexes

´ Toutefois, l'augmentation de la résolution est proportionnelle seulement à la racine carrée


du nombre de plateaux.
´ RS ~ ÖN
´ L'augmentation du nombre de plateaux est limitée par les conditions expérimentales
´ Temps d'analyse, pression
Comment agir sur la séparation ?
Rapprochement des paramètres : largeur de pic et
hauteur réduite d'un plateau théorique

tr1 - tr 2 Lc
Rs = Rs ~ 1
1 / 2 × ( Wb 2 + Wb1 ) 4 h ×d
p

h = f (w )

h = f ( w eddy + w ax + w C )

h : hauteur réduite d'un plateau théorique


Équation de Van Deemter

´ L'équation de Van Deemter établit la relation entre les variances par unité de
longueur d'une colonne de séparation et la vitesse linéaire de la phase mobile en
prenant en compte les propriétés physiques, cinétiques et thermodynamiques
d'une séparation.

h = f ( wturb + wax + wC )

h = A + B/u + C u

• Diffusion turbulente
• Coefficient de diffusion
• Résistance au transfert de
masse
Équation de Van Deemter
Diffusion turbulente

Phénomènes de diffusion :

Diffusion moléculaire longitudinale

Diffusion turbulente
Remplissage
Équation de Van Deemter
Diffusion turbulente

Diffusion de Eddy wturb ~ λ dp λ : Qualité du remplissage de colonne

Variation des trajectoires de diffusion due à :

Trajectoires différentes Mauvais remplissage Distribution large de la


de la colonne taille des particules
Équation de Van Deemter
Diffusion axiale ou longitudinale

´ Augmentation de la largeur de pic due à l'autodiffusion de l'analyte

´ À un débit faible, la durée de séjour de l'analyte dans la phase mobile


est longue
• Augmentation forte de la largeur de pic
• Hauteur accrue d'un plateau théorique
Débit
Équation de Van Deemter
Diffusion axiale ou longitudinale

B/u : diffusion longitudinale :


diffusion du composé de
la région concentrée d’une
bande vers la région diluée B 2γD
= M

γ : facteur d’obstruction ou de tortuosité


u u
DM : coefficient de diffusion :
ü mesure la mobilité du composé dans la phase mobile
ü plus faible dans les liquides que dans les gaz
ü augmente avec la température
ü diminue quand la viscosité du milieu augmente
Équation de Van Deemter
Résistance au transfert de masse

wC ~ dp2
Trajectoires de diffusion différentes

Particule poreuse
Couche stationnaire de la phase
mobile
Équation de Van Deemter
Résistance au transfert de masse

Transfert de masse

a b
ü t0, les molécules a et b d’une
même substance sont sur la
même ligne

ü ti, a va rester dans le pore du


grain de la phase stationnaire
et b dans la phase mobile

ü tf, b ira plus vite que la


molécule a
Équation de Van Deemter
Résistance au transfert de masse

C.u : cinétique de transfert de masse


C. u = (CPS + CPM).u
Transfert de masse favorisé par :

ü une faible épaisseur de phase stationnaire


ü un petit diamètre de colonne
ü une température plus élevée
ü un coefficient de diffusion DM peu élevé (PM peu visqueuse)
ü un faible débit d’éluant
Équation de Van Deemter

Hauteur réduite d'un plateau théorique (h)


h = A + B/u + C u

Courbe cumulative : Van Deemter

Résistance au transfert de masse

Diffusion turbulente

Diffusion axiale
Débit
Équation de Van Deemter
Gaz vecteur

N2
La vitesse linéaire (et le débit)
Hauteur réduite d'un plateau théorique (h)

du gaz vecteur dépend de la


température de colonne. À une
pression de tête constante, la vitesse
linéaire diminue lorsque
la température de colonne augmente.
He La courbe de Van Deemter illustre bien
l'effet de la vitesse linéaire moyenne
(u) du gaz vecteur sur l'efficacité.
H2

uopt VOGA
Uopt: efficacité maximale
u (cm / sec) VOGA : vitesse optimisée de gaz
atteignable
Équation de Van Deemter
Application à la CPG

Equation de Van Deemter

H = A + B/ū + C.ū
ū = vitesse linéaire moyenne d’écoulement de la phase mobile dans la colonne
Comment optimiser une analyse en
21 chromatographie sur colonne ?
But : obtenir le degré de résolution souhaité en un minimum de temps

Ø augmenter N :

§ L : si L doublée, alors R augmente de √2


mais durée de séparation augmente
§ H:
• ∅ particules support ( terme A )
• ∅ colonne( terme C)
• T°(GC) ( terme B)
• épaisseur du film liquide(GC). ( terme C)
• viscosité de la PM ( HPLC) ( terme C)
• optimiser u ( vitesse linéaire de PM)
Comment optimiser une analyse en
22 chromatographie sur colonne ?

Ø modifier k’:
§ k’B optimum: 1-5
§ éviter k’B >10 (durée d’élution ! )
§ modifier la T° (GC)
§ modifier la composition de la PM (HPLC)
§ diminuer l’épaisseur du film liquide et augmenter le diamètre
interne de la colonne (modification de b en GC)

Ø augmenter α si proche de 1 (maintenir 1< k’< 10)


§ modifier la T° de la colonne
§ modifier la composition de la PS
§ modifier la composition de la PM (HPLC)
Comment optimiser une analyse en
23 chromatographie sur colonne ?

Modification de k’ en cours d’élution :

ü Par un gradient de composition ou programmation de solvant :


augmentation graduelle ou continue de la puissance de l’éluant en
cours d’élution (HPLC)
Þ Modification de k’, α et de H
Þ Amélioration de N et de R

ü Par une programmation de température :


augmentation graduelle ou continue de la température de la
colonne en cours d’élution (GC)
Þ Modification de k’, α et de H
Þ Amélioration de N et de R
Comment optimiser une analyse en
24 chromatographie sur colonne ?

Programmation de
Isotherme à 45°
température en GC

Isotherme à 130°

Programmationde température
de 30° à 180°
La théorie cinétique

Les solutions pour minimiser des phénomènes de diffusion :

Ø Améliorer l’homogénéité de la phase:


ü Absence d’hétérogénéités
ü Absence de bulle
ü Absence de vide

Ø Réduire le diamètre des particules dp

Ø Homogénéiser le débit de la phase mobile

Ø Diminuer la taille des grains et des pores


La théorie cinétique

En résumé :

Ø Prendre des particules

ü De petites tailles
ü De faible porosité

Ø Réaliser des chromatographies

ü Rapides
ü Avec des phases stationnaires
miniaturisées
Ø Travailler

ü A faible température
ü En réduisant les volumes morts
Influence de la forme de l'isotherme sur la géométrie
du pic et sur le tr

L’asymétrie d’un pic est traduite par deux paramètres appelés facteur de traînée et
facteur d’asymétrie

a) le tailing factor Le premier est le tailing factor (est souvent utilisé dans l’industrie
pharmaceutique).
Il est mesuré par le rapport AB sur AC, grandeurs mesurées à 5 % de la hauteur du pic.
Influence de la forme de l'isotherme sur la géométrie
du pic et sur le tr
b) le facteur d’asymétrie ou asymmetry factor (Fa ou As)

Le second est l’asymetry factor qui est plutôt utilisé dans l’industrie non pharmaceutique. Il
est mesuré par le rapport BC sur AC, grandeurs mesurées à 10 % de la hauteur du pic. Les
grandeurs seront du même ordre de grandeur mais seront rarement équivalentes. Les valeurs
normales se situent entre 1 et 1.5 pour une nouvelle colonne. Elles sont souvent légèrement
supérieures dans les conditions réelles d’utilisation d’une colonne.
Influence de la forme de l'isotherme sur la géométrie
du pic et sur le tr

Dans le cas d’un fronting, ces 2 paramètres sont inférieurs à l’unité.

Ø Fronting ou front diffus:

Ft <1
Fa<1

Dans le cas d’un tailing, les 2 paramètres sont supérieurs à l’unité.

Ø Tailing ou traînée:

Ft >1
Fa>1
Perte de charge dans une colonne
(Loi de DARCY)

Pour maintenir le débit constant dans la colonne il faut augmenter la


pression. Si la granulométrie de la phase stationnaire n'est pas
régulière, des fines particules peuvent s'insérer dans les
interstices, en s'opposant au passage de la phase mobile.

La résistance à l'écoulement augmente avec l'irrégularité du


remplissage. La différence de pression entre l'entrée et la sortie de la
colonne est appelée perte de charge ( ∆P ).

avec : ∆P perte de charge (Pa),


Φ . η.L.u
η viscosité (Pa.s)
Φ résistance à l'écoulement (sans dimension), ∆P = ▬▬▬▬▬
L longueur de la colonne (m) D2
D diamètre des particules (m) Loi de Darcy (pour un liquide
u vitesse de phase mobile (m.s-1).
Perte de charge dans une colonne
(Loi de DARCY)

η!" ε% dp2
ΔP = K° =
#° &'ε (
&,-
DP perte de charge (en barye = 10-6 bars)

η viscosité (poise)
L longueur de la colonne (cm)
v vitesse de la phase mobile (cm.s-1)
K° constante de perméabilité (cm2)
dp diamètre des particules (cm)
ε porosité interstitielle (volume interstitiel de la colonne/volume total).
En CLHP on travaille avec des pressions en tête de colonne
de l'ordre de 20000 à 150000 hPa (20 à150 bars).
Exercice d’application.2-3

Le chromatogramme de la nicotine a été obtenu dans les conditions


suivante :

Conditions

CPG. Colonne remplie


10% Carbowax 20M/2% KOH sur 80/100 Chromosorb W AW
6' (183cm) x 2mm ID . Débit de la phase mobile: 20mL/min. Inj.:1µL
Four: 200°C. Temps de rétention de la nicotine = 3,20 mn. Four:
180°C. Temps de rétention de la nicotine = 6,60 mn

Questions :

-Le pic de la nicotine a une largeur à mi-hauteur de 10 sec.


Calculez N et H.
Exercice d’application.2-4

Soit une courbe de V.D. expérimentale; en ordonnée est reportée la hauteur de


plateau réduite h = H/dp (où dp = 5 µm est le diamètre des particules. On
considère deux points particuliers A et B sur cette courbe.
1- Au point A (débit = 1 ml/mn, U = 0,65 mm/s et h = 2), calculer le temps mort et le
temps d'analyse.

2- Même question au point B (débit = 2,75 ml/mn, U = 1,7 mm/s et h = 2,5).

3- Calculer la perte d'efficacité de la colonne entre A et B (NB/NA ). Conclusion


Exemple de courbe de Van Deemter expérimentale : Exercice d'application 2-4

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