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1. OBJETIVO
Detectar la presencia de Campylobacter jejuni en hamburguesa de pollo mediante técnica de
PCR.

2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE

Aplicar este procedimiento a muestras de hamburguesa de pollo sospechosa de estar
contaminadas con Campylobacter.

3. FUNDAMENTO
Los métodos de cultivo tradicionales para identificación de C. jejuni son lentos y tediosos, ya
que requieren de aproximadamente 5 días para el aislamiento y caracterización del
microorganismo.
Por otra parte la diferenciación de C. jejuni de otros microorganismos del mismo género basada
en la prueba de hidrólisis del hipurato no siempre permite definir con precisión la identificación,
ya que se ha descrito la existencia de cepas de C. jejuni con ausencia de la enzima hipuricasa. A
partir de la dificultad de los test fenotípicos para la caracterización a nivel de especie de
Campylobacter y el bajo espectro de pruebas bioquímicas, se han desarrollado varios ensayos
basados en biología molecular para la identificación específica de este microorganismo
La reacción especifica de PCR para amplificación específica de C. jejuni fue desarrollada con el
uso de primers según la secuencia nucleotídica de sondas monoespecíficas basadas en el gen
altamente conservado gly A (que codifica una serinahidroximetiltransferasa).

4. REFERENCIAS
4.1 Manual de Procedimientos para el Diagnóstico y Caracterización de Campylobacter spp.
Difundido a través del IV Curso Avanzado de WHO Global Salmonella Survillance 2006,
realizado en el Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS “Dr. Carlos
Malbrán” Servicio de Bacteriología Sanitaria Departamento de Bacteriología.
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5. TERMINOLOGÍA
5.1 ATCC = American Type Culture Collection
5.2 dNTPs = Desoxirribonucleótidos (adenina, timina, citosina, guanina)
5.3 MgCl2 = Cloruro de magnesio
5.4 PCR = Reacción en cadena de la polimerasa
5.5 BSA = Serum Albumina Bovine
5.6 pb = pares de base
5.7 TAE= Tris-Acetato-EDTA

6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1 Materiales
6.1.1 Materiales de uso común en microbiología (pipetas de vidrio, placas de Petri, asa de
inoculación, etc.)

6.2 Reactivos y medios

6.2.1 Suero fisiológico en porciones de 250 mL
6.2.2 Cepa de Campylobacyter jejuni ATCC 33291
6.2.3 Set de partidores específicos
Jun F : 5’CAT CTT CCC TAG TCA AGC CT 3’
Jun R : 5’ AAG ATA TGG CAC TAG CAA GAC 3’
6.2.4 Reactivos de uso común en PCR tradicional (dNTPs, Mg Cl2, Taq DNA polimerasa,
agua calidad biología molecular, micropuntas, microtubos, micropipetas)
6.2.5 Caldo Bolton sin sangre, con suplemento FBP y antibióticos.
6.2.6 Suplemento FBP (Oxoid SR0232E)
6.2.7 Suplemento Skirrow (Oxoid SR0069E)
6.2.8 Suplemento Bolton (Oxoid SR 0183E)
6.2.9 Suplemento Preston (Oxoid)
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6.2.10 Caldo Preston sin sangre, con suplemento FBP y antibióticos

6.2.11 BSA 0,02%
6.2.12 Estándar de peso molecular de100 pares de base (pb)
6.2.13 Agarosa calidad biología molecular
6.2.14 Buffer TAE 1X
6.2.15 Agua calidad biología molecular
6.2.16 Solución de bromuro de etidio (1µ/mL)

6.3 EQUIPOS
6.3.1 Incubadora regulada a 42ºC ± 1ºC
6.3.2 Termociclador
6.3.3 Cámara de electroforesis
6.3.4 Fuente e poder
6.3.5 Microcentrífuga (10.000 x g.)
6.3.6 Digitalizador de imágenes
6.3.7 Congelador -20ºC

7. DESARROLLO
7.1 Preparación de la muestra, PCR en hamburguesa de pollo
7.1.1 Pesar 25 gramos de muestra de hamburguesa de pollo y agregar 250 mL de suero
fisiológico estéril. Agitar por 1 minuto y luego dejar en reposo por 15 a 20 minutos.
7.1.2 Tomar 2 mL del sobrenadante de la solución de lavado del alimento y agregar a 18 mL
de caldo Bolton con suplemento FBP y antibióticos.
7.1.3 Incubar a 42 ± 1 ºC por 18 ± 2 horas en microaerofilia.
7.1.4 Después de la incubación se toma 1mL del cultivo y se centrifuga a 10.000 x g durante
10 minutos.
7.1.5 Luego descartar el sobrenadante.
7.1.6 Resuspender el pellet en 1 mL de suero fisiológico y centrifugar nuevamente a 10000 x
g durante 10 minutos.
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7.1.7 Descartar el sobrenadante.

7.1.8 Resuspender el pellet en 100 uL de agua calidad molecular.
7.1.9 Llevar la suspensión por 10 minutos a 100ºC, y luego mantenerla a 4ºC para utilizarla
como templado.
7.1.10 Realizar la mezcla de PCR, según el siguiente esquema:

Reactivos Volumen (µl) Concentración

Templado 5
Agua PCR 5,75
Buffer 10 X 2,5 1X
MgCl2 50 mM 1 2,0 mM
BSA 1% 0,5 0,02g%
dNTP(mezcla) 2 0,2 mM
Jun F 2,5 1 µM
Jun R 2,5 1 µM
Taq polimerasa 0,25 1,25 U
Volumen final 25

7.1.11 Llevar los tubos al termociclador y someter al siguiente programa:

Una etapa inicial de desnaturalización de 5 minutos a 94ºC,
2 ciclos de 1 minto a 94ºC, 1 minuto a 64 ºC, 1 minuto a 72ºC,
2 ciclos de 1 minto a 94ºC, 1 minuto a 62 ºC, 1 minuto a 72ºC,
2 ciclos de 1 minto a 94ºC, 1 minuto a 60 ºC, 1 minuto a 72ºC,
2 ciclos de 1 minto a 94ºC, 1 minuto a 58 ºC, 1 minuto a 72ºC,
2 ciclos de 1 minto a 94ºC, 1 minuto a 56 ºC, 1 minuto a 72ºC,
Seguido de 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 54ºC, 1 minuto a 72ºC, y una
extensión final de 10 minutos a 72ºC. Al final mantener a 4ºC.

7.1.12 Observar los productos de la reacción de PCR en un gel de agarosa al 2%, corrido a 100
V durante 40 minutos, usando como buffer de corrida TAE 1X y marcador de peso
molecular de 100 pares de base. El tamaño de fragmento esperado es de 773 pb C.
jejuni. La tinción del gel se realiza con bromuro de etidio (1ug/mL), durante 30
minutos y luego se visualiza bajo una fuente de luz U.V.
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7.2 PCR desde cepa aislada

7.2.1 Tomar una asada de cepa desarrollada en agar sangre a 42ºC durante 24 horas en
condiciones de microaerofilia y colocarla en un tubo que contenga 1 mL de suero
fisiológico, agitar en Vortex.
7.2.2 Centrifugar a 12.000 x g durante 5 a 8 minutos. Descartar el sobrenadante y
resuspender. El pellet en 200 uL de agua calidad molecular.
7.2.3 Colocar la suspensión a 100 ºC por 10 minutos, luego colocarla a -20ºC hasta su
utilización como templado.
7.2.4 Realizar la reacción de PCR y la visualización de productos de amplificación de la
misma forma descrita en 7.1.7 a 7.1.9

8. REGISTROS

Identificación Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo retención

del registro y disposición
Registro de Archivador Azul, Libre acceso papel 5 años y disponer
identificación de C. ”Registro de lectura de personal de en la basura
jejuni RG-712.00- informe de resultado” microbiología picado en trozos
105 Laboratorio 348 de alimentos

9. TABLA DE MODIFICACIONES

Revisión Nº Pág. Motivo del cambio Fecha Aprobación

Modificada

10. ANEXOS
10.1 Registro de identificación de C. jejuni, RG-712.00-105