MINISTERE DE L’AGRICULTURE ET DE LA PECHE MARITIME
DEPARTEMENT DE LA PECHE MARITIME
3ème Année Traitement et Valorisation des produits de la pêche 2020/2021
Cours d’Analyse Instrumentale
S2-4: Aspects théorique
Enseignant : K. LHICHOU Khalid LHICHOU
Laboratoire de Contrôle Qualité des Produits
de La Pêche
e-mail: ISTPMHICH@YAHOO.fr Plan de cours
1. Introduction générale sur la chromatographie
2. Aspect théorique de la chromatographie
3. Chromatographie gazeuse : principe et appareillage
4. Chromatographie liquide : principe et appareillage
5. Chromatographie d’ion, sur couche mince et d’exclusion
6. Spectroscopie Composantes de chromatographie liquide La théorie cinétique
Ø La théorie des plateaux est sans doute la meilleur théorie
permettant d’expliquer les phénomènes de séparation chromatographique.
ü Pics gaussiens ü Calcul du nombre de plateaux
Ø Limitations :
ü Absence de considération des phénomènes de diffusion
ü Impossibilité d’introduire tout l’échantillon dans un volume infiniment petit ü Absence de considération cinétique (vitesse d’échanges entre les deux phase ü Causes d’élargissement des pics La théorie cinétique
Ø La théorie cinétique considère le pic chromatographique
comme représentatif de la distribution statistique des temps de rétention des molécules d’une substance donnée sur la colonne.
Ø La théorie cinétique considère les phénomènes de diffusion et
de transfert de masse Comment agir sur la séparation Qu'est-ce qu'un « plateau » en chromatographie ?
Lc 1 Lc Rs ~ 1 N Rs ~ 1 ~ 4 4 H 4 h ×d p
LC Longueur de colonne dp Granulométrie h Hauteur réduite d'un plateau théorique
Un plateau théorique est un stade hypothétique pendant lequel les deux
phases d'une substance (phases liquide et vapeur) sont en équilibre. Comment agir sur la séparation ?
´ Un nombre de plateaux (N) élevé offre :
´ Des pics étroits et pointus
´ Une meilleure détection ´ Une capacité de pics pour séparer des échantillons complexes
´ Toutefois, l'augmentation de la résolution est proportionnelle seulement à la racine carrée
du nombre de plateaux. ´ RS ~ ÖN ´ L'augmentation du nombre de plateaux est limitée par les conditions expérimentales ´ Temps d'analyse, pression Comment agir sur la séparation ? Rapprochement des paramètres : largeur de pic et hauteur réduite d'un plateau théorique
´ L'équation de Van Deemter établit la relation entre les variances par unité de longueur d'une colonne de séparation et la vitesse linéaire de la phase mobile en prenant en compte les propriétés physiques, cinétiques et thermodynamiques d'une séparation.
h = f ( wturb + wax + wC )
h = A + B/u + C u
• Diffusion turbulente • Coefficient de diffusion • Résistance au transfert de masse Équation de Van Deemter Diffusion turbulente
Phénomènes de diffusion :
Diffusion moléculaire longitudinale
Diffusion turbulente Remplissage Équation de Van Deemter Diffusion turbulente
Diffusion de Eddy wturb ~ λ dp λ : Qualité du remplissage de colonne
Variation des trajectoires de diffusion due à :
Trajectoires différentes Mauvais remplissage Distribution large de la
de la colonne taille des particules Équation de Van Deemter Diffusion axiale ou longitudinale
´ Augmentation de la largeur de pic due à l'autodiffusion de l'analyte
´ À un débit faible, la durée de séjour de l'analyte dans la phase mobile
est longue • Augmentation forte de la largeur de pic • Hauteur accrue d'un plateau théorique Débit Équation de Van Deemter Diffusion axiale ou longitudinale
B/u : diffusion longitudinale :
diffusion du composé de la région concentrée d’une bande vers la région diluée B 2γD = M
γ : facteur d’obstruction ou de tortuosité
u u DM : coefficient de diffusion : ü mesure la mobilité du composé dans la phase mobile ü plus faible dans les liquides que dans les gaz ü augmente avec la température ü diminue quand la viscosité du milieu augmente Équation de Van Deemter Résistance au transfert de masse
wC ~ dp2 Trajectoires de diffusion différentes
Particule poreuse Couche stationnaire de la phase mobile Équation de Van Deemter Résistance au transfert de masse
Transfert de masse
a b ü t0, les molécules a et b d’une même substance sont sur la même ligne
ü ti, a va rester dans le pore du
grain de la phase stationnaire et b dans la phase mobile
ü tf, b ira plus vite que la
molécule a Équation de Van Deemter Résistance au transfert de masse
C.u : cinétique de transfert de masse
C. u = (CPS + CPM).u Transfert de masse favorisé par :
ü une faible épaisseur de phase stationnaire
ü un petit diamètre de colonne ü une température plus élevée ü un coefficient de diffusion DM peu élevé (PM peu visqueuse) ü un faible débit d’éluant Équation de Van Deemter
Hauteur réduite d'un plateau théorique (h)
h = A + B/u + C u
Courbe cumulative : Van Deemter
Résistance au transfert de masse
Diffusion turbulente
Diffusion axiale Débit Équation de Van Deemter Gaz vecteur
N2 La vitesse linéaire (et le débit) Hauteur réduite d'un plateau théorique (h)
du gaz vecteur dépend de la
température de colonne. À une pression de tête constante, la vitesse linéaire diminue lorsque la température de colonne augmente. He La courbe de Van Deemter illustre bien l'effet de la vitesse linéaire moyenne (u) du gaz vecteur sur l'efficacité. H2
uopt VOGA Uopt: efficacité maximale u (cm / sec) VOGA : vitesse optimisée de gaz atteignable Équation de Van Deemter Application à la CPG
Equation de Van Deemter
H = A + B/ū + C.ū ū = vitesse linéaire moyenne d’écoulement de la phase mobile dans la colonne Comment optimiser une analyse en 21 chromatographie sur colonne ? But : obtenir le degré de résolution souhaité en un minimum de temps
Ø augmenter N :
§ L : si L doublée, alors R augmente de √2
mais durée de séparation augmente § H: • ∅ particules support ( terme A ) • ∅ colonne( terme C) • T°(GC) ( terme B) • épaisseur du film liquide(GC). ( terme C) • viscosité de la PM ( HPLC) ( terme C) • optimiser u ( vitesse linéaire de PM) Comment optimiser une analyse en 22 chromatographie sur colonne ?
Ø modifier k’: § k’B optimum: 1-5 § éviter k’B >10 (durée d’élution ! ) § modifier la T° (GC) § modifier la composition de la PM (HPLC) § diminuer l’épaisseur du film liquide et augmenter le diamètre interne de la colonne (modification de b en GC)
Ø augmenter α si proche de 1 (maintenir 1< k’< 10)
§ modifier la T° de la colonne § modifier la composition de la PS § modifier la composition de la PM (HPLC) Comment optimiser une analyse en 23 chromatographie sur colonne ?
Modification de k’ en cours d’élution :
ü Par un gradient de composition ou programmation de solvant :
augmentation graduelle ou continue de la puissance de l’éluant en cours d’élution (HPLC) Þ Modification de k’, α et de H Þ Amélioration de N et de R
ü Par une programmation de température :
augmentation graduelle ou continue de la température de la colonne en cours d’élution (GC) Þ Modification de k’, α et de H Þ Amélioration de N et de R Comment optimiser une analyse en 24 chromatographie sur colonne ?
Programmation de Isotherme à 45° température en GC
Isotherme à 130°
Programmationde température de 30° à 180° La théorie cinétique
Les solutions pour minimiser des phénomènes de diffusion :
Ø Améliorer l’homogénéité de la phase:
ü Absence d’hétérogénéités ü Absence de bulle ü Absence de vide
Ø Réduire le diamètre des particules dp
Ø Homogénéiser le débit de la phase mobile
Ø Diminuer la taille des grains et des pores
La théorie cinétique
En résumé :
Ø Prendre des particules
ü De petites tailles ü De faible porosité
Ø Réaliser des chromatographies
ü Rapides ü Avec des phases stationnaires miniaturisées Ø Travailler
ü A faible température ü En réduisant les volumes morts Influence de la forme de l'isotherme sur la géométrie du pic et sur le tr
L’asymétrie d’un pic est traduite par deux paramètres appelés facteur de traînée et facteur d’asymétrie
a) le tailing factor Le premier est le tailing factor (est souvent utilisé dans l’industrie pharmaceutique). Il est mesuré par le rapport AB sur AC, grandeurs mesurées à 5 % de la hauteur du pic. Influence de la forme de l'isotherme sur la géométrie du pic et sur le tr b) le facteur d’asymétrie ou asymmetry factor (Fa ou As)
Le second est l’asymetry factor qui est plutôt utilisé dans l’industrie non pharmaceutique. Il est mesuré par le rapport BC sur AC, grandeurs mesurées à 10 % de la hauteur du pic. Les grandeurs seront du même ordre de grandeur mais seront rarement équivalentes. Les valeurs normales se situent entre 1 et 1.5 pour une nouvelle colonne. Elles sont souvent légèrement supérieures dans les conditions réelles d’utilisation d’une colonne. Influence de la forme de l'isotherme sur la géométrie du pic et sur le tr
Dans le cas d’un fronting, ces 2 paramètres sont inférieurs à l’unité.
Ø Fronting ou front diffus:
Ft <1 Fa<1
Dans le cas d’un tailing, les 2 paramètres sont supérieurs à l’unité.
Ø Tailing ou traînée:
Ft >1 Fa>1 Perte de charge dans une colonne (Loi de DARCY)
Pour maintenir le débit constant dans la colonne il faut augmenter la
pression. Si la granulométrie de la phase stationnaire n'est pas régulière, des fines particules peuvent s'insérer dans les interstices, en s'opposant au passage de la phase mobile.
La résistance à l'écoulement augmente avec l'irrégularité du
remplissage. La différence de pression entre l'entrée et la sortie de la colonne est appelée perte de charge ( ∆P ).
avec : ∆P perte de charge (Pa),
Φ . η.L.u η viscosité (Pa.s) Φ résistance à l'écoulement (sans dimension), ∆P = ▬▬▬▬▬ L longueur de la colonne (m) D2 D diamètre des particules (m) Loi de Darcy (pour un liquide u vitesse de phase mobile (m.s-1). Perte de charge dans une colonne (Loi de DARCY)
η!" ε% dp2 ΔP = K° = #° &'ε ( &,- DP perte de charge (en barye = 10-6 bars)
η viscosité (poise) L longueur de la colonne (cm) v vitesse de la phase mobile (cm.s-1) K° constante de perméabilité (cm2) dp diamètre des particules (cm) ε porosité interstitielle (volume interstitiel de la colonne/volume total). En CLHP on travaille avec des pressions en tête de colonne de l'ordre de 20000 à 150000 hPa (20 à150 bars). Exercice d’application.2-3
Le chromatogramme de la nicotine a été obtenu dans les conditions
suivante :
Conditions
CPG. Colonne remplie
10% Carbowax 20M/2% KOH sur 80/100 Chromosorb W AW 6' (183cm) x 2mm ID . Débit de la phase mobile: 20mL/min. Inj.:1µL Four: 200°C. Temps de rétention de la nicotine = 3,20 mn. Four: 180°C. Temps de rétention de la nicotine = 6,60 mn
Questions :
-Le pic de la nicotine a une largeur à mi-hauteur de 10 sec.
Calculez N et H. Exercice d’application.2-4
Soit une courbe de V.D. expérimentale; en ordonnée est reportée la hauteur de
plateau réduite h = H/dp (où dp = 5 µm est le diamètre des particules. On considère deux points particuliers A et B sur cette courbe. 1- Au point A (débit = 1 ml/mn, U = 0,65 mm/s et h = 2), calculer le temps mort et le temps d'analyse.
2- Même question au point B (débit = 2,75 ml/mn, U = 1,7 mm/s et h = 2,5).
3- Calculer la perte d'efficacité de la colonne entre A et B (NB/NA ). Conclusion
Exemple de courbe de Van Deemter expérimentale : Exercice d'application 2-4
