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Univ Blida I. FSNV.

Master I Microbiologie (2020)

TBBM Génie génétique : Les enzymes de restriction


Introduction :
Découvertes à partir des années 1970. Les enzymes de restriction sont capables de reconnaître
spécifiquement une courte séquence, de 4 à 10 pb, et de cliver l'ADN au site reconnu. Ils
permettent de fragmenter l'ADN en fragments de taille réduite, ou de le couper au site spécifié.
Certaines enzymes coupent le site en son milieu et produisent deux fragments dont les
extrémités sont franches. Cependant, la plupart réalisent une coupure dissymétrique : on parle
dans ce cas d'extrémités cohésives (chaque fragment possède une chaîne qui dépasse l'autre de
quelques bases). Plusieurs centaines de ces enzymes ont été caractérisés:
Elles reconnaissent une grande variété de sites de coupure.
Les enzymes de restriction sont utilisés pour établir une carte de restriction de toute molécule
d'ADN que l'on souhaite caractériser. Cela consiste à déterminer l'ordre des sites de restriction
le long de cette molécule, qui vont produire, après "digestion enzymatique" de cette molécule,
des fragments de tailles différentes dont la taille pourra être définie par électrophorèse.
Les enzymes de restriction appartiennent à la classe des endonucléases, c’est-à-dire des
enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entre deux nucléotides à l’intérieur d’un
acide nucléique (Figure 1). Les endonucléases se différencient des exonucléases qui dégradent
la molécule d’ADN à partir de l’une de ses extrémités (3’ ou 5’).

Figure 1. Profil de coupure d’1 enzyme de restriction

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1- Séquences d’ADN reconnues par les enzymes de restriction.
Les séquences de nucléotides reconnues par les enzymes de restriction sont habituellement des
séquences dites palindromiques. Les séquences palindromiques sont des séquences où la
succession des nucléotides lue dans le sens 5’à 3’ (gauche-droite) pour le premier brin est
identique à la séquence lue dans le sens droite-gauche pour le second brin (sens 5’à 3’). Ces
séquences palindromiques sont le plus souvent constituées de 4, 5 ou 6 paires de bases.
Le nombre de séquences de reconnaissance pour une endonucléase de restriction particulière
dans une molécule d'ADN de longueur connue peut être calculé mathématiquement. Ainsi, la
séquence GATC reconnue par l’enzyme Mbo I est présente avec une fréquence statistique de
1 / 256 paires de bases (1/ 44) soit 1 coupure tous les 256 nucléotides. En effet, la fréquence de
coupure d’un ADN par une enzyme de restriction donnée peut être estimée statistiquement en
considérant le nombre de nucléotides de la séquence spécifique reconnue par l’enzyme. Ainsi,
par exemple, dans la séquence de six nucléotides: GGATCC reconnue par l’enzyme Bam HI,
on aura donc une fréquence de coupure statistique de 1 / 46, soit 1 coupure tous les 4096
nucléotides. Cependant ces calculs supposent que les nucléotides sont ordonnés de manière
aléatoire (au hasard) et que les quatre nucléotides différents sont présents dans des proportions
égales (c'est-à-dire, la teneur en GC = 50% et AT=50%). Par conséquent bien que les
mathématiques puissent donner une idée du nombre de sites de restriction possibles dans une
molécule d'ADN donnée, seule l'analyse expérimentale peut fournir la véritable image de la
répartition des sites de restriction pour une enzyme de restriction en particulier.
Exemple :
Par exemple, la molécule d'ADN du phage λ, à 49 kb, devrait contenir environ 12 sites de
coupure pour une endonucléase de restriction qui reconnait 1 séquence hexanucléotidique
(séquence de 6 nucléotides). En fait, bon nombre de ces sites de reconnaissance sont moins
fréquents (par exemple, six pour BglII, cinq pour BamHI et seulement deux pour SalI, voir
Figure 2), ce qui reflète le fait que la teneur en GC pour l’ADN du phage λ est plutôt inférieure
à 50%.

- BglII reconnait la séquence

- BamHI reconnait la séquence

- SalI reconnait la séquence

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De plus, les sites de restriction ne sont généralement pas régulièrement espacés le long d'une
molécule d'ADN. S'ils l'étaient, la digestion avec une endonucléase de restriction particulière
produirait des fragments de tailles à peu près égales. La figure 2 montre les fragments produits
en coupant l'ADN λ avec BglII, BamHI et SalI; dans chaque cas, il existe une dispersion
considérable des tailles de fragments, ce qui indique que dans l'ADN λ, les nucléotides ne sont
pas ordonnés au hasard.

a) Sites de restriction sur l’ADN du phage λ

b) Tailles des fragments générés par les coupures des enzymes


BglII

BamHI

SalI

Figure 2. Sites de Restriction de la molécule d'ADN du phage λ


a) Les positions des séquences de reconnaissance pour BglII, BamHI et SalI.
b) Les fragments produits par clivage avec chacune des endonucléases de restriction. Les
nombres représentent les tailles des fragments en paires de bases (pb).

2- Origine des enzymes de restriction.


Les enzymes de restriction sont extraites de micro-organismes, le plus souvent des bactéries.
Les bactéries peuvent être parasitées par des virus à ADN. Les bactéries fabriquent des enzymes
de restriction qui sont capables de cliver les ADN étrangers (Figure 3). Pour éviter une auto-
destruction de leur propre ADN, elles se protègent contre leurs propres enzymes de restriction
par une modification des sites de restriction correspondants.

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L’DN du phage injecté


à l’intérieur de la
bactérie

Les endonucléases de L'ADN phagique est clivé et


restriction se lient à inactivé
l'ADN du phage

Figure 3. ADN du phage clivé par les endonucléases de la bactérie

3- Nomenclature des enzymes de restriction.


Les enzymes de restriction présentent une nomenclature bien précise. Leur nom comporte
plusieurs lettres (3 ou 4). La première lettre de dénomination de l’enzyme est écrite en
majuscule, elle correspond au genre de la bactérie d’où a été extraite l’enzyme. La seconde
lettre et la troisième lettre (en minuscules) correspondent à l’espèce de la bactérie d’où l’enzyme
est extraite. On peut avoir une quatrième lettre écrite en majuscule correspondant à la souche
bactérienne. Enfin pour terminer, un chiffre romain indique l’ordre de caractérisation de ces
enzymes.
Exemples:
Eco RI Extraite de Escherichia coli RYB ; site reconnu: G / AATTC
Sma I Extraite de Serratia marcescens ; site reconnu: CCC / GGG
Pst I Extraite de Providencia stuartii ; site reconnu: CTGCA / G

4- Notion d’isoschizomères
Des enzymes de restriction différentes peuvent reconnaître les mêmes sites spécifiques, on les
appelle isoschizomères. Les isoschizomères fournissent souvent après clivage enzymatique des
fragments dont les extrémités sont différentes.
Exemple :
Soit la séquence suivante: GGTACC, cette séquence est coupée par l’enzyme Kpn I et l’enzyme
Acc65 I:
5’-G-G-T-A-C/C-3’
- Kpn I:
3’-C/ C-A-T-G-G-5’

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5’-G/G-T-A-C-C-3’
- Acc65 I:
3’-C-C-A-T-G/G-5’

Ces enzymes sont des isoschizomères, elles reconnaissent en effet la même séquence
nucléotidique GGTACC. On voit tout de suite que les extrémités des fragments obtenus
diffèrent.
5- Exemples de quelques enzymes de restriction :

Blunt : coupure à extrémités franches Sticky : coupure à extrémités cohésives

6- Types de coupures realisées par les enzymes de restriction :


Les enzymes de restriction peuvent donner deux types de coupures (Figure 4):
- la coupure à extrémités franches
- la coupure à extrémités cohésives.
La coupure à extrémités franches aboutit à une coupure au milieu de la séquence palindromique.
La coupure à extrémités cohésives (ou à extrémités adhésives) correspond à une coupure qui se
fait de part et d’autre du centre de symétrie.

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a) Coupure à extrémités franches

Extrémités franches

b) Coupure à extrémités cohésives

Extrémités cohésives
Figure 4. Les extrémités produites par clivage de l'ADN
avec différentes endonucléases de restriction.
(a) Extrémités franches produites par AluI. (b) Extrémité cohésives produites par EcoRI.

Les possibilités de ce type d’outils enzymatiques sont considérables. L’ADN est découpé en
fragments variables et ceci aussi bien l’ADN circulaire des bactéries ou des plasmides que
l’ADN linéaire.

7- Les classes d’enzymes de restriction :


Trois classes différentes d'endonucléases de restriction sont connues, chacune se distinguant
par un mode d'action légèrement différent. Les types I et III sont assez complexes et n'ont qu'un
rôle limité dans le génie génétique, tandis que les endonucléases de restriction de type II sont
les enzymes les plus importantes dans le clonage de gènes.
La plupart des enzymes de restriction utilisées au laboratoire présentent un site de
reconnaissance (souvent palindromique) et un site de coupure identique ou proche du site de
reconnaissance, ce sont des enzymes de type II. Près de 4000 enzymes de type II ont été isolées
et plus de 600 sont disponibles pour une utilisation en laboratoire.
Certaines bactéries possèdent d’autres types d’enzymes de restriction.
Les enzymes de type I reconnaissent des séquences sur l’ADN sans aucune symétrie. Ces
enzymes coupent non pas au niveau de la séquence de reconnaissance mais 1000 à 5000 paires
de bases plus loin.
Les enzymes de type III présentent également un site de reconnaissance mais coupent une
vingtaine de nucléotides plus loin.

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8- Méthylation des sites de restriction et inactivation des enzymes de restriction :
L’ADN bactérien présente des sites de restriction susceptibles d’être repérés par les enzymes
de restriction que possède la bactérie. Pour éviter une auto-destruction, les enzymes de
modification de l’ADN bactérien interviennent. Ces enzymes de modification sont des
méthylases bactériennes (ou enzymes de méthylation). La méthylation de la cytosine (sur le
carbone 5) ou de l’adénine (sur l’azote 6) appartenant à des sites de restriction aboutit à une
inactivation de l’enzyme de restriction correspondante. Cette méthylation peut se réaliser sur
une base ou sur plusieurs bases appartenant au site de restriction. Les méthylases bactériennes
sont très spécifiques.

ADN bactérien

Les endonucléases de Les séquences de


restriction ne peuvent pas reconnaissance sont méthylées
se lier à la séquence de
reconnaissance

9- Utilisations des enzymes de restriction :


Les utilisations des enzymes de restriction sont très nombreuses en biologie moléculaire. Par
exemple, elles permettent de fractionner l’ADN en multiples fragments susceptibles d’être
séparés par les techniques d’électrophorèse. Les enzymes de restriction peuvent être utilisées
pour préparer un fragment d’ADN d’un gène donné (insert) à être inséré dans un vecteur comme
un plasmide. Les enzymes de restriction sont utilisées couramment pour rechercher des
mutations dans le génome.
Les enzymes de restriction sont utilisées pour rechercher dans l’ADN des cellules eucaryotes
les méthylations de bases. Ces méthylations ont une signification complètement différente des
méthylations de bases observées chez les procaryotes. Elles sont en relation directe avec des
modifications de l’expression des gènes des eucaryotes. La méthylation provoque le
verrouillage de l’expression de tel ou tel gène dans un tissu. Les méthylations dans le génome
des eucaryotes concernent les cytosines impliquées dans les doublets dinucléotidiques CG. La
recherche de ces doublets et de la présence ou non d’une méthylation sur les cytosines est

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réalisée à l’aide de deux enzymes de restriction, une enzyme insensible à la méthylation des
cytosines et une autre enzyme sensible à la méthylation des cytosines.
10- Applications des enzymes de restriction :
Elles ont de nombreuses applications :
- Etablir les cartes de restriction qui consiste à déterminer l’ordre des sites de restriction sur
l’ADN.
- Détecter le polymorphisme (exemple : RFLP, AFLP) (Voir le cours polymorphisme).
- Au cours des étapes du clonage, afin d’insérer un fragment d’ADN exogène dans un vecteur
(voir le cours clonage). Les possibilités qu’offrent les enzymes de restriction de recombiner des
ADN d’origines différentes ont permis le développement des techniques de l’ADN
recombinant.
- Formation de banques de gènes pour analyse du génome ou recherche de la fonction d’un gène
(voir le cours clonage).
Remarque :
Dans le processus de clonage on obtient des clones chez qui ont été introduits les vecteurs
portant l’ADN recombiné. Pour distinguer les cellules hôtes qui ont intégrés des vecteurs de
celles qui n’en portent pas, le vecteur doit contenir un facteur de sélection (voir le cours
clonage). En général on utilise des gènes de résistance aux antibiotiques comme c’est le cas
pour le plasmide pBR322 (voir le cours clonage), mais on peut utiliser également des gènes
codant des enzymes absentes de la cellule hôte. Par exemple dans le cas du vecteur plasmidique
pUC18 (Figure 5).

Figure 5.
Schéma du plasmide pUC18 avec le site de
clonage multiple situé dans le gène Lac Z’

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pUC8 est un petit plasmide, ne comprenant que 2,7 kb. En plus de son origine de réplication, il
porte deux gènes, un gène pour la résistance à l'ampicilline et le gène lacZʹ, qui code pour une
partie de l'enzyme β-galactosidase utilisée pour cliver le disaccharide lactose en ses composants
monosaccharides glucose et galactose.
Le criblage bleu-blanc utilise cette activité enzymatique pour facilement identifier les cellules
transformées contenant des plasmides recombinants ou non recombinants. Si un fragment
d'ADN est inséré n'importe où dans le site de clonage multiple, le gène lacZ’ est perturbé et ne
produira pas de copies fonctionnelles de β-galactosidase.
Test pour sélectionner les clones transformés:
Les milieux de culture utilisés dans le test contiennent un antibiotique - l'ampicilline dans ce
cas. Les bactéries non transformées ne peuvent pas se développer dans ces milieux car elles
n'ont pas le gène ampR et donc l'ampicilline tue ces cellules. Ces milieux contiennent également
une substance appelée X-gal, un substrat pour la β-galactosidase. Lorsqu'il est clivé par la β-
galactosidase, il devient bleu. En conséquence, les cellules bactériennes portant des plasmides
non recombinants (qui ne contiennent donc pas d'ADN inséré) ont un gène lacZ’ fonctionnel et
produisent de la β-galactosidase, qui clive X-gal dans le milieu de culture, et ces cellules
deviennent bleues. Les bactéries recombinantes avec des plasmides contenant un fragment
d'ADN inséré formeront des colonies blanches lorsqu'elles se développeront sur du milieu X-
gal car les plasmides dans ces cellules ne produisent pas de β-galactosidase fonctionnelle
(Figure 6). Les colonies blanches peuvent être transférées dans des flacons de bouillon de
culture et cultivées en grandes quantités, après quoi il est relativement facile d'isoler et de
purifier les plasmides recombinants de ces cellules.

ampR

pUC 18 Gène inséré


pUC 18 LacZ’ recombinant dans LacZ’

Ori
Colonies bleues, Lac Z’ Colonies
fonctionnel blanches, Lac Z’
non-fonctionnel

Milieux de culture + ampicilline + X-Gal

Figure 6. Sélection des recombinants Puc18

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10.1. Cartes de restriction :

Historiquement, l'une des premières étapes de la caractérisation d'un clone ADN a été la
construction d'une carte de restriction. Une carte de restriction indique le nombre, l'ordre et les
distances entre les sites de clivage des enzymes de restriction le long d'un segment d'ADN
cloné, fournissant ainsi des informations sur la longueur de l'insert cloné et l'emplacement des
sites de clivage des enzymes de restriction du clone. Ces informations pourraient être utilisées
pour cloner à nouveau des fragments d'un gène ou comparer son organisation avec celle d'autres
séquences clonées. Dans le projet du génome humain, les cartes de restriction du génome
humain ont été essentielles pour digérer le génome en morceaux pouvant être séquencés.
Avant que le séquençage de l'ADN et la bioinformatique ne deviennent des techniques
d’utilisation courante, des cartes de restriction ont été créées en coupant l'ADN avec différentes
enzymes de restriction et en séparant les fragments d'ADN par électrophorèse sur gel, une
méthode qui sépare les fragments par taille, les plus petits fragments se déplaçant le plus loin à
travers le gel (Figure 7).

Figure 7. Gel d'agarose contenant des fragments d'ADN séparés, colorés avec le
bromure d'éthidium et visualisés sous lumière ultraviolette.
Les plus petits fragments migrent plus rapidement et plus loin que les plus gros fragments, ce
qui entraîne la distribution indiquée sur le gel.

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La façon la plus simple de construire une carte de restriction est de comparer les tailles de
fragments produites lorsqu'une molécule d'ADN est digérée avec deux enzymes de restriction
différentes qui reconnaissent différentes séquences cibles.
• Premièrement, un échantillon de la molécule d'ADN est digéré avec une seule des enzymes et
la taille des fragments résultants est mesurée par électrophorèse sur gel d'agarose. Ensuite, un
autre échantillon de la molécule est digéré avec la deuxième enzyme, et les fragments résultants
sont à nouveau mesurés dans un gel d'agarose. Les résultats permettent de déterminer le nombre
de sites de restriction pour chaque enzyme mais ne permettent pas encore de déterminer leur
position relative.
• Un échantillon de la molécule d'ADN est ensuite coupé avec les deux enzymes ensemble.
• Une restriction partielle est effectuée, dans laquelle une seule enzyme est utilisée mais la
digestion ne va pas jusqu'à son terme, soit en réduisant la période d'incubation, de sorte que
l'enzyme n'a pas le temps de couper tous les sites de restriction, ou en incubant à basse
température (par exemple, 4 ◦C plutôt que 37 ◦C), ce qui limite l'activité de l'enzyme.
La restriction partielle conduit à un ensemble complexe de fragments, les produits de restriction
complets étant maintenant complétés par des fragments partiellement clivés qui contiennent
toujours un ou plusieurs sites de restriction non coupés. La taille des fragments partiellement
restreints permet de compléter la carte.

La Figure 8 montre la construction d'une carte de restriction d'un segment d'ADN cloné d'une
taille de 7,0 kb. Trois échantillons de l'ADN cloné sont digérés par des enzymes de restriction
- un par HindIII, un par SalI Sail et un par les 2 enzymes HindIII et Sall. Les fragments sont
séparés par électrophorèse sur gel et colorés avec du bromure d’Ethidium. Ces bandes sont
photographiées ou scannées pour l’analyse. Les tailles des fragments sont mesurés en
comparant leur emplacement sur le gel avec des fragments de tailles connues ayant migrés dans
un puits adjacent. La carte de restriction est construite en analysant le nombre et la longueur
des fragments. Lorsque l'ADN est coupé avec HindIII, deux fragments de 0,8 et 6,2 kb chacun
sont produits, confirmant que l'insert cloné a une longueur de 7,0 kb et ne contient qu'une seule
séquence de reconnaissance pour cette enzyme (située à 0,8 kb d'une extrémité). Lorsque l'ADN
est coupé avec SalI, il en résulte deux fragments (1,2 et 5,8 kb), indiquant que l'insert n'a
également qu'une seule séquence de reconnaissance pour cette enzyme, située à 1,2 kb d'une
extrémité du segment d'ADN cloné. Ces résultats montrent que l'ADN contient un site de
reconnaissance pour chaque enzyme de restriction, mais la disposition relative des deux sites
de restriction est inconnue. D'après les informations disponibles, deux cartes différentes sont
possibles. Sur la Figure 8, le modèle 1 montre la séquence de reconnaissance de Hind III située
à 0,8 kb d'une extrémité et la séquence de reconnaissance SalI de 1,2 kb de la même extrémité.
L’autre carte, le modèle 2, localise le site de reconnaissance HindIII à 0,8 kb à une extrémité et
la séquence Sall à 1,2 kb de l’autre extrémité.
Le modèle correct est déterminé en analysant les résultats de l'échantillon digéré avec HindIII
et SalI. Le modèle l prédit que la digestion avec les deux enzymes générera trois fragments:
0.4. 0,8. et 5,8 kb de long; le modèle 2 prévoit qu'il y aura trois fragments de 0,8. 5,0 et 1,2 kb.
Le profil et les tailles observés sur le gel après digestion avec les deux enzymes indiquent que
le modèle 1 est correct (Figure 8).

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1- Préparation d’une
population d’DN cloné
Fragments d’DN clonés de 7,0 kb

2- Fragments d’ADN Coupure par des enzymes de restriction


clivés par les enzymes et dépôt sur un gel d’électrophorèse
de restriction

3- Les fragments
d’ADN sont séparés
par électrophorèse sur
gel

Modèle 1 Modèle 2

4- Deux modèles sont


possibles avec les
résultats initiaux
5- Les modèles sont Fragments prédits pour la digestion Fragments prédits pour la digestion
testés en se basant par HindIII et SalI : 0,4 ; 0,8 ; et par HindIII et SalI : 0,8 ; 1,2 ; et
sur les résultats de 5,8 kb 5,0 kb
la double digestion
6- Conclusion : Le Fragments prédits pour la digestion par HindIII et SalI : 0,4 ; 0,8 ; et
modèle 1 est correct 5,8 kb

Figure 8. Construction d’une carte de restriction

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11- Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction :
11.1. Les enzymes coupant l’ADN :

La DNase
La DNase utilisée au laboratoire est extraite du pancréas de bovin. Il s’agit d’une endonucléase
qui coupe l’ADN double brin (mais aussi l’ADN simple brin). Elle conduit à des coupures ou
« nicks » tout à fait au hasard, sans reconnaissance d’un site spécifique (ce qui la distingue des
enzymes de restriction). On obtient des fragments de tailles variées (ou oligonucléotides) qui
possèdent en leur extrémité 5’ un groupement phosphate. Cette enzyme est sensible à des ions
bivalents (Mg2+ et Mn2+). Elle est utilisée pour des marquages de sondes avec des
radioisotopes.

La nucléase S1
Cette enzyme extraite d’un champignon, n’attaque que l’ADN simple brin. Elle n’attaque pas
en principe les ADN doubles brins et les hybrides ADN-ARN.
11.2. Les enzymes assurant la ligature :

Les ligases
Les ligases sont capables de lier par une liaison ester un fragment avec un groupement
phosphate en 5’ et un groupement OH en 3’ et ceci en présence d’ATP. Elles peuvent effectuer
des ligatures sur des fragments d’ADN avec bouts francs ou des bouts collants (ou extrémités
cohésives). Elles sont extraites de bactéries. Il existe ADN et ARN ligases.
11.3. Les enzymes enlevant ou ajoutant des groupes phosphates :

Enzymes enlevant des groupes phosphates


Ces enzymes sont appelées phosphatases. Les phosphatases alcalines sont actives à pH alcalin.
Elles permettent d’enlever le groupement phosphate situé en 5’ d’une chaîne d’ADN. Elles sont
extraites de bactéries ou d’origine animale (intestins). Elles sont utilisées pour préparer de
l’ADN recombinant.

Enzymes ajoutant des groupements phosphates


Les kinases permettent de fixer un groupement phosphate en présence d’ATP. Dans cette
molécule d’ATP, le phosphate fixé est celui situé en position gamma (position la plus externe)
de la molécule d’ATP. Le groupement phosphate est fixé à l’extrémité 5’ d’un ADN
préalablement déphosphorylé. Ces kinases sont extraites de bactéries.

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11.4. Les enzymes recopiant les acides nucléiques :

Propriétes générales
Les enzymes recopiant aussi bien une chaîne d’ADN ou d’ARN ont les propriétés générales
suivantes:
- Elles synthétisent le nouveau brin dans le sens 5’à3’.
- Cette synthèse s’effectue de manière complémentaire et antiparallèle.
- Elles nécessitent la présence de nucléosides triphosphates (NTPs) ou de désoxynucléosides
triphosphates (dNTPs).

11.4.1. Les enzymes recopiant un ADN en ADN :


Ces enzymes sont des ADN polymérases ADN dépendantes. Elles ne sont pas capables de
synthétiser le brin nouveau d’ADN sans la présence d’une amorce d’acide nucléique. Les ADN
polymérases catalysent la réaction générale suivante:
(dNMP)n + dNTP à (dNMP)n+1 + PPi
avec N = A, C, T ou G. (PPi = groupe pyrophosphate).
Toutes les ADN polymérases possèdent les caractéristiques suivantes:
- Elles ont besoin d’une amorce avec une extrémité 3’-OH libre.
- La chaîne nouvelle d’ADN est synthétisée dans le sens 5’à3’.
- La chaîne nouvelle est complémentaire de la chaîne matrice d’ADN et antiparallèle.

Exemple1 : L’ADN polymérase I (extraite de E. Coli) et le fragment de klenow


Comme exemple-type d’ADN polymérase, nous citerons l’ADN polymérase I qui est extraite
d’E. coli. Cette enzyme possède des propriétés polymérasiques, mais aussi des propriétés
exonucléasiques. Il est important de préciser que les exonucléases peuvent couper les
nucléotides un par un à partir d’une chaîne polynucléotidique avec une spécificité soit de
l’extrémité 5’ (coupure 5’à 3’), soit de l’extrémité 3’ (coupure 3’à 5’). L’ADN polymérase I
possède les deux activités exonucléasiques: 5’à 3’ et 3’à 5’. Cette enzyme est constituée par
une seule chaîne polypeptidique.
Au laboratoire, on utilise souvent une enzyme préparée à partir de l’ADN polymérase I qui est
appelée fragment de KLENOW. Cette enzyme ne possède plus d’activité exonucléasique 5’à
3’, il reste les propriétés polymérasiques et les propriétés exonucléasiques 3’à 5’. L’activité 3’à
5’ permet à l’enzyme au cours d’une synthèse d’un fragment d’ADN de contrôler si
l’appariement de la base qui vient d’être ajoutée est conforme aux règles de complémentarité.

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Cette remarquable activité exonucléasique 3’à 5’ est encore appelée la fonction d’édition de
l’enzyme.

Exemple2 : Le séquençage
Cette enzyme est d’origine bactérienne mais elle ne possède plus d’activité 3’à 5’. Elle est
utilisée dans le séquençage de l’ADN.

Exemple3 : La Taq polymérase


La Taq polymérase est une ADN polymérase extraite de bactéries présentes dans les sources
chaudes. Elle permet de travailler à des températures plus élevées que les températures usuelles
(ambiante ou 37°C). Elle est très utilisée dans les réactions d’amplification génique et
également dans les réactions de séquençage de l’ADN. En principe, elle est dépourvue de
l’activité exonucléasique 3’à 5’.

11.4.2. Les enzymes recopiant un ARN en un ADN :

Exemple1 : la rétrotranscriptase ou transcriptase inverse


Cette enzyme est surtout présente dans les rétrovirus (virus à ARN). Elle permet de fabriquer à
partir d’un ARN messager (mARN) un ADNc (ou séquence d’ADN complémentaire d’un
mARN).
Elle possède les propriétés suivantes:
- C’est une ADN polymérase qui synthétise le nouveau fragment dans le sens 5’à3’.
- Elle est ARN-dépendante.
- Elle est dépourvue d’activité exonucléasique 3’à 5’, donc de fonction d’édition. Elle peut donc
insérer des bases par erreur.
- Elle a une activité RNAse.
La technique classique pour préparer un ADNc à partir d’un ARNm consiste tout d’abord à
fournir une amorce à la rétrotranscriptase. Cette amorce peut être une séquence courte par
exemple une séquence oligo(dT) capable de s’hybrider avec l’extrémité poly(A) de l’ARNm.
A partir de cette amorce, la rétrotranscriptase poursuit la copie en ADN de l’ARNm
(élongation). De plus à la fin de la copie, elle est capable de recopier son propre travail, donc
elle réalise une boucle à l’extrémité 3’ de l’ADN copié. Un traitement chimique doux permet
de détruire l’ARNm simple brin mais pas sa copie d’ADN simple brin. On ajoute ensuite de
l’ADN polymérase pour réaliser une copie de l’ADN simple en ADN double brin. La nucléase

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S1 peut ensuite éliminer l’extrémité de l’épingle à cheveu. On a ainsi formé un ADNc double
brin. D’autres techniques existent pour préparer un ADNc à partir de l’ARNm.

11.4.3. Les enzymes recopiant un ADN en un ARN :


Les ARN polymérases réalisent des transcriptions de l’un des deux brins d’ADN en un brin
d’ARN. Elles sont extraites des bactéries. Ces ARN polymérases possèdent les propriétés
suivantes:
- Elles synthétisent le brin nouveau dans le sens 5’à 3’.
- Elles n’ont pas besoin d’amorce pour commencer la synthèse (à la différence des ADN
polymérases).
- Elles nécessitent des ribonucléosides triphosphates (ou NTPs) et également (comme les autres
polymérases) des ions Mg2+.
- Elles sont dénuées d’activité d’édition.
- Enfin, dans des conditions normales de transcription, les ARN polymérases ne peuvent
démarrer la transcription que si l’ADN à transcrire possède le promoteur spécifique
correspondant.

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