COMPTE-RENDU TP°1

DE MICROBIOLOGIE
GENERALE

Préparé par : Ben Yacoub Tasnim

Békir Rayène

Bio2/1
Groupe1
 Préparation et Stérilisation des milieux de
culture

L’étude des bactéries a connu son plein développement à partir du

moment où furent mises au point les méthodes permettant de les
cultiver, les isoler, et de les identifier.
Ces différentes opérations nécessitent l’emploi de milieux de culture.

L’objectif  :
Préparation d’un milieu de culture.
Mise en évidence l’ubiquité des microorganismes.

Le principe  :
Préparer un milieu de culture solide ; Gélose de Sabouraud.
Stérilisation.
Mise en évidence de la présence des microorganismes dans :
 La toux.
 L’air libre.
 Le doigt avant nettoyage de la main.
 La poussière sur la paillasse

Le matériel  :

Bec bunsen Autoclave Boites de pétri en gélose Etuve

 Agitateur écouvillon stérile

Agitateur thermique.
Préparation d’un Milieu de culture Solide : Gélose Sabouraud

Milieu de base non sélectif pour l’isolement des champignons

COMPOSITION : en grammes par litre d'eau distillée ;

Peptone...................10
Glucose…………...20                               
Agar……................15
                     pH final = 6

PRINCIPE, INTERET :
Milieu de base qui favorise la pousse des champignons.
PREPARATION :
1. La pesée de la poudre (16,25 gr pour 250 ml d’eau) + Ajout de l’eau distillée.
2. Agitation + chauffage jusqu’à observation d’un nuage thermique.
3. L’homogénéisation.
4. La stérilisation « Autoclave ».
(On agit principalement sur la pression et la température. Le mélange se maintient dans l’autoclave
pendant 20 min à T= 121°C)
5. Refroidissement et écoulement des milieux après stérilisation du poste de travail.
 Les manipulations de microbiologie doivent être menées dans un
environnement contrôlé où la flore microbienne de contamination est
réduite à son maximum.

RESULTATS :

La stérilisation.

La stérilisation est l'opération qui consiste à éliminer les micro-organismes d'un objet,
et ce de manière durable. En microbiologie, le but de la stérilisation est d'une part de
maîtriser les micro-organismes introduits dans le milieu d'étude, et d'autre part
d'éviter la contamination du milieu extérieur et des personnes.

Stérilisation par chaleur humide ; L’autoclave :

Autoclave : c’est un appareil indispensable dans un laboratoire de microbiologie.

Le chauffage a lieu sous pression de vapeur d’eau, à une température de 120°C
pendant une durée qui varie en fonction du milieu, de la température utilisée et du
volume des récipients. Ce procédé tue toutes les cellules végétatives et les
endospores.

Stérilisation du poste de travail :

 Ubiquité des micro-organismes 

Nous vivons en contact permanent avec des micro-organismes : le sol, l’eau, l’air, les surfaces
que nous touchons, ils sont présents partout et notamment dans le laboratoire, notre lieux de
travail.

La gélose dans les boite de Pétri contient tous les nutriments nécessaire au
développement des bactéries. On met en contact les milieux/objets avec la
gélose, et les bactéries se déposent sur la gélose et se développent.

1. Mise en évidence de la présence de micro-organismes au

laboratoire :
Mode opératoire :
On prend 3 milieux gélosés en boite de Pétri qu’on numérote :

 Dans la première boite : On dépose la boite ouverte pendant 30 minutes sur la paillasse puis on referme
la boite.
 Dans la deuxième boite : On dépose l’empreinte des 5 doigts à la surface de la gélose puis on referme la
boite.
 Dans la troisième boite : On applique l’écouvillon sur la surface de la paillasse afin de récupérer de la
poussière , puis on l’applique sur la gélose. On referme ensuite la boite.
 Dans la quatrième boite : On dépose la boite ouverte en face de la bouche et on tousse, puis on referme
la boite.
 A la fin de la manipulation, on regroupe les différentes boites de Pétri et on les place , couvercle vers le
bas , à l’étuve à 37°C pendant 24 heures pour accélérer le développement.

Résultats :
Num de la
Boite
Résultat Description

Première Chaque tâche sur la gélose

boite correspond a une bactérie
souche déposée au départ
et qui s'est par la suite
développée pour former
Deuxième
Boite une colonie.
On remarque
majoritairement la présence
de taches blanchâtres dans
Troisième
boite les 4 boites , montrant
différentes formes et tailles.
en effet, les boites de pétri
ont été contaminé par
l'objet à tester, mais aussi
Quatrièm par l'air. Il faut donc ignorer
e boite
les colonies de bactéries
issues de l'air pour analyser
les résultats.
 La stérilisation :
La stérilisation est l'opération qui consiste à éliminer les micro-organismes d'un objet et ce, de
manière durable.

Les techniques de la stérilisation :

1- STÉRILISATION PAR LES MÉTHODES PHYSIQUES :
A - STÉRILISATION PAR LA CHALEUR :

LE FLAMBAGE :

Il est basé sur l'emploi du bec Bunsen. Cette méthode est utilisée pour la stérilisation
extemporanée (pour utilisation immédiate) du matériel de manipulation : extrémité de l'öse,
extérieur des pipettes Pasteur et pipettes graduées, col des tubes à essai, tubes contenant
des milieux de culture, erlenmeyers et flacons divers, étaloirs ...
Il est à noter que le bec Bunsen, réglé avec une flamme bleue, la plus chaude, crée une
zone de stérilité d'un diamètre d'environ 20 cm, par ascendance de l'air de cette zone

 LE FOUR PASTEUR :

C'est un four - étuve à air chaud et sec. Il est utilisé pour la stérilisation de la verrerie vide
(tubes à essai, boîtes de Pétri, tubes à culture et bouchons, pipettes Pasteur et récipients
divers).  La verrerie à stériliser doit être propre et parfaitement sèche, éventuellement
bouchée avec du coton et emballée dans du papier solide. Elle est alors disposée à
l'intérieur du four et subit un chauffage de :
- 30 minutes à 1 heure à 170° - 180°C 
ou
- 2 heures à 160°C ce qui a pour but d'éviter le brunissement du coton.
Le matériel ainsi stérilisé sera laissé dans l'étuve jusqu'à son refroidissement complet, puis
stocké à l'abri des poussières. Pour ces opérations, compte tenu des températures
relativement élevées, il est conseillé d'utiliser le plus possible de la verrerie de type "pyrex".  
  L'AUTOCLAVE :

C'est un appareil très performant qui est indispensable dans une unité de microbiologie. Il
est utilisé pour stériliser les milieux de culture neufs ou souillés, mais peut également
stériliser tout autre matériel de microbiologie.
Le chauffage a lieu sous pression de vapeur d'eau, à une température de 100° à 130°C,
pendant une durée qui varie en fonction du milieu, de la température utilisée et du volume
des récipients.
En milieu saturé d'humidité et sous pression, la stérilisation s'opère à des
températures inférieures à celles qui sont nécessaires en milieu sec.
Le matériel à stériliser est déposé dans les paniers métalliques de l'autoclave dont on aura
vérifié le niveau d'eau avant chaque opération de stérilisation. Les récipients sont
préalablement bouchés avec du coton (éviter de le prendre avec les doigts - utiliser de
préférence une pince) et recouverts de papier d'aluminium ou de papier d'emballage très
résistant.
Pour la suite des opérations : mise en chauffe, jet de vapeur, montée de pression, lire
attentivement la notice du constructeur.
Ces appareils étant relativement chers, on peut utiliser une cocotte-minute spécialement
achetée et réservée à cet usage. Les températures atteintes ne dépassant pas 115°C, les
temps de chauffe seront prolongés de la moitié du temps nécessaire en autoclave.

PASTEURISATION :

La pasteurisation est toujours suivie d'un refroidissement rapide. Elle peut se faire en
bouteilles ou en vrac. Dans le premier cas, utilisé essentiellement pour la bière, le cidre ou
les jus de fruits, la boisson est mise en bouteilles ; celles-ci sont capsulées puis soumises à
une aspersion d'eau de plus en plus chaude, jusqu'à 65 - 75°C; elles séjournent à cette
température pendant 20 à 30 minutes, puis elles sont refroidies par de l'eau de plus en plus
froide.
La pasteurisation en vrac, généralement utilisée dans le cas du lait, peut se faire de deux
façons : dans la pasteurisation basse, le lait est chauffé à 60 - 70°C pendant 30 minutes, ce
qui nécessite des récipients de volume important ; dans la pasteurisation haute, la plus
utilisée en France, le lait est chauffé à 85 - 90°C pendant 20 à 30 secondes.
Cette opération se fait dans des appareils à plaques ou à tubes. L'appareil se divise en 3
parties : l'échangeur, dans lequel le lait froid se réchauffe en échangeant de la chaleur avec
le lait pasteurisé ; le pasteurisateur proprement dit; et le réfrigérant, où le lait pasteurisé, qui
a déjà été refroidi par le lait froid, va se refroidir encore en échangeant sa chaleur d'abord
avec de l'eau froide, puis avec de l'eau glacée.   
 TYNDALLISATION :

John TYNDALL a imaginé une méthode de stérilisation qui consiste en chauffages

discontinus à une température relativement basse (60 ou 70°C suivant le cas), suivis de
refroidissements. On admet qu'au cours de ces périodes de chauffage discontinu, les
bactéries perdent leur aptitude à sporuler. actuellement, la tyndallisation consiste en une
série de 3 pasteurisations de 1h. à 70 - 80°C, séparées par un intervalle de 24 heures à
température ambiante, ce qui permet la germination et la destruction des spores, sans
l'emploi d'une température excessive. Cette méthode est utilisée pour les milieux fragiles
contenant sérum, œuf ou toute substance thermosensible de forte viscosité qui ne peut être
stérilisée par filtration. Dans le cas de son utilisation, il faut veiller à la protection des cotons,
car l'humidité excessive entraîne des contaminations.  

FLAMBAGE A L'ALCOOL

 Il est utilisé pour la stérilisation de matériel de manipulation en verre, ou la désinfection des
paillasses.

B - STÉRILISATION PAR FILTRATION :

Cette méthode est utilisée pour les milieux sensibles à la chaleur, mais n'est possible que
lorsque la viscosité de ces milieux est faible. On utilise alors, suivant le cas, les bougies de
porcelaine (type Chamberland), les filtres de verre poreux (le verre fritté N°5 arrête de
nombreuses bactéries) ou les membranes filtrantes à usage unique, de type Millipore ou
Sartorius.
 C - STÉRILISATION PAR LES RADIATIONS :

La stérilisation par les U.V. est utilisée au laboratoire pour la décontamination de l'air et des
paillasses situées sous la hotte de protection : le rayonnement n'agit que de façon directe et
sa pénétration est faible. Des instruments ou des récipients tels que les boîtes de Pétri
peuvent être stérilisées de la sorte.

2 - STÉRILISATION PAR DES AGENTS CHIMIQUES :

Ils sont utilisés en général pour la désinfection des salles et plans de travail et pour la
destruction des germes portés par des instruments souillés. Ce mode de stérilisation doit
être systématiquement pratiqué, dans nos laboratoires, pour les lames et pour la verrerie
qui ne passe pas en autoclave. 

 LES ANTISEPTIQUES LIQUIDES :

L'alcool éthylique à 60% pour la désinfection des paillasses et des instruments. Mais

certains germes étant résistants, la désinfection n'est pas toujours évidente.
L'hypochlorite de sodium (eau de Javel) est utilisé dilué au 1/4 dans les bacs destinés à
recevoir les lames usagées, ou en pissette pour la désinfection des mains, des paillasses et
des sols. Rappelons que l'eau de Javel est toujours largement employée en milieu
hospitalier, dans certaines industries et à domicile.
Les savons et détergents agissent surtout par leur pouvoir mouillant, ce qui facilite
l'élimination des germes.

LES ANTISEPTIQUES GAZEUX :

 Les vapeurs d'une solution chauffée de formol sont utilisées pour désinfecter les pièces et
les étuves. Dans les années 70, les salles de classe étaient désinfectées par ce procédé.
Au Centre hospitalier de Haguenau, nous avons observé une enceinte à vapeur de formol
et d'ammoniac, servant à la désinfection des couveuses et des respirateurs, le rôle de
l'ammoniac étant de diminuer la toxicité des vapeurs. 
L'oxyde d'éthylène est utilisé dans l'industrie pour la désinfection de certains matériels en
plastique à usage unique. Dans les centres hospitaliers, une enceinte est réservée à ce
type de désinfection pour le matériel d'intubation par exemple, qui ne supporte pas
l'échauffement. Ce matériel, acheté stérile passe une seule fois dans l'enceinte à oxyde
d'éthylène, pour une deuxième utilisation, puis il est détruit.
IL FAUT :
- Port d'une blouse en coton, fermée.

- Travail dans la zone de stérilité du bec Bunsen.

- Flambage rapide des orifices des tubes à cultures et du matériel de prélèvement et

d'ensemencement.

- Immersion de toutes les lames et petit matériel dans l'eau de Javel.

- Nettoyage rigoureux des mains avant et après la séance.

- Nettoyage des paillasses et du matériel éventuellement contaminé.

- Lavage à ébullition des blouses contaminées.

- Au niveau du laboratoire, les boîtes de Pétri et tubes de culture usagés seront entièrement
immergés dans de l'eau de Javel pendant 24 h. Les boîtes en plastique seront ensuite
incinérées.

- La verrerie et tout le matériel supportant la chaleur seront soigneusement lavés puis

stérilisés dans une étuve à chaleur sèche (180°C pendant 30 à 45 minutes) ou un autoclave
(120°C pendant 20 à 30 minutes).  
I. Les types de milieux de culture :
1- Les milieux en boites :
- Milieu Chapman : Le milieu de Chapman est un milieu sélectif, surtout utilisé en microbiologie
médicale, permettant la croissance des germes halophiles. Parmi ces germes figurent au premier
rang les bactéries du genre Staphylococcus, mais aussi les Micrococcus, les Enterococcus,
les Bacillus, et de rares bactéries à Gram négatif.
Caractères recherchés : On peut étudier la fermentation du mannitol par virage au jaune de l’indicateur
coloré, le rouge de phénol, autour des colonies.
Résultats : Les colonies mannitol + sont entourées d’une auréole jaune.
Ne pas confondre la pigmentation des colonies et le virage de l’indicateur coloré.
Ainsi des colonies pigmentées en jaunes et mannitol + :  forte suspicion de S. aureus

Aspect du milieu avant utilisation Aspect du milieu après utilisation

- Milieu Hektoen  :   La gélose Hektoen est un milieu d'isolement des Salmonelles et des Shigelles, bien que
de nombreuses bactéries à Gram négatif puissent se développer sur ce milieu. L'identification
d'entérobactéries pathogènes repose sur la non utilisation des glucides présents dans le milieu.
Caractères recherchés : trois types de glucides : la salicine (qui est un hétéroside), le saccharose et le
lactose. La production d'H2S à partir de thiosulfate
Résultats Colonies saumon : Escherichia, Levinea, Citrobacter diversus, Klebsiella, Enterobacter, Serratia,
Yersinia Colonies saumon à centre noir : Citrobacter freundii, Proteus vulgaris,
Colonies bleu-vert à centre noir : Suspicion de Salmonella, à différencier de Proteus mirabilis
Colonies bleu-vert ou vertes : Suspicion de Shigella ou de Salmonella

Aspect du milieu avant utilisation Aspect du milieu après utilisation

Gélose SS : Gélose Salmonella-Shigella, milieu sélectif permettant l’isolement d'entérobactéries pathogènes.
Il est très utilisé pour la recherche de Salmonella dans les selles et les denrées alimentaires peu pour
les Shigella car trop sélectif.
Caractères recherchés : Le milieu contient du lactose pouvant être fermenté.
Le milieu contient du thiosulfate pouvant donner du H2S
Résultats : colonies rouges : lactose +
colonies incolores : lactose–
colonies à centre noir : H2S +

Aspect du milieu avant utilisation Aspect du milieu après utilisation

Milieu EMB Milieu Eosine Bleu de Méthylène. Milieu d'isolement des bacilles Gram -. Il est très utilisé pour
l’isolement des coliformes.
Caractères recherchés : Le milieu contient un critère de différenciation, le lactose
Résultats : colonies violettes : semi-bombées de 2 à 3mm de diamètre avec éclat métallique, centre sombre :
E. coli  très bombées muqueuses de diamètre 5 mm centra gris marron sans reflet Klebsiella
colonies grisâtres :
- 1 à 2 mm de diamètre transparentes, grises ambrées : Salmonella, Shigella.
- 2 mm de diamètre, grisâtres avec une pellicule autour de la colonie : Proteus morganii
punctiformes et grisâtres : Enterococcus.

Aspect du milieu avant utilisation Aspect du milieu après utilisation

- Milieu Mac Conkey : Milieu sélectif pour l'isolement des bacilles Gram - Salmonella et Shigella ainsi que
des bactéries coliformes dans les eaux, les produits alimentaires, les produits pharmaceutiques et biologiques.
Caractères recherchés : le lactose dont l’utilisation est révélée par l’indicateur coloré du milieu, le
rouge neutre.
Résultats : colonies rouges entourées d’un halo opaque de la même couleur du à la précipitation des sels
biliaires: lactose+
colonies jaunes ou incolores : lactose-

Aspect du milieu avant utilisation Aspect du milieu après utilisation

-  Gélose Sabouraud : La gélose de Sabouraud constitue un milieu classique pour la culture, l'isolement et
l'identification des levures et des moisissures saprophytes ou pathogènes.
Elle est recommandée essentiellement pour l'isolement des moisissures dans les prélèvements peu chargés en bactéries,
les contrôles de stérilité des produits pharmaceutiques, cosmétiques ou alimentaires, la culture des moisissures en vue de
réaliser leur identification.
Dans le cas de prélèvements fortement contaminés, il est préférable d'utiliser la gélose Sabouraud + chloramphénicol .

Aspect du milieu avant utilisation Aspect du milieu après utilisation

- Milieu BCP  :  C’est un milieu utilisé pour la détection et l’isolement des entérobacteriacées dans l’eau, les
produits alimentaires, l’urine et les sels .Ce milieu facilite la différenciation des colonies par le caractère
lactose. Il inhibe l’envahissement de la surface de la boite par des nappes de Proteus car il ne contient pas
d'électrolytes.
C’est un milieu non sélectif qui est utilisé pour l’isolement de nombreuses espèces n’appartenant pas aux
entérobactéries. C’est un milieu contenant une base nutritive ordinaire permettant la pousse des bactéries
non exigeantes. Il contient un critère de différenciation : la fermentation du lactose révélée par le virage en
milieu acide de l’indicateur coloré de pH, le bromocrésol pourpre. Il est déficient en électrolytes : absence
d'ions minéraux.

Aspect du milieu avant utilisation Aspect du milieu après utilisation

- Milieu Baird Parker  : Recherche et dénombrement de Staphylococcus aureus
Ce milieu contient une base nutritive riche.
Il contient des accélérateurs de la croissance : le pyruvate de sodium et le glycocolle

Aspect du milieu avant utilisation Aspect du milieu après utilisation

Autres milieux :

-   Gélose au sang
- Milieu Slanetz
-  Milieu Cétrimide
- Gélose Sabouraud plus  chloramphénicol
- Gélose CIN
- Gélose au lait
- Gélose à l’amidon
- Gélose à l’œuf
- Gélose TSN
- Gélose Drigalski
- Gélose à l’ADN
- Gélose TCBS
- Gélose lactosée au désoxycholate 0.1%
- Milieu Muller Hinton
- Gélose nutritive ordinaire
- Milieu Todd Hewit
- Milieu TTC tergitol
- Gélose au sang cuit
- Gélose  Mossel
 2 - Les milieux en tubes :

Milieu Caractéristiques

- Milieu Hajna-Kligler Le milieu de Hajna-Kligler est un milieu complexe, qui permet la recherche de
plusieurs caractères biochimiques. Il est très utilisé dans l'identification
des Enterobacteriaceae.

- Milieu Lysine Fer   Ce milieu peut être utilisé en routine  mais il est généralement utilisé pour
l’identification des souche de Salmonella.

          
- Milieu citrate de   Ce milieu est un exemple de milieu synthétique, c'est à dire de milieu dont la
Simmons composition, qui est complexe, est connue exactement tant qualitativement que
quantitativement

- Milieu phénylalanine Milieu utilisé pour la recherche de la phénylalanine désaminase. Le phénylpyruvate

donne une teinte verte en présence de fer III.

- Milieu Clark et Lubs   Ce milieu permet l’étude de la voie de fermentation du glucose.

- Milieu viande-foie
 L'étude du type respiratoire d'une bactérie (c'est à dire ses rapports avec l'O 2)
nécessite un milieu de culture riche contenant un gradient de pression partielle en
di-oxygène.

  - Milieu Hugh et Leifson

De l'étude du métabolisme énergétique il découle que un glucide peut être
catabolisé par voie respiratoire ou par voie fermentative. Le milieu de Hugh et
Leifson permet de distinguer entre les deux processus.
La dégradation d'un glucide s'accompagne généralement d'une acidification du
milieu :
- lors des respirations le glucide est oxydé en CO 2, par le dioxygène (ou un autre
oxydant minéral);
- Lors des fermentations le glucide est oxydé en acides, alcools, qui sont libérés
dans le milieu qu'ils acidifient sensiblement. Toutes les voies fermentaires ne sont
cependant pas également acidifiantes.