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TP01 D’ANALYSES

BIOCHIMIQUES
Réalisé par :
Ben Yacoub Bekir
&
Tasnim Rayène

Bio 2/1
Groupe 1
Séparation de l’ADN par
électrophorèse sur gel d’Agarose

1) Objectif :
Migration d’ADN par électrophorèse sur gel d’Agarose à différentes
concentrations.
2) Principe :
La technique d’électrophorèse a pour but de séparer des molécules
 Chargées, par migration sous l'effet d'un champ électrique au travers
d'un gel (un polymère). Les molécules se déplacent vers le pôle de charge
opposée à leur charge nette à une vitesse v.

Electroph
Energie électrique orèse Porter

Champ électrique : Générateur de courant


électrique
Support du champ : tampon conduisant le
courant d’un pôle à l’autre ( liquide/semi-
solide :gel)

3) Electrophorèse sur gel :


a) Mode opératoire :
1) préparation du gel d’agarose : Mobilité électrophorétique
Notre support est le gel d’Agarose qui, dans +
Effet filtration sur gel
notre manipulation, pourra être à 0,8% ou à
1%. pour ce faire on mélange pour : tamis
moléculaire
100 mL de solution
0,8g d’agarose tampon TBE 1x

20 mL TBE 5x 20 mL TBE 5x
+ +
80 mL eau 80 mL eau
distillée distillée
100 mL de solution
Le gel de 0,8%  1g d’agarose tampon TBE 1x
2) Ebullition avec agitation de la
solution préparée.
3) Refroidir le gel à 45°C.
4) Couler le gel dans la cuve d’électrophorèse
suite au dépôt de peigne.
Le gel de 1%
Le tampon de migration TBE (Tris
Le peigne assure la formation des
Borate EDTA) peut être remplacé par
logettes de dépôt : les puits.
le TAE (Tris Acétate EDTA)

Le support est scellé avec du ruban-cache pour couler le


gel; lorsque le gel est polymérisé, il faut enlever le ruban-
cache pour permettre au courant électrique de circuler à
travers le gel au cours de la migration.

5) On enlève les 2 peignes et on remplit les cuves de l’appareil avec le


TBE 1x jusqu’à recouvrir le gel.
6) Les échantillons d’ADN sont mélangés avec un tampon de charge .

Exemple:
Glycérol/Saccharose Alourdisseur
Extrait l’AND au fond +
Marqueur de mobilité

Bleu de bromophénol : Migre


avec les petits fragments.
+
Xylène Cyanol : Migre avec les
grands fragments.

4) Dépôt des
échantillons dans les puits du gel.
5)Migration d’ADN chargé négativement sur le gel de la cathode vers
l’anode selon la taille de chaque fragment dans chaque puit.

Le gel doit être doté d’un


marqueur de poids
moléculaire de tailles
connues dit standards
6) La révélation des bandes d’ADN :
Elle se fait grâce au BET ( bromure d’éthidium) qui est un marqueur
permettant la détection des bandes sous rayons U.V.
7) L’évaluation des masses moléculaires des protéines préparées se fait en
comparant chaque bande avec le marqueur de poids moléculaire .

b) Résultat :
Pour le gel d’agarose 1% : les bandes observées sont assez proches et
condensées , alors que pour le gel 0,8% : elles sont éloignées les unes par
rapport aux autres .
On en déduit que : quand le pourcentage en agarose augmente ,les protéines
migrent moins rapidement , c’est-à-dire les pores du gel 1% sont plus petits
que ceux du gel 0,8%.

% agarose taille des pores vitesse de migration d’ADN

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