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TLC

Les glycérolipides peuvent être classés en différentes classes en fonction de la tête polaire, mais dans
chacune de ces classes, ils peuvent également différer par la nature de leur AF, ce qui conduit à un très
grand nombre de molécules différentes [7]. Les méthodes d'analyse de routine des glycérolipides ont
considérablement évolué. Bien que les techniques d'extraction des lipides restent pratiquement
inchangées, basées sur des méthodes initialement développées par Bligh and Dyer [12] ou Folch [13], les
techniques de quantification sont remarquablement renouvelées. Jusqu'à récemment, les méthodes
classiques étaient basées sur la séparation des différentes classes de glycérolipides par chromatographie
sur couche mince (CCM), suivie de l'extraction des lipides présents dans chaque classe, puis de la
méthanolyse de l'acide folique associé pour former l'ester méthylique de l'acide folique (EMAG).

Figure1

Quantification de la synthèse lipidique in vivo par la CCM. (A) CCM d'extraits lipidiques d'E. coli de type
sauvage [JM109 (DE3)] E. coli à membrane mixte hétérochirale (MEP/DOXP+EL+) induits tôt dans la
croissance (DO600 = 0,0) avec différentes concentrations d'IPTG et incubés jusqu'à la phase stationnaire,
et la souche d'E. coli hébergeant la totalité de la voie des lipides de l'éther mais dépourvue du gène
araM (MEP/DOXP+EL+AraM) traitée de manière similaire. (B) Quantification relative des taches
détectées dans la CCM. AG, archétidylglycérol ; CL, cardiolipine ; PE, phosphatidyléthanolamine ; PG,
phosphatidylglycérol. (chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC))
Fifure5

d'E. coli avec une membrane mixte hétérochirale. La souche E. coli avec toutes les enzymes lipidiques de
l'éther. MEP/DOXP + EL + [non induite, orange ; induite avec 10 μM IPTG au début de la phase de
croissance (DO 600 = 0,0, rouge)] a été comparée à la souche de type sauvage JM109(DE3) (bleu) et à la
souche contenant l'opéron intégré MEP-DOXP MEP/DOXP + (vert) pour la survie contre l'exposition à
différents stress environnementaux. (A) Choc thermique. (B) Congélation à -80 °C. (C) Tolérance au l-
butanol. Les données ont été normalisées par rapport à l'UFC d'échantillons non traités. Les résultats
sont les moyennes de quatre répliques biologiques ±SEM.

Bien que tous les Archaea ne soient pas des extrêmophiles, les lipides d'éther des Archaeal ont été
associés à l'extrêmophilie et à la robustesse (40). Par conséquent, l'impact du choc thermique et froid
sur la survie des souches à membranes hétérochéral hybrides a été testé. Des souches d'E. coli de type
sauvage et deux souches modifiées [JM109 (DE3), MEP/ DOXP + , MEP/DOXP + EL + ] ont été exposées à
des températures élevées pendant 2 minutes et ont pu se rétablir pendant 1 heure à 37 °C. La souche
MEP/DOXP + EL + non induite et induite (10 μM IPTG) d'E. coli a montré une survie globale élevée lors
d'une exposition à 55 °C et 58 °C par rapport aux deux souches témoins JM109(DE3) et MEP/DOXP + d'E.
coli qui ne survivent pas à une exposition à des températures supérieures à 50 °C (Fig. 5A). Les cellules
ont également été exposées à la congélation et à la décongélation (-80 °C). Les cellules induites avec 10
μM IPTG ont été remarquablement plus tolérantes à ce traitement que les témoins (Fig. 5B), comme le
montre le nombre plus élevé d'UFC. Enfin, la tolérance au solvant organique l-butanol a été testée en
exposant les souches pendant 1 h à différentes concentrations. Une résistance plus élevée a été
observée dans la souche MEP/DOXP + EL + d'E. coli non induite et induite (10 μM IPTG), qui contient
toute la voie de synthèse biologique des lipides de l'archaeal, par rapport aux témoins (figure 5C). Ce
résultat a été particulièrement remarquable lorsque les cellules ont été traitées avec 2 % de l-butanol. Il
est important de noter que, à de faibles niveaux d'induction, la production de lipides AG n'est pas
toxique pour la cellule bactérienne, mais rend les cellules plus résistantes à différents types de ...
Figure4 E
effet des membranes hétérochirales mixtes sur les cellules d'E. coli détectées par double coloration avec
le FM4-64 et le DAPI. Coloration des lipides montrant des cellules allongées et plus fines dans la souche
modifiée par rapport au témoin, présence de taches associées à la membrane dans la souche modifiée.
La double coloration au FM4-64 et au DAPI montre la présence d'appendices entourés d'une couche
lipidique et la présence d'ADN. Présence de sites de division irréguliers dans les cellules modifiées par
rapport au septum de division symétrique présent dans les cellules de type sauvage. (Barre d'échelle : 5
μm.)

Figur 2

Stéréochimie de la biosynthèse des lipides d'éther chez E. coli et stéréosélectivité du GGGPS archéen.
Spécificité du GGGPS (A) de l'archéal M. maripaludis et des enzymes PlsB (B) de la bactérie E. coli vis-à-
vis de G1P et G3P. Le nombre total d'ions est normalisé en utilisant le détergent n-dodécyl-β-D-
maltoside (DDM) comme étalon interne. Les résultats sont les moyennes de deux expériences ±SEM. (C)
Spectres RMN de l'AG dérivé de l'ester de Mosher. AG synthétique de configuration G3P (I), AG
synthétique de configuration G1P (II), un mélange des deux (III), AG de la souche E. coli exprimant la
totalité de la voie de biosynthèse des lipides d'éther (IV), et de la souche E. coli portant la délétion du
gène AraM (V). Les cases rouges en pointillés mettent en évidence les signaux de diagnostic.

Figure3
Analyse de la croissance et de la morphologie cellulaire des souches membranaires mixtes
hétérochirales. (A) Croissance de la souche MEP/DOXP + EL + d'E. coli avec toutes les enzymes lipidiques
éther [non induites (orange)], induites avec 10 μM (rouge), et induites avec 100 μM (noir) d'IPTG ajouté
tôt pendant la croissance (DO 600 = 0,0) par rapport à deux souches témoins négatives : E. coli
JM109(DE3) de type sauvage (bleu) et E. coli MEP/DOXP + souche avec l'opéron MEPDOXP intégré
(vert). Les données sont les moyennes de trois réplicats biologiques ±SEM. (B) MEB d'E. coli de type
sauvage et de la souche hétérochirale à membrane mixte induite à une phase de croissance tardive (0,3
DO 600 ) et précoce (0,03 DO 600 ) en utilisant 100 μM d'IPTG. (I) Modification de la forme et de la
longueur des cellules. (II) Division cellulaire aberrante et formation de bourrelets et de lambeaux. (C)
Analyse statistique de la longueur des cellules de E. coli JM109(DE3) (en haut), E. coli MEP/DOXP + EL +
induites avec 10 μM d'IPTG (au milieu), et 100 μM d'IPTG (en bas).