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THÈSE

En vue de l'obtention du

DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE


Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier
Discipline ou spécialité : Sciences et génie des matériaux

Présentée et soutenue par Hélène AUTEFAGE


Le 20 Juillet 2009

Titre : RÔLE OSTEOINDUCTEUR D’UN REVÊTEMENT D’APATITE CARBONATÉE


NANOCRISTALLINE SUR DES CÉRAMIQUES DE PHOSPHATE DE CALCIUM
BIPHASIQUE

JURY
Dr. J. AMÉDÉE Rapporteur
Pr. M. P. GINEBRA Rapporteur
Pr. M. GOLDBERG Examinateur
Pr. P. BONNEVIALLE Examinateur
Pr. C. REY Directeur de thèse
Pr. P. SWIDER Co-directeur de thèse
Dr. S. GONÇALVÈS Membre invité
Dr. F. BRIAND-MÉSANGE Membre invité

Ecole doctorale : Sciences de la Matière


Unité de recherche : CIRIMAT, INP-UPS-UMR CNRS 5085
Laboratoire de Biomécanique EA3697
Directeur(s) de Thèse : Pr. Christian Rey et Pr. Pascal Swider
Rapporteurs : Dr. Joëlle Amédée et Pr. Maria Pau Ginebra
« L’esprit d’équipe ? C’est des mecs
qui sont une équipe, ils ont un esprit !
Alors, ils partagent ! »
Michel Colucci, dit Coluche

A ma famille,

A mon amour,

A mes amis…
Remerciements
Cette thèse est le fruit d’une collaboration entre cinq laboratoires académiques, membres du
groupe de travail « Biomatériaux, os et dents » de l’Université Paul Sabatier créé en 2004 :

• Le laboratoire « Phosphates, Pharmacotechnie et Biomatériaux », anciennement


« laboratoire de physico-chimie des phosphates », du Centre Interuniversitaire de
Recherche et d’Ingénierie des Matériaux à l’Université de Toulouse, dirigé par le Pr
Christian Rey puis le Dr Christèle Combes.

• Le laboratoire de Biomécanique, EA 3697, de l’Université de Toulouse, dirigé par le Pr


Pascal Swider.

• L’équipe du Pr Jean-Pierre Salles et du Dr Patrick Raynal du département


« Lipoprotéines et Médiateurs Lipidiques » de l’unité U563 de l’Institut National de la
Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM), au Centre de Physiopathologie de
Toulouse Purpan, dirigé par le Pr Bertrand Perret.

• Le service de chirurgie des animaux de compagnie de l’Ecole Nationale Vétérinaire de


Toulouse, dirigé par le Pr André Autefage.

• Le département d’anatomie et cytologie pathologique de l’hôpital de Rangueil à


Toulouse, dirigé par le Pr Marie-Bernadette Delisle.

J’ai donc à cette occasion eu le plaisir de travailler aux côtés de nombreuses personnes. Mais
avant de m’engager dans le vif du sujet et de vous remercier, vous qui m’avez aidée tout au
long de ce projet, je voudrais commencer par exprimer ma reconnaissance aux membres de
mon jury de thèse qui ont accepté d’évaluer mon travail :
- le Professeur Michel Goldberg, du laboratoire sur la réparation et les remodelages
orofaciaux de l’Université René Descartes - Paris V, qui m’a fait l’honneur de présider
mon jury de thèse.
- Mes deux rapporteurs : le Docteur Joëlle Amédée, directrice de l’unité 577
« Biomatériaux et réparation tissulaire » de l’INSERM de Bordeaux et le Professeur
Maria-Pau Ginebra, du département « Materials Science and Metallurgical Engineering »
de l’Universitat Politècnica de Catalunya de Barcelone, pour l’intérêt qu’elles ont porté à
ce travail et les suggestions apportées.
- le Pr Paul Bonnevialle, du service de chirurgie orthopédique et traumatologique de
l’hôpital Purpan à Toulouse, qui sait ponctuer ses questions d’une touche d’humour très
agréable.
Vous avez rendu ma soutenance très intéressante par vos questions et remarques pertinentes
et je suis ravie de vous avoir rencontrés à cette occasion.

Je tiens ensuite à exprimer ma gratitude à ceux qui ont fait que ce projet a pu voir le jour en
s’engageant dans cette collaboration, c'est-à-dire les directeurs des équipes impliquées, le Pr
Christian Rey, le Pr Pascal Swider, le Pr Jean-Pierre Salles, le Pr André Autefage et le Pr
Marie-Bernadette Delisle. Je vous remercie pour votre accueil chaleureux dans vos
laboratoires et je souhaite que cette expérience vous ait été profitable et que cela vous
encourage à entretenir de tels partenariats dans le futur.

J’adresse ensuite mes plus sincères compliments à ceux qui ont fait vivre ce projet et m’ont
encadrée tout au long de ce travail : mes directeurs de thèse bien sûr, le Pr Christian Rey et le
Pr Pascal Swider mais aussi le Dr Fabienne Briand-Mésange, le Dr Didier Mathon et le Dr
Anne Gomez-Brouchet. Vous avez été au cœur de ce projet, travaillant ensemble à son
développement et sa réalisation, vous investissant pleinement aussi bien dans les tâches
administratives que scientifiques. Vous m’avez guidée, soutenue, transmis une part de vos
connaissances et vous m’avez fait confiance pour mener ce projet à bien. Ce fût un réel plaisir
de travailler à vos côtés et d’apprendre à votre contact. Pour tout cela, MERCI.
Plus spécifiquement,…
Christian, vous êtes un puits (sans fond) de connaissances, un grand « maître » des phosphates
de calcium. Merci pour tout le temps que vous m’avez accordé, votre gentillesse et nos
discussions toujours passionnantes.
Pascal, vous avez été un moteur dans la réalisation de ce projet. Vous m’avez aidé à avancer
étape par étape, en gardant le cap pour atteindre les objectifs fixés. J’admire l’énergie et la
détermination dont vous avez fait preuve pour que ce travail puisse aboutir et je souhaite qu’il
s’agisse d’un investissement à long terme qui continuera à porter ses fruits.
Fabienne, tu as vraiment été là pour moi à tous les niveaux. Ton écoute et tes conseils ont été
des atouts précieux. Je reste encore maintenant impressionnée par tes compétences
scientifiques et tes qualités humaines. Je te souhaite beaucoup de bonheur et de réussite aussi
bien dans tes projets professionnels que dans ta vie personnelle.
Anne, ton regard de lynx a été déterminant dans ce projet. Je te remercie d’avoir partagé avec
moi ton expertise et ton temps souvent compté.
Didier, aux doigts de fée, aussi à l’aise avec une perceuse qu’avec du fil et une aiguille. J’ai
vraiment apprécié de pouvoir participer (de loin) aux expérimentations et te voir à l’œuvre.
Du grand art ! Merci pour ton implication.

Ce projet a, en outre, été réalisé en partenariat avec l’entreprise Teknimed S.A. à l’Union,
dirigée par Mr Léonard. Je remercie donc Mr Léonard, le Dr Benoît Donazon et le Dr
Stéphane Gonçalvès pour l’intérêt qu’ils ont porté à notre projet ainsi que pour les moyens
financiers et techniques qu’ils ont mis à notre disposition. Merci en particulier à Stéphane qui
a géré la collaboration avec entrain et réactivité et a accepté de participer à mon jury de thèse
en tant qu’invité.

Je remercie, d’autre part, la présidence de l’Université Paul Sabatier pour nous avoir octroyé
une bourse ministérielle et la région Midi-Pyrénées pour le financement qu’elle nous a
accordé. C’est la combinaison de ces différents facteurs qui a permis la réalisation de ce projet
ambitieux.
Mais comme même bien encadrée, on ne peut tout faire seul, il reste encore beaucoup de
personnes qui ont joué un rôle majeur dans ce travail :
- Le Dr Christèle Combes, avec son rire sincère et chaleureux, le Dr Sophie Cazalbou,
toujours pleine d’énergie, et le Dr Christophe Drouet et sa gourmandise légendaire. Merci
d’avoir été présents à mes côtés tout au long de mon parcours et encore maintenant.
- Sandrine Cavalié, pour accomplir tes missions parfois périlleuses (comme l’achat d’un
équipement commun, par exemple), tu as à ta disposition ta bonne humeur, ta vitalité et ta
patience. Accompagnée de Mme Chamayou, tu as été mon fil d’Ariane dans ces
méandres administratifs. Pour cela et pour le reste, nous te devons tous un GRAND
MERCI.
- Cédric Charvillat et Olivier Marsan, qui m’ont si spontanément proposé leur aide. Cédric,
merci pour ces moments passés dans et en dehors du labo, j’espère que nous pourrons
continuer à mieux nous connaître, avec ou sans Mona… Olivier reste passionné et
enthousiaste, c’est un vrai bonheur !
- Dominique Bonsirven, la resplendissante Domi. S’il te plaît, fais-nous partager ton secret.
- Le Dr Jérôme Briot, le maître incontesté de MATLAB® et un allié de poids pour le labo.
Merci pour ton aide, tes conseils et nos longues discussions politico-scientifiques ou
scientifiques tout court.
- Le Pr Jean-Jacques Railhac et le Pr Nicolas Sans du service de radiologie et imagerie
médicale de l’hôpital Purpan à Toulouse pour le prêt de la tablette graphique, qui fût fort
utile, et les radiographies effectuées.
- Le Dr Nicolas Bonnevialle, parfois pressé mais toujours souriant. Ravie d’avoir pu
collaborer un temps avec toi.
- Le Dr Jean-Michel Lafosse, Monsieur Efficacité. Ce fût bref mais tu m’as rendu un très
grand service. Pour cela et pour tes encouragements, je te remercie.
- Le Dr Sophie Palièrne, avec son dynamisme hors-norme. Nul doute que nos petites brebis
ont été bien chouchoutées grâce à toi.
- Joëlle Ribaut, qui répond toujours rapidement. Désolée pour les appels réguliers qui ne te
sont pas destinés.
- Gisèle Viguier et Marie Cortèse. Un grand MERCI à vous, d’abord pour ne pas avoir fuit
en me voyant arriver les bras chargés de « cadeaux » et ensuite bien sûr pour tout le
travail que vous avez accompli en gardant le sourire.

Beaucoup d’autres personnes ont croisé ma route, partagé mon chemin. Je pense à mes amis
et collègues qui ont été là pour moi et avec lesquels j’ai passé une multitude de bons
moments :
Mona, mon amie, ton enthousiasme, ta générosité, ta « folie », nous rendent tous meilleurs. Tu
me manques, Pup you et Te iubesc ! Solène, qui associe bonne humeur et prévenance avec un
soupçon de coups de gueule pour l’obtention d’un mélange détonnant ; Jean-Phi, mon
sauveur, toujours plein de bonnes idées ; Françoise, merci pour ta bienveillance, je te souhaite
toute la réussite du monde dans tes projets, tu le mérites ; la Belle Imane et le très convivial
Farid, plein de réussite et de bonheur à vous deux ; Amhed, no stress, tu gères ; Sabrina,
toutes mes félicitation pour ta petite Annabelle ; David, le nouveau gourmand de l’équipe ;
Gérard et son calme impressionnant ; Stéphanie, en temps partiel sur Toulouse ; Hélène et
Sophie qui ont toujours le sourire ; Caroline, avec qui je peux parler « bio » ; Albert, avec ses
idées parfois étonnantes ; Jean-Louis que l’on entend de loin et Michèle pleine de tendresse ;
mais aussi, Patricia, Fabien, Audrey, Anne-Marie, Véronique, Fernand, Hakim, Ingrid, Fred,
Amal, Laeticia, Christos, Jaime, Djar, Yann….
…. Mes copines du vaisseau U563. Et les filles, vous savez pas quoi ?... J’ai « adoooré »
passer du temps en votre compagnie ! Anne, petite padawan, (petite mais solide). Merci pour
ton écoute et ton soutien, qui m’ont très souvent été utiles. J’espère que nous pourrons
continuer nos interminables discussions (en direct ou de loin) encore très longtemps.
Marianne, avec ta fraicheur et ta joie communicative, tu es une personne exceptionnelle à
connaître absolument. Armelle, scientifique, conseillère perso, bricoleuse, pro de la retouche
de photos et des gâteaux, je me demande vraiment ce que tu ne sais pas faire. A toi aussi
merci et bon courage. La douce et glamour Audrey, je te souhaite plein de larmes de joies
pour cette année et toutes celles à venir. L’attachante et plutôt bavarde Marie, j’aurais
vraiment aimé mieux te connaître ; Véro, si tu montes un club « gourmandise », j’adhère tout
de suite ; Camille, ta joyeuse excentricité nous manque ; Pierre, tu n’es pas une fille, mais
admets-le, sur un malentendu, on peut se tromper…Je pense aussi bien sûr à Dénis, avec qui
on se comprend trop bien sur certains points, bon courage ; la « timide » Aurélie ; Claudia
avec son rythme et son accent délicieux ; Sara et son emploi du temps millimétré ; l’avenante
Alex ; la toujours superbe Stéphanie ; Thomas et sa bobo attitude ; Emmanuelle qui
m’autorise à piquer des bonbons ; Françoise qui déborde d’énergie et de gaité ; Greg, le ventre
sans fond ; Guillaume, le blagueur ; Jean-Philippe avec son maxi pot de Nutell…, (« chut chut
pas de marque ») ; Clo et Christine P qui savent se faire entendre mais n’oublient jamais
d’être attentives aux autres ; Nicole et son organisation hors-pair ; Yvette, toujours prête à
rendre service, surtout entre midi et deux ; Christine C à qui je souhaite plein de bonnes
choses pour la suite ; Isabelle, discrète et attentionnée ; sans oublier bien entendu, Patrick,
Muriel, Valérie, Nathalia, Justine, Véro, Séverine, Sophie, Ronan, Coco, Xénia, Stéphane,
Gérald, Bertrand, Xavier, Elvire, Emmanuel, Laurent, Michel, François, Jean-Luc, Michel…
je vous souhaite à vous tous bonne chance pour le futur….

… Eric, Gaëtan, Georges, Fabien… qui sont toujours très accueillants bien qu’ils parlent une
r
∂φ ( r , t ) r r
autre langue ( = ∇.( D (φ , r )∇φ ( r , t )) )….
∂t

…Les vétos, dont notamment Eric avec son sens de l’humour et ses spécialités niçoises,
Patricia qui m’a évité les points à vifs, Iban le spécialiste du plaquage de brebis…

Je voudrais, d’autre part, exprimer ma reconnaissance à mes anciens mentors qui m’ont
encouragée dans cette voie, Claude, Thierry et Nathalie ; à mes yeux ce sont vos qualités
humaines qui font la différence.

Je souhaite enfin faire de gros bisous à ceux que j’aime…


A ma maman et mon papa, qui m’ont tant soutenue tout au long de ces années. Pour les
efforts que vous avez faits pour nous et l’amour que vous nous témoignez tous les jours, les
mots que j’écrirai ne pourront pas suffire pour vous exprimer ma gratitude. Alors ma douce
maman et mon gentil papa, que j’ai embêté plus d’une fois le we, je vous dis simplement, je
vous aime !
A Julien, mon âme-sœur. Nul besoin de mots pour se comprendre et heureusement, car il n’en
existe pas d’assez fort... T’aim.
A mon grand frère, Xavier, toujours là pour moi, plein de prévenance et d’humour. Je te
souhaite un bel avenir avec Véro sur Toulouse (de préférence) ou ailleurs.
A Fabien et Ciloune, qui occupent depuis toujours une grande place dans mon cœur.
A Chantal, Josie, Jojo, Daniel, Francis, Martine, Francette, Christian, Christiane, Vaness,
Philippe, Olive et Delphine, Mélanie, Patrice, Olivier et tous les petits bouts de choux qui
vous ressemblent et font notre bonheur.
A Maïté, Michel, Billy, Seb, Adi et Lilou qui m’ont accueillie avec amour dès le début et qui
continuent à m’encourager.
A celles et ceux qui ne sont plus là, mais que je garde très profondément dans mon cœur.

Et pour finir à mes amis IRL, de longue date ou en devenir :


Marine, Sarah, Marina, ma Jojo, Alex, Micka, Yaya, Christophe, Constance, Stéphanie,
Claudine, Hyo Young, Chach, Sandra, Audrey, Axel, Cindy, Agnes, Greg, Yoann, Trévor,
Ailyc, Sylvain,…
…. Non, je vous le répète une dernière fois : « Je ne fais pas de schtroumpf-moutons » !

Je pense aussi à toi qui as lu mes remerciements dans leur ensemble. Tu me sembles être
quelqu’un de courageux ; tu peux donc, dès à présent, t’attaquer à la lecture du reste de mon
manuscrit….
RÔLE OSTEOINDUCTEUR D’UN REVÊTEMENT D’APATITE
CARBONATÉE NANOCRISTALLINE SUR DES CÉRAMIQUES
DE PHOSPHATE DE CALCIUM BIPHASIQUE

Résumé
Les céramiques commerciales à base de phosphate de calcium frittées à haute température
présentent une très faible surface spécifique et sont peu réactives. Bien qu'elles possèdent une
excellente ostéoconductivité, leur capacité d'ostéoinduction est très limitée.
L'hypothèse centrale de ce travail a consisté à supposer qu'un revêtement d'apatite carbonatée
nanocristalline pouvait améliorer les propriétés de surface et biologiques de ces céramiques.
Les analyses physico-chimiques ont montré qu'un revêtement composé de nanocristaux
présentant des caractéristiques proches de celles du minéral osseux conduisait à une
augmentation sensible de la surface spécifique et à la formation de nanopores, à priori
favorables à une amélioration de l'activité biologique. Cette amélioration a été établie par
l’étude de l’adsorption d’un facteur de croissance ostéogénique, la rhBMP-2. La quantité de
BMP-2 adsorbée a été sensiblement augmentée et le revêtement a de plus permis une
libération temporellement soutenue. La biocompatibilité des échantillons revêtus a été ensuite
évaluée in vitro par l’étude du comportement de deux types cellulaires. Une étude in vivo a été
menée sur modèle animal ovin en site intramusculaire afin d'évaluer le potentiel
ostéoinducteur des céramiques phosphocalciques. La proportion d’os néoformé dans ce site
ectopique, est apparue significativement augmenté par l’association avec la BMP-2 pour des
quantités de protéines réduites, mais également, plus étonnamment, par la seule présence du
revêtement nanocristallin. Ce dernier résultat, particulièrement original, ouvre la voie à des
applications cliniques à court terme dans le domaine des substituts osseux.

Mots clés
Ostéoinduction – Phosphate de calcium – Apatite nanocristalline – Activation de surface –
Bone Morphogenetic Protein
OSTEOINDUCTIVE POTENTIAL OF NANOCRYSTALLINE CARBONATED
APATITE - COATED BIPHASIC CALCIUM PHOSPHATE CERAMICS

Abstract
Commercial calcium phosphate ceramics sintered at high temperature exhibit a very low
specific surface area and a poor surface reactivity. Although they are excellent
osteoconductive materials, their osteoinductive properties appear rather weak. In this work,
we hypothesised that a nanocrystalline carbonated apatite coating could improve the surface
and biological properties of these ceramics. The physico-chemical analyses showed that a
coating made of bone mineral-like nanocrystals increased the specific surface area of the
ceramics and induced the formation of nanopores, which could favor the biological activity.
The adsorption study of an osteogenic growth factor, the rhBMP-2, confirmed the
improvement of surface reactivity. An increased amount of protein was adsorbed and its
release was sustained. The biocompatibility of the coated ceramics was demonstrated in vitro.
The in vivo osteoinductive property of the modified ceramic was studied in intramuscular sites
of an ovine animal model. The modified ceramic, associated with BMP-2 promoted the
formation of bone. Furthermore, interestingly, the nanocrystalline coating itself, without any
addition of BMP-2, was found to be osteoinductive. This last result, particularly innovating,
could lead to clinical applications in the field of bone substitutes.

Key words
Osteoinduction – Calcium phosphate – Nanocrystalline apatite – Surface activation –
Bone Morphogenetic Protein
Abréviations
ALP Phosphatase alcaline
BCP Phosphate de calcium biphasique
BET Brunauer-Emmet-Teller
BMP Bone Morphogenetic Protein (rhBMP : BMP humaine recombinante)
BSA Albumine de sérum bovin
CKO Conditional Knock-out mouse
DBM Demineralized bone matrix
DCPA Phosphate dicalcique anhydre (CaHPO4)
DCPD Phosphate dicalcique dihydraté (CaHPO4, 2H2O)
DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium
DMSO Diméthylsulfoxide
DO Densité optique
DRX Diffraction des rayons X
FGF Fibroblast Growth Factor
FTIR Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier
HA Hydroxyapatite (Ca10(PO4)6(OH)2)
ICP-MS Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometer
JCPDS Fiche Joint committee on powder diffraction standard
KO Knock-out mouse
µCT Microcomputed tomography
MEB Microscopie Electronique à Balayage
MET Microscopie Electronique à Transmission
MSC Cellules Souches Mésenchymateuses (hMSC : MSC humaines)
MTT Bromure de 3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5(-diphényltétrazolium)
NanoAp Revêtement d’apatite nanocristalline 1
NanoAp-EtOH Revêtement d’apatite nanocristalline 2 (Etape additionnelle)
OCP Phosphate octacalcique (Ca8(PO4)4(HPO4), 5H2O)
PBS Phosphate Buffer Saline
PDLLA Poly(D,L-lactide)
PGE2 Prostaglandine E2
PLGA Poly D,L(lactide-co-glycolide)
pI Point Isoélectrique
qRT-PCR Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
RANK Receptor Activator of Nuclear factor κB
Rapport S/L Rapport Solide/Liquide
RMN Résonance magnétique nucléaire
SBF Simulated body fluid
SD Ecart-type à la moyenne
SEM Erreur standard à la moyenne
SVF Sérum de veau fœtal
TCP Phosphate tricalcique (Ca3(PO4)2)
TGF-β Transforming growth Factor-β
TRAP Tartrate-resistant acid phosphatase
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
Table des matières
Table des matières __________________________________________________________ 1

Chapitre 1
Introduction bibliographique générale __________________________________________ 5
1. L’os ________________________________________________________________________ 6
1.1. La matrice extracellulaire ____________________________________________________________ 6
1.1.1. La matrice organique ____________________________________________________________ 6
1.1.2. Le minéral osseux _______________________________________________________________ 7
1.2. Les cellules de l’os et le remodelage osseux ______________________________________________ 8
2. Les matériaux de comblement osseux ___________________________________________ 10
2.1. Les céramiques phosphocalciques_____________________________________________________ 11
2.1.1. L’hydroxyapatite (HA) __________________________________________________________ 11
2.1.2. Le phosphate tricalcique-β (β-TCP) ________________________________________________ 11
2.1.3. Les phosphates de calcium biphasiques (BCP)________________________________________ 12
2.1.4. Les apatites analogues au minéral osseux ____________________________________________ 12
3. Caractéristiques des substituts osseux ___________________________________________ 12
3.1. Biocompatibilité __________________________________________________________________ 12
3.2. Résistance mécanique ______________________________________________________________ 13
3.3. La porosité_______________________________________________________________________ 13
3.4. Biorésorbabilité ___________________________________________________________________ 15
3.5. Bioactivité _______________________________________________________________________ 15
3.6. Ostéoconduction __________________________________________________________________ 17
4. L’ostéoinduction_____________________________________________________________ 18
4.1. L’ostéoinduction par les BMPs _______________________________________________________ 19
4.1.1. Les BMPs ____________________________________________________________________ 20
4.1.1.1. Structure __________________________________________________________________ 20
4.1.1.2. Production par génie génétique ________________________________________________ 21
4.1.1.3. Rôle des BMPs dans l’ostéogenèse _____________________________________________ 21
4.1.2. Association BMPs-matériaux : Efficacité in vivo ______________________________________ 23
4.1.2.1. Influence de la quantité administrée sur la réponse _________________________________ 24
4.1.2.2. Influence du temps de libération _______________________________________________ 25
4.2. L’ostéoinduction induite par les matériaux ______________________________________________ 26
4.2.1. Caractéristiques des matériaux ostéoinducteurs _______________________________________ 26
4.2.2. L’ostéoinduction par les céramiques phosphocalciques _________________________________ 27
4.2.3. Les mécanismes d’action envisagés ________________________________________________ 28
5. Les interactions cellules/biomatériaux ___________________________________________ 29
5.1. Matériaux et ostéoprogéniteurs ou ostéoblastes __________________________________________ 30
5.1.1. Influence de la composition chimique ______________________________________________ 30
5.1.2. Influence de la topographie de surface ______________________________________________ 31
5.1.3. Influence de la taille des cristallites ________________________________________________ 32
5.1.4. Influence de l’énergie de surface __________________________________________________ 33
5.1.5. Les mécanismes d’action possibles ________________________________________________ 33
5.2. Matériaux et ostéoclastes ___________________________________________________________ 34
5.3. Matériaux et cellules immunitaires ____________________________________________________ 34
6. Objectifs de notre étude_______________________________________________________ 35

Chapitre 2
Etude d’un procédé de revêtement de céramiques poreuses par une apatite carbonatée
nanocristalline ____________________________________________________________ 38
1. Introduction bibliographique __________________________________________________ 38

1
1.1. Les caractéristiques du minéral osseux _________________________________________________ 38
1.2. Les analogues de synthèse du minéral osseux____________________________________________ 41
1.2.1. Propriétés des apatites biologiques et de leurs analogues de synthèse : Influence de la couche
hydratée ___________________________________________________________________________41
1.3. Exemples de procédés de revêtements d’apatites à faible température _________________________ 42
2. Objectifs ___________________________________________________________________ 45
3. Matériel et méthodes _________________________________________________________ 46
3.1. Matériaux _______________________________________________________________________ 46
3.2. Caractérisation des nanocristaux______________________________________________________ 47
3.2.1. Diffraction des Rayons X ______________________________________________________ 47
3.2.2. La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier __________________________________ 47
3.2.3. Dosage du calcium, du phosphore et du sodium_______________________________________ 48
3.2.4. Dosage des carbonates __________________________________________________________ 49
3.2.5. Microscopie Electronique à Transmission ___________________________________________ 49
3.3. Caractérisation des granulés _________________________________________________________ 50
3.3.1. Microscopie Electronique à Balayage_______________________________________________ 50
3.3.2. Mesure de la surface spécifique ___________________________________________________ 50
3.3.3. Mesure de la porosité ___________________________________________________________ 51
3.3.4. Echange ionique : Strontium______________________________________________________ 51
4. Résultats ___________________________________________________________________ 51
4.1. Caractérisation des nanocristaux______________________________________________________ 52
4.2. Caractérisation des granulés _________________________________________________________ 56
4.2.1. Morphologie des granulés revêtus _________________________________________________ 56
4.2.2. Surface spécifique______________________________________________________________ 57
4.2.3. Porosité ______________________________________________________________________ 58
4.2.4. Echange ionique avec le strontium _________________________________________________ 59
5. Discussion __________________________________________________________________ 60
5.1. Procédé de revêtement _____________________________________________________________ 60
5.2. Morphologie du revêtement _________________________________________________________ 61
5.3. Caractéristiques des nanocristaux _____________________________________________________ 62
5.4. Comparaison des granulés revêtus ____________________________________________________ 63
5.4.1. Surface spécifique______________________________________________________________ 63
5.4.2. Porosité ______________________________________________________________________ 64
5.4.3. Echange avec le strontium _______________________________________________________ 65
6. Conclusion et perspectives_____________________________________________________ 66

Chapitre 3
Etude de l’adsorption et de la libération de la rhBMP-2 sur les céramiques de BCP revêtues
d’un dépôt d’apatite carbonatée nanocristalline__________________________________ 68
1. Introduction bibliographique __________________________________________________ 68
1.1. Adsorption de protéines sur l’hydroxyapatite ____________________________________________ 68
1.2. Adsorption de protéines acides _______________________________________________________ 69
1.3. Adsorption de la BMP-2 ____________________________________________________________ 69
1.4. Paramètres influençant l’adsorption de protéines sur les Ca-P _______________________________ 70
1.4.1. Conditions d’adsorption _________________________________________________________ 71
1.4.2. Influence des caractéristiques de l’adsorbant _________________________________________ 72
1.5. La libération _____________________________________________________________________ 74
2. Objectifs de l’étude __________________________________________________________ 75
3. Matériel et méthodes _________________________________________________________ 76
3.1. Réactifs _________________________________________________________________________ 76
3.1.1. Adsorbant ____________________________________________________________________ 76
3.1.2. Adsorbat : La rhBMP-2 non-glycosylée _____________________________________________ 76
3.2. Adsorption de la rhBMP-2 __________________________________________________________ 76
3.2.1. Marquage de la BMP-2__________________________________________________________ 77

2
3.2.2. Protocoles d’adsorption de la BMP-2 par les granulés __________________________________ 77
3.3. Libération de la rhBMP-2 ___________________________________________________________ 79
3.3.1. Echantillons utilisés ____________________________________________________________ 79
3.3.2. Protocole de suivi de la libération__________________________________________________ 79
4. Résultats ___________________________________________________________________ 80
4.1. Comparaison de l’efficacité des différents revêtements ____________________________________ 80
4.2. Etude comparative entre les granulés témoins et NanoAp-EtOHx1 ___________________________ 82
4.2.1. Cinétiques d’adsorption de la rhBMP-2 _____________________________________________ 82
4.2.2. Isothermes d’adsorption de la rhBMP-2 _____________________________________________ 83
4.3. Suivi de la libération de la rhBMP-2___________________________________________________ 84
5. Discussion __________________________________________________________________ 86
5.1. Vitesse d’adsorption _______________________________________________________________ 87
5.2. Comparaison des capacités d’adsorption des différents échantillons __________________________ 88
5.2.1. Comparaison des granulés témoins et revêtus ________________________________________ 88
5.2.2. Comparaison des revêtements_____________________________________________________ 90
5.3. Libération de la rhBMP-2 ___________________________________________________________ 91
6. Conclusions et perspectives ____________________________________________________ 94

Chapitre 4
Etude du comportement cellulaire vis-à-vis des céramiques de BCP revêtues ou non avec le
procédé NanoAp-EtOH _____________________________________________________ 95
1. Introduction bibliographique __________________________________________________ 95
1.1. Les modèles cellulaires pour l’étude de l’interaction matériaux/ostéoprogéniteurs ou ostéoblastes___ 95
1.2. Les modèles cellulaires pour l’étude de la différenciation ostéoblastique induite par la BMP-2 _____ 97
2. Objectifs ___________________________________________________________________ 98
3. Matériels et méthodes ________________________________________________________ 99
3.1. Modèles cellulaires ________________________________________________________________ 99
3.2. Culture cellulaire sur les granulés ____________________________________________________ 100
3.3. Etudes de l’adhésion et de la prolifération _____________________________________________ 101
3.3.1. Conditions de cultures _________________________________________________________ 101
3.3.2. Test au MTT _________________________________________________________________ 102
3.4. Morphologie des cellules __________________________________________________________ 102
3.4.1. Conditions de culture __________________________________________________________ 102
3.4.2. Microscopie Electronique à Balayage (MEB) _______________________________________ 103
3.5. Etude de la différenciation ostéoblastique______________________________________________ 103
3.5.1. Conditions de culture __________________________________________________________ 103
3.5.2. Récupération des cellules incubées sur les granulés ___________________________________ 103
3.5.3. Dosage de l’activité ALP _______________________________________________________ 104
3.5.4. Dosage de l’ADN _____________________________________________________________ 105
4. Résultats __________________________________________________________________ 105
4.1. Etude des réponses cellulaires vis-vis des matériaux _____________________________________ 105
4.1.1. Adhésion et prolifération _______________________________________________________ 105
4.1.1.1. C2C12___________________________________________________________________ 105
4.1.1.2. C3H10T1/2_______________________________________________________________ 107
4.1.2. Morphologie des cellules ensemencées sur les granulés________________________________ 108
4.1.3. Différenciation des cellules en contact avec les matériaux______________________________ 109
4.2. Différenciation en réponse à la BMP-2 adsorbée ________________________________________ 110
5. Discussion _________________________________________________________________ 112
5.1. Biocompatibilité générale des céramiques étudiées ______________________________________ 112
5.2. Adhésion et prolifération cellulaires __________________________________________________ 114
5.3. La différenciation intrinsèque _______________________________________________________ 116
5.4. Différenciation en réponse à la rhBMP-2 adsorbée ______________________________________ 117
6. Conclusions et perspectives ___________________________________________________ 118

3
Chapitre 5
Etude du potentiel ostéoinducteur des céramiques de BCP revêtues avec un dépôt d’apatite
carbonatée nanocristalline avec ou sans rhBMP-2 chez l’animal___________________ 121
1. Introduction bibliographique _________________________________________________ 121
1.1. Les modèles animaux _____________________________________________________________ 121
1.1.1. Les modèles d’ostéoinduction par les BMPs ________________________________________ 121
1.1.2. Les modèles d’ostéoinduction par les matériaux _____________________________________ 122
1.2. Le site d’implantation _____________________________________________________________ 123
1.3. La taille de l’implant ______________________________________________________________ 124
1.4. Le temps d’implantation ___________________________________________________________ 124
2. Objectifs __________________________________________________________________ 125
3. Matériel et méthodes ________________________________________________________ 126
3.1. Implants________________________________________________________________________ 126
3.1.1. Les céramiques _______________________________________________________________ 126
3.1.2. Association avec la rhBMP-2 ____________________________________________________ 126
3.2. Implantations intramusculaires ______________________________________________________ 127
3.3. Etude histologique________________________________________________________________ 129
3.4. Etude statistique _________________________________________________________________ 134
4. Résultats __________________________________________________________________ 135
4.1. Observations générales ____________________________________________________________ 135
4.2. Inflammation et fibrose ____________________________________________________________ 135
4.3. Comparaison de l’efficacité des échantillons – quantification de l’os néoformé (ostéoinduction) ___ 135
4.3.1. Implants intramusculaires 1 mois _________________________________________________ 135
4.3.1.1. Echantillons avec rhBMP-2 déposée ___________________________________________ 135
4.3.1.2. Echantillons sans rhBMP-2 __________________________________________________ 137
4.3.1.3. Evaluation quantitative______________________________________________________ 137
4.3.2. Implants intramusculaires 3 mois _________________________________________________ 138
4.3.2.1. Echantillons avec rhBMP-2 déposée ou adsorbée_________________________________ 138
4.3.2.2. Echantillons sans rhBMP-2 __________________________________________________ 139
4.3.2.3. Evaluation quantitative______________________________________________________ 140
5. Discussion _________________________________________________________________ 141
5.1. Effet ostéoinducteur de la rhBMP-2 __________________________________________________ 142
5.2. Effet ostéoinducteur du revêtement___________________________________________________ 143
6. Conclusions et perspectives ___________________________________________________ 146

Conclusions et perspectives générales _________________________________________ 148


1. Evaluation de la capacité de reconstruction osseuse en site orthotopique _____________ 149
2. Transfert industriel _________________________________________________________ 151
3. Etude des mécanismes d’ostéoinduction ________________________________________ 151
3.1. Etudes chez l’animal ______________________________________________________________ 152
3.2. Etudes in vitro ___________________________________________________________________ 153

Liste des publications et communications issues de ce projet ______________________ 156

Références_______________________________________________________________ 158

4
Chapitre 1

Introduction bibliographique générale


L’os est une structure dynamique qui possède la propriété de se renouveler et de se
reconstruire. Les capacités de régénération sont cependant limitées et il arrive dans certaines
circonstances qu’un comblement osseux soit nécessaire pour obtenir une reconstruction
complète de la zone lésée. C’est le cas notamment lorsque la taille de la zone à reconstruire
est importante (pseudarthrose, résection de tumeurs ou de kystes osseux, forte perte de
substance lors d’un traumatisme, …) ou lorsque la reconstruction est lente (union retardée,
maladie, patient agé…).
Pour faciliter la réparation de grandes pertes de substances, une greffe osseuse peut être
réalisée. L’autogreffe est considérée comme la référence du matériau de comblement. Sa
réalisation comporte cependant plusieurs inconvénients : le prélèvement du greffon
s’accompagne d’une augmentation de la douleur pour le patient, consécutive à l’opération, et
d’un fort risque de morbidité du site de prélèvement. La quantité et la qualité du tissu osseux
prélevé sont, d’autre part, variables et peuvent être insuffisantes chez les patients d’un âge
avancé ou malades (Dawson et al. 2008).
Des allogreffes, c'est-à-dire des greffes osseuses provenant d’un donneur différent, sont aussi
disponibles. Afin de limiter les problèmes d’histocompatiblité entre le donneur et le receveur
et les risques de transmissions virales, ces greffons sont classiquement stérilisés par radiations
gamma. Après stérilisation, les propriétés mécaniques et biologiques de ces greffons peuvent
cependant être altérées et leur potentiel de reconstruction, plus limité que celui des autogreffes
en raison de l’absence de cellules vivantes, ne permet pas en général un remplacement total
du substitut par de l’os néoformé (Nguyen et al. 2007).

Avec le prolongement de la durée de vie notamment, la demande de substituts osseux est en


constante augmentation et ce domaine représente donc un marché économique important. En
raison des difficultés rencontrées par l’utilisation de greffes osseuses, les orthopédistes et
dentistes se tournent de plus en plus vers l’utilisation de matériaux de comblement
synthétiques ou d’origine naturelle contrôlée. Plusieurs types de matériaux sont, en effet,
disponibles : éponges de collagène, polymères synthétiques ou naturels, bioverres, composés
phosphocalciques, matériaux composites (Rezwan et al. 2006, Kokubo 2008).
Mais les matériaux commercialisés à l’heure actuelle présentent au mieux des propriétés
ostéoconductrices, c'est-à-dire qu’ils possèdent la capacité de favoriser la croissance osseuse
lorsqu'ils sont au contact d'un os (Jarcho 1981). Ces propriétés ostéoconductrices sont
cependant insuffisantes pour soutenir la reconstruction complète de larges pertes de substance
dans lesquelles le contact os-matériau ne se fait qu’aux extrémités de la zone à reconstruire.

5
Il apparaît donc essentiel d’élaborer de nouvelles catégories de matériaux possédant des
capacités de reconstruction du tissu osseux sans contact direct avec l’os ; les matériaux
ostéoinducteurs ont ce potentiel. L’ostéoinduction, contrairement à l’ostéoconduction, est un
processus biologique qui induit une différenciation de cellules progénitrices en ostéoblastes.
Dans ce cas, la croissance osseuse pourra avoir lieu dans l’ensemble du matériau, ce qui
augmente l'efficacité de la reconstruction. Plusieurs stratégies envisagées s’inspirent des
processus d'ossification et visent à les reproduire en partie (De Bruijn et al. 2008).

1. L’os
L’os est un tissu conjonctif dynamique soumis à un renouvellement régulier, appelé
remodelage, et qui possède la capacité de se régénérer lorsqu’il est endommagé. Il est
composé d’une matrice extracellulaire minéralisée et de cellules qui participent à son
remodelage et à sa réparation.

1.1. La matrice extracellulaire

La matrice extracellulaire osseuse est composée d’une matrice organique, de minéral et d’eau
qui représentent respectivement 30, 60 et 10% de la masse osseuse.

1.1.1. La matrice organique

La matrice organique est composée essentiellement de fibres de collagènes (90%) qui sont
associées entre elles et constituent l’architecture du tissu osseux. Le collagène de type I est
largement majoritaire mais d’autres types de collagènes ont été détectés (les collagènes de
type V et III) et participent à l’organisation de cette matrice (Niyibizi et al. 1994). Cette
structure collagénique assure la visco-élasticité de l’os alors que le minéral qui se dépose à la
surface et entre les fibres de collagène (parallèlement à celles-ci) est responsable de la rigidité
du tissu. L’orientation et la composition de ces fibres, qui régulent la quantité et l’orientation
du minéral déposé, conditionnent donc la résistance mécanique du tissu osseux (Viguet-Carrin
et al. 2006).
Des protéines non-collagéniques sont, par ailleurs, incluses dans la matrice et peuvent
participer à la formation d’os et à sa régulation. Ces protéines sont nombreuses et assurent des
fonctions variées. Plusieurs d’entre elles jouent un rôle sur l’organisation de la matrice et sa
minéralisation (protéoglycanes, sialoprotéine osseuse, ostéocalcine, ostéopontine,

6
ostéonectine, phosphatase alcaline (ALP)…). D’autres peuvent avoir une action - directe ou
indirecte - sur l’activité des ostéoblastes et/ou des ostéoclastes (protéoglycanes, Bone
Morphogenetic Proteins (BMPs), osteoprotégérine…). Des protéines caractéristiques du
remodelage osseux (Tartrate-resistant acid phosphatase : TRAP) et de la vascularisation
(Vascular Endothelial Growth Factor : VEGF) sont aussi présentes (Schmidmaier et al. 2006,
Lamoureux et al. 2007, Schreiweis et al. 2007).

1.1.2. Le minéral osseux

Comme nous l’avons indiqué, la matrice extracellulaire osseuse est minéralisée. Cette
minéralisation assure la rigidité du tissu osseux et participe activement à l’homéostasie du
calcium de l’organisme. Le minéral osseux sert en effet de réservoir d’ions.
Le minéral osseux est composé de fines plaquettes d’apatite de taille nanométrique qui se
déposent parallèlement aux fibres de collagène (Kuhn et al. 2008). Longtemps considéré
comme de l’hydroxyapatite substituée, le minéral osseux correspond en fait à une apatite
carbonatée déficiente en ions calcium et hydroxyde. La composition moyenne du minéral
osseux peut être représentée par la formule chimique suivante (Legros et al. 1986) :
Ca8,3 1,7(PO4)4,3(HPO4 et CO3)1,7(OH et/ou 1/2 CO3)0,3 1,7

Une caractéristique majeure des apatites biologique est la présence d'environnements ioniques
qui n'existent pas dans les apatites bien cristallisées. Ces environnements ont été attribués à la
présence en surface des cristaux d’une couche hydratée bien organisée, mais labile, contenant
des ions minéraux (environnements des ions CO32-, HPO42- et PO43- notamment) (Rey et al.
1989, Eichert et al. 2002). Cette couche hydratée, qui évolue au cours du temps, serait
responsable de la très grande réactivité de surface des apatites biologiques. Ces apatites
présentent de très fortes capacités d’échanges ioniques et d’adsorption de protéines, ce qui
leur permet d’interagir facilement avec les fluides biologiques. Ces propriétés pourraient être
liées à la présence de cette couche hydratée, qui contient des espèces ioniques relativement
mobiles et facilement échangeables (Figure I.1) (Ouizat et al. 1999, Cazalbou 2000). Une
description plus complète des caractéristiques du minéral est faite dans la partie
bibliographique du chapitre 2.

7
Figure I.1 : Schéma de la couche hydratée en surface des nanocristaux. Les ions présents
dans la couche hydratée peuvent être facilement échangés avec les ions présents en solution
et participer à l’adsorption de protéines (Pr) à la surface des cristaux.

1.2. Les cellules de l’os et le remodelage osseux

Le maintien du capital osseux est assuré par deux types cellulaires, les ostéoblastes qui sont
les cellules formatrices de l’os et les ostéoclastes qui le dégradent. Deux autres types
cellulaires qui correspondent à des ostéoblastes différenciés, les ostéocytes et les cellules
bordantes de l’os, sont présents dans l’os et ont un rôle majeur dans la régulation de ces
phénomènes. Toutes ces cellules agissent de manière coordonnée lors du remodelage osseux
(Matsuo et al. 2008).

• Les ostéoblastes
Les ostéoblastes sont issus de cellules souches mésenchymateuses, situées notamment dans la
moelle osseuse, et sont responsables de la formation de l’os. Lors de leur différenciation, les
pré-ostéoblastes, qui deviennent progressivement des ostéoblastes matures, expriment
différents facteurs (phosphatase alcaline, collagène de type I, ostéopontine, ostéocalcine,
sialoprotéine osseuse) qui participent à la formation du tissu ostéoïde (la matrice organique de
l’os) puis à sa minéralisation. Les ostéoblastes matures peuvent se différencier en ostéocytes,
en cellules bordantes de l’os ou être éliminés par apoptose (mort cellulaire programmée).

• Les ostéocytes
Les ostéocytes sont des ostéoblastes qui sont totalement différenciés et sont entourés de
matrice minéralisée. Ils sont incapables de proliférer mais participent activement à l’initiation
et à la régulation du remodelage osseux, notamment par leur action de mécanosenseurs.

8
• Les cellules bordantes de l’os
Les cellules borbantes de l’os sont des ostéoblastes différenciés, aplatis, qui recouvrent la
surface de l’os. Leur fonction consiste à protéger la matrice osseuse contre l’action des
ostéoclastes. Lors du remodelage osseux, ces cellules sécrètent des collagénases qui dégradent
le tissu ostéoïde, découvrant donc la matrice minéralisée et participent à l’activation des
ostéoclastes.

• Les ostéoclastes
Les ostéoclastes sont des cellules multinucléées issues de progéniteurs hématopoïétiques aussi
présents dans la moelle osseuse. Les précurseurs hématopoïétiques expriment le récepteur
RANK (Receptor Activator of Nuclear factor κB) à leur surface puis fusionnent sous
l’activation du ligand (RANKL), ce qui conduit à la formation de cellules multinucléées
actives. Les ostéoclastes matures sont des cellules polarisées capables de dégrader la matrice
osseuse minéralisée par la libération d’enzymes (cathepsine K) et d’acide chlorhydrique.

Le remodelage osseux peut être divisé en trois phases : initiation, transition, terminaison
(Figure I.2)

Figure I.2 : Le remodelage osseux. Les ostéoclastes sont en rouge et les ostéoblastes en bleu.
Lors de la phase d’initiation, les précurseurs hématopoïétiques sont recrutés au niveau du
site à remodeler. La différenciation des ostéoclastes est induite par les cellules bordantes de
l’os qui expriment des ligands des ostéoclastes tels que RANKL. Ceci entraine la fusion des
précurseurs ostéoclastiques qui deviennent multinucléés et entament la résorption de l’os. La
phase de transition correspond au passage de la résorption vers la formation osseuse. Celle–
ci comprend le recrutement de cellules progénitrices et leur différenciation ostéoblastique
alors que les ostéoclastes partent en apoptose. Ces évènements sont susceptibles d’être
régulés par différents facteurs sécrétés, des liaisons directes entre ostéoclastes et ostéoblastes
ou la libération de facteurs contenus dans la matrice lors de sa dégradation. Lors de la phase
de terminaison, l’os est reformé, minéralisé puis protégé par les cellules bordantes de l’os
(Matsuo et al. 2008).

9
2. Les matériaux de comblement osseux
De nombreux types de matériaux peuvent être utilisés comme substituts osseux. Leur nature,
leur composition, leur formulation et leurs propriétés sont diverses. Différents types de
matériaux de comblement sont déjà commercialisés et utilisés en orthopédie ou chirurgie
dentaire. Quelques exemples de substituts osseux commercialisés sont mentionnés dans le
tableau I.1.
Tableau I.1 : Types de matériaux de comblement commercialisés (LeGeros 2002, Ge et al.
2008, Kokubo 2008).
Catégorie Exemples Noms commerciaux
Healost® (Orquest)
Polymères naturels Collagène
Apcoll® (Devro Medical Corp.)
Poly(α-hydroxy acids)
Polymères Trugraft® (osteobiologics)
(Poly(lactic-co-glycolic acid)
synthétiques Peek-Classix® (Invibio)
(PLGA))
Bioverres Bioglass® (US Biomaterials Corp.)
Biocéramiques Biocéramique d’alumine Biolox® (CeramTec)
diverses
Prozyr® (St-Gobain Advanced
Zircone
ceramics Desmarquest)
Interpore® et Pro-Osteon®
(InterPore Int)
Hydroxyapatite (HA) naturelle
Endobon® (Merk)
ou synthétique
Calcitite® (Calcitek)
Céramiques Osteograf® (Ceramed)
phosphocalciques TRIHA+® (Teknimed)
Phosphate tricalcique-β (β-TCP)
Vitoss® (Orthovita, Inc)
CERAFORM® (Teknimed)
Phosphate de calcium biphasique
Triosite® (Zimmer, Ind.)
(BCP) (HA/β-TCP)
MBCP® (Biomatlande)
CEMENTEK® (Teknimed)
BoneSource® (Stryker, Inc.)
Phosphocalciques
Biobon® (ETEX, Inc.)
Ciments
Norian SRS® (Synthes)
Polymères (Polyméthyl- Cortoss® (Orthovita, Inc.)
méthacrylate) CEMFIX® (Teknimed)
Collagène d’origine naturelle + Collapat II® (BioMet, Inc)
HA ou BCP Collagraft® (Zimmer, Inc)
Matériaux Tricos® (Baxter BioSciences
composites Fibrine Glue + BCP
BioSurgery)
Polymère synthétique + BCP MBCP Gel® (Biomatlande France)

10
2.1. Les céramiques phosphocalciques

De par leur composition ionique proche de celle du minéral osseux et leurs bonnes propriétés
ostéoconductrices, les céramiques phosphocalciques constituent une catégorie de matériaux
très souvent utilisée pour le comblement de perte de substance osseuse. Ces céramiques sont
en général à base d’hydroxyapatite et/ou de phosphate tricalcique-β. Ces céramiques peuvent
comporter une phase unique de l’un de ces deux composés ou un mélange des deux (BCP)
avec des rapports variables. Elles peuvent se présenter sous différentes formes (pastilles
denses, blocs ou granulés poreux).

2.1.1. L’hydroxyapatite (HA)

L’hydroxyapatite (HA) fait partie de la famille des apatites qui sont des composés minéraux
dont la principale caractéristique est leur capacité à admettre un grand nombre de substitutions
et de lacunes ioniques. Les apatites stoechiométriques sont en général représentées par la
formule chimique :
Me10(XO4)6Y2
Où Me est un métal bivalent, XO4 un anion trivalent et Y un anion monovalent.
L’hydroxyapatite stoechiométrique est donc représentée par la formule Ca10(PO4)6(OH)2.
La synthèse de l’hydroxyapatite est en général effectuée par précipitation en conditions
basiques puis frittage à une température excédant les 1000°C.
L’HA stoechiométrique est caractérisée par son rapport Ca/P de 1,67. Son analyse par
spectroscopie infrarouge montre des bandes caractéristiques attribuées aux ions OH- et au
groupement phosphate ; et son diagramme de diffraction des rayons X correspond à une
structure hexagonale (groupe P63/m) avec les paramètres de maille : a = 0,9422 nm et c =
0,688 nm (LeGeros 2002).

2.1.2. Le phosphate tricalcique-β (β-TCP)

Le phosphate tricalcique-β a pour formule chimique : Ca3(PO4)2. Il est caractérisé par un


rapport Ca/P de 1,5. Il est de structure rhomboédrique (groupe R3c) et a pour paramètres de
mailles : a = b = 1,0439 nm et c = 3,7375 (pour la maille multiple hexagonale).
Sa préparation se fait par frittage à haute température d’apatite déficiente en calcium de
rapport Ca/P de 1,5 ou par réaction solide-solide à haute température. Les températures de
frittage sont en général comprises entre 1000 et 1250°C (Rey et al. 2008).

11
2.1.3. Les phosphates de calcium biphasiques (BCP)

Des céramiques biphasiques contenant un rapport HA/β-TCP variable sont également


synthétisées. Pour cela, une apatite déficiente en calcium précipitée avec un rapport compris
entre 1,5 et 1,67 est frittée à haute température. En fonction du rapport Ca/P du composé
initial, la céramique obtenue aura un rapport HA/β-TCP défini. La deuxième technique de
fabrication consiste à mélanger des poudres d’hydroxyapatite et de β-TCP dans le rapport
souhaité avant frittage.
Les céramiques de BCP les plus couramment utilisées ont un rapport HA/β-TCP de l’ordre de
60/40 ou 80/20.

2.1.4. Les apatites analogues au minéral osseux

Ces céramiques frittées à haute température ne sont pas parfaitement comparables au minéral
osseux, notamment en ce qui concerne leur réactivité de surface (Gautier et al. 1998). Il est
cependant possible de synthétiser de vrais analogues du minéral osseux. Ces composés
possèdent les caractéristiques des apatites biologiques au niveau de la taille des cristallites, de
la composition et de la présence d’une couche hydratée à leur surface. Ces analogues du
minéral osseux sont par conséquent très réactifs (Cazalbou 2000). Le développement de
substituts osseux biomimétiques à partir de ces apatites est envisagé mais plusieurs problèmes
techniques devraient d’abord être surmontés, notamment en ce qui concerne la mise en forme
et la résistance mécanique de tels matériaux.

3. Caractéristiques des substituts osseux


En vue de leur utilisation en clinique, les substituts osseux doivent répondre à certains
critères. Ces caractéristiques définissent l’efficacité du matériau de comblement.

3.1. Biocompatibilité

La biocompatibilité des substituts employés est primordiale. Ces matériaux ainsi que leurs
produits de dégradation ne doivent pas, en effet, présenter de cytotoxicité ni s’accompagner
d’une forte réaction inflammatoire.
De par leur nature, les matériaux phosphocalciques et leurs produits de dégradation (calcium,
phosphate) sont parfaitement assimilables par l’organisme et participent même à la

12
régénération osseuse. Que ce soit in vitro ou in vivo, la majorité de ces matériaux présentent
une très bonne biocompatibilité. L’implantation de céramiques d’HA, de β-TCP ou de BCP
chez l’animal s’accompagne d’une bonne apposition d’os à la surface des matériaux, sans
présence de réaction inflammatoire (Jarcho 1981). Dans de rares cas, une dissolution trop
importante des matériaux s’accompagne d’une cytotoxicité et par suite, d’un manque
d’efficacité. De telles observations ont pu être faites pour des céramiques d’α-TCP (Yuan et
al. 2001a).

3.2. Résistance mécanique

Les substituts osseux peuvent être soumis à des efforts mécaniques importants similaires à
ceux que l’os doit supporter. Il est donc important que ces matériaux présentent de bonnes
propriétés mécaniques afin d’éviter leur effritement ou leur fracture lors de la mise en place
durant l'opération chirurgicale ou au moment de la mise en charge.
La résistance mécanique des substituts osseux est dépendante principalement de leur
composition, de leur mode de fabrication et de leur morphologie.
L’hydroxyapatite dense possède une forte résistance à la traction ou à la compression avec des
valeurs supérieures ou comparables à celle de l’os cortical. Sa résistance à la traction est
comprise entre 79 et 106 MPa contre 69 à 110 MPa pour l’os cortical (LeGeros 2002) et sa
résistance à la compression peut atteindre 400 MPa contre 100 à 200 MPa pour l’os cortical
(Rezwan et al. 2006).
Cependant, la présence nécessaire de pores interconnectés dans les matériaux employés
diminue de manière drastique leurs propriétés mécaniques. Les valeurs obtenues, très
variables en fonction du type de céramique phosphocalcique étudié, sont de l’ordre de 50
MPa pour la résistance à la traction et inférieures à 10 MPa pour la résistance à la
compression (LeGeros 2002, Dellinger et al. 2006).

3.3. La porosité

La morphologie des substituts osseux est un paramètre majeur qui conditionne leur efficacité.
Il est en effet nécessaire que le matériau contienne des pores interconnectés. Il a été montré
que deux gammes de porosités doivent être présentes pour assurer une bonne reconstruction
osseuse :

13
• Une macroporosité
La macroporosité correspond en général à des pores de diamètre supérieur à 100 µm, et
classiquement compris entre 300 et 600 µm. La présence de ces macropores assure
l’envahissement du matériau par les cellules ainsi que la mise en place de la vascularisation
permettant un apport des fluides biologiques nécessaires à la survie et à la différenciation
cellulaire. Une porosité minimale de 40-70 µm est indispensable pour l’envahissement de
vaisseaux et la formation d’os. Klenke et al. ont montré que la taille des macropores était
directement corrélée à la quantité d’os et au nombre de vaisseaux formés après implantation
de céramiques de BCP sur des crânes de rats. Les valeurs obtenues sont significativement plus
importantes pour des gammes de porosités supérieures à 140 µm et augmentent avec la taille
des pores (Klenke et al. 2008).

• Une microporosité
La présence de mésopores de diamètre inférieur à 10 µm – communément appelées
micropores dans le domaine des biomatériaux – joue par ailleurs un rôle important dans
l’efficacité de reconstruction de ces matériaux, notamment sur leurs propriétés
ostéoconductrices et/ou ostéoinductrices. Il a été évoqué que ces micropores étaient
susceptibles de jouer un rôle à plusieurs niveaux : augmentation de la surface spécifique des
matériaux, création d’un microenvironnement à l’intérieur de ces pores, augmentation de la
rugosité, augmentation de la résorbabilité. Ces différents paramètres, associés à la réactivité
du matériau, pourraient donc avoir une influence sur la bioactivité du matériau ou ses
capacités d’adsorption (Habibovic et al. 2008, Zhu et al. 2008).
La porosité des matériaux est contrôlée par leur mode de fabrication. En général, la
macroporosité et la microporosité peuvent être assurées par l’utilisation de moules poreux ou
l’intégration d'agents porogènes qui vont être dégradés à haute température (frittage de
céramiques par exemple). Les porosités peuvent aussi être obtenues simplement par le frittage
de billes calibrées ou encore par dissolution de l'agent porogène ajouté (pour la préparation de
polymères poreux par exemple). Dans le cas des céramiques phosphocalciques, la
microporosité est aussi corrélée à la température de frittage : plus la température de frittage est
faible, plus la microporosité sera importante (Wilson et al. 2006).

14
3.4. Biorésorbabilité

La biorésorbabilité est un facteur important : Elle va déterminer la vitesse à laquelle le


matériau va être dégradé in vivo par les phénomènes de dissolution spontanés et par l’action
des ostéoclastes. Celle-ci doit être contrôlée pour obtenir une dégradation directement
corrélée dans le temps à la formation d’os : Le matériau doit, en effet, être en mesure de se
dégrader pour permettre le remplacement progressif de la céramique par l’os néoformé mais
une dégradation trop rapide peut être responsable de la perte de l’intégrité de la structure de la
céramique qui ne pourra donc plus soutenir la croissance osseuse.
La biorésorbabilité est dépendante des caractéristiques physico-chimiques des matériaux.
La composition chimique du matériau conditionne son degré de solubilité et donc sa vitesse
de dégradation. Il est généralement considéré que la biodégradabilité est liée au produit de
solubilité du matériau. L’HA stœchiométrique est définie par de nombreux auteurs comme un
matériau non résorbable. Son produit de solubilité est, en effet, très faible. Au contraire, le
β-TCP a un produit de solubilité beaucoup plus grand que celui de l’hydroxyapatite (si on le
rapporte au même nombre d'ions phosphate dans de l’eau à 25°C) et peut être plus facilement
dissout à pH acide. La combinaison d’HA et de β-TCP pour former les céramiques mixtes de
BCP a pour objectif principal de contrôler leur vitesse de résorption. Ces céramiques mixtes
ont une résorbabilité intermédiaire et sont capables d’être dégradées entièrement pour être
remplacées par la matrice osseuse.
La vitesse de dissolution des céramiques peut être modifiée par différents facteurs dont la
taille des cristallites et la porosité du matériau (LeGeros 2002). La présence de micropores
permet d’augmenter la surface spécifique des matériaux et donc leur vitesse de dissolution et
leur dégradation à composition chimique et produit de solubilité identiques (Dellinger et al.
2006, Wilson et al. 2006).

3.5. Bioactivité

Les matériaux bioactifs possèdent la propriété unique de créer un contact direct avec l’os sans
formation de chape fibreuse augmentant de ce fait leur potentiel d’intégration. Cette capacité
réside dans la possibilité pour ces biomatériaux de précipiter à leur surface une apatite
nanocristalline, similaire au minéral osseux, au contact des fluides biologiques (Takadama et
al. 2008).

15
La formation de cette phase apatitique se fait en plusieurs étapes : 1) existence d’un
environnement sursaturé en ions calcium et phosphate ; 2) précipitation à la surface du
matériau d’une apatite nanocristalline carbonatée ; 3) association puis incorporation de cette
phase avec la matrice organique de l’os nouvellement formé. La première étape est réalisée
naturellement et les fluides biologiques au contact d'un implant sont sursaturés par rapport
aux apatites nanocrystallines susceptibles de se former. On considère que le produit ionique
du sérum est proche du produit de solubilité du phosphate Octacalcique (OCP) (Eidelman et
al. 1987). La deuxième étape dépend des propriétés de nucléation de la surface, elle est
particulièrement importante pour l'hydroxyapatite et d'autres phosphates de calcium
susceptibles de favoriser la croissance epitactique de cristaux d'apatite. Cependant, cette
capacité d'une surface à favoriser la germination d'une phase apatitique peut être exaltée par la
libération d'ions minéraux du biomatériau lui-même. Ainsi, la bioactivité des bioverres est
attribuée à leur capacité à libérer du calcium dans leur environnement immédiat et favoriser
ainsi localement la précipitation de phosphate de calcium. Deux autres ions peuvent
contribuer à cet effet, les phosphates et les ions OH- par leur effet sur le pH local, et certains
biomatériaux utilisent aussi ces propriétés. La troisième étape est plus complexe et elle
implique de nombreux paramètres physico-chimiques et biologiques. Parmi les paramètres
physico-chimiques, il faut mentionner la vitesse de croissance des cristaux, l’inhibition de la
croissance et de la germination par des protéines ou des ions (Mg, carbonates,
pyrophosphates, citrates ...), la diffusion de ces groupements vers le front de minéralisation.
Les paramètres biologiques concernent, notamment l'adhésion, la prolifération, la
différenciation et la minéralisation des ostéoblastes, qui dépendent fortement de la surface du
biomatériau et de certains ions minéraux en solution (notamment calcium et phosphate) (cf.
paragraphe I.5.1). Tout comme le minéral osseux, la phase apatitique nanocristalline
néoformée est très réactive et elle possède des capacités importantes d’échange ionique et
d’adsorption de protéines. Il a, par ailleurs, été suggéré que des protéines issues des fluides
environnants pourraient être co-précipitées et donc incluses dans cette couche apatitique lors
de sa formation.
La bioactivité de matériaux a été montrée pour la première fois par Hench et al. qui ont
remarqué la formation de cette couche apatitique sur leur bioverre (Hench et al. 1972).
Kokubo et al. ont ensuite montré que la bioactivité d’un matériau pouvait être évaluée in vitro
par immersion à 37°C du matériau dans une solution de SBF (simulated body fluid) qui
reproduit la composition ionique du plasma sanguin. Dans ces conditions, seuls les matériaux

16
bioactifs ont la capacité d’induire la nucléation-croissance de cette phase apatitique à leur
surface (Kokubo 1991).
La présence de sites de nucléation et un accroissement de la sursaturation en ions calcium
et/ou phosphate à la surface du matériau sont deux mécanismes permettant d'induire la
formation de cette apatite similaire au minéral osseux (Duan et al. 2004).
La plupart des céramiques à base de phosphates de calcium sont bioactives à des degrés
variables. La microporosité de ces matériaux semble jouer un rôle important dans ce
phénomène : cette microporosité augmente la surface spécifique des échantillons et donc le
nombre de sites de nucléation. Il a, d’autre part, été suggéré qu'elle pourrait permettre
d’obtenir un micro-environnement favorable pour une sursaturation en ions calcium et
phosphate (Duan et al. 2004).

3.6. Ostéoconduction

L’ostéoconduction est définie actuellement comme la capacité d’un matériau à permettre une
croissance osseuse lorsqu'il est au contact ou à proximité d'un os (Jarcho 1981). Le matériau
doit être en mesure d’accueillir les précurseurs ostéoblastiques qui migrent de la moelle
osseuse et d’assurer leur prolifération puis leur différenciation en ostéoblastes. D’un point de
vue pratique, l’ostéoconduction est mesurée après implantation d’un matériau dans un site
osseux. Il s’agit, en général, d’études comparatives qui mettent en évidence le potentiel
ostéoconducteur d’un matériau par rapport à un autre. Les évaluations effectuées peuvent être
histologiques, avec la mesure de la formation d’os formé et de la vascularisation, ou
mécaniques, avec des mesures de la force de la liaison os-matériau (Nakamura et al. 2008).
La composition chimique et la topographie de surface des échantillons ont une forte influence
sur l’ostéoconduction. Le contact os-implant et la résistance aux tests mécaniques d’implants
en titane apparaissent, en effet, significativement accrues en présence d’un revêtement d’HA,
bioactif, à leur surface ou d’une rugosité importante, susceptible de stimuler la différenciation
et la minéralisation des ostéoblastes (Goldberg et al. 1995, Moroni et al. 2008). En outre, bien
qu’elle n’apparaisse pas indispensable dans l’initiation du phénomène, la présence d’une
macroporosité favorise l’ostéointégration des matériaux (Takemoto et al. 2005).
Les céramiques phosphocalciques présentent de très bonnes propriétés ostéoconductrices et
leur capacité est déterminée par leurs caractéristiques et notamment leur composition
chimique et leur microporosité. L’implantation dans des fémurs de chien de céramiques de
BCP (HA/β-TCP : 62/38) montre une ostéointégration plus précoce et une quantité d’os

17
néoformé supérieure à tous les temps de l’étude par rapport à des échantillons d’HA (de
porosité similaire) (Yuan et al. 2006a).
Wilson et al. ont, par ailleurs, étudié de manière combinée les effets de la composition et de la
microporosité sur le potentiel ostéoconducteur des céramiques phosphocalciques. Ils ont
comparé la formation d’os après implantation dans le rachis lombaire de chèvres
d’échantillons de β-TCP, d’HA et BCP (HA/β-TCP : 80/20) qui ont été frittés à des
températures variables, et donc qui présentent des microporosités différentes. Ils ont ensuite
classé les échantillons par rapport à leur potentiel ostéoconducteur : BCP frittées à faible et
moyenne température (rugueuses et lisses) = β-TCP > HA frittée à faible température > BCP
frittée à haute température (rugueuses et lisses) > HA frittée à haute température. Au vue des
résultats obtenus, ils indiquent que le paramètre qui déterminerait le potentiel ostéoconducteur
serait la bioactivité des céramiques reliée à leur vitesse de dissolution (Wilson et al. 2006).
Dans une de leur étude, Habibovic et al. ont obtenus des résultats comparables après
implantation en site orthotopique de différents phosphates de calcium : L’HA, l’apatite
carbonatée et des céramiques de BCP dépourvues de micropores induisent peu de formation
osseuse alors que celle-ci est très importante pour des échantillons de BCP microporeux
(Habibovic et al. 2008).
Habibovic et al. confirment par ailleurs dans ce travail que les matériaux phosphocalciques
ont non seulement des propriétés ostéoconductrices mais aussi, dans certains cas, des
propriétés ostéoinductrices (Habibovic et al. 2008). Les propriétés ostéoinductrices des
matériaux phosphocalciques seront détaillées dans le paragraphe suivant.

4. L’ostéoinduction
Les matériaux ostéoconducteurs ont de bonnes capacités de reconstruction lorsque qu’un
contact direct entre l’os et le matériau est possible et que la zone à reconstruire est petite. Ils
sont en revanche peu efficaces pour la régénération de larges pertes de substance osseuse
(Johnson et al. 1996). Dans ces situations, il est nécessaire d’utiliser des substituts osseux qui
permettent la différenciation ostéoblastique de cellules progénitrices (endogènes ou exogènes)
et assure donc l’ostéogenèse dans l’ensemble du matériau. Deux grands domaines d’études
concernent la recherche et le développement de tels matériaux. L’ingénierie tissulaire, d’une
part, s’intéresse à l’élaboration de stratégies et méthodes efficaces pour associer des cellules
progénitrices issues du patient sur des matériaux qui permettent leur différenciation

18
ostéoblastique. L’implantation de ces cellules a pour but d’initier et soutenir la formation
osseuse et la vascularisation au sein de l’implant (Dawson et al. 2008, Grellier et al. 2009).
Le second domaine d’investigation concerne le développement de matériaux ostéoinducteurs :
il s’agit de matériaux qui sont capables d’accueillir les cellules progénitrices de l’hôte et
d’induire leur différenciation ostéoblastique.
L’ostéoinduction reproduit les mécanismes classiques de l’ostéogenèse : 1) migration de
cellules souches progénitrices, 2) différenciation de ces cellules et ossification endochondrale
ou intramembranaire avec la formation de vaisseaux, 3) production de la moelle osseuse et 4)
mise en place du remodelage osseux (De Bruijn et al. 2008).
Les méthodes les plus étudiées à l’heure actuelle pour élaborer des matériaux ostéoinducteurs
sont les suivantes :
- Association d’un matériau avec des facteurs de croissances ou leur séquence
d’ADN codante. La combinaison de protéines de la famille des BMPs – la BMP-2
et la BMP-7 notamment – avec des substituts osseux est particulièrement étudiée en
raison de son efficacité (Saito et al. 2003).

- Développement de matériaux capables à eux seuls d’assurer ces processus


d’ostéoinduction (Habibovic et al. 2007).

4.1. L’ostéoinduction par les BMPs

En 1965, Urist a mis en évidence que l’implantation intramusculaire de matrice osseuse


déminéralisée (Demineralized Bone Matrix, DBM) s’accompagnait d’une formation d’os chez
la souris, le rat, le lapin et cochon. Il a montré que cette ostéogenèse se produisait à l’intérieur
des cavités de l’implant et que les nouveaux ostéoblastes provenaient de cellules pluripotentes
de l’hôte (Urist 1965). Avec ses collaborateurs, Urist a ensuite pu associer ce phénomène
d’ostéoinduction à la présence de Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) dans la matrice
déminéralisée (Urist et al. 1967).
Depuis, l’ostéoinduction médiée par les BMPs a largement été étudiée. Ces facteurs de
croissance, seuls ou associés à des matériaux, sont capables d’initier la formation d’os dans
des sites ectopiques, c'est-à-dire après implantation sous-cutanée ou intramusculaire, dans
différents modèles animaux : souris, rat, lapin, chien, chèvre, singe, babouin (Miyamoto et al.
1993, Yuan et al. 1998, Boyan et al. 1999, Ripamonti et al. 2001, Yuan et al. 2001c, Liu et al.
2005, Kempen et al. 2009).

19
4.1.1. Les BMPs

4.1.1.1. Structure

Les BMPs font partie de la superfamille du TGF-β (Transforming-Growth factor-β) et plus


d’une vingtaine de BMPs ont déjà été répertoriées. Les BMPs sont des dimères – homo- ou
hétéro-dimères – d’environ 30 à 40 KDa. Elles sont synthétisées sous la forme de deux grands
précurseurs qui subissent un clivage protéolytique avant de se dimériser. La dimérisation et la
conformation finale de la protéine sont assurées par la présence de 7 résidus cystéines dans
chaque momonère.
Sebald et al. ont caractérisé la structure de la BMP-2 recombinante humaine homodimérique
(Scheufler et al. 1999). Après glycosylation et clivage protéolytique des pro-protéines de 453
acides aminés, les deux résidus C-terminaux de 114 acides aminés s’homodimérisent. Le
dimère obtenu a une structure globulaire et symétrique de dimension 70 Å x 35 Å x 30 Å
(Figure I.3). La structure de chaque monomère est stabilisée par les trois ponts disulfures
intrachaines formés entre 6 résidus cystéines (Cys43, Cys47, Cys111, Cys 113, Cys14 et Cys
79). Une stabilisation supplémentaire de la structure de la BMP-2 est obtenue par sa
dimérisation via un pont disulfure entre les résidus Cys78 de chaque monomère. La protéine
contient une large zone hydrophobe qui pourrait expliquer son profil de solubilité particulier :
son degré de solubilité est faible dans les conditions physiologiques mais peut être largement
augmenté par une force ionique importante. La région positive dans la cavité I, liées à un
cluster d’acides aminés basiques au niveau de la queue N-Terminale est particulière à la
BMP-2 et pourrait correspondre au site de liaison de la protéine avec l’héparine (Ruppert et
al. 1996).

Figure I.3 : Représentation de la surface de la rhBMP-2 accessible aux solvants. Les


régions hydrophobes sont en blanc, les régions chargées négativement en rouge et les zones
chargées positivement en bleu (Scheufler et al. 1999).

20
4.1.1.2. Production par génie génétique
Les BMPs les plus utilisées comme agent ostéoinducteur dans le domaine des biomatériaux
sont les BMP-2 et BMP-7 (ou osteogenic Protein-1 : OP-1) recombinantes humaines (rhBMP-
2 ou -7). Il est, en effet, possible d’utiliser le génie génétique pour produire en grande
quantités des protéines qui ont la même séquence d’acides aminés que celle de la protéine
humaine. Cette protéine recombinante peut être produite dans un modèle eucaryote tel que les
CHO (chinese hamster ovarian) conduisant à la protéine BMP-2 glycosylée. Elle peut, en
outre, être produite dans un modèle procaryote (E.coli) sans modification post-traductionnelle
(obtention de BMP-2 non-glycosylée). Dans les deux cas, la BMP-2 produite possède de
fortes capacités ostéoinductrices, même si la forme glycosylée reste plus efficace in vitro.

4.1.1.3. Rôle des BMPs dans l’ostéogenèse


Les BMPs sont des facteurs clé dans l’ostéogenèse que ce soit lors du développement
embryonnaire ou chez l’adulte, du remodelage osseux ou de la réparation de fractures. Parmi
les BMPs connues, l’importance des BMP -2, -4 et -7, plus précisement, dans ces phénomènes
a pu être mis en évidence par le développement de souris invalidées (knock-out (KO) ou
Conditional-knock-out (CKO)) (Tableau II.2) et par des études effectuées in vitro (Cao et al.
2005).
Tableau II.2 : Phénotypes des souris invalidées ou mutées pour les BMP -2, -4 et -7 (Cao et
al. 2005).
Gènes Mutations Promoteurs Phénotypes
Bmp4 CKO Collα1 Développement osseux imparfait
Bmp2/4 KO Souris non viables
Bmp2/4 CKO Prx-1 Développement osseux imparfait
Bmp7 KO Imperfections mineures dans l’os

Ces BMPs peuvent avoir des influences variées sur les différents types cellulaires impliqués
dans les processus d’ostéogenèse. Leur rôle apparaît majeur tant dans l’initiation du
phénomène que dans sa régulation :

• Effet sur la migration cellulaire


Les BMPs ont, à des concentrations de l’ordre du fentomolaire, un effet chimioattractant sur
différents types cellulaires potentiellement impliqués dans l’ostéogenèse.

21
Il a été montré que la BMP-2 bovine induisait la migration de monocytes et initiait
l’expression de TGF-β, facteur qui intervient à son tour dans la migration de cellules souches
mésenchymateuses et d’ostéoblastes, et qui participe à leur prolifération et différenciation
ostéoblastique (Cunningham et al. 1992). Les BMP-2, -4, et -7 peuvent, par ailleurs, avoir un
effet direct sur la migration de cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSCs) et
d’ostéoblastes plus matures ; cet effet chimio-attractant apparaît inversement corrélé à l’état
de différenciation de ces cellules (Fiedler et al. 2002, Lee et al. 2006).

• Engagement des cellules souches vers la voie chondro/ostéoblastisque et


stimulation de la différenciation ostéoblastique.
Les BMP-2, -4 et -7 sont impliquées dans l’engagement vers la voie ostéoblastique de cellules
souches non différenciées telles que les C3H10T1/2 ou des MSCs de rat ou de souris (Abe et
al. 2000, Rawadi et al. 2003, Osyczka et al. 2004, Luu et al. 2007). Concernant les cellules
souches mésenchymateuses humaines (hMSC), le rôle des BMPs sur l’engagement vers la
voie ostéoblastique apparaît cependant plus limité. La présence d’agents différenciants dans le
milieu semble, en effet, requise pour observer un effet des BMPs sur la différenciation
ostéoblastique de ces cellules (Osyczka et al. 2004, Schwartz et al. 2008).
Ces protéines ont, d’autre part, un effet sur la chondrogenèse : l’engagement vers la voie
chondroblastique en réponse aux BMP-2 ou -7 a été visualisée sur des cellules souches -
C3H10T1/2 et cellules issues de moelle osseuse de rat (ST-2) - ou pré-ostéoblastes issues
d’explants de crânes de rat (Asahina et al. 1993, Lou et al. 2000, Tominaga et al. 2009).
Les BMPs ne sont pas uniquement impliquées dans l’engagement cellulaire vers les voies
chondro/ostéoblastiques, leur action est soutenue tout au long de la différenciation : elles
stimulent la différenciation et la minéralisation de cellules plus différenciées (pré-ostéoblastes
ou ostéoblastes murins et humains) (Lai et al. 2005).

• Apoptose des ostéoblastes


Il est, d’autre part, envisagé que les BMPs puissent aussi participer au processus apoptotique
normal d’une partie des ostéoblastes qui survient pour contrôler le remodelage osseux.
Gautschi et al. ont montré, en effet, que le traitement d’ostéoblastes humains primaires et
immortalisés (hFOB1.19) avec de la BMP-2, de la BMP-4 et de la BMP-7 (à des
concentrations inférieures à 1ng/ml) induisait une inhibition de la prolifération et une
augmentation de l’apoptose de ces cellules de manière dose-dépendante (Gautschi et al.
2009).

22
• Action sur la vascularisation
Plusieurs études, dans des modèles murins in vitro et in vivo, ont mis en évidence que
l’activation de la voie des BMPs s’accompagnait d’une forte augmentation de l’angiogenèse
osseuse. Ce phénomène apparaît directement relié à la production de membres de la famille
du VEGF par les ostéoblastes (Deckers et al. 2002, Zhang et al. 2009).

• Action sur les ostéoclastes


Les BMPs sont enfin capables de jouer un rôle dans la formation et la survie des ostéoclastes.
Il a été montré dans des modèles murins (in vivo ou in vitro) que les BMPs-2/4 pouvaient
stimuler la formation d’ostéoclastes et qu’elles étaient indispensables à cette formation (Abe
et al. 2000, Okamoto et al. 2006).

4.1.2. Association BMPs-matériaux : Efficacité in vivo

L’efficacité des BMPs, en site ectopique comme orthotopique, est dépendante de la quantité
administrée et de son mode d’association. Son potentiel ostéoinducteur est largement
augmenté par son association avec un matériau. Ce matériau a pour but, d’une part,
d’accueillir la formation d’os à sa surface, et doit donc posséder des caractéristiques
identiques à celles des substituts osseux classiques (biocompatiblité, biorésorbabilité,
porosité…). Il doit, d’autre part, être en mesure d’assurer la rétention de la BMP au niveau du
site chirurgical.
Différentes sortes de matériaux peuvent être utilisées en association avec les BMPs. Les
polymères naturels ou synthétiques, les phosphates de calcium et les matériaux composites
sont parmi les plus étudiés (Seeherman et al. 2005).

Deux matériaux associés avec des BMP recombinantes humaines glycosylées ont déjà reçu
l’agrément de la FDA pour leur utilisation en orthopédie (fusion vertébrale, fractures ouvertes
de tibia et reconstructions maxillofaciales). Il s’agit d’éponges de collagènes absorbables
(ACS) associées avec de la rhBMP-2 (INFUSE Bone Graft, Medtronic Sofamor Danek) ou de
particules de collagène de type I bovin contenant de la rhBMP-7 (OP-1 Device, Stryker
Biotech). L’association se fait directement dans la salle d’opération par immersion de
l’éponge dans la solution protéique pendant 15 minutes. Ces matériaux ont fait l’objet de
premiers tests cliniques concluants, en chirurgie maxillofaciale notamment. Cependant,
quelques études cliniques réalisées avec l’INFUSE Bone Graft pour la fusion intervertébrale

23
montrent dans plusieurs cas, la présence de zones de résorption et une diminution de la
densité osseuse, comme l’indiquent Toth et al. (Toth et al. 2009).
Par ailleurs, ces éponges de collagène absorbables ne sont pas en mesure d’assurer une
libération progressive : la totalité de la BMP est libérée entre 1 et 2 semaines d’implantation
(Uludag et al. 2001).

4.1.2.1. Influence de la quantité administrée sur la réponse


La capacité de la BMP à induire la formation d’os en site ectopique est directement corrélée à
la quantité de protéine implantée. Chez la souris, l’adsorption de rhBMP-2 sur des céramiques
phosphocalciques (HA, BCP, β-TCP) conduit à une formation d’os dose-dépendante, avec
une quantité minimale requise pour assurer l’initiation du phénomène (Alam et al. 2001).
Les doses nécessaires à l’efficacité des BMPs, en site ectopique comme orthotopique, sont
largement dépendantes de l’espèce envisagée. En effet, plus l’espèce est évoluée d’un point de
vue phylogénique, plus la quantité de BMP requise sera importante. Alors que chez les
rongeurs cette quantité est l’ordre du microgramme à la dizaine de microgrammes, chez
l’homme la quantité préconisée en combinaison avec les éponges de collagène absorbables est
particulièrement importante (1,5 mg de rhBMP-2/ml de zone à combler). Chez le mouton par
exemple, qui a une masse corporelle similaire à celle de l’homme, les quantités efficaces sont
plus faibles. Elles sont en général de l’ordre de la centaine de microgrammes (à partir de 100
µg/implant) et la quantité 430 µg/ml de comblement peut correspondre à une valeur moyenne
conseillée d’après Toth et al. (Kessler et al. 2004, Toth et al. 2009).

Mais en parallèle de cette quantité minimale requise, quelques études ont mis en évidence des
effets adverses après implantation en site orthotopique d’une forte quantité de BMP. Sumner
et al. ont montré, par exemple, que la croissance osseuse sur des cylindres de titane revêtus
avec du BCP chez le chien était inversement reliée à la quantité de BMP-2 déposée sur les
échantillons avant lyophilisation (Sumner et al. 2004). Pour connaître l’influence de la
quantité de rhBMP-2 administrée sur la résorption osseuse, Toth et al. ont étudié l’influence
de la quantité de rhBMP-2 ajoutée à des éponges de collagène adsorbable sur la résorption
osseuse après implantation dans des condyles fémoraux de moutons. Ils ont observé que la
quantité de BMP-2 était directement corrélée à l’importance de la résorption mise en place
lors des premières semaines. Bien que l’ostéogenèse soit clairement visible, après 8 semaines
d’implantation, la zone à reconstruire reste encore à ce temps-là plus importante que la zone
de comblement initialement crée (Toth et al. 2009).

24
Ces études, cependant, ont un point commun : les méthodes d’association du facteur de
croissance avec le matériau ne permettent pas une libération soutenue de la protéine et
conduisent à une forte concentration locale de protéine dans les premiers jours d’implantation.

4.1.2.2. Influence du temps de libération


Comme l’indiquent Seeherman et al., il est maintenant acquis qu’une libération soutenue dans
le temps constitue un élément majeur dans la capacité de reconstruction des systèmes
d’association biomatériaux-protéines. Il est donc nécessaire de développer des matériaux qui
permettent une libération progressive et contrôlée du facteur de croissance pour permettre la
migration de cellules progénitrices et leur différenciation ostéoblastique (Seeherman et al.
2005). Un tel profil de libération permet par ailleurs de diminuer la quantité de protéine
associée pour une efficacité équivalente (Liu et al. 2004).

Plusieurs méthodes d’association de la protéine avec le matériau peuvent être envisagées.


Comme nous l’avons indiqué, l’imprégnation simple de la protéine sur le matériau par
immersion de courte durée conduit à une libération très rapide du facteur de croissance. Le
dépôt d’une goutte de protéine sur le matériau puis séchage successif avant implantation ne
permet pas non plus une libération contrôlée et la protéine sera entièrement relarguée lors des
premiers jours d’implantation. Il a été mentionné que dans le cas où la protéine est
simplement précipitée ou séchée sur un matériau, la libération sera principalement reliée à son
degré de solubilité (Uludag et al. 2001, Schmoekel et al. 2004).
L’incorporation de protéine dans des revêtements phosphocalciques, des ciments
phosphocalciques ou certains polymères permet, au contraire, une libération contrôlée dans le
temps (Uludag et al. 2001, Liu et al. 2005, Ginebra et al. 2006). Cette libération soutenue peut
être attribuée à la diffusion de la protéine à travers le matériau, dans le cas de certains ciments
notamment, ou reliée à la dégradation de l’échantillon et donc sous le contrôle des
ostéoclastes (Seeherman et al. 2005). L’ostéoinduction après implantation sous-cutanée chez
le rat de cylindres de titane revêtus d’apatite avec de la rhBMP-2 est largement supérieure
lorsque la rhBMP-2 est incorporée dans le revêtement que lorsqu’elle est simplement déposée
à sa surface et séchée. Après 5 semaines d’implantation, 60% seulement du revêtement a été
détruit par les ostéoclastes et il reste donc encore 40% de la protéine introduite disponible
(Liu et al. 2005).
L’adsorption de protéines sur des matériaux phosphocalcique peut permettre aussi une
libération soutenue dans le temps. L’adsorption sur ces composés est un phénomène qui

25
implique des liaisons fortes entre le substrat et la protéine et la désorption est faible en
absence d’une forte concentration en phosphate. Des céramiques phosphocalciques sur
lesquelles ont été adsorbées de la rhBMP-2 présentent de bonnes capacité d’ostéoinduction.
Des différences de réponses sont obtenues en fonction du rapport HA/β-TCP. La formation
osseuse induite par la BMP apparaît supérieure pour les échantillons de BCP de rapport
HA/β-TCP de 75/25 par rapport aux céramiques (HA, β-TCP ou BCP) (Alam et al. 2001).
Yuan et al. ont montré que les céramiques de BCP avaient une bonne capacité d’adsorption de
BMP bovine et que l’implantation intramusculaire chez le chien de ces échantillons
(HA/β-TCP : 70/30) s’accompagnait d’une formation osseuse importante à 50 et 100 jours
(Yuan et al. 1998).

4.2. L’ostéoinduction induite par les matériaux

Différents types de matériaux présentent des propriétés d’ostéoinduction intrinsèques. Les


matériaux décrits comme ostéoinducteurs sont principalement des céramiques
phosphocalciques (Habibovic et al. 2008).
Il a été mis en évidence que plusieurs paramètres étaient indispensables au phénomène
d’ostéoinduction directement médié par les matériaux. Ces caractéristiques sont comparables
à celles nécessaires pour l’ostéoconduction.

4.2.1. Caractéristiques des matériaux ostéoinducteurs

Les caractéristiques des matériaux qui semblent importantes pour l’ostéoinduction sont les
suivantes :

• Macroporosité :
Ripamonti a mis en évidence que la présence de macropores au sein des matériaux
apparaissait comme un pré-requis pour l’ostéoinduction. La formation d’os après implantation
dans un site ectopique d’hydroxyapatite n’est observée qu’à l’intérieur des macropores. Dans
toutes les études effectuées, concernant l’ostéoinduction par les matériaux, aucune présence
d’os néo-formé en surface des matériaux n’est décrite (Ripamonti 1996).

• Microporosité
Il a aussi été montré que la microporosité était un élément essentiel pour l’ostéoinduction.
Le groupe de De Groot s’est particulièrement penché sur l’importance de la microporosité
dans le phénomène d’ostéoinduction. Habibovic et al. ont montré que la température de

26
frittage des céramiques d’HA ou de BCP (HA/β-TCP : 88/12) avait une forte influence sur les
propriétés ostéoinductrices des matériaux phosphocalciques. La plus grande quantité d’os
néo-formé est observée pour les échantillons avec une microporosité et une surface spécifique
plus importantes (Habibovic et al. 2005). Des observations similaires ont pu être effectuées
par comparaison d’échantillons de BCP (70/30) poreux ou lisses (Habibovic et al. 2008).

• La bioactivité
En parallèle des matériaux phosphocalciques, qui comme nous l’avons présenté sont bioactifs,
d’autres types de matériaux peuvent avoir des propriétés ostéoinductrices. La formation d’os
ectopique a pu être observée dans des céramiques d’alumine (Yuan et al. 2001d), du titane
(Fujibayashi et al. 2004) et des verres céramiques (Yuan et al. 2001b). Ces différents types de
matériaux ont aussi la caractéristique d’être bioactifs et la formation d’os ectopique est
précédée de la précipitation d’apatite nanocristalline dans leurs cavités.

4.2.2. L’ostéoinduction par les céramiques phosphocalciques

Parmi les céramiques phosphocalciques étudiées, des différences peuvent être observées en
fonction de la composition chimique. Dans plusieurs de leurs études, Habibovic et al., ont
comparé le potentiel ostéoinducteur de céramiques phosphocalciques de compositions et
structures variées après implantation intramusculaire chez la chèvre. Ils ont constaté que les
céramiques de BCP (HA/β-TCP : 70/30 et 80/20) présentant une macroporosité et une
microporosité étaient ostéoinductrices alors que des échantillons d’HA et d’apatite
carbonatée, de porosités équivalentes, étaient incapables d’initier la formation d’os dans ce
site ectopique. Les auteurs, qui ont associé ces effets à la surface spécifique des échantillons,
indiquent qu’une surface spécifique minimale serait requise pour observer un phénomène
d’ostéoinduction. Ils suggèrent qu’il serait essentiel d’avoir des échantillons avec des surfaces
spécifiques « élevées » mais adaptées car une surface spécifique trop élevée, comme celle de
l’apatite carbonatée, ne permettrait pas d’initier la formation d’os en site ectopique.
(Habibovic et al. 2006a, Habibovic et al. 2008).
Yuan et al. ont montré, par ailleurs, que l’implantation intramusculaire chez le chien de
céramiques de BCP (HA/β-TCP : 62/38) conduisait à une formation ectopique d’os plus
précoce que pour des échantillons d’HA (30 jours contre 45 jours respectivement). La
quantité d’os formé apparaissait aussi plus importante à tous les temps de l’étude sur les
céramiques de BCP par rapport aux échantillons d’HA (Yuan et al. 2006a). Dans une autre
étude, Yuan et al. ont comparé le potentiel ostéoinducteur de céramiques d’α-TCP et de

27
β-TCP qui diffèrent notamment par leur produit de solubilité. Après implantation
intramusculaire chez le chien, la présence d’os néoformé a été détectée sur les céramiques de
β-TCP à 45 et 150 jours alors que les échantillons d’α-TCP, qui subissent une plus grande
dissolution, apparaissaient incapables d’induire la formation osseuse. D’après ces études, ce
sont les céramiques de BCP, frittées à faible température ou de β-TCP qui semblent avoir les
meilleures propriétés ostéoinductrices (Yuan et al. 2001a).

Par l’implantation de mêmes échantillons dans le muscle et en site orthotopique, Yuan et al. et
Habibovic et al. ont montré, en outre, qu’il existait une corrélation directe entre
ostéoinduction et ostéoconduction : plus le matériaux a une forte capacité à induire la
formation d’os en site ectopique, plus son potentiel ostéoconducteur est important (Yuan et al.
2006a, Habibovic et al. 2008).

4.2.3. Les mécanismes d’action envisagés

Ces différentes études s’appuient sur des comparaisons entre différents types de matériaux.
Elles ont déjà permis de mettre en évidence l’importance de plusieurs paramètres dans le
phénomène d’ostéoinduction développé par les matériaux (macro- et micro-porosités, capacité
de précipitation d’une apatite carbonatée nanocristalline à leur surface). En revanche, les
mécanismes d’actions n’ont pu être déterminés pour l’instant.
Plusieurs hypothèses ont été avancées pour expliquer ces phénomènes. Ripamonti suggère
que l’ostéoinduction par les matériaux pourrait être liée à leur capacité de fixation de
protéines ostéoinductrices telles que les BMPs. Selon lui, une accumulation de ces facteurs de
croissance pourrait avoir lieu à l’intérieur des pores des matériaux et ainsi induire la
différenciation ostéoblastique des cellules progénitrices environnantes (Ripamonti 1996).
Cette hypothèse a aussi été reprise par Habibovic et al. qui mentionnent que la formation
d’apatite carbonatée nanocristalline à la surface des matériaux ostéoinducteurs pourrait être
asociée à une co-précipitation de facteurs de croissances favorables à l’initiation du
phénomène (Habibovic et al. 2005). Ces auteurs indiquent, par ailleurs, qu’il pourrait y avoir
une influence directe de la composition ionique du milieu à l’intérieur des pores des
céramiques. Ils suggèrent que des phénomènes de dissolution/reprécipitation des composés
phosphocalciques, et notamment des céramiques des BCP, pourraient permettre la formation
de micro-environnements favorables à la migration et à la différenciation ostéoblastique des
cellules progénitrices. Il est à noter toutefois que, d’un point de vue physico-chimiste, la

28
dissolution de céramiques d’HA, β-TCP ou BCP, qui serait responsable d’une libération
importante d’ions calcium et phosphate, est peu problable en raison de la sursaturation des
fluides biologiques par rapport à ces composés phosphocalciques. En revanche, ceci n’exclut
pas l’influence potentielle de micro-environnements spécifiques formés au sein des
micropores des implants dans l’initiation du phénomène d’ostéoinduction. Il a enfin été
suggéré que la réaction inflammatoire pourrait avoir une influence sur l’ostéoinduction (Le
Nihouannen et al. 2005). Quelques expériences in vitro semblent étayer cette hypothèse (cf.
paragraphe 5.3) par contre, celle-ci n’a, pour l’instant, pas été validée in vivo.
A l’heure actuelle, aucune de ces hypothèses n’a pu être confirmée et il n’est pas possible de
déterminer précisément les facteurs clés responsables du phénomène d’ostéoinduction. En
effet, bon nombre de matériaux ostéoconducteurs présentent toutes les caractéristiques citées
précédemment sans pour autant posséder des propriétés ostéoinductrices.

La réponse de chacun des types cellulaires impliqués dans la formation osseuse vis-à-vis des
matériaux implantés est susceptible d’avoir une influence majeure sur ce phénomène. Les
études cellulaires permettent en partie d’apporter des informations sur les caractéristiques
importantes dans les phénomènes d’interaction cellules/matériaux.

5. Les interactions cellules/biomatériaux


Différents types cellulaires sont susceptibles d’interagir avec les matériaux lors de leur
implantation in vivo en site orthotopique ou ectopique et, comme nous l’avons indiqué, les
caractéristiques des matériaux influent de manière importante sur la réponse obtenue.
L’influence de ces caractéristiques sur le comportement de ces cellules peut être évaluée in
vitro. Ces études permettent tout d’abord de recueillir des données préliminaires concernant la
biocompatibilité et les propriétés ostéoconductrices et ostéoinductrices éventuelles des
matériaux synthétisés. Elles permettent, par ailleurs, d’évaluer de manière compartimentée
l’influence de certains paramètres sur les interactions cellules/matériaux et apportent par
conséquent des informations sur les phénomènes observés après implantation de ces substituts
osseux chez l’animal. Trois grandes classes de cellules vont interagir avec les matériaux in
vivo et, d’après les études effectuées in vitro, plusieurs paramètres principaux sont
susceptibles de modifier le comportement de ces cellules vis-à-vis des biomatériaux.

29
5.1. Matériaux et ostéoprogéniteurs ou ostéoblastes

Les ostéoblastes et les cellules souches progénitrices sont responsables de la formation


osseuse in vivo respectivement dans un contexte orthotopique et ectopique. Après colonisation
du matériau, ces cellules vont migrer, adhérer à la surface du matériau puis proliférer avant
d’entamer leur phase de différenciation ostéoblastique puis leur minéralisation. Une bonne
interaction de ces cellules avec les matériaux est, par conséquent, primordiale et de
nombreuses études s’intéressent aux paramètres susceptibles de favoriser la réponse de ces
cellules vis-à-vis des biomatériaux. Il a été montré que plusieurs de ces facteurs pouvaient
avoir une forte influence sur l’adhésion, la prolifération et la différenciation ostéoblastique de
ces cellules.

5.1.1. Influence de la composition chimique

Nous avons déjà indiqué que les composés phosphocalciques présentaient de bonnes capacités
de reconstruction osseuse et possédaient dans certains cas des propriétés ostéoinductrices in
vivo. Ces composés semblent, de même, apporter un avantage significatif sur les réponses
cellulaires observées in vitro. D’une manière générale, en effet, la présence de phosphate de
calcium dans les matériaux favorise à la fois l’adhésion, la prolifération et la différenciation
ostéoblastique de cellules souches mésenchymateuses ou d’ostéoblastes (Midy et al. 2001,
Zhao et al. 2006). La présence de phosphates de calcium dans les matériaux semble être
particulièrement importante dans les phénomènes d’initiation de la différenciation
ostéoblastique. En effet, plusieurs études ont montré que des composés apatitiques pouvaient
induire la différenciation de cellules progénitrices ou d’ostéoblastes sans autre agent de
différenciation. Müller et al., par exemple, ont montré que la différenciation de hMSCs en
ostéoblastes, en absence de milieu ostéogénique, était importante sur des composés
phosphocalciques (gel contenant de l’HA et du β-TCP) et ont indiqué une forte influence de la
présence de phosphate de calcium sur la différenciation (Muller et al. 2008). Ces observations
ont été confirmées par le travail de Lin et al., qui ont mis en évidence une induction de la
différenciation ostéoblastique de MSCs murines (C3H10T1/2) après culture sur des pastilles
d’HA (Lin et al. 2008). De même, Sun et al. ont observé une très forte expression génique des
marqueurs de la différenciation ostéoblastique après croissance de cellules mésenchymateuses
humaines sur les pastilles de BCP (HA/β-TCP : 70/30) (Sun et al. 2008). Chou et al. ont
montré, d’autre part, que le revêtement de puits de culture par des phosphates de calcium

30
biomimétiques induisait une différenciation des MC3T3-E1 en absence de milieu
ostéogénique (Chou et al. 2005).

Par ailleurs, comme pour d’autres types de matériaux (titanes, bioverres…), la réponse
cellulaire observée est particulièrement dépendante de la composition chimique des
céramiques phosphocalciques. En effet, la présence d’ions étrangers, tels que des ions
carbonates, strontium, magnésium, joue par exemple un rôle important sur l’interaction
cellules/matériaux (Redey et al. 2000, Capuccini et al. 2008, Sader et al. 2008). Parmi les
composés phosphocalciques purs, des différences de réponse sont aussi observées en fonction
du rapport Ca/P (Suzuki et al. 2000, Ergun et al. 2008). Des modifications de l’adhésion, la
prolifération et la différenciation ostéoblastique entre des échantillons d’HA, β-TCP ou BCP
(avec différents rapports HA/β-TCP) sont en effet souvent détectées (Suzuki et al. 2000,
Arinzeh et al. 2005, dos Santos et al. 2009). Ces effets peuvent être reliés d’une part à leur
composition chimique - et notamment leur capacité d’échange ionique avec le milieu - mais
aussi à leur propriétés physiques, comme par exemple leur énergie de surface ou leur
topographie comme l’ont montré Dos Santos et al. après revêtement d’échantillons d’HA ou
β-TCP avec un film d’or (dos Santos et al. 2008, 2009).

5.1.2. Influence de la topographie de surface

En effet, de nombreuses études ont mis en évidence une influence de la topographie de


surface des matériaux sur les réponses cellulaires. La topographie et la rugosité sont
susceptibles d’induire des modifications de l’orientation, la morphologie, l’adhésion, la
prolifération et la différenciation des cellules.
L’influence de la microtopographie sur la réponse cellulaire est dépendante de la taille et de la
morphologie du motif créé. D’après l’étude de Zinger et al., une microtopographie avec des
pores de diamètre équivalent ou légèrement supérieur à la taille des cellules affecterait
l’adhésion et la morphologie d’ostéoblastes humains (MG63), alors qu’elle serait sans effet
lorsque les pores ont une taille inférieure (de l’ordre de 10 µm) (Zinger et al. 2004). La
microtopographie peut, par ailleurs, conduire à une orientation particulière des cellules
ostéoblastiques. Ricci et al. ont montré que des colonies issues de moelle osseuse de rat,
s’allongeaient et se positionnait parallèlement aux rainures tracées à la surface des matériaux
(Ricci et al. 2008).

31
La micro-topographie ou la rugosité engendrée par celle-ci ont aussi une influence sur la
différenciation ostéoblastique. Il a été mis en évidence, pour des ostéoblastes (primaires issus
de crânes de rat ou MC3T3), que la présence d’une rugosité en surface des matériaux
favorisait la différenciation ostéoblastique et était nécessaire pour l’obtention d’une
minéralisation physiologique in vitro (Boyan et al. 2002, Park et al. 2008).
Plus récemment, il été montré que la nanotopographie avait une forte influence sur la
morphologie et l’adhésion de différents types cellulaires dont des ostéoblastes (MG63 ou
ostéoblastes primaires humains) ou des cellules souches mésenchymateuses. Des différences
du pourcentage d’adhésion et de l’étalement des cellules ainsi que du nombre et de la
répartition des points focaux ont été observées en réponse à des nanotopographies variables
(Lim et al. 2007, Biggs et al. 2008). La nanotopographie semble, par ailleurs, avoir un effet
majeur sur l’expression génique et l’activation de voies de signalisation des ostéoblastes. Lim
et al. ont constaté que la présence de creux de tailles nanométrique s’accompagnait de
l’expression sélective de certaines protéines impliquées dans les phénomènes d’adhésion
(sous-unité αv des intégrines, paxiline et Focal Adhesion Kinase (FAK)) et de l’activation de
voies de signalisations médiées par les intégrines (autophosphorylation de FAK) (Lim et al.
2007). Biggs et al. ont de même montré une modulation des voies de différenciation
ostéoblastique (Wnt/β-cathenine, voie du TGF-β) en réponse à des nanotopographies, avec
une influence particulière de la forme du motif synthétisé sur la réponse (Biggs et al. 2008).

5.1.3. Influence de la taille des cristallites

La taille des cristallites apparaît aussi être un élément important dans l’interaction
ostéoblastes/matériaux avec une réponse inversement proportionnelle à la taille des cristallites
(Webster et al. 2000a, 2000b). Webster et al. ont montré que l’adhésion, la prolifération et la
différenciation d’ostéoblastes primaires de rats, étaient supérieures sur des « nanophases »
(matériaux composés de grains inférieurs à 100 nm) par rapport à des échantillons présentant
des grains de taille plus importante. Dans ces études, la réponse obtenue est indépendante de
la composition chimique du substrat, et apparaît principalement associée à l’augmentation des
capacités d’adsorption protéique des cristaux relative à la diminution de leur taille (Webster et
al. 2000a, 2000b).

32
5.1.4. Influence de l’énergie de surface

Plusieurs études ont, par ailleurs, indiqué que l’énergie de surface des matériaux pouvaient
avoir un effet sur l’adhésion et la prolifération et la différenciation ostéoblastique
d’ostéoblastes humains (hFOB 1.19 ou MG63). Ils ont montré que ces réponses cellulaires
étaient fortement corrélées à la mouillabilité des échantillons et que d’une manière générale
l’adhésion, la prolifération et la différenciation ostéoblastique seraient favorisées par des
surfaces plutôt hydrophiles (Liu et al. 2007, Navarro et al. 2008). La morphologie des cellules
et notamment leur étalement semble aussi très dépendants de l’énergie de surface du matériau
(dos Santos et al. 2008).

5.1.5. Les mécanismes d’action possibles

Ces différentes études montrent que les réponses cellulaires peuvent être très variables en
fonction du type d’échantillon étudié et de ses caractéristiques. Il est très difficile d’étudier un
facteur indépendamment des autres et donc d’identifier de manière claire l’influence de
chaque paramètre sur l’interaction cellule-matériau. Les mécanismes par lesquels les
matériaux pourraient influencer la réponse cellulaire ne sont pas connus. Alors que beaucoup
d’études apparentent les différences d’adhésion, de prolifération et de différenciation
cellulaires à la capacité du substrat à adsorber des protéines d’adhésion comme la fibronectine
ou la vibronectine (Webster et al. 2000b, Chou et al. 2005, Rouahi et al. 2006b), certains
auteurs, en revanche, ne trouvent pas de corrélation directe entre l’adsorption de telles
protéines sur le matériau et la réponse cellulaire (Murphy et al. 2005, Pellenc et al. 2006). Lin
et al. proposent que la différenciation induite par l’HA soit liée à une augmentation de la
sécrétion ou même de la synthèse de facteurs de différenciation par les cellules
indépendamment du recrutement par le matériau de facteurs environnants (Lin et al. 2008).
D’autre part, Lim et al. indiquent que la nanotopographie pourrait avoir un effet direct sur
l’adhésion cellulaire médiée par l’augmentation de l’expression de gènes spécifiques et
l’activation de voies de signalisation. Ils pensent à un mécanisme par lequel les surfaces
nanostructurées influenceraient physiquement les voies intracellulaires (Lim et al. 2007). Des
observations similaires ont été effectuées par Biggs et al. qui ont montré des différences de la
régulation des voies ostéoblastiques pour des cellules souches mésenchymateuses en réponse
à des nanotopographies de forme particulières (Biggs et al. 2008).

33
5.2. Matériaux et ostéoclastes

Un substitut osseux, dans certaines applications, doit avoir la capacité d’être progressivement
éliminé et remplacé par l’os néoformé. La dégradation des matériaux phosphocalciques peut
être la résultante de la dissolution du matériau dans les fluides biologiques d’une part et de
l’action des ostéoclastes d’autre part. Comme pour les ostéoblastes ou les cellules
ostéoprogénitrices, les caractéristiques des matériaux ont une forte influence sur l’action des
ostéoclastes. L’activité de résorption des ostéoclastes peut être modulée par la composition
chimique, la solubilité des matériaux et leur topographie (Yamada et al. 1997, Webster et al.
2001, Monchau et al. 2002). Kim et al. ont montré que la dissolution par les ostéoclastes
d’apatite nanocristalline similaire au minéral osseux était inversement corrélée à l’état de
maturation de l’apatite et pouvait être largement augmentée par un léger pH acide du milieu
(Kim et al. 2001). L’énergie de surface des échantillons joue par ailleurs un rôle sur
l’adhésion des ostéoclastes alors que l’étalement des cellules serait plutôt lié à la composition
chimique (Redey et al. 1999).

5.3. Matériaux et cellules immunitaires

Lors de la phase d’implantation, une réaction inflammatoire précoce apparaît en réponse au


geste chirurgical et à l’introduction d’un matériau étranger. Lors de cette réaction, des cellules
du système immunitaire vont être en contact avec l’implant. Il a récemment été suggéré que
les interactions entre ces cellules et le matériau implanté pourraient avoir une influence sur les
propriétés d’ostéoinduction des matériaux (Le Nihouannen et al. 2005). Cette hypothèse
pourrait en partie être étayée par des observations effectuées in vitro. Quelques études ont
montré que la rugosité de surface d’échantillons induisait une forte augmentation de la
production de la prostaglandine E2 (PGE2) par des macrophages. Cette PGE2 sécrétée est,
par ailleurs, capable d’induire la migration et la différenciation des cellules
mésenchymateuses humaines (De Bruijn et al. 2008). Il a, par ailleurs, été mis en évidence
que la co-culture de monocytes avec des particules d’HA s’accompagnait d’une production de
cytokines pro-inflammatoires par les cellules (Grandjean-Laquerriere et al. 2005). Ces travaux
suggèrent que de telles interactions cellules inflammatoires/matériaux pourraient participer à
la mise en place des phénomènes d’ostéoinduction par les matériaux.

34
6. Objectifs de notre étude
L’objectif principal de notre étude était de développer un matériau qui présente une forte
réactivité de surface dans le but de lui donner des propriétés ostéoinductrices par association
avec de la rhBMP-2. Nous avons basé notre projet sur plusieurs hypothèses :

Hypothèse 1 : L’ajout d’un revêtement d’apatite biomimétique à la surface de céramiques


phosphocalciques frittées ostéoconductrices est susceptible d’augmenter la surface spécifique
et la réactivité des échantillons.
Hypothèse 2 : Augmenter la réactivité de surface des échantillons devrait permettre
d’adsorber une grande quantité de protéine, et notamment de rhBMP-2, et une libération
progressive dans le temps.
Hypothèse 3 : La combinaison (céramiques phosphocalciques + revêtement + rhBMP-2)
serait plus ostéoinductrice que les échantillons sans revêtement biomimétique.
Hypothèse 4 : Etant donné sa forte réactivité, le revêtement à lui seul – sans ajout de facteurs
de croissance – pourrait avoir un certain potentiel ostéoinducteur.

Pour valider ou infirmer ces hypothèses, nous avons réalisé un projet en différentes étapes.
La première phase du projet comprenait le développement d’un revêtement d’apatite
nanocristalline carbonatée analogue au minéral osseux sur des céramiques phosphocalciques.
Des céramiques poreuses de phosphate de calcium biphasique (HA/β-TCP : 65/35) nous ont
été fournies par la société Teknimed. Le choix de cette composition a été réalisé en raison des
bonnes propriétés ostéoconductrices et la résorbabilité progressive de telles céramiques.
La méthode de revêtement était basée sur des expériences préliminaires réalisées au sein du
laboratoire du CIRIMAT. Dans un premier temps, il a été nécessaire de mettre au point les
conditions expérimentales en vue d’obtenir un revêtement assez homogène et réactif.
Plusieurs expériences ont été réalisées et différents types de revêtements ont été obtenus. Une
sélection de ces revêtements par l’étude de l’adsorption d’une protéine modèle, l’albumine de
sérum bovin a été effectuée. Ces différentes études, ne seront cependant pas présentées ici. A
l’issue de ces expériences, deux revêtements, basés sur un même type de protocole, ont été
choisis. Une caractérisation physico-chimique poussée a été réalisée sur ces échantillons.
La réactivité de ces échantillons a ensuite été évaluée. Pour cela, nous avons comparé, d’une
part, les capacités d’échanges ioniques et, d’autre part, les capacités d’adsorption de la
rhBMP-2 sur les céramiques témoins et revêtues avec les deux types de revêtements

35
précédemment choisis. Nous avons étudié l’adsorption et la libération de la rhBMP-2 sur nos
céramiques par suivi d’un traceur radiomarqué dans le laboratoire de D. Fourmy (INSERM
U858). Cette étude avait, d’une part, pour but de comparer nos échantillons vis-à-vis de leur
propriétés d’adsorption et de retention protéique et, d’autre part, constituait un pré-requis pour
les études animales effectuées par la suite. Nous avons donc choisi les conditions
expérimentales (quantité de protéine/échantillon, type de milieu de libération) en fonction de
ces études futures. A l’issue de ces expériences d’adsorption protéique, un seul des deux
revêtements étudiés a été conservé pour la suite du projet.
La troisième partie de notre travail a consisté à évaluer le comportement cellulaire vis-à-vis de
nos matériaux in vitro. Cette partie avait deux buts principaux : 1) comparer la
biocompatiblité et le potentiel de différenciation ostéoblastique de nos céramiques témoins et
revêtues en utilisant des cellules progénitrices des ostéoblastes et 2) évaluer la différenciation
ostéoblastique en réponse à la rhBMP-2 adsorbée sur les échantillons.
Enfin, nous avons voulu déterminer le potentiel ostéoinducteur de nos différents échantillons
dans un modèle animal. Des implantations intramusculaires des céramiques témoins et
revêtues en présence ou absence de rhBMP-2 ont été effectuées chez le mouton. La rhBMP-2
a été associée aux échantillons soit par la méthode de dépôt d’une solution concentrée puis
séchage soit par adsorption réelle de la protéine sur les échantillons.

L’ensemble du projet a été pensé de manière à pouvoir effectuer un transfert industriel du


procédé et utiliser le matériau développé pour des applications cliniques à court ou moyen
terme, si les résultats obtenus le permettaient. Les expériences ont donc été réalisées dans
cette optique, depuis la prise en considération des contraintes liées au transfert industriel du
procédé jusqu’au choix du modèle animal et des quantités de protéines associées.

La réalisation de ce projet global a nécessité la collaboration de cinq laboratoires académiques


ou cliniques et d’un partenaire industriel. La conduite du projet a été principalement réalisée
par les Professeurs Pascal Swider et Christian Rey, qui ont co-dirigés cette thèse.
Les différentes équipes et leurs responsables scientifiques impliqués dans ce projet sont les
suivants :
Institut Carnot-CIRIMAT-INPT-ENSIACET
Pr. Christian Rey, Dr. Christèle Combes, Dr. Sophie Cazalbou
Mise au point et caractérisation du procédé de revêtement et adsorption protéique

36
Laboratoire de biomécanique EA3697 (UPS)
Pr. Pascal Swider, Dr. Jérôme Briot, Dr. Nicolas Bonneviale, Dr. Jean-Michel Lafosse
Etude de la perméabilité, traitement d’image pour l’histomorphométrie et acquisition
d’images par µCT

INSERM U563, Département Lipoprotéines et Médiateurs Lipidiques


Dr. Fabienne Briand-Mésange, Pr. Jean-Pierre Salles
Etude de l’adsorption protéique et expériences en culture cellulaire

Service de Chrirurgie des animaux de compagnie, Ecole Nationale Vétérinaire de


Toulouse
Dr. Didier Mathon, Dr. Sophie Palierne, Pr. André Autefage
Implantation chez l’animal et étude des résultats

Département de cytologie et anatomie pathologique, CHR Rangueil


Dr. Anne Brouchet-Gomez, Pr. Marie-Bernadette Delisle
Préparation et études histologiques des explants

Teknimed S.A., L’union, France


Dr. Stéphane Gonçalvès, Mr. Léonard
Soutien matériel et financier du projet et transfert industriel

En parallèle de leur contribution dans leurs domaines spécifiques de compétences, ces


différents acteurs se sont impliqués dans la conception et la réalisation du projet dans son
ensemble.

Ce projet a été soutenu financièrement par la région Midi-Pyrénée (dossier n°06001852) et


par l’entreprise Teknimed.

37
Chapitre 2

Etude d’un procédé de revêtement de


céramiques poreuses par une apatite carbonatée
nanocristalline
Dans ce chapitre, nous présenterons les caractéristiques de revêtements d’apatite analogue au
minéral osseux réalisés sur des granulés de BCP. L’étude bibliographique de ce chapitre
résume les caractéristiques du minéral osseux et de ses analogues de synthèses utilisés comme
base dans notre procédé de recouvrement et fait un point rapide sur quelques procédés de
revêtements à basse température déjà utilisés. Dans la partie « Résultats », nous comparerons
les caractéristiques de deux types de dépôts réalisés.

1. Introduction bibliographique

1.1. Les caractéristiques du minéral osseux

Les apatites biologiques sont souvent décrites comme de l’hydroxyapatite (Ca10(PO4)6(OH)2)


substituée. Plusieurs études ont cependant montré que l’apatite du minéral osseux était
significativement différente de l’hydroxyapatite. Les caractéristiques principales de ces
apatites biologiques sont mentionnées ci-après.

Le minéral osseux est constitué de fines plaquettes d’apatite allongées selon l’axe c présentant
une surface spécifique importante. Les dimensions des cristallites évoluent en fonction de la
maturation du minéral. Elles sont de l’ordre de 15-20 nm x 5-8 nm (Cazalbou 2000, Kuhn et
al. 2008).
Il est désormais admis que le minéral osseux est constitué d’apatite carbonatée
nanocristalline, sans autres phases phosphocalciques détectées, et contient des substitutions
ioniques telles que HPO4, Na et Mg (Kokubo 2008). La structure apatitique du minéral osseux
permet des substitutions partielles ou totales sans que celle-ci ne soit notablement modifiée.
L’intégration d’ions CO32- et HPO42- dans la structure apatitique du minéral osseux a été mise
en évidence. La substitution d’ions PO43- par les ions HPO42- entraine la formation d’une
lacune en ions Ca2+ et d’une lacune en ions OH-. Les ions carbonates peuvent eux se
substituer soit aux ions PO43- soit aux ions OH- soit aux deux à la fois. Il se forme alors des
apatites carbonatées en site de type B, de type A ou de type AB, respectivement. Les
substitutions de type B entrainent l’apparition de lacunes en calcium et OH-, alors que seules
des lacunes en ions OH- sont présentes pour les substitutions de type A (Combes et al. 2003).
Ce sont les carbonates substitués en site de type B qui sont majoritaires dans l’émail, l’os et la
dentine (Rey et al. 1991). La proportion de carbonates de type A augmente cependant au
cours du temps dans l’os (Kuhn et al. 2008).

38
Les rapports atomiques Ca/P et Ca/(P+C) - avec Ca = calcium, P = phosphate et C =
carbonate - sont souvent utilisés pour caractériser la composition chimique des apatites
biologiques. Une hydroxyapatite stœchiométrique possède un rapport Ca/P de 1,67. Ces
rapports donnent en général des indications sur l’écart à la stœchiométrie relatif aux ions
calcium. Le rapport Ca/P ne peut pas être relié directement à la stœchiométrie de l’apatite en
raison de la présence, dans les apatites biologiques, de différentes substitutions carbonate qui
remplacent essentiellement les groupements phosphate. Les rapports Ca/(P+C) ou
(Ca+Na)/(P+C) donnent donc des informations sur la stœchiométrie plus proches de la réalité
en considérant que des lacunes n'ont jamais pu être mise en évidence sur les sites phosphate
des apatites. Pour le minéral osseux, ce rapport est toujours très inférieur à 1,67 et témoigne
que le minéral osseux est une apatite fortement déficiente en calcium (Tableau II.1). Au cours
de la maturation de l’os, les rapports Ca/P et Ca/(P+C) de même que la teneur en ions
carbonate augmentent légèrement (Kuhn et al. 2008). Ces données indiquent que les cristaux
qui composent l’os tendent vers une apatite plus stable. Le taux de carbonate peut être assez
variable et est compris entre 4 et 7 %.

Tableau II.1 : Rapports atomiques et pourcentages de carbonates de quelques apatites


biologiques.
Echantillons Ca/P Ca/(P+C) Taux CO32- (%) Référence
Os spongieux bovin 1,51 – 1,58 1,31 – 1,33 4,8 – 5,3
(Kuhn et al. 2008)
Os cortical bovin 1,61 – 1,64 1,39 – 1,41 5,0 – 5,3
Os de poulet 1,51 – 1,88 1,27 – 1,45
(Cazalbou 2000)
Os de maccaques 1,72 – 1,74

Une différence importante entre le minéral osseux et l’hydroxyapatite vient de la faible teneur
en ions OH- du minéral osseux. Plusieurs études ont montré l’absence totale d’ions hydroxyle
dans la structure apatite de l’os (de rat ou de bovins notamment) (Rey et al. 1995, Loong et al.
2000). La détection de ces ions est cependant très sensible aux conditions de préparation des
échantillons et une étude récente par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) solide a
montré la présence d’ions OH- dans le minéral osseux de rat, de chat et d’homme. La quantité
d’ions OH- reste cependant très faible et représenterait pour un os cortical humain environ
20% du taux présent dans l’hydroxyapatite, d'après cette seule étude (Cho et al. 2003).
D'autres travaux du Laboratoire, non encore publiés, concernant l’étude d’os frais de
différents mammifères par spectroscopie Raman suggèrent des taux d'hydroxylation beaucoup

39
plus faibles compris entre 0 et 5%. Notons qu'une des difficultés de ces études est liée à
l'hydrolyse interne des ions PO43- de l'apatite par des molécules d'eau :
PO43- + H2O → HPO42- + OH-
qui peut modifier sensiblement la teneur en ions OH- au cours du temps.

D’autre part, une caractéristique importante des apatites biologiques est la présence d’un
environnement ionique non apatitique à la surface des nanocristaux. Cet environnement a été
attribué à la présence en surface des cristaux d’une couche hydratée relativement bien
structurée contenant des ions labiles (CO32-,HPO42- et PO43- labiles) (Eichert et al. 2002).
Eichert et al. ont montré que, lors du séchage d’analogues de synthèse, cette couche perdait
son organisation initiale et donnait des environnement non-apatitiques de nature différente,
proches d'un phosphate amorphe. Cependant une réhydratation permet une réorganisation
partielle de cette couche. Il a été suggéré que cette couche hydratée permettait la réduction de
l’énergie de surface des nanocristaux d’apatite (Eichert et al. 2002). Ces environnements non
apatitiques peuvent être détecté par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR).
Cette couche plus ou moins hydratée, existant à la fois sur les apatites biologiques et leurs
analogues de synthèse, a fait l’objet de nombreuses études (Cazalbou 2000, Rey et al. 2007).
Elle est pourrait être en partie responsable de la forte réactivité de ces cristaux, puisqu’elle
contient des ions relativement mobiles et facilement échangeables.

La composition chimique et la structure du minéral osseux ne sont pas figées dans le temps.
De nombreux facteurs évoluent au cours de la maturation du minéral. La maturation
correspond à une évolution des apatites en solution conduisant à un développement des
domaines apatitiques stables aux dépens des ions de la couche hydratée moins stable. La
maturation conduit à des cristallites de taille plus grande dans certains organes, l'émail
dentaire par exemple, et se traduit par une nette augmentation du rapport Ca/(P+C) et une
évolution vers l'hydroxyapatite stœchiométrique. Dans les os, cependant, on observe une
augmentation du taux de carbonates et l'évolution vers une stœchiométrie beaucoup plus
limitée. Dans tous les cas cependant, on note une nette diminution de la couche hydratée
(Cazalbou et al. 2005, Kuhn et al. 2008), avec une intégration de certains ions présents dans
cette couche dans la structure apatitique.

40
1.2. Les analogues de synthèse du minéral osseux

L’équipe du CIRIMAT s’intéresse depuis plusieurs années à la réalisation et la caractérisation


d’apatites nanocristallines analogues au minéral osseux dans le but de mieux connaître les
propriétés des apatites biologiques et expliquer leur forte réactivité. Elle est parvenue à
réaliser des analogues de synthèse présentant des caractéristiques très intéressantes,
semblables à celles de l’os :
- Cristallites de forme et de taille similaires à celles de l’os
- Surface spécifique importante (supérieure ou égale à 100 m2/g)
- Obtention d’une apatite carbonatée déficiente en calcium contenant des ions
HPO42- dans la structure apatitique. La substitution des carbonates est
majoritairement de type B et le taux de carbonate peut être ajusté.
- Faible quantité d’ions OH- dans la structure apatitique.
- Présence d’une couche hydratée à la surface des nanocristaux (présence d’ions
CO32-, HPO42- et PO43- labiles).
- Evolution importante des cristaux au cours du temps caractérisée par des
modifications semblables à celles qui parviennent lors de la maturation du minéral
osseux.
Ces apatites se comportent de manière similaire au minéral osseux et constituent donc un bon
modèle des apatites biologiques. Elles peuvent être considérées comme des matériaux
biomimétiques et sont très réactives.

1.2.1. Propriétés des apatites biologiques et de leurs analogues de


synthèse : Influence de la couche hydratée

La réactivité des apatites biologiques dépend de plusieurs facteurs : la présence


d’environnements non apatitiques (couche hydratée) mais aussi la composition, la taille et la
morphologie des cristallites. Ces apatites évoluent de manière significative au cours du temps
et cette maturation influence leurs propriétés d’échange ionique et d’adsorption de protéines.
La quantité d’ions labiles (HPO42-, PO43- et CO32-) diminue au cours de la maturation des
analogues de synthèse et avec l’âge pour les apatites biologiques. La présence de carbonates
dans cette couche participe à sa stabilisation (Rey et al. 1995). Au cours de la maturation, il a
été montré, par spectrométrie infrarouge, en utilisant des substitutions isotopiques, que ces
ions s’intègraient progressivement dans la structure apatitique et que la couche hydratée se

41
réduisait. D’autre part, il a été suggéré que la diminution de cette couche hydratée pouvait
s’accompagner de l’intégration d’ions OH- dans la structure apatitique des analogues de
synthèse (Eichert et al. 2002, Cazalbou et al. 2005).

La couche hydratée semble essentielle dans les mécanismes d’échanges ioniques. En effet
qu’il s’agisse d’échanges anionique (HPO42- et CO32-) ou cationique (Sr2+ ou Mg2+ et Ca2+),
l’échange est très rapide et très facile. La réversibilité de l’échange est aussi très élevée
(presque totale). La diminution de la taille de la couche hydratée, observée lors de la
maturation, s’accompagne d’une réduction significative des capacités d’échanges ioniques de
ces apatites. Cet environnement ionique non-apatitique apparaît donc essentiel dans la
réactivité du minéral osseux (Cazalbou et al. 2004, Cazalbou et al. 2005).
L’échange ionique se fait initialement par l’intermédiaire de cette couche hydratée (échange
rapide avec les ions labiles). Selon le type d’ion échangé, il est ensuite possible qu’il y ait
incorporation de cet ion dans la structure apatitique au cours de la maturation, de manière
identique à l’intégration des ions CO32-, PO43- et HPO42- initialement contenus dans la couche
hydratée. Ceci a été montré pour l’échange avec le strontium. Après un échange rapide, cet
ion est progressivement incorporé dans la structure de l’apatite et ne peut plus être échangé.
Le magnésium au contraire ne s’intègre pas dans les domaines apatitiques et la réversibilité de
l’échange reste quasi-totale même après des temps de maturation très longs (Cazalbou et al.
2004).
Les analogues de synthèses présentent des capacités d’adsorption de protéines supérieures à
celle de l’hydroxyapatite (Ouizat et al. 1999) et des travaux de l’équipe suggèrent une
influence de la couche hydratée dans ces phénomènes (Cazalbou et al. 2004, Cazalbou et al.
2005).

1.3. Exemples de procédés de revêtements d’apatites à faible


température

La réalisation de revêtements de composés apatitiques sur des supports de différentes


compositions a été étudiée. Le revêtement de prothèses en titane par de l’hydroxyapatite, par
exemple, devient courante car il a été montré que cela permettait une intégration plus rapide
de la prothèse dans le tissu et conduisait à une résistance mécanique accrue dans les tests
d'extraction en torsion (Moroni et al. 2008). Différentes techniques de revêtement existent
(Leeuwenburgh et al. 2008). La plupart des procédés industriels utilisent des températures

42
élevées incompatibles avec la préservation d’apatites non-stoechiométriques nanocristallines.
La surface spécifique de ces composés est souvent faible tout comme leur réactivité de
surface (pas de couche hydratée à leur surface).

D’autres méthodes de revêtement à faible température existent et présentent l’avantage


d’aboutir à un dépôt de composés phosphocalciques divers avec des tailles de cristallites
faibles et des caractéristiques plus ou moins proche de celles du minéral osseux. D’autre part,
ces techniques sont compatibles avec l’association de molécules ostéoinductrices, telles que
des protéines, à l’intérieur du revêtement.
L’utilisation de SBF, solution ionique de composition (plus ou moins) proche de la
composition des fluides biologiques, permet l’obtention de revêtements réactifs. La croissance
d’apatite nanocristalline par immersion d’implants dans du SBF à 37°C pendant plusieurs
jours a été décrite pour la première fois par Kokubo (Kokubo 1991). D’autres méthodes
faisant appel à l’utilisation de solutions de SBF ont ensuite été décrites : Barrère et al., par
exemple, ont mis en place un procédé nécessitant l’utilisation successive de deux solutions de
type SBF différentes. Dans un premier temps, l’immersion de pastilles en titane dans une
première solution de SBF classique pendant 24h, permet d’obtenir un fin précipité de
phosphate de calcium carbonaté amorphe. Ces premiers cristaux agissent comme des sites de
nucléation pour la croissance d’autres cristaux phosphocalciques lors de l’immersion, dans un
deuxième temps, des échantillons dans une autre solution de SBF beaucoup plus concentrée
(jusqu'à cinq fois plus). La composition ionique de cette dernière solution peut être ajustée
pour obtenir des revêtements phosphocalciques de différentes nature (OCP, apatite déficiente
en calcium, apatite carbonatée de type B…) (Barrere et al. 1999).
Le mécanisme de nucléation-croissance de cristaux de phosphate de calcium est aussi utilisé
dans d’autres procédés. Dans l’étude de Kim et al., la croissance d’un film fin d’apatite peu
cristallisée sur différents types d’implants est réalisée à partir d’une solution métastable de
phosphate de calcium : ils utilisent une solution sursaturée d’apatite dissoute en milieu acide
et induisent la précipitation de cristaux phosphocalcique par augmentation du pH. Après
filtration, les solutions métastables contenant des ions calcium et phosphate sont mises en
contact avec les échantillons à revêtir pendant 24h à 8°C. Cette phase permet la nucléation
hétérogène à la surface des matériaux de cristaux de phosphate de calcium amorphe. Les
échantillons sont maintenus dans la solution à une température inférieure à 60°C pour
permettre la croissance des cristaux. L’épaisseur du dépôt obtenu est dépendante du temps

43
d’incubation. Cette technique à faible température permet la croissance de nanocristaux
d’apatite sur différents types de surface, incluant des surfaces hydrophobes (Kim et al. 2000).
Zhang et al., par ailleurs, obtiennent la croissance d’OCP sur des implants poreux en titane
par immersion dans des solutions sursaturées à 37°C pendant 6 jours. Ils montrent, en utilisant
des échantillons ayant subi différentes sortes de prétraitement, que l’homogénéité du
revêtement est fortement dépendante de la nature du substrat (Zhang et al. 2005). Cette
méthode de revêtement a été envisagée dans notre étude : les résultats obtenus montrent que
l’utilisation de solutions sursaturées est peu compatible avec le caractère biphasique et la
morphologie complexe de nos échantillons. Par ailleurs l'utilisation de telles solutions,
métastables voire instables, est peu pratique sur le plan industriel. Nous n’avons donc pas
retenu ce procédé pour le revêtement de granulés de BCP dans cette étude.
Layrolle et al. induisent la précipitation de phosphate de calcium par l’utilisation de CO2.
Dans ce procédé, les échantillons sont immergés dans une solution sursaturée en phosphate et
calcium sous pression partielle de CO2 élevée qui provoque une diminution du pH de la
solution, la stabilise et permet une manipulation aisée. Lorsque la pression partielle de CO2
est brutalement réduite à température physiologique, le pH augmente progressivement avec la
libération du CO2 en surtension et un fin précipité de phosphate de calcium carbonaté se
forme à la surface des échantillons. Le transfert de ce procédé semble possible par l’utilisation
d’un réacteur qui permet d’effectuer le revêtement, en présence de molécules biologiques, en
conditions stériles (Layrolle et al. 2004).
La croissance cristalline à composition constante peut enfin être utilisée comme procédé de
revêtement. Cette autre technique permet la nucléation-croissance de composés apatitiques sur
différents supports par l’utilisation de solutions métastables. Dans ce cas-ci, les
concentrations ioniques et le pH sont maintenus à leur valeur initiale évitant une évolution de
la solution et donc une modification de la nature des cristaux de revêtements au cours du
traitement (Royer 1993).
D’autres méthodes, réservées au revêtement de matériaux conducteurs, utilisent les méthodes
de synthèse électrochimiques. Il est possible de réaliser des dépôts apatitiques par électrolyse
d'une solution aqueuse. L'électrolyse d'une solution aqueuse saturée induit une libération de
dihydrogène à la cathode et conduit à une augmentation locale du pH, qui produit une
sursaturation et une précipitation à la surface de la cathode. Ces techniques sont intéressantes
car elles permettent d’obtenir un dépôt à faible température en un temps réduit mais le
potentiel est différent selon la zone de l’implant considérée (en surface et à l’intérieur des
pores) conduisant ainsi à des revêtements d’épaisseurs différentes (Zhang et al. 2005)

44
Une autre méthode, l'électrodéposition, consiste à provoquer le déplacement de particules
d'apatites chargées en solution vers une surface métallique au moyen d'un champ électrique.
Cette technique permet d’obtenir un dépôt de même composition sur l’ensemble de la surface
mais l’adhérence est assez faible et peut nécessiter un frittage à haute température
(Leeuwenburgh et al. 2008).
Ces différentes techniques permettent le revêtement d’implants par des composés
phosphocalciques réactifs mais sont parfois difficilement transposables à l’échelle industrielle
(temps d’incubation longs, croissance de cristaux sur les parois du réacteur…) et ne sont pas
toujours adaptées aux matériaux de morphologie complexe : La nature des cristaux ou
l’épaisseur du revêtement peuvent être variables selon la zone de l’implant envisagée (des
différences peuvent notamment être observées en surface ou à l’intérieur de pores. Par ailleurs
les procédés électrochimiques ne peuvent être appliqués qu'au recouvrement de métaux.

2. Objectifs
L’objectif de cette partie était d’élaborer un substitut osseux présentant une forte réactivité de
surface. Pour y parvenir, nous avons décidé d’utiliser des céramiques de phosphate de
calcium biphasiques (HA/β-TCP) déjà commercialisées et d’améliorer leurs propriétés de
surface par l’ajout d’un revêtement apatitique nanocristallin. Ces céramiques initiales
présentent déjà une bonne efficacité de reconstruction mais leur fabrication nécessite un
frittage à haute température indispensable pour obtenir une bonne résistance mécanique. Un
tel traitement conduit à une diminution importante de leur surface spécifique et de leur
réactivité de surface (Gautier et al. 1998). Effectuer un revêtement d’un composé apatitique
nanocristallin à la surface de ces céramiques permettrait de conserver leurs avantages
(biocompatibilité, biorésorbabilité, bioactivité, bonne résistance mécanique, présence
nécessaire de macro- et micro-porosités) tout en augmentant leur réactivité de surface.
Plusieurs méthodes de revêtements, basées sur des travaux issus de publications ou provenant
d'essais antérieurs réalisés au CIRIMAT, ont été envisagées. Le dépôt d’apatite carbonatée
nanocristalline analogue au minéral osseux a été préférée en raison de sa forte réactivité de
surface. A l’instar du minéral osseux, ces apatites présentent un état de maturation faible
(susceptible d’évoluer de manière similaire à l’os dans les milieux biologiques), une surface
spécifique élevée et une couche hydratée à leur surface, probablement responsable de leur
forte réactivité. La méthode envisagée s’appuie sur des études préliminaires effectuées au sein
du laboratoire du CIRIMAT. Elle permet d’associer les caractéristiques initiales des

45
céramiques de BCP et la forte réactivité de surface de ces analogues de synthèse. Une mise au
point du procédé de revêtement a été effectuée mais ne sera pas décrite ici pour des raisons de
confidentialité. A l’issue de ces expériences, deux types de revêtements ont été choisis et
caractérisés. Une comparaison des propriétés des céramiques initiales et revêtues a finalement
été effectuée (surface spécifique, porosité et capacité d’échange avec les ions strontium).

3. Matériel et méthodes

3.1. Matériaux

La société TEKNIMED nous a fourni plusieurs lots de céramiques poreuses (65% de


porosité) correspondant aux produits commercialisés CERAFORM de type phosphates de
calcium biphasiques (BCP) constitués de 65% d'hydroxyapatite stœchiométrique et de 35% de
phosphate tricalcique-β :
- des granulés poreux de forme irrégulière de dimension voisine de 1 mm (Figure II.1a),
- des granulés de forme cubique de 3 mm de coté (Figure II.1b),
- des barres frittées parallélépipédiques de 20 mm x 5 mm x 5 mm (Figure II.1c)
- des cylindres frittés de Ø 6 mm x L 20 mm (Figure II.1d)

Figure II.1: Photographies des céramiques CERAFORM utilisées.

Notre étude concernant les procédés de recouvrement de ces céramiques biphasiques a portée
sur les deux premiers types de granulés, les autres céramiques étant réservées aux
implantations chez l’animal.
Nous avons réalisé des revêtements de ces échantillons avec des analogues de synthèse du
minéral osseux. Le procédé de revêtement et les mises au point effectuées au cours de ce
travail ne seront pas décrits. Seuls deux types de revêtements issus de nos investigations
seront comparés.

46
3.2. Caractérisation des nanocristaux

3.2.1. Diffraction des Rayons X

La diffraction des rayons X (DRX) est un outil de caractérisation qui permet l’identification
de matières bien ou très bien cristallisées. Sur des composés de faible cristallinité comme le
minéral osseux ou les apatites carbonatées de notre étude, cette technique donne des
informations concernant la nature des phases mais la largeur des raies et leur dissymétrie ne
permet pas une détermination précise des dimensions de la maille cristalline. La mesure des
largeurs de raies à partir des diagrammes obtenus permet toutefois de déduire la dimension
moyenne des cristallites par la formule de Scherrer :
0,94λ
Lhkl =
cos θ Δ2r − Δ2o

Avec
0,94 : Constante de Scherrer
L (Å) : Taille apparente dans la direction perpendiculaire au plan de diffraction hkl
λ (Å):Longueur d’onde du rayonnement X
θ : Angle de diffraction correspondant à la raie hkl considérée
Δr (radians) : Largeur à mi-hauteur de la raie hkl de diffraction
Δo (radians) : Largeur à mi-hauteur de la raie hkl de diffraction d’une hydroxyapatite bien
cristallisée.
Dans cette étude, l’analyse des échantillons est réalisée au moyen d’un diffractomètre INEL
CPS 120 par exposition au rayonnement Kα émis par une anticathode au Cobalt
(λCoKα=1,78892 Å). Le temps d’acquisition des apatites mal cristallisées a été fixé à 15h.

3.2.2. La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

La spectrométrie infrarouge consiste à irradier l'échantillon dans le domaine 4000 - 400 cm-1
et à détecter les fréquences absorbées par ce dernier. Lors de l’irradiation, certaines vibrations
moléculaires sont activées au sein de l'échantillon. L’énergie (ou la fréquence) absorbée est
caractéristique d'une molécule ou d'un ion moléculaire et elle est affectée par sa position au
sein du réseau cristallin ou plus généralement par son environnement immédiat.
Les apatites carbonatées mal cristallisées comme le minéral osseux ou les apatites de notre
étude analysées par FTIR se caractérisent par des bandes d’adsorption relatives aux

47
groupements PO43-, HPO42-, CO32- et OH- présents dans la phase apatite ou non apatitique
(Tableau II.1).

Tableau II.1 : Bandes d’adsorption caractéristiques des apatites carbonatées.


Domaine Position des bandes (cm-1) Attribution
615 PO43- non-apatitique
600, 575, 560 PO43- apatitique
550 HPO42- apatitique
ν4PO4
534 HPO42- non-apatitique
635 OH- apatitique

ν1PO4 960 PO43- apatitique

ν3PO4 1040-1100 PO43- apatitique

1545 CO32- apatitique de type A


ν3CO3 1412 CO32- apatitique de type B
1452 CO32- apatitique de type AB

879 CO32- apatitique de type A


ν2CO3 872 CO32- apatitique de type B
886 CO32- non-apatitique

L'appareillage utilisé dans cette étude est un spectromètre infrarouge à transformée de Fourier
Nicolet 5700. Le domaine spectral étudié s'étend de 4000 cm-1 à 400 cm-1. Les mesures sont
réalisées sur des pastilles de bromure de potassium dans lesquelles les poudres à analyser sont
dispersées après broyage. Après correction de la ligne de base, la décomposition des spectres
est réalisée à l'aide du logiciel Grams (Galactic Ind. Corp.).

3.2.3. Dosage du calcium, du phosphore et du sodium

Le dosage des ions calcium, phosphate et sodium a été effectué sur des poudres de cristaux,
préparées dans des conditions similaires aux revêtements, après dissolution en milieu acide
(HClO4, 6N). Il est, en effet, quasiment impossible de dissoudre sélectivement le revêtement
en milieu acide sans attaquer la céramique sous-jacente.

48
La quantité d’ions calcium présents dans les différents échantillons a été déterminée par
dosage complexométrique en retour en raison de la présence d'ions phosphate. Les ions
calcium présents dans la solution acide sont complexés par l’ajout, en excès, d’acide éthylène
diaminetetraacétique (EDTA). L’excès d’EDTA est ensuite dosé par ajout progressif d’une
solution de zinc à 0,05 M à pH basique et en présence d’un indicateur coloré, le noir
d’ériochrome T (Charlot 1974).

Les ions phosphate sont dosés par spectrophotométrie. La solution est mélangée à une
solution de vanadate d'ammonium et de molybdate d'ammonium en milieu acide. Les ions
phosphates réagissent dans ces conditions pour former un acide complexe
phosphovanadomolybdique de couleur jaune. L’absorbance est mesurée à 460 nm (Hitachi,
U-1100 spectomophometer). Une gamme étalon permet de déterminer la quantité de
phosphore présente en solution (Charlot 1974).

Le dosage du sodium est réalisé par adsorption atomique sur un spectrophotomètre muni
d’une lampe à cathode creuse à 589 nm (AAS 300 Perkin Elmer). Une gamme étalon
comprise entre 0,25 et 1 ppm permet de déterminer la quantité de sodium dans la solution.

3.2.4. Dosage des carbonates

La quantité de ions carbonate présents dans les apatites similaires à celles du revêtement peut
être déterminée à partir d’un coulomètre (UIC Inc. CM5014). La poudre est placée dans un
récipient parcouru par courant d'air exempt de CO2. Elle est ensuite dissoute par ajout d’acide
perchlorique 6N. Le CO2 libéré par l'attaque acide des carbonates réagit avec une solution
d’éthanolamine pour former un acide titrable (par la génération d'une base par électrolyse). La
mesure du taux de CO2 émis permet de déterminer le pourcentage massique d’ions carbonate
présents dans l’échantillon.

3.2.5. Microscopie Electronique à Transmission

La microscopie électronique à transmission (MET) est un outil de caractérisation des


matériaux solides à l’échelle (sub-)nanométrique. Le MET offre la possibilité de réaliser des

49
images de hautes résolution et de recueillir des diagrammes de diffraction pour des petits
grains ou cristaux.
Pour nos expériences, les cristaux sont dispersés dans une solution d’éthanol dans un bain à
ultrasons. Une goutte de cette suspension est ensuite déposée sur une grille de cuivre
surmontée d’un film de colodium contenant du carbone pour rendre les échantillons
conducteurs. L’appareil utilisé est un Jeol Jem 2100F. La tension d’accélération des électrons
appliquée est comprise entre 480 et 3200 kV.
Les espacements (d-spacing) entre les franges d’interférences sont déterminés à partir des
micrographies obtenues grâce à un logiciel d’imagerie.

3.3. Caractérisation des granulés

3.3.1. Microscopie Electronique à Balayage

La microscopie électronique à balayage (MEB) est un outil de caractérisation en haute


résolution de la surface d’objets dont la taille est comprise entre une dizaine de nanomètres et
quelques millimètres. Son principe repose principalement sur la détection d'électrons
rétrodiffusés par l'échantillon.
Pour notre étude, les granulés phosphocalciques, entiers ou coupés en deux de manière à
visualiser l’intérieur de la céramique, ont été métallisés à l’argent puis placés dans un
microscope Leo 435 VP monté avec un détecteur à scintillation (détection des électrons
secondaires). Des images de la topographie de la surface (ou de l’intérieur des granulés) ont
ainsi été obtenues.

3.3.2. Mesure de la surface spécifique

La surface spécifique des échantillons a été mesurée par la méthode de Brunauer-Emmet-


Teller (BET) avec un Quantachrome Nova 1000. Cette méthode est basée sur l’adsorption
d’un gaz, dans notre cas, l’azote, à la surface d’un solide. Un dégazage d’au moins 12h à
température ambiante a été réalisé avant les mesures. Celles-ci ont été effectuées en un ou
plusieurs points suivant les nécessités. La mesure de plusieurs points d’obtenir des résultats
plus précis. De même des courbes d’adsorption et de désorption peuvent être réalisées afin
d’évaluer les faibles porosités.

50
3.3.3. Mesure de la porosité

La porosité de nos échantillons témoins et revêtus a été déterminée par porosimétrie à


mercure entre 8 et 60000 psi (Micromeretics Autopore III). Le volume de mercure ayant
pénétré en fonction de la pression appliquée (correspondant à un diamètre de pores) est
mesuré. Ces mesures donnent le profil et le pourcentage de porosité des échantillons.

3.3.4. Echange ionique : Strontium

Les granulés revêtus sont immergés dans une solution de chlorure de strontium à 1M (SrCl2,
VWR Normapur) pendant 30 minutes à température ambiante avec un rapport solide sur
liquide de 20 mg/ml. Les échantillons sont ensuite lavés à trois reprises dans de l’eau
désionisée puis séchés. La quantité de Strontium contenue dans les échantillons est ensuite
déterminée par ICP-MS (Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometer).

4. Résultats
Les expériences effectuées lors de la phase de mise au point du procédé de revêtement ne
seront pas décrites dans cette étude. Seule une comparaison entre deux types de revêtements
obtenus dans des conditions différentes est réalisée.
A l’issue des essais de mise au point du procédé, deux types de revêtements ont, en effet, été
choisis et une caractérisation globale de leur propriétés a été effectuée.
Les études ont été faites sur le revêtement NanoAp et le revêtement NanoAp-EtOH. La
technique et les conditions de revêtement sont identiques entre les deux revêtements à
l’exception d’une étape. Une étape supplémentaire, faisant appel à l’utilisation d’un solvant
alcoolique, a été ajoutée au procédé initial et les échantillons obtenus sont notés NanoAp-
EtOH. Cette étude permet donc d’évaluer les modifications induites par l’ajout de cette
nouvelle étape et de comparer la réactivité de ces deux types de revêtements.
Il est, d’autre part, possible de réaliser le procédé de revêtement à plusieurs reprises sur un
même granulé, ce qui conduit à une multiplication des dépôts sur la surface de la céramique.
L’influence de cette répétition sur les propriétés des matériaux a donc été étudiée : une
comparaison des granulés NanoAp et NanoAp-EtOH après 1 ou 2 revêtements (notés x1 ou
x2) a été effectuée.

51
4.1. Caractérisation des nanocristaux

Les analyses des cristaux n’ont pu être effectuées directement sur les granulés revêtus ni sur
les revêtements issus de ces céramiques en raison de la morphologie complexe des
échantillons et de la faible quantité de cristaux déposés à leur surface. La caractérisation a
donc été réalisée sur des nanocristaux qui sont synthétisées et traitées de manière identique
aux cristaux des revêtements.
Les diagrammes de DRX des échantillons NanoAp et NanoAp-EtOH présentent des pics
assez larges caractéristiques d’une apatite mal cristallisée (Figure II.2).

Figure II.2 : Diagrammes XRD des cristaux NanoAp et NanoAp-EtOH.

Les pics de diffraction observés correspondent à ceux de l’hydroxyapatite (fiche Joint


committee on powder diffraction standard (JCPDS) n°9-432) et les largeurs des raies de
diffraction indiquent que les domaines apatitiques correspondant sont de taille nanométrique.
Nous pouvons constater un rétrécissement de la largeur et une élongation des raies de
diffraction pour le dépôt NanoAp-EtOH. Ceci traduit une augmentation de la taille des
domaines apatitiques associée à une maturation plus importante du revêtement (Tableau II.2).

Tableau II.2 : Taille des cristallites déterminées par la méthode de Scherrer.

Cristaux Raie 002 Raie 310


(longueur) (largeur-épaisseur)
NanoAp 178 ± 9 Å 64 ± 3 Å

NanoAp-EtOH 245 ± 5 Å 102 ± 3 Å

52
Ces données indiquent que les domaines apatitiques sont allongés selon l’axe c (raie 002).
Les observations par MET permettent de confirmer ces résultats (Figure II.3 a et c).

Figure II.3 : Micrographies MET des cristaux NanoAp et NanoAp-EtOH à 480kV (a et c –


barres d’échelle = 50 nm) et 3200 kV (b et d – barres d’échelle = 5 nm).

Les échantillons sont composés de fines plaquettes de formes irrégulières et souvent


agglomérées (en particulier pour les cristaux NanoAp). Leurs dimensions paraissent
correspondre à celles déterminées ci-dessus.
Les échantillons présentent une structure apatitique caractérisée par les espacements mesurés
entre les franges d’interférences (Figure II.3 b et d). Un espacement de 3,4 Å, qui correspond
au plan cristallographique 002 de l’HA, a été mesuré à plusieurs reprises. Des espacements de
2,7 et 2,8 Å (correspondant respectivement aux plans cristallographiques 300 et 112 ou 211
de l’HA) ont aussi été observés.

Les analyses chimiques des cristaux montrent qu’il s’agit d’apatites carbonatées déficitaires
en calcium (Tableau II.3).

Tableau II.3 : Résultats des analyses chimiques


Echantillon Ca/P (Ca+Na)/(P+C) % Sodium % carbonates
NanoAp 1,49 ± 0,01 1,40 ± 0,01 0,37 ± 0,04 2,60 ± 0,1
NanoAp-EtOH 1,51 ± 0,01 1,47 ± 0,01 0,38 ± 0,06 1,5 ± 0,1

53
Les valeurs des rapports Ca/P et (Ca+Na)/(P+C) sont plus élevées pour les échantillons
NanoAp-EtOH, traduisant une maturation plus importante. D’autre part, la quantité d’ions
carbonate présents dans les cristaux NanoAp-EtOH est plus faible, indiquant une perte d’ions
carbonate (sans doute sous forme de CO2) au cours de l’étape additionnelle. Le pourcentage
de sodium, contre-ion des anions phosphate et carbonate dans les solutions utilisées pour le
revêtement, est faible et comparable entre les deux types d’échantillons.

Les spectres FTIR indiquent qu’il existe des différences sensibles entre les deux types
d’apatites traduisant la réactivité de ces nanocristaux (Figure II. 4).

Figure II.4 : Spectres FTIR et domaines ν4PO4 et ν3CO3 des cristaux NanoAp et NanoAp-
EtOH.

Comme précédemment, nous constatons une diminution de la quantité d’ions carbonate. La


comparaison du domaine ν3CO3 (entre 1350 et 1700 cm-1) montre des intensités de bandes
plus faibles dans les cristaux NanoAp-EtOH. D’autre part, pour ces cristaux, une grande
partie des ions carbonate est substituée aux ions OH- (substitution de type A). Ce type de
substitution est très faible dans le cas des apatites NanoAp. L’étude du domaine ν4PO4 nous
indique par ailleurs, la présence d’ion OH- dans la structure apatitique des cristaux NanoAp-
EtOH alors que nous n’en distinguons pas pour les échantillons Nano-Ap. Nous pouvons
aussi constater la présence d’un environnement ionique non apatitique pour les deux types
d’apatites. La présence d’ions CO32- et HPO42- et PO43- labiles est notée. Ceci indique la
présence à la surface des cristaux d’une couche hydratée, déjà décrite et susceptible de
conférer aux cristaux une très grande réactivité. Cette couche hydratée, très sensible à l’état de
maturation des apatites nanocristalline, est cependant nettement réduite pour les échantillons
NanoAp-EtOH, en conformité avec les observations obtenues par diffraction des rayons X,
montrant une augmentation de la taille des domaines apatitiques corrélativement à la
diminution globale du taux de carbonates. Une décomposition des spectres (curve fitting) a

54
été réalisée. La décomposition du domaine ν4PO4 des cristaux NanoAp-EtOH est montrée à
titre d’exemple (Figure II.5).

Figure II.5 : Décomposition du domaine ν4PO4 des cristaux NanoAp-EtOH.

La décomposition des domaines ν4PO4, ν2CO3 et ν3CO3, qui donne une idée plus précise des
intensités des bandes relatives à chaque groupement, nous a permis de confirmer ces
observations (Tableau II.4). Cette analyse montre, en effet, une diminution des aires relatives
attribuées ions PO43-, HPO42- et CO32- non-apatitiques à la surface des cristaux NanoAp-EtOH
par rapport aux échantillons NanoAp. Comme nous l’avons indiqué d’autre part, la quantité
d’ions carbonate substitués en position A et d’ions OH- apparaît bien supérieure pour les
cristaux NanoAp-EtOH.

Tableau II.4: Aires relatives des bandes attribuées à différentes espèces ioniques par
rapport à la somme des aires attribuées aux groupements phosphate du domaine ν4PO4.
Domaines Espèces NanoAp NanoAp-EtOH

PO43- non apatitique 0,11 ± 0,01 0,03 ± 0,01

ν4 PO4 HPO42- non apatitique 0,19 ± 0,01 0,14 ± 0,05

OH- Non détecté 0,17 ± 0,01

CO32- type A 0,020 ± 0,001 0,028 ± 0,001


ν3 CO3
CO32- labiles 0,08 ± 0,02 0,03 ± 0,01

55
4.2. Caractérisation des granulés

4.2.1. Morphologie des granulés revêtus

La morphologie des différents granulés revêtus a été évaluée par MEB (Figure II.6).

Figure II.6 : Micrographies MEB des granulés revêtus NanoAp et NanoAp-EtOH après 1
ou 2 revêtements (grossissement x100, barre d’échelle = 100 µm).

Premièrement nous avons pu constater que l’ensemble du granulé était revêtu, aussi bien à
l’extérieur qu’à l’intérieur des pores. Le revêtement est bien présent au cœur de la céramique
avec une morphologie similaire à celle observée sur la surface extérieure des échantillons.
Cependant, sa structure très poreuse ne permet pas d’obtenir un dépôt homogène. En effet,
nous pouvons observer sur les échantillons NanoAp que le dépôt présente des craquelures
importantes, notamment au fond des pores où l’épaisseur de la couche nanocristalline est
grande. Contrairement aux granulés NanoAp, les granulés NanoAp-EtOH apparaissent plus
homogènes (moins de craquelures visibles). Les craquelures sont toujours visibles mais fines
et le dépôt recouvre donc l’ensemble de la céramique.
La multiplication du revêtement NanoAp accroît de manière importante l’homogénéité du
dépôt en raison de la superposition des couches de cristaux. La superposition est visible aussi
pour le procédé NanoAp-EtOH, mais le gain apparait plus limité.
Il est difficile de déterminer de manière précise l’épaisseur des revêtements. L’ordre de
grandeur peut cependant être évalué en mesurant la tranche des craquelures. Les deux types

56
de procédé conduisent à l’obtention d’un dépôt de quelques micromètres (de 2 à 8 µm en
général avec une moyenne à environ 5 µm d’après nos observations) (Figure II.7).

Figure II.7 : Micrographie par MEB des tranches des craquelures des dépôts NanoAp et
NanoAp-EtOH (grossissement x1000, barre d’échelle = 10 µm).

4.2.2. Surface spécifique

Nous avons ensuite mesuré la surface spécifique des granulés en fonction du revêtement
appliqué. Ce paramètre constitue, en effet, une information indispensable dans le choix de nos
échantillons, puisqu’il est susceptible de jouer un rôle dans la réactivité des granulés revêtus.
Nous pouvons constater que l’ajout d’un revêtement induit une augmentation de la surface
spécifique des céramiques et que la multiplication du nombre de couches participe à cette
augmentation (Figure II.8). Cependant, pour des quantités de cristaux déposés équivalentes
(pourcentage massique du dépôt), les granulés revêtus par le procédé NanoAp-EtOH ont une
surface spécifique plus élevée. Ceci semble indiquer que d’autres paramètres participeraient à
cette augmentation.

Figure II.8 : Surface spécifique et pourcentage massique de revêtement présent à la surface


des granulés.

57
Il faut noter que les valeurs de surface spécifique mesurées sont très faibles et présentent une
forte variabilité liée à l'incertitude instrumentale mais aussi à la reproductibilité des dépôts. La
variabilité due à la répétabilité du revêtement a été évaluée à environ 15%. L'incertitude
instrumentale peut quant à elle être diminuée par l’utilisation du mode multi-point du BET.
Les valeurs des surfaces spécifiques mesurées pour les granulés témoins et revêtus avec le
procédé NanoAp-EtOH, utilisés lors des expériences d’adsorption de la BMP-2, sont notées
dans le tableau II.5.

Tableau II.5 : Surface spécifique des granulés (p12/10) Témoins et NanoAp-EtOH et de la


poudre NanoAp-EtOH lyophilisée.
Granulés Témoins 0,44 ± 0,09 m2/g
Granulés NanoAp-EtOH x1 2,03 ± 0,09 m2/g
Granulés NanoAp-EtOH x2 3,05 ± 0,15 m2/g
Poudre lyophilisée NanoAp-EtOH 84 ± 10 m2/g

Le revêtement NanoAp-EtOH induit une augmentation de la surface spécifique des granulés


d’un facteur 4,7. Ces valeurs semblent correspondre dans ce cas à la quantité de cristaux
déposés.

4.2.3. Porosité

Comme nous l’avons mentionné dans la partie introductive, la porosité des substituts osseux
semble particulièrement importante et détermine leurs capacités de reconstruction et leur
réactivité. La porosité des échantillons a été étudiée par porosimétrie à mercure (Figure II.9).

Les céramiques témoins présentent trois distributions de porosités : une macroporosité


(comprise entre 150 et 300 µm de diamètre, non visible sur ces graphes) et deux sortes de
distributions de pores de taille micrométrique d’environ 10 µm et 100 nm de diamètres.
Sur les granulés revêtus, nous ne notons pas de modifications majeures de la porosité initiale
du matériau. Les trois sortes de porosités peuvent être observées. De plus, une porosité
additionnelle à l’échelle nanométrique est observée.

58
Figure II.9 : Profil de porosité des granulés témoins et revêtus NanoAp-EtOH (mesures
entre 8 et 60000 psi) (a) et micrographies MEB des pores (grossissement x10000, barre
d’échelle = 1 µm) (b).

Pour les échantillons NanoAp-EtOHx1, la distribution des nouveaux pores est comprise entre
9 et 21 nm avec un maximum à environ 15 nm. Cette porosité de taille nanométrique a été
retrouvée sur les poudres nanocristallines obtenues dans des conditions similaires aux
revêtements. De même, une mesure des granulés NanoAp-EtOH par BET (adsorption et
désorption de gaz) confirme la présence d’une nano-porosité avec un diamètre moyen de 18
nm. Cette porosité additionnelle à l’échelle nanométrique pourrait donc être attribuée aux
espacements inter-nanocristaux.
La multiplication des revêtements entraine une augmentation du pourcentage de cette porosité
nanométrique et nous observons une augmentation de la largeur de la distribution. Un système
de pores additionnel semble exister, sur les échantillons revêtus en multicouche, à environ 20
nm de diamètre. Cette porosité pourrait être liée à l’espace entre couches de revêtements.
Des résultats similaires ont été obtenus pour les échantillons revêtus par le procédé NanoAp.

4.2.4. Echange ionique avec le strontium

Une des caractéristiques des apatites nanocristallines est une forte capacité d’échange ionique.
L’échange ionique avec le strontium qui est un ion d’intérêt biologique (action sur les
ostéoblastes et les ostéoclastes) a été étudié sur les différents granulés témoins et revêtus.

59
Tableau II.6 : Quantité de strontium échangé par les échantillons témoins et revêtus
(Immersion dans une solution de SrCl2 à 1M pendant 30 minutes, lavages et séchages).
Granulés Sr en mg/g granulés Sr en mg/m2
Témoin 0,36 ± 0,01 0,53 ± 0,01
NanoApx1 1,14 ± 0,04 1,34 ± 0,05
NanoApx2 2,30 ± 0,05 1,42 ± 0,03
NanoAp-EtOHx1 1,05 ± 0,06 0,62 ± 0,04

Le taux de strontium échangé par gramme de granulés est largement supérieur (environ 3 fois
plus grand) sur les granulés revêtus en comparaison avec les granulés témoins (Tableau II.6).
Concernant les revêtements, la quantité totale de strontium échangée est peu différente entre
les échantillons NanoAp et NanoAp-EtOH. La multiplication du revêtement NanoAp induit
une nette augmentation de la quantité échangée.
L’expression de la quantité de strontium échangé par unité de surface montre que les
échantillons NanoAp présentent une capacité d’échange supérieure aux granulés NanoAp-
EtOH. En effet, pour les échantillons NanoAp, la quantité échangée/m2 est similaire qu’il y ait
un ou deux revêtements, par contre, la quantité échangée par les granulés NanoAp-EtOH est
beaucoup plus faible, et à peine supérieure à la quantité échangée par les granulés témoins.

5. Discussion
Dans cette partie, nous avons cherché à activer la surface de céramiques de BCP par la
réalisation d’un revêtement de phosphate de calcium réactif. Nous avons montré qu’il était
possible de réaliser un revêtement d’apatite carbonatée nanocristalline très réactive sur ces
céramiques malgré leur morphologie complexe.

5.1. Procédé de revêtement

Comme nous l’avons indiqué dans la partie introductive, différentes techniques de


revêtements existent et sont efficaces pour le dépôt d’hydroxyapatite par exemple sur des
matériaux de forme simple (Kokubo 2008). Afin de conférer au matériau une forte réactivité
de surface, il est préférable d’utiliser des méthodes de revêtements à faible température. Un
revêtement de composés phosphocalciques réactifs par nucléation-croissance a été envisagé
dans cette étude. En utilisant un protocole adapté du travail de Zhang et al., à partir de
solutions sursaturées, nous sommes parvenus à faire croître des cristaux à la surface des

60
céramiques de BCP (Zhang et al. 2005). Ces cristaux possédaient la morphologie
caractéristique du phosphate octacalcique (OCP) (croissance de fines plaquettes en rose des
sables). Cette méthode est, cependant, difficilement transposable à l’échelle industrielle et
s’adapte mal aux morphologies complexes (macro- et micro- porosités) nécessaires pour
l’efficacité biologique des matériaux de comblement osseux, d'après différents auteurs. Nous
avons constaté que la porosité importante des matériaux associée à leur caractère biphasique
conduisait à l’obtention d’un revêtement hétérogène (Figure II.10). Cet exemple est
représentatif des difficultés rencontrées pour le revêtement de matériaux de morphologie et de
composition complexes.

Figure II.10 : Dépôt de cristaux de morphologie caractéristique de l’OCP par l’utilisation


de solutions sursaturées. Micrographies par MEB de la surface ou de l’intérieur des
granulés (grossissement x5000, barre d’échelle = 1 µm).

Le procédé de revêtement choisi dans notre étude permet de recouvrir l’ensemble de la


surface de céramiques poreuses avec un dépôt très réactif dont les caractéristiques sont
identiques quelle que soit sa localisation dans le matériau (en surface ou à l’intérieur des
pores). D’autre part, il peut être facilement transposé à l’échelle industrielle et largement
modifié en fonction des caractéristiques recherchées. De plus, ce procédé offre la possibilité
d’ajouter des ions ou des molécules biologiquement actives à différentes étapes de la
réalisation.

5.2. Morphologie du revêtement

Une grande partie du travail réalisé a consisté à mettre au point un procédé permettant
d’obtenir un revêtement présentant une surface homogène, dépourvu de craquelures.
Il a été montré une influence de la micro-topographie de différents matériaux sur les réponses
cellulaires. En effet, la topographie de surface est susceptible de jouer un rôle tant au niveau
de l’adhésion, de la prolifération, de l’orientation que de la différenciation ostéoblastique des

61
cellules (Zinger et al. 2004, Ricci et al. 2008). Les réponses obtenues varient cependant de
manière importante en fonction de la taille et de la morphologie des pores et dans notre
situation, il semble donc difficile de prédire les conséquences de la présence de craquelures
allongées d’une largeur de l’ordre de 10 µm à la surface de nos céramiques sur la réponse
cellulaire.
D’un point de vue plus pratique, il nous a semblé plus intéressant d’obtenir un dépôt
homogène recouvrant l’ensemble de la céramique. Cela permet d’avoir un seul type de
composé (apatite nanocristalline) accessible aux fluides biologiques et aux cellules et une
surface de contact augmentée. D’autre part, bien que des tests d’adhérence classiques des
dépôts n’aient pu être réalisés sur les granulés en raison de leur morphologie complexes,
certaines observations tendent à montrer que l’adhérence des gros blocs de nanocristaux est
faible. Par exemple, des tests effectués sur les granulés NanoAp dans de l’eau désionisée ou
de l’éthanol dans un bain à ultrasons montrent que les gros blocs ont tendance à se détacher
de la surface plus facilement que les zones de dépôts fines et peu craquelées. Des observations
similaires ont été faites sur les échantillons après la réalisation de tests de perméabilité
(Bonnevialle et al. 2009).

5.3. Caractéristiques des nanocristaux

Les revêtements obtenus sont composés d’apatite carbonatée nanocristalline présentant des
caractéristiques proches de celles du minéral osseux. Les cristaux NanoAp, en particulier,
semblent similaires au minéral osseux : La taille et la forme des cristallites correspondent à
celle d’un os cortical jeune ou d’un os spongieux plus âgé (Kuhn et al. 2008). Les rapports
Ca/P, Ca/(P+C) et (Ca+Na)/(P+C) faibles sont comparables aussi aux rapports trouvés dans le
minéral osseux (Cazalbou et al. 2005, Kuhn et al. 2008). La quantité d’ions carbonate est
cependant plus faible, de l’ordre de 2,5% contre au moins 4% dans le minéral osseux. Il
semble qu’il y ait une perte de carbonates sous forme de CO2 lors des différentes étapes du
procédé de revêtement. Les intensités relatives des bandes des groupements OH-, PO43-,
HPO42- et CO32- sont aussi en correspondance avec les profils observés dans le minéral
osseux. La couche hydratée est présente et importante, suggérant une forte réactivité de ces
cristaux (Rey 2007).
Le procédé NanoAp-EtOH, en revanche, conduit à l’obtention de cristaux d’apatite
carbonatée dont les caractéristiques sont légèrement différentes de celles du minéral osseux
(même âgé). Ces cristaux présentent des altérations exacerbées mais semblables à celles

62
notées lors la maturation des apatites biologiques : augmentation de la taille des cristallites,
rapports Ca/P et (Ca+Na)/(P+C) augmentés, diminution importante de la couche hydratée,
augmentation relative de la quantité d’ions carbonate substitués en site de type A dans la
structure apatitique. Nous constatons, par ailleurs, une augmentation de la quantité d’ions OH-
dans l’apatite. Cette augmentation semble en accord avec la maturation des analogues de
synthèse mais diffère cependant de celle du minéral osseux. Cette observation est
nécessairement corrélée à la diminution des ions carbonate et au dégagement supposé de CO2:
CO32- → CO2 + O2-
puis en raison de l'instabilité des ions oxyde en présence d'eau :
O2- + H2O → 2 OH-
Cependant, ces résultats ne signifient pas que ce sont des carbonates de type A qui sont
affectés. En effet les résultats de diffraction des rayons X montrent nettement une
augmentation de la taille des domaines apatitiques dont la croissance pourrait être favorisée
par la diminution de la teneur en ions carbonate dans la couche hydratée, et sa déstabilisation.
La réaction suivante peut aussi intervenir dans la diminution des groupements carbonate et
hydrogénophosphate :
2HPO42- + CO32- → 2PO43- + CO2 + H2O
D’autre part, la réaction d’hydrolyse des ions phosphate peut aussi participer à l’augmentation
de la quantité des ions OH- et HPO42- dans la structure apatitique.
PO43- + H2O → HPO42- + OH-
Cette maturation des nanocristaux NanoAp-EtOH est liée à l’étape additionnelle dans notre
procédé de revêtement mais des expériences complémentaires indiquent que cette évolution
dépend principalement des conditions appliquées lors de cette étape supplémentaire et non de
l’utilisation d’un solvant alcoolique (résultats non montrés).

5.4. Comparaison des granulés revêtus

5.4.1. Surface spécifique

La surface spécifique et la microporosité, qui sont souvent des paramètres associés, sont
susceptibles de jouer un rôle important dans l’adsorption de protéines ou l’ostéoinduction des
matériaux (Gautier et al. 1998, Habibovic et al. 2005, Zhu et al. 2008).
Les revêtements induisent une forte augmentation de la surface spécifique, initialement faible,
des céramiques de BCP. Celle-ci est corrélée pour chaque type de revêtements à la quantité de

63
nanocristaux déposés : le rapport surface spécifique sur pourcentage massique est équivalent
pour les échantillons revêtus 1 ou 2 fois. Toutefois, ce rapport apparaît différent pour les deux
types d’échantillons (NanoAp ou NanoAp-EtOH). La surface spécifique des échantillons
NanoAp-EtOH semble correspondre aux résultats attendus (en raison de la surface spécifique
de la poudre de revêtement et de la quantité de dépôt). Ceci semble indiquer que la majeure
partie de la surface des nanocristaux du revêtement est accessible pour l’adsorption des
molécules d’azote. En revanche, la surface spécifique est plus faible pour les granulés revêtus
par le procédé NanoAp que pour les échantillons NanoAp-EtOH. Ce phénomène ne peut pas
s'expliquer par les caractéristiques intrinsèques des nanocristaux, puisque c'est l'inverse qui
serait alors observé : d'après les résultats de DRX, les domaines apatitiques sont plus grands
dans NanoAp-EtOH que dans NanoAp. Il faut tout d’abord prendre en compte le fait que le
revêtement NanoAp, plus craquelé présente une adhérence plus faible. Des morceaux de
revêtements pourraient alors se détacher lors de la manipulation des échantillons et conduire à
des surfaces spécifiques mesurées plus faibles. Le procédé NanoAp semble aussi conduire à
un retrait plus important suggérant une densité plus grande et des interactions intercristallines
plus importantes pouvant soustraire une partie de la surface à l'adsorption d'azote. Le
revêtement apparaît cependant poreux et les dimensions de ces pores (entre 10 et 20 nm de
diamètre) semblent compatibles avec la pénétration des molécules d’azote de petites tailles à
l’intérieur du dépôt. Nous pouvons enfin envisager que la présence de la couche hydratée,
importante pour les échantillons NanoAp puisse interférer avec l’adsorption des molécules
d’azote à la surface des cristaux.

5.4.2. Porosité

Comme nous l’avons mentionné à plusieurs reprises, la porosité des matériaux semble un
élément essentiel, d'après différents auteurs, pouvant déterminer l'efficacité de la
reconstruction osseuse : La macroporosité (avec des pores supérieurs à 100 µm) permet
l’invasion cellulaire alors que la microporosité (pores inférieurs à 10 µm) augmente la surface
spécifique des échantillons et peut être responsable de la formation de micro-environnements
(Habibovic et al. 2005). Ces deux types de porosités sont présents dans les céramiques
initiales et revêtues. En raison de l’épaisseur des revêtements (2 à 5 µm environ), la
conservation des micro-porosités sans changement majeur à la surface des échantillons
revêtus apparaît cependant étonnante. On peut envisager qu’une partie du dépôt soit arraché
lors de l'intrusion du mercure et permette l'accès aux pores de la céramique sous-jacente.

64
Il a été suggéré dans l'étude de matériaux céramiques ostéoinducteurs que la micro-porosité
pouvait accroitre les capacités d’adsorption des protéines (Zhu et al. 2008). L’addition d’une
nouvelle porosité à l’échelle nanométrique (environ 15 nm de diamètre) par le revêtement
paraît donc très intéressante et pourrait éventuellement contribuer à une amélioration
significative des propriétés des céramiques. La porosimétrie à mercure n’est cependant pas la
méthode la plus adaptée pour l’étude des mésopores car elle peut entrainer une destruction de
l’échantillon. Cela dit, cette porosité a aussi été observée par la méthode BET. De plus, des
pores de diamètre équivalent ont été mesurés sur les poudres cristallines obtenues dans des
conditions identiques aux revêtements ; ce qui semble confirmer que cette nouvelle porosité
peut bien être attribuée à l’espacement entre les cristaux.
Des analyses complémentaires faisant appel à des techniques différentes, telles que la mesure
de la porosité par calorimétrie sont envisagées (Hartmann et al. 2008). Cela permettrait
notamment d’aboutir à une mesure plus précise du diamètre des nanopores.

5.4.3. Echange avec le strontium

L’échange ionique avec le strontium est bien supérieur en présence des revêtements. Il a déjà
été montré que les apatites nanocristallines possédaient des capacités d’échange ionique très
importantes. Le strontium notamment s’échange rapidement avec les ions calcium des apatites
analogues au minéral osseux (Cazalbou 2000). Cazalbou et al. ont montré que cet échange
rapide faisait intervenir en premier lieu les ions labiles présents à la surface des cristaux et
était réversible. Lors de la maturation des cristaux cependant, le strontium initialement présent
dans la couche hydratée s’intègre progressivement aux domaines apatitiques en croissance et
ne peut alors plus être échangé (Cazalbou 2000, Cazalbou et al. 2004, Cazalbou et al. 2005).
Dans notre étude, nous avons effectué un échange sur les échantillons revêtus pendant
seulement 30 minutes. Nous sommes donc en droit de penser que cet échange s’est fait
essentiellement par l’intermédiaire des ions présents dans la couche hydratée des nanocristaux
et que celui-ci est donc réversible. Il a été montré que la réduction de la couche hydratée au
cours de la maturation s’accompagnait d’une diminution des capacités d’échange ionique et
d’adsorption protéique des apatites biologiques et de leurs analogues de synthèse (Ouizat et
al. 1999, Cazalbou et al. 2005). Dans notre étude, la quantité de strontium échangée par unité
de surface est assez faible pour les granulés NanoAp-EtOH. Cette observation semble bien
indiquer que la couche hydratée est impliquée dans ces processus d’échange. En effet, celle-ci
est très faible dans le cas des échantillons NanoAp-EtOH. Mais cette faible capacité

65
d’échange est compensée par une surface accessible, mesurée par BET, accrue, permettant
aux granulés NanoAp-EtOH d’échanger une quantité globale de strontium finalement
équivalente à celle présente sur les granulés NanoAp.

6. Conclusion et perspectives
Dans ce travail, nous avons choisi d’utiliser des matériaux déjà commercialisés ayant prouvé
leur efficacité en tant que substituts osseux et d’améliorer leur réactivité de surface,
initialement faible. Nous avons montré qu’il était possible d’effectuer un revêtement d’apatite
nanocristalline à leur surface même à l'intérieur des granulés poreux. Deux types de
revêtements ont été choisis pour être caractérisés. Le premier, NanoAp, possède des
caractéristiques similaires au minéral osseux, dont la présence d’une importante couche
hydratée à la surface des nanocristaux, mais il ne recouvre pas la céramique de manière
homogène. Le second, NanoAp-EtOH, comporte une étape supplémentaire avec un solvant
alcoolique qui permet d’obtenir un revêtement plus homogène mais conduit à une maturation
accrue des cristaux, ce qui suppose une diminution de leur réactivité de surface. Quoi qu’il en
soit, nous avons pu montrer que l’ajout de ces deux types de revêtements permet d'accroitre
de manière significative la surface spécifique accessible des céramiques de BCP notamment
pour les granulés revêtus avec NanoAp-EtOH. Les macro- et micro-porosités de la céramique
initiale semblent conservées et une porosité additionnelle d’une quinzaine de nanomètres de
diamètre est observée. Cette nouvelle porosité pourrait apporter un avantage substantiel aux
échantillons. Enfin, les capacités d’échange avec l’ion strontium sont bien supérieures en
présence des revêtements NanoAp ou NanoAp-EtOH.
Les capacités d’adsorption protéiques de ces deux types de granulés revêtus seront comparées
dans le chapitre suivant. Le choix du type de revêtement conservé pour la suite des études
sera effectué à l’issue de ces expériences d’adsorption.

Comme nous l’avons mentionné dans ce paragraphe le procédé peut permettre la réalisation
de dépôts nanocristallins de caractéristiques très différentes. Nous avons étudié l’influence de
différents facteurs sur la morphologie ou la surface spécifique des échantillons revêtus.
D’autres paramètres susceptibles d’avoir une influence notable sur les caractéristiques du
dépôt pourraient faire l’objet de nouvelles études : la quantité d’ions carbonate, par exemple,
peut être modifiée pour se rapprocher de celle du minéral osseux. D’autre part, l’ajout d’ions
magnésium (présents dans les apatites biologiques) pourrait à la fois influer sur les

66
caractéristiques biologiques du revêtement (Sader et al. 2008, Xue et al. 2008) mais aussi sur
la morphologie du revêtement, en réduisant les craquelures (Sarda et al. 2000).
D’autre part, une caractérisation poussée des deux types de revêtements a été effectuée ;
cependant certains paramètres physiques comme l’énergie ou le potentiel de surface ou la
vitesse de dissolution de ces cristaux n’ont pas pu être déterminés. Ceci pourrait faire l’objet
d’études ultérieures. Une évaluation des effets de la stérilisation par rayonnement gamma sur
les caractéristiques des matériaux est, par ailleurs, en cours de réalisation.

En outre, nous avons réalisé au sein du laboratoire de biomécanique une étude préliminaire
concernant la perméabilité hydraulique des échantillons témoins et revêtus soit par le procédé
NanoAp soit par de l’OCP (Bonnevialle et al. 2009). Cette étude a montré que le revêtement
NanoAp modifiait significativement la perméabilité des échantillons. Ce paramètre est
susceptible de jouer un rôle important in vivo : La circulation des fluides biologiques,
directement liée à la perméabilité des substituts osseux, permet d’une part l’acheminement
des molécules nécessaires à la survie, prolifération et différenciation cellulaire à l’intérieur de
l’implant et, d’autre part, induit des contraintes mécaniques susceptibles de participer
notamment à la différenciation cellulaire (mécanotransduction) (Riddle et al. 2009). Il serait
donc intéressant de poursuivre ces études de perméabilité en effectuant, par exemple, des
comparaisons entre différents types de revêtement. Enfin, effectuer des tests de perméabilité
en appliquant des contraintes de cisaillement liée à la circulation de fluides pourrait aussi être
un moyen d’étude de l’adhérence des dépôts et de leur évolution physico-chimique en
conditions dynamiques, par exemple.

67
Chapitre 3

Etude de l’adsorption et de la libération de la


rhBMP-2 sur les céramiques de BCP revêtues
d’un dépôt d’apatite carbonatée nanocristalline
Dans ce chapitre, nous avons étudié les propriétés d’adsorption et de désorption de granulés
de BCP non révêtus ou revêtus par des procédés décrits précédemment vis-à-vis d’une
protéine, la rhBMP-2. Une partie bibliographique, ciblée sur les paramètres majeurs
susceptibles d’influer sur les propriétés d’adsorption et de désorption de la BMP-2 sur nos
granulés de BCP, précède la description des objectifs de ce chapitre.

1. Introduction bibliographique

1.1. Adsorption de protéines sur l’hydroxyapatite

L’hydroxyapatite présente une grande capacité d’adsorption des protéines et est couramment
utilisée en chromatographie pour la rétention et la séparation de protéines, d’acides
nucléiques, de virus et autres molécules biologiques. De nombreuses études relatent les
propriétés d’adsorption de l’hydroxyapatite vis-à-vis de différentes protéines (Barroug et al.
1998, Ohta et al. 2002, Kandori et al. 2005) et s’intéressent aux mécanismes mis en jeu lors
de l’adsorption. Il a été montré que l’HA présentait deux types de sites d’adsorption : les sites
C, correspondant aux ions calcium chargés positivement et les sites P, associés aux ions
phosphate de la structure, qui sont chargés négativement.
Les interactions physiques impliquant les forces coulombiennes entre l’adsorbat et l’adsorbant
sont considérées par beaucoup comme le facteur principal d’adsorption. La protéine est en
général caractérisée par son point isoélectrique et l’adsorbant par son potentiel zéta. Ces deux
paramètres définissent les charges globales de surface des composés dans des conditions
expérimentales données. Le potentiel de surface de l’adsorbant varie en fonction des ions
présents en solution (H+, OH-, Ca2+, PO43-, Mg2+, CO32-…) qui vont pouvoir s’adsorber sur les
échantillons. La présence d’ions HPO42- en surface devrait, par exemple, conduire à une
adsorption préférentielle d’ions calcium, modifiant ainsi la charge de surface de l’adsorbant.
Les protéines dites « acides » (pI<7) qui possèdent des groupements carboxyliques ou
phosphate sont susceptibles de s’adsorber sur les sites calcium de l’HA et sont éluées par
l’augmentation de la concentration en ions phosphate. Alors que les protéines « basiques »
(pI>7) qui possèdent des groupements chargés positivement, vont s’adsorber au niveau des
sites P de l’HA et sont éluées par des solutions cationiques d’ions calcium.
Dans le cas de l’adsorption du lysosyme par l’HA, il a été montré que les interactions
préférentielles sont liées à l’attraction entre le lysosyme chargé positivement à pH neutre et
l’HA chargée négativement (Kandori et al. 2005). Dans ce cas, les interactions mises en jeu
sont faibles et l’adsorption est réversible.

68
Ohta et al. ont étudiés l’adsorption de protéines sur plusieurs composés phosphocalciques
(HA, phosphate dicalcique dihydraté (DCPD), phosphate dicalcique anhydre (DCPA) et
β-TCP) (Ohta et al., 2001, Ohta et al. 2002). Dans ces études, ils suggèrent que l’adsorption
dépend du nombre de sites C et P disponibles et du potentiel zéta de l’adsorbant, d’une part, et
du pI de la protéine d’autre part. Pourtant, ils n’ont pu démontrer de corrélation directe simple
entre le point isoélectrique des protéines et l’adsorption de celles-ci sur les composés
phosphocalciques.

1.2. Adsorption de protéines acides

Les mécanismes d’adsorption de la BSA, ou d’autres protéines acides, sur l’HA semblent
complexes et ne sont pas clairement définis : Yin et al. montrent que l’adsorption de BSA est
un phénomène rapide qui fait intervenir essentiellement des interactions physiques liées aux
charges électrostatiques (Yin et al. 2002). De même Barroug et al. discutent leurs résultats
concernant l’adsorption du lysozyme succinylé et de la catalase par rapport aux forces de
répulsions de charges mises en jeu lors de l’adsorption (Barroug et al. 1997, Barroug et al.
1998). Ils indiquent cependant que d’autres mécanismes impliquant des interactions
hydrophobes et des altérations de la conformation de la protéine sont susceptibles de jouer un
rôle. De tels mécanismes sont aussi envisagés par Zhu et al. dans l’adsorption de la BSA sur
différentes céramiques phosphocalciques (HA, β-TCP, BCP) (Zhu et al. 2007). Kandori et al.
indiquent, d’autre part, que l’adsorption de la BSA sur l’HA serait essentiellement gouvernée
par un effet des contre-ions en solution (Kandori et al. 2005). Quels que soient les
mécanismes mis en jeu, après adsorption de BSA sur l’HA, sa désorption, quasiment
irréversible, nécessite de très grandes concentrations en ions phosphate, indiquant des liaisons
fortes entre l’HA et la BSA (Ohta et al. 2002, Kandori et al. 2005).

1.3. Adsorption de la BMP-2

L’adsorption de BMP-2 par l’hydroxyapatite n’a fait l’objet que trois études. La modélisation
des mécanismes d’adsorption de la rhBMP-2 sur la face 001 de l’hydroxyapatite menée par
Dong et al. suggère l’implication de 3 groupements dans ce processus : D’une part, les
groupements COO- qui vont interagir avec les sites calcium de l’HA et d’autre part, les
fonctions NH2 et OH de la BMP qui vont former des ponts hydrogènes entre eux et avec les
sites phosphate de l’adsorbant (Dong et al. 2007). Boix et al., dans une étude expérimentale

69
de l'adsorption de BMP-2 sur de la poudre d’HA, montrent que l’ajout d’ions calcium en
solution conduit à une augmentation importante de la quantité maximale de BMP-2
adsorbable, et qu’à l’inverse l’ajout d’ions phosphate inhibe l’adsorption de la protéine. Cette
étude suggère là aussi que l’adsorption de la BMP-2 sur l’HA se produit essentiellement via
une interaction entre les groupements COO- de la protéine et les ions calcium de l’HA (Boix
et al. 2005). Une troisième étude compare l’adsorption de BMP-2 bovine sur des céramiques
de HA ou de BCP de différentes compositions. Ils montrent que la désorption de cette
protéine est quasiment irréversible et ne se produit qu’en présence d’ions phosphates,
indiquant une forte interaction entre la protéine et les ions calcium de l’apatite (Yuan et al.
1998).

1.4. Paramètres influençant l’adsorption de protéines sur les Ca-P

Dans la majorité des cas, l’adsorption de différentes protéines sur l’HA se fait en une
monocouche : Les isothermes d’adsorption sont, en effet, caractéristiques du modèle de
Langmuir et sont parfaitement décrits par l’équation de Langmuir suivante:

CKN
Q =
1 + KC
Avec :
Q : Quantité de protéine adsorbée par unité d’adsorbant
C : concentration à l’équilibre de la protéine en solution
N : Nombre maximum de sites d’adsorption par unité d’adsorbant
K : Constante d’affinité de la protéine pour l’adsorbant

Différents types de protéines sont absorbées par ce modèle : lysozyme natif et succinylé,
catalase, BSA, BMP-2 (Hughes Wassel et al. 1995, Barroug et al. 1997, Barroug et al. 1998,
Ouizat et al. 1999, Yin et al. 2002, Boix et al. 2005, Kandori et al. 2005). Les paramètres
d’adsorption N et K peuvent être définis à partir de cette équation. Le tableau III.1 mentionne
les valeurs de ces paramètres déterminés dans quelques études concernant l’adsorption de
protéines sur l’HA.

70
Tableau III.1 : Valeurs des paramètres d’adsorption de différentes protéines sur
l’hydroxyapatite décrits dans la littérature.
Protéine N x 108 (mol/m2) K x 10-6 (M-1) Références
BMP-2 3,8-11,5 0,24-23 (Boix et al. 2005)
BSA 2,3-4,2 0,03-16 (Ouizat et al. 1999)
Lysozyme succinylé 1,2-8,2 0,01-116 (Barroug et al. 1997)
BSA 0,6 - 1,8* mg/m2 100-1685* L/g (Hughes Wassel et al. 1995)

Dans ces différentes études, impliquant des protéines acides ou la BMP-2, les auteurs
montrent une forte influence des conditions expérimentales sur les valeurs des paramètres
d’adsorption N et K. Il y a une influence, d’une part, des conditions physico-chimiques de
l’adsorption des protéines et, d’autre part, des caractéristiques intrinsèques du matériau utilisé
en tant qu’adsorbant. Nous indiquons ici quelques paramètres susceptibles de modifier la
quantité de protéine adsorbée à saturation.

1.4.1. Conditions d’adsorption

• Ajout d’ions calcium ou phosphate


Ce paramètre semble très influent sur la quantité de protéine fixée. Dans le cas des protéines
se fixant préférentiellement par leurs groupements COO-, l’ajout de calcium conduit à une
augmentation de la quantité de protéine adsorbée (Hughes Wassel et al. 1995, Barroug et al.
1998, Ouizat et al. 1999, Boix et al. 2005). Les ions calcium en solution vont se fixer sur les
sites phosphate de l’apatite ; la présence de calcium en solution peut conduire à un
changement de polarité de la surface de l’HA, facilitant les interactions électrostatiques avec
les groupements chargés négativement (Yin et al. 2002). Les ions calcium sont, par ailleurs,
capables de se fixer directement sur les protéines comme la BSA et des ponts calcium peuvent
donc se former entre la protéine et l’HA (Hughes Wassel et al. 1995).
A l’inverse la présence d’ions phosphate inhibe partiellement ou totalement l’adsorption de
telles protéines, en rentrant en compétition avec les sites C de l’HA.

• Le pH et la force ionique
D’une manière générale, il a été montré que la quantité maximale de molécules adsorbées
augmente lorsque le pH se rapproche du pI de la protéine (Hughes Wassel et al. 1995,
Barroug et al. 1997, Barroug et al. 1998, Boix et al. 2005). Par ailleurs, l’augmentation de la
force ionique jusqu’à un certain seuil (différent selon les études), conduit à une augmentation

71
de la quantité de protéines « acides » adsorbée (Hughes Wassel et al. 1995, Barroug et al.
1997, Barroug et al. 1998, Boix et al. 2005).

• La température d’incubation
La température peut avoir une influence sur la quantité de protéine adsorbée mais cet effet
peut être différent d’une étude à l’autre, selon les protéines envisagées. Yin et al. ont montré,
par exemple, que la quantité de BSA adsorbée à saturation augmentait de presque 20%
lorsqu’on passait d’une température de 18,5°C à 30°C (N = 41,5 et 49 mg/g, respectivement)
(Yin et al. 2002), alors qu’une autre étude concernant l’adsorption de statherine, une protéine
de la salive, sur l’HA montre que celle-ci est quasiment indépendante de la température de
l’étude, avec peut-être même une légère diminution de la quantité adsorbée quand la
température augmente (Goobes et al. 2006).

1.4.2. Influence des caractéristiques de l’adsorbant

• La présence de β-TCP dans les échantillons


Comme nous l’avons indiqué, de nombreux travaux relatent des propriétés d’adsorption de
l’hydroxyapatite mais, en revanche, peu d’études ont été effectuées sur le β-TCP ou des
céramiques de BCP. Yuan et al. (Yuan et al. 1998) ont montré que l’adsorption d’une BMP-2
bovine diminuait lorsque le pourcentage de β-TCP dans des céramiques de BCP augmentait.
De même, Pellenc et al. ont observé une adsorption de fibronectine très faible sur des disques
de BCP alors que celle-ci était très importante sur l’HA ou le β-TCP seul, et ont indiqué que
la présence de deux composés pouvait diminuer l’adsorption (Pellenc et al. 2006). Zhu et al.
ont comparé l’adsorption du lysozyme et de la BSA sur l’HA, le β-TCP ou des céramiques de
BCP. Alors que l’adsorption du lysozyme est peu différente sur les trois types d’échantillons,
l’adsorption de la BSA est très largement supérieure sur les granulés de BCP en comparaison
avec les produits purs. Le caractère biphasique de ces composés semblerait donc intervenir
dans l’adsorption de la BSA, en modifiant, d’après ces auteurs, l’hydrophobicité modérée
observée pour l’HA ou le β-TCP (Zhu et al. 2007). Ohta et al. ont montré, en outre, qu’il
existait des différences d’adsorption et d’élution de la BSA sur le β-TCP, par rapport aux
autres composés phosphocalciques. L’adsorption de la BSA sur l’HA, le DCPA ou le DCPD
est quasiment irréversible et son élution ne se produit qu’en présence de fortes concentrations
en ions phosphate ; les molécules de BSA adsorbées sur du β-TCP sont, en revanche, éluées
très facilement à une très faible concentration en ions phosphate (Ohta et al. 2001).

72
• La surface spécifique et la porosité des échantillons
Gautier et al. ont souligné l’influence de la surface spécifique d’échantillons
phosphocalciques (apatite déficiente en calcium et phosphates de calcium biphasiques
(HA/β-TCP : 56/44) sur l’adsorption d’une hormone de croissance et sur sa cinétique de
libération in vitro, dans du PBS. Ils démontrent qu’au-delà d’un certain seuil, la surface
spécifique est fortement corrélée à la quantité de protéine adsorbée, alors que cette influence
ne semble pas primordiale pour les échantillons présentant une faible surface spécifique
(Gautier et al. 1998). Matsumoto et al. aussi ont montré que l’adsorption de cytochrome c sur
des échantillons d’HA était directement reliée à leur surface spécifique (Matsumoto et al.
2004).
Quelques auteurs discutent de l’influence de la porosité sur l’adsorption des protéines :
Habibovic et al. indiquent que l’ostéoinduction due aux matériaux pourrait être liée à leur
microporosité et que, dans ce cas, l’adsorption de protéines des fluides biologiques pourrait
être facilitée (Habibovic et al. 2005). Rouahi et al. ont, d’autre part, montré que l’adsorption
de protéines contenues dans du sérum est favorisée par l’existence de pores sur les matériaux
phosphocalciques (Rouahi et al. 2006b). Les mêmes observations ont été faites par Zhu et al.
qui ont étudié l’adsorption de TGF-β1 sur des pastilles denses ou poreuses de BCP. A l’instar
de leur résultats in vitro, l’implantation intramusculaire de ces céramiques placées dans des
chambres de diffusion chez la souris pendant 3 et 7 jours montre que la microporosité
augmente très fortement la quantité de TGF-β1 adsorbée sur les échantillons (Zhu et al.
2008).

• La présence d’une couche hydratée à la surface des échantillons


Ouizat et al. ont montré que le taux d’adsorption de la BSA sur les apatites mal cristallisée
était dépendante de l’état de maturation de celles-ci. En effet, les apatites présentant le plus
faible temps de maturation présentaient une capacité d’adsorption supérieure à celle des
autres. Cet effet avait été relié à la présence d’ions labiles dans la couche hydratée, donnant
aux apatites nanocritallines leur réactivité (Ouizat et al. 1999). De même, Midy et al. ont
comparé l’adsorption de deux protéines, le VEGF et le FGF, sur des poudres d’hydroxyapatite
ou d’apatites carbonatées présentant des surfaces spécifiques élevées et une forte quantité
d’ions labiles. Ils ont montré que l’adsorption de ces protéines était largement accrue sur les
échantillons d’apatite carbonatée. Ce phénomène a été relié à la présence à leur surface de
cette couche hydratée très réactive, capable d’échanger facilement les ions non contenus dans
la maille de l’apatite (Midy et al. 1998, Midy et al. 2001).

73
1.5. La libération

En général, dans les études effectuées chez l’animal, les protéines d’intérêt, susceptibles
d’avoir un effet ostéoinducteur, sont associées directement sur les biomatériaux par simple
dépôt d’une goutte concentrée et séchage de celle-ci. La libération de ces protéines associées
est par ailleurs rarement étudiée. Cependant, il est maintenant acquis qu’une libération
soutenue dans le temps constitue un élément majeur dans la capacité de reconstruction des
systèmes d’association biomatériaux-protéines (Seeherman et al. 2005).

La désorption de protéines, adsorbées sur l’HA ou d’autres composés phosphocalciques a été


régulièrement étudiée, notamment en chromatographie. Il est, par exemple, clairement définit
que l’adsorption de la BSA sur l’HA est quasiment irréversible et que son élution ne peut se
produire qu’en présence de fortes concentrations en ions phosphate (Ohta et al. 2001, Ohta et
al. 2002, Kandori et al. 2005). Les propriétés de désorption sont différentes selon les protéines
étudiées et le type de phosphate de calcium considéré comme l’on montré Ohta et al. (Ohta et
al. 2001, Ohta et al. 2002). Selon le mode fixation de la protéine, essentiellement sur les sites
C ou P, la désorption sera différente. La papaïne, par exemple, qui présente un pI entre 8,8 et
9,5 peut être désorbée très facilement dans du milieu SBF, alors que ce n’est pas le cas, des
protéines « acides ». D’autre part, l’élution de la BSA est différente selon qu’elle ait été
adsorbée sur du β-TCP ou d’autres composés phosphocalciques. Sur le β-TCP, l’élution se
fait facilement en présence d’une faible quantité d’ions phosphate.
La désorption de la BMP-2 n’a fait l’objet que d’une seule étude : Yuan et al. ont montré que
la BMP-2 bovine adsorbée sur des disques de HA ou BCP était uniquement désorbée en
présence d’ions phosphate (Yuan et al. 1998). De même, considérant l’adsorption de FGF ou
de VEGF sur l’HA ou des apatites carbonatées, seule un faible pourcentage de protéine est
libérée dans du TBS (Midy et al. 1998, Midy et al. 2001). Le pourcentage de libération du
cytochrome c adsorbé sur l’HA est très faible à pH 7 (Matsumoto et al. 2004).
Il est à noter, enfin, que la surface spécifique des adsorbats semble aussi jouer un rôle dans le
temps de libération des protéines. Le temps nécessaire pour que la moitié de la protéine
(hormone de croissance) soit désorbée dans du PBS contenant du sérum est largement
supérieur pour des échantillons présentant des surface spécifiques élevées (Gautier et al.
1998).

74
En résumé, ces différentes études concernant l’adsorption et la désorption de protéines sur des
composés phosphocalciques montrent que les mécanismes d’adsorption envisagés sont variés,
et diffèrent d’une étude à l’autre. Différents modèles d’adsorption sont proposés :
- Des modèles physiques faisant appel à des interactions dirigées par la charge de
surface des échantillons et le pI des protéines d’une part, ou à des interactions
hydrophobes, reliées à l’énergie interfaciale des échantillons, d’autre part.
- Des modèles chimiques impliquant des liaisons fortes entre l’adsorbant et
l’adsorbat. Dans ce cas, deux types de mécanismes peuvent être considérés :
L’association de la protéine sur des sites d’adsorption spécifiques sans réaction
chimique ou bien l’adsorption sur l’adsorbant par réaction d’échange ionique. Ce
dernier mécanisme a été proposé notamment comme mécanisme d’adsorption du
biphosphonate ou de l’héparine sur l’HA (Errassifi et al. 2009).
Beaucoup de questions sont donc encore en suspens et la compréhension des mécanismes
d’adsorption nécessitent des études plus approfondies. Etant donné le caractère appliqué de
notre projet, nous n’avons pas effectué de recherche des mécanismes mis en place lors de
l’adsorption de protéines sur nos échantillons, mais nous avons utilisé les données
expérimentales de la littérature.

2. Objectifs de l’étude
Les différents éléments décrits ci-dessus nous ont permis de penser que l’association de
céramiques de BCP avec des revêtements nanocristallins, très réactifs, pourrait favoriser
l’adsorption de protéines et une désorption de celles-ci soutenue dans le temps. Dans ce
chapitre, nous avons évalué la capacité de différents échantillons à adsorber la rhBMP-2 qui
est la protéine d’intérêt de notre étude. C’est l’adsorption de cette protéine sur nos
échantillons qui constituait à notre avis le facteur limitant concernant le choix final du type de
revêtement à utiliser pour la suite de l’étude. Nous avons donc comparé les capacités
d’adsorption de granulés de BCP non revêtus et revêtus avec deux types de procédés décrits
dans le chapitre précédent : les procédés NanoAp et NanoAp-EtOH. Les résultats obtenus
nous ont permis de déterminer le type de revêtement qui semblait présenter le plus fort
avantage.
Une fois ce choix effectué, nous avons poursuivit la caractérisation des échantillons témoins
et revêtus vis-à-vis de leur propriétés d’adsorption et de désorption de la rhBMP-2. Il était, en
effet, important de connaître les caractéristiques de ces échantillons en vue des études

75
réalisées par la suite, c'est-à-dire des expériences en culture cellulaire et des implantations
chez l’animal.

3. Matériel et méthodes

3.1. Réactifs

3.1.1. Adsorbant

L’adsorption des protéines est réalisée sur les micro-granulés de BCP (CERAFORM, poudre
12/10) revêtus ou non avec les différents dépôts décrits dans le chapitre précédent. Les
granulés non revêtus, notés granulés témoins, ont été calcinés et conservés à -20°C comme les
granulés revêtus. Les résultats obtenus ont par ailleurs été validés pour des granulés de forme
différente (granulés cubiques de 3 mm de côté).

3.1.2. Adsorbat : La rhBMP-2 non-glycosylée

La BMP-2 nous a été fournie par le Professeur W. Sebald de l’université de Würtsburg. Il


s’agit d’une BMP-2 recombinante humaine (rhBMP-2) exprimée chez E.coli. Cette protéine
n’a donc pas subit les modifications post-traductionnelles de glycosylation. Elle est
caractérisée par une masse molaire de 25,8 kDa, un point isoélectrique d’environ 8,2 et une
faible solubilité dans les conditions physiologiques (environ 2 µM) (Ruppert et al. 1996,
Abbatiello et al. 1997).

3.2. Adsorption de la rhBMP-2

L’adsorption de la rhBMP-2 par les céramiques est déterminée par l’utilisation d’un traceur,
rhBMP-2 radiomarquée, ajouté à une solution de BMP-2 froide. Cette méthode permet de
déduire avec une bonne précision la quantité de protéine adsorbée à partir des mesures de la
BMP-2 restante en solution. Il est par ailleurs possible de mesurer l’adsorption de la protéine
directement sur les granulés et de suivre sa désorption dans du milieu de culture en présence
d’autres protéines.

76
3.2.1. Marquage de la BMP-2

Le marquage radioactif de la BMP-2 a été réalisé par une méthode modifiée de la


chloramine T (Frolik et al. 1984). Il s’agit d’une méthode d’oxydation du groupement phénol
des tyrosines ou de la chaîne latérale de résidus histidines constituant la protéine par la
chloramine T en présence de Na125I. Ces composés oxydés vont réagir avec le Na125I ce qui
donne une protéine marquée à l’iode radioactif. Le marquage s’effectue selon le protocole
suivant :
10 µg de BMP-2 sont dissouts dans 50 µl d’un tampon phosphate (0,25M, pH 7,5) et
mélangés à 10 µl de Na125I (1 mCi). La réaction est initiée par l’ajout de l’agent oxydant à
température ambiante (solution de chloramine T à 0,1 mg/ml dans du tampon phosphate).
Trois ajouts successifs sont effectués : 5 µl pendant 2 minutes, 5 µl pendant 1,5 minutes, et 5
µl pendant 1 minute. La réaction est stoppée par l’addition de 20 µl de L-tyrosine (50mM),
200 µl d’iodure de potassium (60 mM) and 200 µl d’urée ultrapure (1,2 mg/ml d’acide
125
acétique 1M). La séparation de la BMP-2 radiomarquée, I-rhBMP-2, est ensuite effectuée
avec une colonne de chromatographie Sephadex G25 préalablement équilibrée. La
125
I-rhBMP-2 est éluée avec la solution suivante : 4 mM HCl, 75 mM chlorure de sodium,
0,1% BSA.

3.2.2. Protocoles d’adsorption de la BMP-2 par les granulés

Les protocoles d’adsorption sont basés sur des expériences précédentes qui avaient
montré une augmentation de la quantité maximale adsorbée de plusieurs protéines, dont la
BMP-2, en présence d’ions calcium (Hughes Wassel et al. 1995, Barroug et al. 1998, Boix et
al. 2005). Les solutions d’adsorption sont réalisées par dilution d’une solution mère de
rhBMP-2 froide (à 5 mg/ml) dans une solution tamponnée à pH 7,4 en présence de CaCl2 et
différentes concentrations de NaCl, selon les expériences. La 125I-rhBMP-2 est ensuite ajoutée
en faible quantité à la solution et sert de traceur pour évaluer la quantité de BMP-2 adsorbée
sur les échantillons.
Les conditions exactes des cinétiques d’adsorption ont été définies par rapport à la quantité de
rhBMP-2/implant nécessaire pour les implantations et des études préliminaires avec de la
albumine de sérum bovin.

77
• Expérience 1 : comparaison des différents substrats
Une solution d’adsorption à 300 µg/ml de rhBMP-2 est préparée dans un tampon NaCl
125
150 mM, CaCl2 10 mM, TRIS 25 mM, pH 7,4. La I-rhBMP-2 est ajoutée à cette solution
pour obtenir un rapport protéine marquée/protéine non marquée de 1 : 2000. 150 mg de
granulés sont immergés dans 300 µl de solution (Rapport S/L = 0,5 mg/µl). L’adsorption est
réalisée à 4°C et des prélèvements de 5 µl sont effectués aux temps 0, 15 minutes, 30 minutes,
1 h, 2 h, 4 h et 24 h. La radioactivité restante en solution est comptée à l’aide d’un compteur
de radiations gamma. Un tube ne contenant que la solution radioactive sert de référence. Les
mesures sont effectuées sur des échantillons en deux exemplaires sur deux expériences
indépendantes et exprimées en tant que moyenne ± écart-type.

• Expérience 2 : Cinétiques d’adsorption pour deux types de granulés


Dans cette cinétique, les conditions expérimentales ont été modifiées pour obtenir de
meilleurs résultats et se placer dans des conditions optimales pour une utilisation industrielle
potentielle. Plusieurs paramètres ont été changés : l’utilisation d’un tampon de force ionique
élevée permet d’augmenter la quantité maximale de protéine adsorbée (Boix et al. 2005) et la
solubilité de la BMP-2 (Abbatiello et al. 1997). D’autre part, la température d’adsorption a été
augmentée et des tubes indépendants de forme conique permettant un meilleur contact entre
les échantillons et la solution d’adsorption ont été utilisés. Des mélanges plus réguliers des
échantillons ont enfin été réalisés afin de mettre tout en œuvre pour faciliter la diffusion des
protéines et le contact avec les granulés.
La BMP-2 froide est dissoute dans un tampon NaCl 1 M, CaCl2 10 mM, TRIS 25 mM, pH
125
7,4, à une concentration de 300 µg/ml et la I-rhBMP-2 est ajoutée à la solution avec un
rapport 1 : 4000. Des échantillons indépendants sont réalisés pour chaque temps
d’incubation : 30 mg de granulés sont incubés dans 60 µl de solution d’adsorption dans des
tubes fermés mélangés régulièrement et placés à 37°C pendant un temps variable (15 minutes,
30 minutes, 1h, 2h, 4h, 8h ou 24h). Aux temps donnés, la radioactivité présente dans le
surnageant est comptée (2 prélèvements de 5 µl). Les mesures sont effectuées sur au
minimum 3 échantillons distincts par type de granulés et par temps d’incubation (Moyenne ±
Erreur standard à la moyenne (SEM)).

• Expérience 3 : Isothermes d’adsorption


La BMP-2 froide est dissoute dans un tampon NaCl 1 M, CaCl2 10 mM, TRIS 25 mM, pH
7,4, à des concentrations variables comprises entre 150 µg/ml (6 µM) et 1000 µg/ml (39.9
125
µM). La I-rhBMP-2 est ajoutée aux solutions avec un rapport 1 : 2000. 20 µg de granulés

78
revêtus ou témoins sont incubés dans 40 µl de solution d’adsorption pendant 24h à 37°C dans
un batch fermé mélangé régulièrement. A l’issue de ce temps, les surnageants sont prélevés et
comptés (2 prélèvements de 5 µl). Afin de vérifier les paramètres d’adsorption obtenus par
cette technique, les granulés sont lavés à trois reprise avec 1 ml de solution saturée en β-TCP
pour éliminer la 125I-rhBMP-2 non adsorbée tout en évitant la dissolution des granulés. Après
séchage à température ambiante pendant 72h, les échantillons sont dissouts dans 300µl
d’acide perchlorique 6N. Les solutions de dissolution sont comptées et les paramètres
d’adsorption sont évalués.

3.3. Libération de la rhBMP-2

Nous avons comparé la libération dans du milieu de culture de la rhBMP-2 associée, par deux
méthodes distinctes, aux granulés témoins ou revêtus présentant la plus grande capacité
d’adsorption. Cette libération a été suivie en mesurant le taux de radioactivité dans les
solutions mises en contact avec les différents échantillons.

3.3.1. Echantillons utilisés

• Granulés contenant la rhBMP-2 adsorbée


Les échantillons utilisés dans cette étude sont issus de la cinétique d’adsorption n°2. Les
échantillons ayant servis pour les points 24h, ont été lavés à trois reprises avec 1 ml de
solution saturée en β-TCP puis séchés à température ambiante pendant 72h.

• Granulés contenant de la rhBMP-2 déposée par goutte


La préparation des échantillons est réalisée de la manière suivante : 6 µl de solution de
rhBMP-2 à 3 mg/ml contenant de la 125I-rhBMP-2 (rapport 1 : 680) sont déposés sur 30 mg de
granulés. Les granulés sont ensuite séchés à température ambiante pendant 72 heures. Ces
échantillons sont notés témoins ou revêtus « - rhBMP-2 déposée ».

3.3.2. Protocole de suivi de la libération

La désorption de la rhBMP-2 est suivie dans du milieu de culture DMEM (Dulbecco’s


modified Eagle’s medium), complémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (Gibco, Invitrogen)
et des antibiotiques (1% pénicilline et streptomycine (Invitrogen)). Pour chaque type
d’association BMP-granulé, deux des cinq échantillons disponibles sont dissouts dans 300µl
d’acide perchlorique et les molécules radioactives présentes dans ces solutions sont comptées

79
afin de déterminer la valeur initiale de radioactivité présente sur les granulés (100%). Les trois
autres échantillons sont utilisés pour la cinétique de désorption. Ces échantillons sont incubés
avec 1 ml de milieu de désorption. Après 2 minutes d’incubation et à des intervalles de temps
irréguliers jusqu’à 22 jours, le milieu est prélevé et remplacé par 1 ml de milieu frais. Les
molécules radioactives libérées dans le milieu prélevé sont comptées. Après avoir pris en
considération la perte de radioactivité relative au temps de demi-vie de l’iode125, une courbe
de libération cumulée en fonction du temps a été tracée.

4. Résultats

4.1. Comparaison de l’efficacité des différents revêtements

Nous avons comparé les capacités d’adsorption des différents revêtements vis-à-vis de la
rhBMP-2.

Figure III.1 : Cinétique d’adsorption de la rhBMP-2 pour les différents échantillons.


Quantité de protéine adsorbée par gramme de granulés (a) et par unité de surface des
échantillons (b) en fonction du temps. Conditions expérimentales : rhBMP-2 à 300 µg/ml
dans tampon NaCl 150 mM, CaCl2 10mM, TRIS 25 mM, pH 7,4, rapport S/L=0,5mg/µl,
incubation à 4°C.

80
Nous pouvons observer sur la Figure III.1a que les profils d’adsorption de la BMP-2 en
fonction du temps sont similaires pour les différents échantillons : la quantité de BMP-2
adsorbée augmente rapidement au cours des premières heures puis l’adsorption se poursuit
progressivement jusqu’à 24h.
Quel que soit le procédé de recouvrement utilisé, les granulés revêtus présentent une quantité
de BMP-2 absorbée supérieure à celle des granulés témoins, non revêtus, dès 15 minutes et
jusqu’à 24 heures. Cela indique que les modifications de surface effectuées permettent
d’augmenter de manière significative (p < 0,05) la capacité d’adsorption des granulés ainsi
que la vitesse d’adsorption. Parmi les différents revêtements étudiés, le dépôt
NanoAp-EtOHx1 donne les résultats les plus prometteurs. En effet, à 24h, les granulés
NanoAp-EtOHx1 adsorbent 2,3 fois plus de BMP-2 que les granulés témoins (p = 0,0002) et
1,6 fois plus que les granulés NanoApx1 (p = 0,006).
La multiplication du nombre de revêtements est corrélée à la quantité de rhBMP-2 adsorbée
pour les granulés NanoAp. Par contre, cet effet n’est pas observé pour les échantillons revêtus
par le procédé NanoAp-EtOH. En effet, la quantité adsorbée apparaît même légèrement plus
faible pour les granulés NanoAp-EtOHx2 que pour les granulés NanoAp-EtOHx1.
L’expression de la quantité de BMP-2 adsorbée par aire de surface d’échantillon permet
d’évaluer l’influence de la surface spécifique sur les propriétés d’adsorption des céramiques
(Figure III.1b). Dans ce cas, les courbes d’adsorption de la BMP-2 par les granulés
NanoApx1, NanoApx2 et NanoAp-EtOHx1 se superposent parfaitement. Ces résultats
semblent indiquer une influence de la surface spécifique sur l’adsorption des protéines par les
granulés revêtus. Cependant, nous pouvons observer que la quantité de protéine adsorbée par
m2 d’échantillon NanoAp-EtOHx2 est beaucoup plus faible et qu’à l’inverse les céramiques
témoins sont capables d’adsorber une quantité plus importante de BMP-2 (en µg/m2) que les
échantillons revêtus. D’autres paramètres apparaissent donc impliqués dans les capacités
d’adsorption de nos échantillons vis-à-vis de la BMP-2.

Ces premières expériences nous ont permis d’effectuer une comparaison entre les différents
échantillons concernant l’adsorption de la rhBMP-2. Les résultats obtenus indiquent que les
modifications de surface effectuées sur les céramiques apportent un avantage significatif pour
l’adsorption de cette protéine.
Le revêtement qui semble présenter le plus d’intérêt est le NanoAp-EtOHx1. D’autre part, la
multiplication des revêtements par le procédé NanoAp-EtOH ne semble pas apporter

81
d’avantage substantiel. Cette technique n’a donc pas été retenue, étant donné les contraintes
supplémentaires qu’elle engendrerait d’un point de vue industriel.
Nous avons donc choisi de retenir le revêtement NanoAp-EtOHx1 pour la suite du projet et
nous avons poursuivi la caractérisation de ses propriétés d’adsorption et de désorption.

D’autre part, le pourcentage d’adsorption de la BMP-2 par rapport à la quantité présente en


solution apparait assez faible dans les conditions expérimentales étudiées : ce pourcentage est
seulement de 42% pour les échantillons NanoAp-EtOHx1. Nous avons donc modifié les
conditions expérimentales d’adsorption de la rhBMP-2 afin d’obtenir un meilleur rendement.

4.2. Etude comparative entre les granulés témoins et


NanoAp-EtOHx1

Dans cette partie, nous avons comparé de manière plus poussée les propriétés d’adsorption
des céramiques témoins, non revêtues, et des céramiques revêtues par le dépôt NanoAp-
EtOHx1.
Les expériences concernant l’adsorption de la rhBMP-2 ont été réalisées dans des conditions
différentes, susceptibles d’améliorer le taux d’adsorption.

4.2.1. Cinétiques d’adsorption de la rhBMP-2

La cinétique d’adsorption de la BMP-2 sur les granulés témoins et les granulés revêtus,
NanoAp-EtOHx1, dans ces nouvelles conditions est décrite par la figure III.2.

Figure III.2 : Cinétiques d’adsorption de la rhBMP-2 sur les granulés témoins et NanoAp-
EtOHx1. Conditions expérimentales : rhBMP-2 à 300 µg/ml dans tampon NaCl 1 M, CaCl2
10mM, TRIS 25 mM, pH 7,4, rapport S/L=0,5mg/µl, incubation à 37°C.

82
Nous pouvons constater que comme précédemment, pour chacun des temps d’incubation, le
revêtement augmente de manière significative (p<0,005) la quantité de facteur de croissance
adsorbée. Après 24h, les granulés NanoAp-EtOHx1 adsorbent 517 ± 9 µg de rhBMP-2 par
gramme de granulés alors que les granulés témoins n’adsorbent que 397 ± 19 µg/g. Cette fois-
ci la quantité de BMP-2 adsorbée est plus importante et atteint 87% ± 3% pour les céramiques
revêtues et 66% ± 4% pour les témoins.
La cinétique d’adsorption peut être décrite de la manière suivante : la quantité de BMP-2
adsorbée augmente rapidement jusqu’à l’obtention d’un palier pour les granulés NanoAp-
EtOHx1 à partir de 4h et continue d’augmenter progressivement pour les granulés témoins
jusqu’à 24h. Les vitesses initiales d’adsorption ont pu être calculées à partir de la pente sur les
premiers points de la courbe et correspondent à 444 µg/(g.h) contre 185 µg/(g.h) pour les
granulés revêtus et témoins respectivement.

4.2.2. Isothermes d’adsorption de la rhBMP-2

Les isothermes d’adsorption sont représentés par la figure III.3.

Figure III.3 : Isothermes d’adsorption de la BMP-2 sur les échantillons témoins et revêtus
par le procédé NanoAp-EtOH. Conditions expérimentales : rhBMP-2 entre 150 et 1000
µg/ml dans un tampon NaCl 1 M, CaCl2 10mM, TRIS 25 mM, pH 7,4, rapport S/L=0,5mg/µl,
incubation à 37°C pendant 24h.

Pour des concentrations supérieures à 150 µg/ml, les granulés revêtus adsorbent une plus
grande quantité de rhBMP-2 que les granulés témoins. Ces isothermes sont caractéristiques du
modèle de Langmuir. Le calcul des paramètres N et K, représentant respectivement, la

83
quantité théorique maximale de molécules adsorbée et l’affinité de la protéine pour le
substrat, peut être effectué à partir du modèle linéarisé de Langmuir :
C C 1
= +
Q N N .K

Avec :
Q : Quantité de protéine adsorbée par unité d’adsorbant (en µg/g ou µmol/m2)
C : concentration à l’équilibre de la protéine en solution (en µg/ml ou µM)
N : Nombre maximum de sites d’adsorption par unité d’adsorbant (en µg/g ou µmol/m2)
K : Constante d’affinité de la protéine pour l’adsorbant (en ml/µg ou litre/µmol)

La quantité maximale théorique de BMP-2 adsorbée est égale à 1608 ± 170 µg/g pour les
granulés revêtus et 758 ± 68 µg/g pour les granulés témoins.

Tableau III.2 : Valeurs des paramètres N et K pour l’adsorption de la BMP-2.


Adsorbant N ± ∆N x108 (mol/m2) K ± ∆K x10-6 (M-1) Référence
Granulés témoins 6.9 ± 0.6 0.28 ± 0.15 Ce travail
Granulés NanoAp-EtOH 3.2 ± 0.3 0.17 ± 0.05 Ce travail
Poudre Hydroxyapatite 3.8 – 11.5 0.24 – 23 (Boix et al. 2005)

Exprimée par unité de surface des échantillons (Tableau III.2), la quantité maximale de
BMP-2 adsorbée est plus faible pour les granulés revêtus que pour les granulés témoins, ce
qui rejoint les résultats précédents. En comparant nos résultats avec ceux obtenus par Boix et
al. dans l’étude de l’adsorption de rhBMP-2 sur de la poudre d’HA, nous constatons que la
quantité maximale de protéine adsorbée est du même ordre de grandeur pour les échantillons
témoins mais apparaît légèrement plus faible pour les granulés NanoAp-EtOH. De même,
l’affinité de la BMP-2 pour les échantillons est faible, notamment pour les granulés revêtus.

4.3. Suivi de la libération de la rhBMP-2

Dans cette partie, nous avons cherché à déterminer le profil de libération de la BMP-2 suite à
son association avec nos échantillons témoins et NanoAp-EtOH par deux méthodes
différentes qui ont été utilisée dans la suite du projet pour les implantations chez l’animal.

84
La figure III.4 représente la cinétique de libération cumulée de la BMP-2 associée à nos
granulés dans du milieu complet, présentant une composition proche de celle des fluides
biologiques.

Figure III.4 : Libération cumulée de la rhBMP-2 dans du milieu de culture complet. La


BMP-2 a été préalablement adsorbée ou déposée sur les échantillons témoins et NanoAp-
EtOHx1.

Les différents profils de libération de la BMP-2 sont similaires : nous pouvons observer tout
d’abord une libération assez rapide puis un ralentissement de celle-ci après 48 heures. La
libération se poursuit progressivement de manière linéaire.
Considérant les granulés contenant la BMP-2 adsorbée, la libération cumulée est plus lente
pour les granulés revêtus que pour les granulés témoins. La différence de libération entre ces
échantillons est faible mais significative après seulement 4h d’incubation. A 21 jours, la
quantité de BMP-2 désorbée est de 139 ± 4 µg/g pour les granulés témoins et 100 ± 5 µg/g
pour les échantillons NanoAp-EtOH. Si l’on considère à la fois qu’une quantité plus grande
de BMP-2 est adsorbée sur les granulés revêtus et que la libération est plus lente, après 21
jours, le pourcentage de libération est bien plus faible pour les granulés revêtus (23%) que
pour les céramiques témoins (46%).
Lorsque la BMP-2 est associée aux céramiques par simple dépôt d’une goutte concentrée et
séchage, la libération est au contraire supérieure pour les granulés revêtus par rapport aux
granulés témoins : 268 ± 13 µg/g de BMP-2 est relarguée dans le milieu après 21 jours par les

85
échantillons revêtus contre et 225 ±12 µg/g par les céramiques témoins. Nous pouvons
constater que ces valeurs sont très supérieures à celles obtenues pour les échantillons
contenant la protéine adsorbée.
Nous observons que la libération de la BMP-2 est plus rapide pour les échantillons
« BMP-2déposée » dès les premières minutes et que l’écart s’amplifie au cours de la cinétique.
En effet, la détermination de la pente entre des temps tardifs (entre 7 et 22 jours) permet de
calculer la quantité de BMP-2 libérée par heure à partir de 7 jours d’incubation dans le milieu.

Tableau III.3 : Vitesse de libération après 7 jours d’incubation dans du milieu de culture
complet et pourcentage de libération à J21 pour les différents échantillons.
Vitesse de libération Pourcentage de BMP-2
Echantillons
entre J7 et J22 libérée à J21
Témoin-BMP-2adsorbée 0,10 µg/g/h 45 ± 1 %
Revêtu-BMP-2adsorbée 0,04 µg/g/h 23 ± 2 %
Témoin-BMP-2déposée 0,18 µg/g/h 37 ± 2 %
Revêtu-BMP-2déposée 0,21 µg/g/h 45 ± 2 %

Les résultats, mentionnés dans le tableau III.3, montrent que l’adsorption de la BMP-2
conduit à une désorption lente pour les échantillons témoins et revêtus et permet aux granulés
revêtus d’assurer une libération soutenue dans le temps, si on l’a compare à la fois aux
échantillons témoins et à la méthode d’association par simple dépôt d’une goutte de solution
protéique.

5. Discussion
Dans cette étude, nous avons étudié les propriétés d’adsorption et de désorption de granulés
de BCP revêtus par différentes sortes de dépôts d’apatite nanocrystalline présentant une forte
réactivité de surface. De par leurs propriétés, les céramiques revêtues étaient susceptible de
présenter une capacité d’adsorption protéique importante et une libération soutenue dans le
temps. Les différents revêtements permettent, en effet, d’augmenter la surface spécifique des
échantillons et présentent à leur surface une couche hydratée qui rentre en jeu dans la
réactivité des apatites nanocrystallines (Ouizat et al. 1999, Cazalbou 2000) et possèdent, en
plus des macro- et micro- porosités initiales, une nano-porosité susceptible d’augmenter la
quantité de protéines adsorbée. L’étude de l’adsorption de la rhBMP-2 a montré effectivement
que les granulés revêtus présentaient une capacité d’adsorption plus importante que celle des

86
granulés non revêtus : la quantité d’adsorption et la vitesse d’adsorption sont plus importantes
en présence des revêtements. La cinétique d’adsorption apparaît relativement lente par rapport
aux études concernant l’adsorption de protéines sur HA.

5.1. Vitesse d’adsorption

L’adsorption de différentes protéines, incluant la BSA et la BMP-2, par HA est généralement


très rapide et l’équilibre est atteint en moins de 30 minutes (Hughes Wassel et al. 1995,
Ouizat et al. 1999, Boix et al. 2005). Dans d’autres études, cependant, le temps d’incubation
nécessaire pour que l’équilibre soit atteint est de l’ordre de plusieurs heures. C’est le cas, par
exemple, de l’adsorption du lysozyme succinylé (Barroug et al. 1997) et de la catalase
(Barroug et al. 1998). Dans ces études, Barroug et al. ont suggéré que l’adsorption pouvait
être ralentie par les forces de répulsions existantes entre l’adsorbat et l’adsorbant, tous deux
chargés négativement, ou par la nécessité pour la protéine de subir des modifications
conformationnelles pour s’adsorber (Barroug et al. 1997, Barroug et al. 1998). D’autre part,
dans l’étude des mécanismes d’adsorption de la BSA sur l’hydroxyapatite menée par Kandori
et al., l’équilibre d’adsorption est atteint entre 6 et 24 heures (Kandori et al. 2005). Ce résultat
est différent de ceux publiés par ailleurs (Hughes Wassel et al. 1995, Ouizat et al. 1999) alors
que les conditions expérimentales ne semblent pas présenter de différences notables. La
vitesse d’adsorption pourrait donc être soumise à d’autres conditions. Dans leur étude
concernant l’adsorption de la catalase sur l’HA, Barroug et al. ont en effet suggéré que des
problèmes liés à la diffusion de la protéine à l’intérieur de leur hydroxyapatite poreuse
pouvait intervenir dans le ralentissement de l’adsorption protéique (Barroug et al. 1998). Etant
donné la morphologie de nos échantillons, ce paramètre mérite d’être pris en considération.
Nous avons observé aussi bien pour la BMP-2 que pour la BSA (Figure III.5a) que l’équilibre
n’était atteint qu’après plusieurs heures d’incubation. Or, Ouizat et al. ont montré que
l’adsorption de la BSA sur des apatites mal cristallisées, présentant des caractéristiques
similaires aux cristaux composant nos revêtements, était très rapide (Ouizat et al. 1999). Un
des paramètres majeurs qui diffère entre ces deux études est la morphologie de l’adsorbant :
alors que dans le travail de Ouizat et al., les apatites étaient sous forme de poudre, dans notre
cas, nous utilisons des granulés très poreux, présentant à la fois une macro- et une micro-
porosités et parfois une nano-porosité. Des problèmes liés à la diffusion de la solution à
l’intérieur des pores ont donc été envisagés et une expérience réalisée dans ce projet nous
fournit quelques renseignements à ce sujet : nous avons comparé l’adsorption de la BSA après

87
2h d’incubation à température ambiante avec des granulés NanoAp avant et après séchage du
revêtement. Les pourcentages de BSA adsorbée sont de 85% pour les échantillons non séchés
contre 29% pour les granulés séchés (Figure III.5b). Ceci indique qu’une diffusion facilitée
par un revêtement encore humide conduit à une augmentation nette de la vitesse d’adsorption.
La diffusion des protéines à l’intérieur des macro- micro- et nano-pores des échantillons
semblent donc constituer le principal facteur limitant de la vitesse d’adsorption dans notre
étude. Le projet initial prévoyait d’associer la protéine d’intérêt aux céramiques directement
en salle d’opération avant leur implantation. Au vue des résultats obtenus ici, une association
préalable de la protéine a été préférée pour les expériences d’implantation chez l’animal.

Figure III. 5: Adsorption de la BSA sur les échantillons revêtus. Pourcentage d’adsorption
de la BSA après 30 minutes ou 24h d’incubation avec les granulés témoins ou revêtus selon
différents procédés (a). Conditions expérimentales : BSA à 250 µg/ml dans solution NaCl
150 mM à 4°C, rapport S/L=0,25mg/µl. Pourcentage d’adsorption après 2h d’incubation
avec les granulés NanoAp avant ou après séchage du revêtement (b). Conditions
expérimentales : Conditions expérimentales : BSA à 250 µg/ml dans de l’eau désionisée à
température ambiante, rapport S/L=0,25mg/µl.

5.2. Comparaison des capacités d’adsorption des différents


échantillons

5.2.1. Comparaison des granulés témoins et revêtus

L’augmentation de la quantité de protéine adsorbée constitue le principal avantage de notre


procédé de revêtement. Les résultats obtenus indiquent que la surface spécifique joue un rôle
important dans la capacité d’adsorption des échantillons, comme cela a déjà été décrit
(Gautier et al. 1998, Matsumoto et al. 2004). Cependant, les différences d’adsorption

88
observées ne peuvent pas être uniquement expliquées par une modification de la surface
spécifique des granulés : il apparaît que ce sont les granulés témoins, non revêtus, qui
possèdent la plus grande capacité d’adsorption par unité de surface. Des comportements
similaires ont été observés lors de nos études préliminaires de l’adsorption de la BSA sur nos
échantillons. Ces résultats pourraient provenir soit d’une différence des propriétés
d’adsorption des granulés de BCP et des nanocristaux d’apatite, soit d’une diffusion limitée
de la protéine à l’intérieur du revêtement.
Plusieurs études ont montré que l’adsorption de protéines pouvait être différente sur des
échantillons de BCP et sur l’HA (ou le β-TCP). Gautier et al., en particulier, ont mesuré
l’adsorption d’une hormone de croissance sur des céramiques de BCP (56/44) et sur l’apatite
déficiente en calcium ayant servie à leur fabrication ; il semble qu’ils obtiennent des profils
similaires aux nôtres. La forte surface spécifique des apatites déficientes en calcium
permettrait d’adsorber une quantité de protéine très supérieure à celle mesurée sur les
céramiques de BCP frittées, présentant une surface spécifique faible. Pourtant, comparée à la
surface spécifique des échantillons, la quantité de protéine fixée semble plus importante pour
les granulés de BCP, frittés à haute température (Gautier et al. 1998). Zhu et al. ont montré
que des granulés de BCP possédaient des capacités d’adsorption de la BSA très supérieures à
l’HA ou le β-TCP (Zhu et al. 2007). Dans notre étude, il n’est donc pas exclu que les effets
observés soient en partie dus à des capacités d’adsorption différentes entre les céramiques de
BCP et les nanocristaux d’apatite carbonatée déficiente en calcium. Cependant, la présence de
β-TCP dans nos échantillons ne semble pas influencer de manière significative l’adsorption
des protéines étudiées. En effet, les quantités maximales de protéines adsorbées sur les
granulés témoins déterminées ici sont du même ordre de grandeur que celles obtenues
précédemment, par Boix et al. pour la BMP-2 (Boix et al. 2005) et Ouizat et al. par exemple
pour la BSA (Ouizat et al. 1999).
Ce sont, en fait, les résultats obtenus pour les granulés revêtus (quantité adsorbée de rhBMP-2
ou BSA par unité de surface) qui apparaissent particulièrement faibles. Ceci semble indiquer
que l’accessibilité de la protéine aux nanocristaux est limitée par des phénomènes de diffusion
de la solution d’adsorption au travers des nanopores de nos revêtements. La comparaison des
capacités d’adsorption des différents revêtements tend à étayer cette hypothèse.
L’affinité de la BMP-2 est plus faible pour les granulés revêtus que pour les granulés témoins.
Ces valeurs sont par ailleurs inférieures à celles précédemment décrites dans des conditions
similaires (Boix et al. 2005). Ce paramètre, cependant, est particulièrement sensible aux

89
conditions expérimentales et aux caractéristiques du substrat, comme le montrent les écarts
obtenus dans des études précédentes selon les paramètres étudiés. Ce paramètre varie
considérablement (d’un facteur 100) dans l’étude de Ouizat et al. sur l’adsorption de BSA sur
des apatites nanocristallines en fonction de leur état de maturation (Ouizat et al. 1999).

5.2.2. Comparaison des revêtements

Les propriétés d’adsorption les plus avantageuses ont été observées pour les échantillons
revêtus par le procédé NanoAp-EtOH. Ouizat et al. ont montré que le taux d’adsorption de la
BSA sur les apatites mal cristallisée était dépendante de leur état de maturation et cet effet a
été relié à la quantité d’ions labiles présents dans la couche hydratée (Ouizat et al. 1999).
Dans notre étude, l’influence de cette couche hydratée sur les capacités d’adsorption de la
BMP-2 n’est pas mise en évidence : les cristaux NanoAp-EtOH ont une quantité d’ions labiles
en surface plus faible que les cristaux NanoAp ; pourtant, leurs capacités d’adsorption par
unité de surface apparaissent similaires. Dans cette étude, l’épaisseur de la couche hydratée ne
semble donc pas être un élément critique pour l’adsorption de la BMP-2 sur nos échantillons,
alors que nous avons constaté qu’elle jouait un rôle important dans les mécanismes d’échange
ionique avec le strontium.
Ces résultats semblent indiquer que les protéines ont des difficultés à pénétrer à l’intérieur des
pores du revêtement. Ces pores présentent, en effet, un diamètre inférieur à 15 nm et
pourraient être rapidement obstrués par la BMP-2 de dimension 7 nm x 3,5 nm x 3 nm
(Scheufler et al. 1999). L’accessibilité des protéines à la surface serait donc plus faible que
celle des molécules d’azote, utilisées pour déterminer la surface spécifique, ou des ions
strontium, de taille plus petite. De plus, la formation de ponts hydrogènes entre les cristaux et
les molécules d’eau – de la solution ou de la couche hydratée – pourrait aussi limiter les
phénomènes de diffusion de la protéine à l’intérieur du revêtement.

Dans les études d’adsorption de la BMP-2, la répétition du procédé de revêtement NanoAp


induit une augmentation significative de la quantité de protéine adsorbée mais les capacités
d’adsorption par unité de surface sont similaires pour les échantillons NanoApx1 et
NanoApx2. La répétition du procédé NanoAp-EtOH, par contre, n’engendre pas de
modifications significatives de la quantité de protéine adsorbée. La quantité de protéine
adsorbée apparaît légèrement supérieure pour la BSA (Figure III.5a) et légèrement inférieure
pour la BMP-2. Ce dernier résultat est étonnant et pourrait être la résultante de modifications

90
du dépôt liées au procédé de fabrication (perte d’adhérence du dépôt, changement des
propriétés de surface dont la mouillabilité ou la charge de surface). Ce résultat devrait
cependant être confirmé avant d’entreprendre une étude plus approfondie. La répétition du
procédé NanoAp-EtOH ne conduit donc pas à un avantage substantiel concernant l’adsorption
protéique et la quantité de protéine adsorbée par unité de surface est très faible pour les
échantillons NanoAp-EtOHx2. Cette observation pourrait être reliée aux difficultés de
diffusion de la solution protéique à l’intérieur du revêtement, citées précédemment. Comme
nous l’avons vu dans le chapitre précédent, pour le procédé NanoAp, la multiplication du
revêtement s’accompagne, en parallèle de l’augmentation de la surface spécifique, d’une
augmentation de la surface extérieure de contact : les blocs cristaux de superposent,
augmentant ainsi le taux de recouvrement de la céramique par le dépôt. Par contre, le dépôt
NanoAp-EtOH recouvre initialement la quasi-totalité de la surface de la céramique et la
multiplication du procédé de revêtement induit majoritairement une augmentation de
l’épaisseur du dépôt. Les résultats d’adsorption obtenus pour les différents revêtements
suggèrent donc que la protéine ne pénètre que partiellement dans le dépôt nanocristallin :
l’augmentation de la surface de contact s’accompagne d’une capacité d’adsorption protéique
accrue alors que l’augmentation de l’épaisseur de revêtement n’a qu’un effet très limité sur la
quantité de protéine adsorbée.

5.3. Libération de la rhBMP-2

Il a été montré dans de nombreuses études que le temps de rétention de la protéine d’intérêt au
niveau du site chirurgical était un facteur primordial pour la réussite de la reconstruction
osseuse (Seeherman et al. 2005, Liu et al. 2007b). En fonction du matériau et du type
d’association impliqués, plusieurs modes d’action du facteur de croissance peuvent être
envisagés : (i) la libération spontanée de la protéine et son interaction consécutive avec les
récepteurs cellulaires ; (ii) la libération de la protéine par contrôle cellulaire, avec notamment
l’implication des ostéoclastes ; et (iii) l’interaction directe entre la protéine adsorbée dont le
domaine de liaison avec les récepteurs serait accessible.
Dans le premier cas, la protéine peut intervenir à une certaine distance de l’implant, mais
sa libération ne peut être contrôlée. Lorsque l’association de la protéine est effectuée par
simple imprégnation et séchage (méthode d’association la plus couramment utilisée), seuls
des mécanismes liés à la diffusion de la molécule sont susceptibles d’intervenir. Dans ce type
d’association, il est probable que la protéine précipite ou cristallise à la surface du matériau en

91
formant des agrégats. La libération serait donc uniquement liée aux phénomènes de diffusion
et de dissolution et dans ces conditions, le degré de solubilité de ces agrégats constitueraient
donc un paramètre important dans la cinétique de libération de la protéine. Deux études ont
montré, en effet, que la BMP-2 non glycosylée, présentant une solubilité faible en milieux
physiologiques, avait un temps de rétention plus long que des BMP-2, dont la solubilité avait
été augmentée, après leur association simple sur des fibres de collagène (Uludag et al. 2001)
ou sur des gels de fibrine (Schmoekel et al. 2004). Dans notre étude de libération (lors de
laquelle la limite de solubilité n’est jamais atteinte), nous avons pu déterminer que la quantité
libérée de BMP-2, préalablement adsorbée, était très faible. Les granulés revêtus présentent
un temps de rétention largement supérieur aux autres échantillons. La comparaison des
cinétiques de libération selon le mode d’association de la protéine (adsorption ou dépôt d’une
goutte et séchage) nous a permis d’exclure la faible solubilité de la rhBMP-2 non-glycosylée
comme paramètre principal de cette libération soutenue.
Dans le cas de la BMP-2 adsorbée, nous pouvons constater que la libération spontanée dans
du milieu de culture est assez faible mais non négligeable, alors que, par exemple, la
libération de BSA dans du SBF est quasi-nulle. Une dissolution spontanée des échantillons ne
semble pas être responsable de cette libération étant donné que le milieu de culture doit être
sursaturé par rapport au revêtement nanocristallin ou au β-TCP. Par contre, le milieu de
désorption contient à la fois des ions phosphate et de nombreuses molécules susceptibles de
déplacer la BMP-2. En général, cependant, la libération par les ions phosphate est rapide et
dépend essentiellement de leur concentration. Nous avons indiqué que les sites d’association
entre la BSA et la BMP-2 pourraient être identiques et que par contre l’affinité de la BSA
pour les granulés serait supérieure à celle de la BMP-2. De telles protéines pourraient donc
participer à la désorption de la BMP-2, donnant lieu à une libération moins rapide. De même,
il n’est pas exclu que des changements dans les caractéristiques de surface des échantillons
puissent intervenir.
D’autre part, Ohta et al. ont montré que l’élution de protéines acides telles que la BSA était
différente sur le β-TCP que sur l’HA et s’effectuait en présence d’une concentration en
phosphate très faible (Ohta et al. 2001). Nous pouvons donc envisager que la présence de
β-TCP dans nos échantillons puisse en partie être responsable de la libération de la BMP-2
dans le milieu. Enfin, la différence de désorption observée par Gautier et al. en fonction de la
surface spécifique des échantillons (Gautier et al. 1998) est aussi valable dans notre étude

92
puisque la désorption est significativement plus faible après adsorption de la rhBMP-2 sur les
granulés revêtus par rapport aux granulés témoins.
Il faut noter, cependant, que la libération n’a pas été effectuée dans les conditions standards,
régies par les normes de la pharmacopée européenne. Celles-ci prévoient que la libération du
principe actif doit être réalisée dans un grand volume de milieu sous agitation controlée. Ces
normes n’ont pas pu être appliquées dans nos expériences (détection de la proteines libérée
trop faible, risque de dégradation du revêtement…), mais un renouvellement régulier du
milieu a été effectué afin de limiter une diminution potentielle de la libération liée à la
présence de concentrations locales en protéine importantes. Il est par ailleurs possible que le
taux de libération ne soit pas identique in vivo, mais les mécanismes décrits précédemment
sont susceptibles de se produire et nous pouvons penser que la libération de la BMP-2
adsorbée sera de la même manière soutenue dans le temps dans de telles circonstances.
Dans le deuxième cas, la libération du facteur de croissance est contrôlée par les cellules
présentes au niveau du site chirurgical et plusieurs études ont montré une efficacité supérieure
d’un tel mode de libération (Seeherman et al. 2005, Liu et al. 2007b). Nous pouvons penser
que dans le cas de la BMP-2 adsorbée sur nos céramiques, à la fois une libération spontanée et
un contrôle cellulaire seront mis en jeu dans le mode d’action de la protéine. En effet, la
libération spontanée observée est assez faible, spécialement pour les granulés revêtus. Celle-ci
pourrait cependant apporter un avantage pour la reconstruction par la mise en place d’un
gradient de BMP-2 autour de l’implant, favorisant la migration d’ostéoclastes et de cellules
progénitrices vers le site de reconstruction. Une fois les cellules présentes au niveau de
l’implant, les ostéoclastes peuvent participer à la libération de la protéine par destruction de la
céramique. La libération de la BMP-2 adsorbée devrait donc être contrôlée par ces cellules en
particulier pour les échantillons revêtus. Etant donné que l’activité des ostéoclastes est
souvent couplée à celle des ostéoblastes, d’une part, et que la protéine libérée sous le contrôle
cellulaire devrait favoriser la différenciation des cellules progénitrices d’autre part, ce type de
matériau pourrait en conséquence apporter un avantage significatif dans les phénomènes de
reconstruction osseuse.
Le troisième mode d’action pourrait être la reconnaissance directe entre la BMP-2 adsorbée et
les récepteurs cellulaires, présents à la surface des ostéoclastes et des ostéoblastes. Certains
exemples d’enzymes liées à des matériaux montrant une activité cellulaire identique ou accrue
ont été décrits (Zisch et al. 2001, Tsujigiwa et al. 2005). Une telle situation implique
cependant que le site de reconnaissance de la protéine pour son récepteur soit parfaitement
accessible et dans la bonne conformation. Lors de l’adsorption de la BMP-2 sur l’HA, les

93
sites de liaisons sont répartis en plusieurs points de la séquence protéique, et il n’est pas exclu
que les modifications conformationnelles aient lieu. Il semble donc difficile de penser, à
priori, qu’une telle interaction protéine adsorbée-récepteur se produise.

6. Conclusions et perspectives
Dans ce chapitre, nous avons étudié les propriétés d’adsorption de nos céramiques témoins et
revêtues par deux types de procédés vis-à-vis de la rhBMP-2. Nous avons montré que la
présence de tels revêtements apportait un avantage significatif pour l’adsorption protéique.
Cette étude nous a, par ailleurs, permis d’effectuer notre choix final parmi les deux procédés
pré-sélectionnés dans le chapitre précédent, en raison de leur morphologie et leur réactivité
supposée. Les résultats obtenus nous indiquent que le revêtement NanoAp-EtOH semble être
le plus prometteur. Ce revêtement a donc été caractérisé de manière plus poussée vis-à-vis de
ses propriétés d’adsorption et de désorption en vue de son utilisation ultérieure pour des
expériences en culture cellulaire et chez l’animal. La désorption de la BMP-2 à partir des
échantillons revêtus est soutenue dans le temps et pourrait être majoritairement régulée in vivo
par un contrôle cellulaire. Ces résultats, très encourageants, nous laissent espérer que les
échantillons revêtus par le procédé NanoAp-EtOH apporteront un avantage significatif dans
l’ostéoinduction induite par la BMP-2. D’autre part, plusieurs études ont suggéré que
l’ostéoinduction intrinsèque de composés phosphocalciques pouvait être liée à leur capacité
d’adsorption de protéines impliquées dans l’ostéogénèse. Nous pouvons donc envisager le fait
que de tels matériaux très réactifs pourraient aussi avoir une influence positive sur la
reconstruction osseuse sans ajout de facteurs de croissance.
Ces hypothèses ont été évaluées dans le reste de l’étude, comprenant à la fois des études des
matériaux en culture cellulaires et des implantations chez l’animal.
D’un point de vue plus théorique, il serait intéressant d’effectuer de nouvelles mesures
d’adsorption sur les poudres cristallines obtenues dans des conditions identiques aux
revêtements NanoAp et NanoAp-EtOH. Cette étude pourrait nous donner de plus amples
informations sur l’importance de la surface spécifique de ces nanocristaux très réactifs par
rapport aux autres facteurs susceptibles d’influencer l’adsorption protéine, dont la présence
d’une couche hydratée à leur surface. Les facteurs influençant la désorption pourraient aussi
être évalués par une étude chromatographique sur de tels composés (mise en place de ces
nanocristaux dans des colonnes de chromatographie). Cette étude pourrait être menée pour la
BMP-2 ainsi que pour d’autres protéines.

94
Chapitre 4

Etude du comportement cellulaire vis-à-vis


des céramiques de BCP revêtues ou non avec le
procédé NanoAp-EtOH
Dans ce chapitre, nous effectuons une comparaison du comportement général de différents
types cellulaires après leur ensemencement sur nos échantillons témoins et revêtus par le
procédé NanoAp-EtOH. Les expériences effectuées nous ont permis d’évaluer la
biocompatibilité des matériaux et leur capacité à initier la différenciation ostéoblastique de
cellules progénitrices ou d’ostéoblastes d’une part. L’activité biologique de la BMP-2 pré-
adsorbée sur nos céramiques a d’autre part été étudiée. Les facteurs principaux impliqués dans
l’interaction entre les cellules ostéoprogénitrices ou ostéoblastes et les matériaux ayant été
décrits dans le chapitre 1 de ce manuscrit, l’étude bibliographique de cette partie mentionne
uniquement les différents modèles cellulaires qui peuvent être utilisés dans de telles études.

1. Introduction bibliographique
Il est important de connaître les caractéristiques d’un matériau, et notamment sa
biocompatibilité, avant son implantation chez l’animal ou l’homme. L’adhésion et la
prolifération cellulaires sont considérées comme des facteurs de cytocompatibilité précoce et
à moyen terme des matériaux (Liu et al. 2007a). Ces réponses, associées au potentiel de
différenciation des matériaux, peuvent fournir des indications sur les propriétés
ostéoconductrices et ostéoinductrices des matériaux et participent à la compréhension de ces
phénomènes. De ce fait, beaucoup d’études s’intéressent à l’adhésion, la prolifération et la
différenciation de cellules – pré-ostéoblastes ou cellules souches mésenchymateuses – sur des
matériaux de composition ou topographie diverses, comme nous l’avons déjà indiqué. Les
réponses obtenues dans ces études dépendent des caractéristiques des matériaux mais aussi
des modèles cellulaires utilisés.

1.1. Les modèles cellulaires pour l’étude de l’interaction


matériaux/ostéoprogéniteurs ou ostéoblastes

Différents modèles cellulaires d’ostéoblastes peuvent être utilisés dans l’étude de l’interaction
cellules/matériaux. Ces cellules peuvent être plus ou moins différenciées et issues d’espèces
animales différentes. Leur comportement vis-à-vis d’un matériau peut s’avérer cependant
différent et il est donc important de déterminer quel type cellulaire utiliser par rapport à
l’information recherchée.
L’état de différenciation des cellules et les conditions de culture (présence ou absence
d’agents différenciants) constituent les premiers critères. Ces paramètres influent en effet sur
la réponse obtenue et les indications fournies par ces études pourront être reliées soit aux

95
phénomènes d’ostéoinduction (pour des cellules non différenciées cultivées en absence de
milieu ostéogénique) soit aux propriétés ostéoconductrices des matériaux (pour des cellules
déjà engagées vers la voie ostéoblastique).
D’autre part, plusieurs types cellulaires (cultures primaires ou lignées établies) peuvent être
utilisés dans l’étude des interactions cellules/matériaux. Les cellules primaires présentent
l’avantage d’approcher la population ostéoblastique (ou ostéoprogénitrice) avec laquelle le
matériau sera en contact in vivo. En revanche, leurs conditions de culture sont souvent assez
délicates (sensibilité accrue au lot de sérum, nombre de passages limité…) et la variabilité
inter-individu est importante. L’utilisation de lignées établies bien caractérisées ou de cellules
immortalisées permet de palier ces inconvénients mais leur comportement peut s’avérer
parfois différent de celui des cellules primaires (Oreffo et al. 1999).
Quelques exemples de cellules de la lignée ostéoblastique couramment utilisées en co-culture
avec des biomatériaux sont présentés ci-dessous.

• Les cellules souches mésenchymateuses (MSC)


Les cellules souches mésenchymateuses humaines constituent un modèle de choix pour
étudier la différenciation ostéoblastique intrinsèque en réponse à un biomatériau. Il s’agit de
cellules primaires issues de patients et sélectionnées pour être positives à STRO-1, facteur
caractéristique de leur multipotence. Dans la majorité des études en association avec des
biomatériaux, elles sont cultivées en présence de milieu ostéogénique pour faciliter leur
différenciation ostéoblastique. Quelques études ont cependant montré que ces cellules étaient
capables d’exprimer des marqueurs de différenciation ostéoblastique en absence de ce milieu
après croissance sur des matériaux phosphocalciques (Muller et al. 2008). La réponse obtenue
dans ce cas, peut apporter des informations sur le comportement ostéoinducteur des
matériaux.
Les C3H10T1/2 sont des cellules embryonnaires murines. Plus facile d’utilisation que les
MSCs humaines, elles sont aussi pluripotentes et sont capables d’exprimer les marqueurs
caractéristiques de la différenciation ostéoblastique (collagène de type I, ostéocalcine,
ALP…) en réponse à des agents ostéogéniques ou à des matériaux phosphocalciques (Lin et
al. 2008).

• Les pré-ostéoblastes murins ou humains issus d’explants


Des pré-ostéoblastes d’origine animale ou humaine peuvent être obtenus à partir d’explants
osseux. Après culture des explants d’os spongieux, l’échantillon cellulaire isolé est composé
d’un mélange de cellules plus ou moins engagées vers la voie ostéoblastique, ce qui

96
correspond globalement à la population cellulaire rencontrée lors d’une implantation en site
osseux (Oreffo et al. 1999). Les études effectuées à partir de ces cellules, en présence ou
absence de milieu de différenciation, apportent par conséquent des informations sur la
biocompatibilité des matériaux ainsi que sur leurs propriétés ostéoconductives.

• Cellules immortalisées ou issues d’ostéosarcomes.


Des cellules immortalisées ou issues d’ostéosarcomes peuvent par ailleurs être utilisées.
Parmi les lignées établies utilisées, les MC3T3 sont des pré-ostéoblastes murins. Elles sont
très souvent utilisées dans les études d’interaction ostéoblastes/matériaux en raison de leur
facilité d’entretien et leur forte capacité de différenciation en réponse aux matériaux, en
présence ou absence de milieu de différenciation (Chou et al. 2005).
Les MG63 et SaOS-2 issues d’ostéosarcomes humains sont particulièrement utilisées dans
l’étude des interactions ostéoblastes/matériaux. Elles permettent d’évaluer la biocompatibilité
des matériaux et leur potentiel de différenciation ostéoblastique. Toutefois, les réponses
obtenues doivent être prises avec précaution. En effet, quelques études ont montré que leurs
réponses vis-à-vis des matériaux pouvaient être différentes de celles obtenues avec des
cellules souches mésenchymateuses. Vohra et al. ont, par exemple, mis en évidence que ces
cellules interagissaient avec des protéines d’adhésion différentes des MSCs humaines et
qu’elles exprimaient des sous-unités d’intégrines particulières (Vohra et al. 2008).

1.2. Les modèles cellulaires pour l’étude de la différenciation


ostéoblastique induite par la BMP-2

Le choix de la lignée cellulaire, et plus précisément de l’espèce animale dont elle est issue, est
important pour l’étude de la différenciation ostéoblastique en réponse aux BMPs.

En effet, alors que les cellules de rongeurs présentent une grande capacité de réponse à la
rhBMP-2, les cellules humaines sont moins réceptives. Quelques ostéoblastes humains sont
capables d’exprimer des facteurs de différenciation ostéoblastique en réponse à la BMP-2 (Lai
et al. 2005). Ce facteur de croissance est, en revanche, en général incapable d’initier la
différenciation ostéoblastique de cellules souches mésenchymateuses humaines, en absence
de milieu ostéogénique. Osyczka et al. ont montré que sur 26 cultures primaires de MSC
humaines issues de donneurs différents seulement 4 étaient en mesure d’exprimer des
marqueurs de l’ostéogenèse en réponse à la rhBMP-2 (Osyczka et al. 2004). Cette étude
corrobore les travaux issus du laboratoire lors desquels aucune augmentation de l’activité de

97
la phosphatase alcaline en réponse à la rhBMP-2 (300 ng/ml) n’a pu être observée sur des
hMSCs issues de trois donneurs différents. Il a, par ailleurs, été montré que la BMP-2 pourrait
même inhiber la différenciation ostéoblastique des cellules d’ostéosarcomes MG63 (Murphy
et al. 2001). Les cellules humaines ne semblent donc pas être un bon modèle pour l’étude de
la différenciation ostéoblastique induite par la BMP-2.
Ces observations pourraient, en outre, être élargies à des cellules issues d’autres espèces
animales. Des résultats issus du laboratoire ont, en effet, montré une influence sporadique de
la BMP-2 sur la différenciation ostéoblastique de pré-ostéoblastes issus d’explants d’os
spongieux ovins. Une augmentation de l’activité phosphatase alcaline en réponse à la
rhBMP-2 n’a pu être observée que sur une des trois cultures primaires étudiées.

Le modèle le plus utilisé pour étudier les voies de signalisation de la différenciation


ostéoblastique en réponse à la BMP-2 est une lignée de pré-myoblastes murins, les C2C12.
Ces cellules sont en effet capables de trans-différencier vers la voie ostéoblastique en réponse
au facteur de croissance et expriment tous les marqueurs de différenciation classiques
(augmentation de l’activité ALP, expression de collagène de type I, d’ostéocalcine,
d’ostéopontine…)(Abe et al. 2000, Ozeki et al. 2007). Les C2C12 peuvent donc être utilisées
pour évaluer l’activité de la BMP-2 libérée dans le milieu de culture à partir de matériaux
(Schliephake et al. 2007). Dans quelques études, elles sont aussi utilisées comme modèle pour
évaluer la différenciation ostéoblastique en réponse à la BMP-2 après culture sur des
matériaux phosphocalciques (Habibovic et al. 2006b, Okuda et al. 2008).

2. Objectifs
Dans ce chapitre, nous avons cherché à effectuer une comparaison générale de nos matériaux
témoins et revêtus par le procédé NanoAp-EtOH vis-à-vis de la réponse cellulaire. Nous
avons évalué l’adhésion, la prolifération, la morphologie et la différenciation de différents
types cellulaires, capables de se différencier en ostéoblastes, après leur ensemencement sur
nos matériaux. Les données recueillies avaient pour but d’évaluer la biocompatibilité et la
capacité de différenciation des matériaux avant leur implantation chez l’animal.

Le deuxième objectif de cette étude cellulaire in vitro était d’évaluer la capacité de la BMP-2
adsorbée sur nos deux types d’échantillons à induire la différenciation ostéoblastique. Cette

98
étude avait pour but de vérifier que l’adsorption sur les matériaux n’entrainait pas de forte
altération de la protéine, susceptible de limiter son action sur la différenciation.

Dans cette étude, différents types cellulaires ont été utilisés. Les cellules ont été ensemencées
directement au cœur des céramiques poreuses. En raison de leur forte sensibilité à la
rhBMP-2, les C2C12 nous ont servi de modèles pour évaluer l’activité de la BMP-2 adsorbée.
Afin d’évaluer leur comportement lors de leur croissance sur les matériaux, l’adhésion et la
prolifération de ces cellules en absence de BMP-2 ont dans un premier temps été déterminées.
Ces expériences nous ont permis d’obtenir une première évaluation de la biocompatibilité des
matériaux. La mesure de l’activité biologique de la BMP-2 adsorbée sur les échantillons a
ensuite été effectuée par dosage de l’activité spécifique de la phosphatase alcaline, marqueur
classique de la différenciation ostéoblastique.
Une fois les conditions expérimentales mises au point sur ce modèle, nous avons cherché à
confirmer la biocompatibilité de nos échantillons vis-à-vis de cellules souches
mésenchymateuses, modèles cellulaires plus révélateurs des populations ostéoprogénitrices
rencontrées dans un contexte d’implantation en site ectopique. En raison des contraintes liées
à l’utilisation de cellules mésenchymateuses humaines, et notamment la faible quantité à notre
disposition, seules quelques expériences préliminaires ont été effectuées avec ces cellules. A
ce stade de l’étude, l’utilisation de cellules mésenchymateuses embryonnaires murines, les
C3H10T1/2, a été préférée. L’utilisation de ce modèle cellulaire semble approprié : comme
les cellules mésenchymateuses humaines, il s’agit de cellules pluripotentes susceptibles de se
différencier vers l’ostéoblaste lorsqu’elles sont cultivées sur de l’HA (Lin et al. 2008).
L’étude du potentiel de différenciation intrinsèque de nos échantillons a enfin été effectuée
après croissance des cellules sur les matériaux en absence d’agent de différenciation. Cette
étude a été réalisée avec des C3H10T1/2 et des MG63, pour déterminer la capacité des
échantillons à induire ou à stimuler, respectivement pour chaque type cellulaire, la
différenciation ostéoblastique.

3. Matériels et méthodes

3.1. Modèles cellulaires

- Les C2C12 sont cultivées dans du milieu DMEM complémenté avec 10% de SVF
et 1% de pénicilline et streptomycine (P/S).

99
- Les cellules souches mésenchymateuses humaines nous ont été fournies par
l’Etablissement Français du Sang (EFS). Elles sont entretenues dans du milieu
MEM-alpha contenant 10% de SVF et 1% P/S et sont utilisées jusqu’au passage 6.

- Les MG63 sont des ostéoblastes issus d’ostéosarcomes humains (ATCC : CRL-
1427). Ces ostéoblastes, peu différenciés, peuvent être utilisés même à des passages
tardifs. Ils sont cultivées dans du milieu MEM complémenté avec 10% de SVF, 1%
de P/S et 1% d’acides aminés non essentiels.

- Les C3H10T1/2 sont des cellules souches mésenchymateuses embryonnaires


murines capables de se différencier en ostéoblastes (ATCC : CCL-226). Elles sont
cultivées dans du milieu DMEM à 10% de SVF et 1% P/S.

Les cellules sont maintenues dans leur milieu de culture respectif dans un incubateur à 37°C
en atmosphère humide sous 5% de CO2. Le milieu est changé tous les 2 jours et les cellules
sont passées lorsqu’elles atteignent 80% de confluence pour limiter leur différenciation
spontanée.
Les réactifs de culture cellulaire (milieu de culture, trypsine-EDTA, pénicilline et
streptomycine, acides aminés non essentiels et sérum de veau fœtal) ont été fournis par Gibco
Invitrogen.

3.2. Culture cellulaire sur les granulés

Pour nos expériences, les cellules sont ensemencées directement sur les granulés et leur
croissance se fait au sein du matériau.
Les matériaux utilisés sont les granulés cubiques poreux (3x3x3mm3) de BCP non revêtus et
revêtus par le procédé NanoAp-EtOH. Avant leur utilisation, ces granulés ont été stérilisés par
rayonnement gamma.
L’ensemencement des cellules sur les céramiques s’effectue en plusieurs étapes :

• Equilibrage des granulés dans le milieu de culture


Les granulés sont pré-incubés pendant 30 minutes à température ambiante dans du milieu
complet. Le milieu est ensuite retiré et les granulés sont disposés dans des puits de culture
(plaques 24 puits, 1 granulé par puits) et placés dans un incubateur à 37°C pendant 45 minutes
pour y être pré-séchés.

100
• Préparation de la suspension cellulaire
Les cellules sont décollées par une solution de trypsine-EDTA, comptées et centrifugées à
1500 RPM pendant 10 minutes. Le culot cellulaire est repris dans du milieu complet. La
concentration de la suspension cellulaire, déterminée en fonction des conditions de l’étude, est
comprise entre 10000 et 60000 cellules / 5 µl.

• Ensemencement des cellules


A l’issue des 45 minutes de pré-séchage, 5 µl de suspension cellulaire sont déposés sur les
granulés poreux. La suspension pénètre à l’intérieur du granulé. Le volume de 5 µl est le
volume maximal que ces granulés peuvent contenir sans que la suspension ne traverse les
pores et ne se dépose au fond des puits.

• Pré-adhésion des cellules et ajout du milieu


Les granulés sont incubés à 37°C pendant 45 min, pour permettre une pré-adhésion des
cellules. Enfin, on ajoute doucement 600 µl de milieu complet dans les puits et les granulés
sont à nouveau placés dans l’incubateur pour permettre l’adhésion totale des cellules.

Le milieu est remplacé le lendemain par le milieu adéquat pour l’étude.

3.3. Etudes de l’adhésion et de la prolifération

3.3.1. Conditions de cultures

Les cellules sont cultivées dans des puits de culture (plaque 24 puits) ou sur les granulés (1
granulé par puits) avec 600 µl de milieu complet (10% SVF, 1% P/S) pendant 4h à 14 jours.
Le milieu est renouvelé tous les 2 jours.
Les C2C12 sont ensemencés à 10000, 20000, 40000 ou 60000 cellules/granulé pour
l’adhésion et 20000 cellules/granulé pour la cinétique de prolifération. L’ensemencement des
cellules à différentes concentrations (entre 5000 et 180000 cellules) dans les puits de culture
d’une plaque 24 puits est réalisé en même temps afin d’obtenir une gamme étalon.
Les C3H10T1/2 ont été ensemencées à 20000 ou 40000 cellules/granulés pour les expériences
d’adhésion et prolifération.

101
3.3.2. Test au MTT

L’adhésion et la prolifération des cellules ont été suivies par coloration au MTT. Le MTT
(bromure de 3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5(-diphényltétrazolium)) (Sigma-aldrich) est un
sel de tétrazolium (jaune, soluble) qui se transforme en cristaux de formazan (bleu-violet,
insoluble) après réduction par une enzyme cellulaire (la succinate déshydrogénase
mitochondriale). Les cristaux de formazan formés peuvent être dissouts dans du
Diméthylsulfoxide (DMSO) et l’intensité de la coloration est proportionnelle au nombre de
cellules viables.
Dans ces expériences, la réaction se fait directement sur les granulés. Les cellules présentes
sur les granulés (ou dans les puits de culture) sont lavées avec du PBS à deux reprises. On
ajoute ensuite dans les puits 600 µl de DMEM sans rouge de phénol contenant le réactif MTT
à une concentration finale de 0,5 mg/ml. Après une incubation de 2 heures à 37°C, le milieu
est enlevé. Les granulés sont déplacés dans des tubes eppendorfs (1 granulé par tube) afin de
ne prendre en compte que les cellules présentes sur le granulé et non pas celles qui ont migré
et proliféré sur le puits de culture. Les cristaux de formazan sont ensuite dissouts dans 300 µl
de DMSO après broyage des granulés par sonde à ultra-sons. Les solutions sont centrifugées 1
minute à 7500 RPM et 200 µl de surnageant sont déposés dans une plaque 96 puits. Une
dilution dans du DMSO peut être réalisée si nécessaire. L’absorbance est mesurée en
microplaque par spectrométrie (Varioskan flash, Thermo Electron Corporation). La différence
des densités optiques (DO) mesurées à 570 mn et 650 nm est proportionnelle à la quantité de
cellules viables. La conversion DO-nombre de cellules peut être réalisée par l’intermédiaire
d’une gamme étalon de cellules.

3.4. Morphologie des cellules

3.4.1. Conditions de culture

Les cellules souches mésenchymateuses humaines sont ensemencées sur les granulés à une
concentration de 3000 cellules /granulé. Après 3 jours de culture dans du milieu MEM-alpha
complet, les granulés sont lavés à deux reprises dans du PBS et conservés dans une solution
de glutaraldéhyde à 0,2% et de Cacodylate de sodium à 0,1M à 4°C pour fixer les cellules.

102
3.4.2. Microscopie Electronique à Balayage (MEB)

La préparation et la visualisation par MEB des échantillons ont été effectuées par le Centre de
Microscopie Electronique Appliqué à la Biologie (CMEAB) (Faculté de médecine de
Rangueil, Toulouse). Après dessication par point critique au CO2, les granulés sont métallisés
avec une couche conductrice d’or-palladium. La visualisation est réalisée avec un microscope
électronique à balayage Hitashi S450.

3.5. Etude de la différenciation ostéoblastique

3.5.1. Conditions de culture

• Différenciation induite par l’interaction cellules-matériaux


Les MG63 ou C3H10T1/2 sont ensemencées sur les granulés à une concentration de 40000
cellules par granulé et incubées dans leur milieu de culture respectif de 24h (J0) à 21 jours.

• Différenciation en réponse à la BMP-2 adsorbée sur les granulés


Les granulés sont immergés dans une solution de rhBMP-2 à 150 µg/ml (tampon NaCl 1M,
CaCl2 10 mM et TRIS 25 mM, pH 7,4 ; rapport S/L = 0,5 mg/µl) pendant 24h à 37°C. Les
granulés sont ensuite lavés dans de l’eau désionisée à deux reprises et séchés à 37°C pendant
24h. A cette concentration, les granulés témoins et revêtus absorbent une quantité proche de
BMP-2 correspondant à environ 7 µg/granulé.
Les C2C12 sont ensuite ensemencées sur les granulés comme indiqué dans le paragraphe 3.2
à une concentration de 40000 cellules/granulé pour la cinétique de différenciation. Pour
l’étude de l’influence de la confluence cellulaire, les cellules sont ensemencées à 10000,
20000 ou 40000 cellules/granulé. Après 24h d’incubation (correspondant au point J0), le
milieu est remplacé par du milieu DMEM avec 1% SVF et 1% P/S. Le milieu est renouvelé
tous les 2 ou 3 jours. Les cellules sont cultivées dans ces conditions pendant 24h à 21 jours.
Pour chaque temps et chaque échantillon, les mesures sont effectuées sur 3 granulés
indépendants.

3.5.2. Récupération des cellules incubées sur les granulés

Les mesures de l’activité de la phosphatase alcaline et le dosage de l’ADN sont effectués sur
les cellules préalablement décrochées de la surface des matériaux. La méthode de
récupération des cellules est décrite ci-dessous.

103
Après incubation dans les conditions souhaitées dans des plaques 24 puits, les granulés
contenant les cellules sont lavés dans du PBS et déplacés dans des tubes eppendorfs (1
granulé par tube). 300µl de trypsine-EDTA sont ajoutés dans les tubes et ceux-ci sont incubés
10 minutes à 37°C. L’action de la trypsine-EDTA (permettant de décoller les cellules de la
surface des matériaux) est ensuite neutralisée par l’ajout de 700 µl de milieu de culture
complet. A l’aide d’une micropipette, les cellules sont récupérées en injectant le milieu à
l’intérieur du granulé : 10 cycles d’aller-retour du milieu dans le granulé sont effectués. Ce
milieu est ensuite récupéré pour être collecté dans un autre tube (Tube B). A nouveau, 500µl
de milieu complet sont ajoutés sur le granulé et l’opération est répétée afin de récupérer le
plus grand nombre de cellules. Ces 500µl de milieu sont prélevés et ajoutés au tube de
récupération (Tube B). La suspension cellulaire est ensuite centrifugée 45 secondes à 7500
RPM, le culot est lavé dans 500 µl de PBS, centrifugé à nouveau puis repris dans 200 µl de
solution de Triton X100 à 0,1%. Les solutions sont ensuite soniquées pendant 20 secondes
avant les dosages.
L’activité spécifique de l’ALP, c'est-à-dire l’activité ALP exprimée par unité cellulaire,
définie dans notre cas par la quantité d’ADN, est un marqueur de la différenciation vers
l’ostéoblaste.

3.5.3. Dosage de l’activité ALP

L’activité enzymatique de la phosphatase alcaline est déterminée par transformation du


paranitrophenol-phosphate incolore en para-nitrophénol de couleur jaune. La transformation
enzymatique de ce composé est quantifiée par mesure de la DO par spectrophotométrie.
Pour le dosage, on mélange, dans une plaque 96 puits, 10 µl de d’échantillons avec 90 µl de
substrat (paranitrophénol-phosphate à 1,3 mg/ml dans une solution de 2-amino-2-methyl-1-
propanol hydrochloride à 1,5 M pH 10,3). La plaque est incubée à 37°C pendant un temps
donné (entre 5 et 45 minutes) et la réaction est stoppée par ajout de NaOH 1N. La mesure est
ensuite effectuée par spectrophotométrie à 410 nm (varioskan flash, Thermo Electron
Corporation). Une gamme étalon de paranitrophénol permet de déterminer la quantité de
produit formé.

104
3.5.4. Dosage de l’ADN

La quantité d’ADN qui est proportionnelle au nombre de cellules dans les échantillons est
dosée avec le kit PicoGreen (Molecular Probes) selon les conditions standard d’utilisation. On
dépose 10 µl d’échantillon dans un puits d’une plaque 96 puits, on ajoute 90 µl de tampon
puis 100 µl de réactif (dilué dans du tampon). La fluorescence émise par le réactif qui se lie à
l’ADN double brin est mesurée par spectrofluorimétrie (λexcitation = 485 nm et λémission = 535
nm). Une gamme étalon d’ADN permet de déterminer la quantité présente dans les
échantillons.

4. Résultats

4.1. Etude des réponses cellulaires vis-vis des matériaux

Dans un premier temps, nous avons voulu évaluer le comportement de différents types
cellulaires capables de se différencier en ostéoblastes vis-à-vis de nos deux matériaux
(témoins et revêtus par le procédé NanoAp-EtOH).

4.1.1. Adhésion et prolifération

L’adhésion et la prolifération sont les premières réponses cellulaires que nous avons étudiées.
Deux types cellulaires ont été utilisés : une lignée de pré-myoblastes murins qui servent de
modèle à la différenciation ostéoblastique en réponse à la BMP-2 et des cellules souches
mésenchymateuses embryonnaires murines, les C3H10T1/2.

4.1.1.1. C2C12
L’adhésion et la prolifération des C2C12 sur les granulés témoins et revêtus NanoAp-EtOH
sont représentés sur la Figure IV.1.
L’adhésion des C2C12, 4 heures après leur ensemencement sur les granulés, apparaît
significativement plus faible (p<0,05) en présence du revêtement pour chacune des
concentrations cellulaires étudiées (Figure IV.1a). Cela dit, sur les deux matériaux, le
pourcentage d’adhésion par rapport aux puits contrôles (TCPS) est supérieur à 50%, indiquant
une bonne biocompatibilité des matériaux.

105
Figure IV.1 : Adhésion et prolifération des C2C12 sur les granulés témoins et revêtus.
Adhésion après 4h d’incubation (a) : Les cellules ont été ensemencées à 10000, 20000,
40000 ou 60000 cellules/granulé. Les résultats sont exprimés en moyenne ± écart SEM sur 5
échantillons. Cinétique de prolifération des C2C12 (b) : Les cellules ont été ensemencées à
20000 cellules par granulé et maintenues dans du DMEM complet. Le nombre de cellules a
été déterminé par test MTT. Les résultats correspondent à la moyenne ± écart-type de 4
expériences indépendantes (n=2 pour chaque expérience).

Les courbes de prolifération des C2C12 ont été réalisées par test au MTT avec une
concentration initiale de 20000 cellules/granulé. Des concentrations plutôt faibles sont
souvent utilisées pour observer la prolifération cellulaire sur plusieurs jours (entre 3000 et
10000 cellules/cm2) (Webster et al. 2000a). La sensibilité de la méthode apparaît cependant
assez faible dans les conditions de notre étude. La concentration choisie ici permet de
visualiser la prolifération cellulaire sur plusieurs jours, tout en conservant une sensibilité
suffisante pour effectuer une bonne comparaison entre les matériaux.

Les courbes de prolifération obtenues montrent que pour chaque temps (de J0 à J7), le nombre
de cellules est significativement plus faible en présence du revêtement. Les profils de
prolifération apparaissent toutefois comparables entre les deux sortes de granulés. Des temps
de doublements approximatifs calculés entre J1 et J3 sont du même ordre de grandeur pour les
granulés témoins et revêtus (25 ± 3 h et 27 ± 5 h respectivement).
Ceci semble indiquer que la prolifération des C2C12 serait peu différente en présence ou non
du revêtement et que les différences observées concernant le nombre de cellules sur les
granulés seraient majoritairement liées à l’adhésion plus faible sur les échantillons revêtus.

106
4.1.1.2. C3H10T1/2
Pour ce deuxième type cellulaire, les profils d’adhésion et de prolifération apparaissent
différents de ceux observés pour les C2C12 (Figure IV.2).

Figure IV.2 : Adhésion et prolifération des C3H10T1/2 sur les granulés témoins et revêtus.
Les cellules ont été ensemencées à 20000 cellules/granulé (a) ou 40000 cellules/granulé (b)
et maintenues dans du DMEM complet. Les valeurs de DO obtenues par test MTT sont
proportionnelles au nombre de cellules viables. Les résultats sont représentés en moyenne ±
écart-type (n=2 pour chaque point).

Dans ce cas, deux concentrations cellulaires ont été étudiées. La concentration de 20000
cellules/granulé permet d’étudier le profil de prolifération comme nous l’avons indiqué
précédemment pour les C2C12, alors que la concentration initiale de 40000 cellules/granulé
nous a aidés à déterminer le nombre de cellules en fonction du temps dans les conditions
choisies pour l’étude de la différenciation ostéoblastique. Dans ces études, en effet, il est
préférable de travailler avec une confluence cellulaire plus importante pour favoriser la
différenciation ostéoblastique. La concentration choisie est en concordance avec celles
utilisées dans d’autres études impliquant des matériaux phosphocalciques (Muller et al. 2008,
dos Santos et al. 2009).

Pour les C3H10T1/2, nous n’observons pas de différences d’adhésion entre les échantillons
témoins et revêtus après 24h d’incubation. D’autre part, la prolifération des cellules présente
un profil similaire pour les deux types d’échantillons : pendant les premiers jours, la
prolifération est assez lente puis nous constatons une accélération de celle-ci (Figure IV.2a).

107
Nous pouvons remarquer, cependant, que le nombre de cellules est plus faible en présence du
revêtement après 72h de croissance sur les granulés. Ceci semble indiquer que la présence du
revêtement est responsable d’un ralentissement de la prolifération des C3H10T1/2 au cours
des premiers jours d’incubation. La prolifération s’accélère ensuite et le nombre de cellules
atteint progressivement celui des granulés témoins. Ces remarques sont valables pour les deux
concentrations d’ensemencement initial (Figure IV.2a et b). Par contre, à J7, le nombre de
cellule est équivalent sur les deux sortes de granulés pour un ensemencement initial de 40000
cellules/granulé, alors qu’il apparaît encore plus faible pour la concentration initiale de 20000
cellules/granulé.

4.1.2. Morphologie des cellules ensemencées sur les granulés

Nous avons observé la morphologie de cellules souches mésenchymateuses humaines après 3


jours de croissance sur les granulés témoins et revêtus (Figure IV.3).

Figure IV.3 : Micrographies MEB de cellules souches mésenchymateuses humaines après


3 jours de prolifération sur les granulés témoins et revêtus.

108
En raison de la morphologie très poreuse des granulés et du mode d’ensemencement, la
répartition des cellules n’apparaît pas homogène sur la surface des matériaux. Nous pouvons
observer des zones pour lesquelles les cellules sont agglomérées et enchevêtrées, alors que
d’autres pores ne sont recouverts que de quelques cellules isolées.

Ces cellules ne semblent avoir aucune difficulté à adhérer sur les échantillons en présence ou
non du revêtement. Nous ne constatons pas de différence notable de morphologie des MSCs
entre les deux types d’échantillons : les cellules sont étalées et de nombreux filopodes
assurent l’ancrage des cellules sur les céramiques. Nous pouvons constater deux types de
morphologie (pour les deux types de matériaux) : des cellules allongées qui semblent
accrochées à la surface au niveau de leurs extrémités essentiellement par l’intermédiaire de
ces longs filopodes, d’une part ; et des cellules plus étalées en contact étroit avec la céramique
avec semble-t-il la présence de lamellipodes, d’autre part.

Ces observations sont compatibles avec une bonne adhésion et une bonne interaction cellule-
matériau. La présence du revêtement ne semble donc pas modifier de manière significative le
comportement des MSCs après 3 jours d’incubation.

4.1.3. Différenciation des cellules en contact avec les matériaux

Plusieurs études ont montré que des matériaux pouvaient induire directement une
différenciation cellulaire sans ajout d’autre facteur. Dans cette étude, nous avons évalué
l’activité phosphatase alcaline de deux types cellulaires (C3H10T1/2 et MG63) après
croissance sur nos matériaux (Figure IV.4).
Pour les deux types cellulaires, nous n’observons pas d’augmentation significative de
l’activité de l’ALP, qui pourrait laisser suggérer une différenciation ostéoblastique induite par
l’interaction cellules-matériau.

109
Figure IV.4 : Activité spécifique de la phosphatase alcaline des C3H10T1/2 (a) et MG63 (b)
après croissance sur les granulés témoins et revêtus. Les cellules ont été ensemencées à
40000 cellules/granulés et incubées pendant 7 à 14 jours dans du milieu complet. Les
résultats correspondent à la moyenne de 3 granulés ± écart-type.

4.2. Différenciation en réponse à la BMP-2 adsorbée

Le processus d’adsorption de la BMP-2 sur les granulés phosphocalciques est susceptible


d’engendrer des modifications de la structure protéique et donc une perte d’activité de celle-
ci. La capacité de différenciation de la BMP-2 adsorbée sur les différents types de céramiques
a donc été évaluée.

Figure IV.5 : Activité spécifique de l’ALP en fonction du temps d’incubation des C2C12
sur les granulés, témoins et revêtus, contenant la rhBMP-2 adsorbée. Les cellules ont été
ensemencées à 40000 cellules par granulé et maintenues dans du milieu DMEM avec 1% de
SVF et 1%P/S. Les résultats correspondent à la moyenne ± écart-type de 3 échantillons pour
chaque point).

110
Sur la figure IV.5, nous pouvons remarquer une très forte augmentation de l’activité
spécifique de la phosphatase alcaline des C2C12 après leur incubation sur les granulés
contenant la BMP-2 adsorbée. Le profil en cloche, observé pour les deux types de granulés,
est caractéristique de la différenciation ostéoblastique : l’activité spécifique de l’ALP
augmente après initiation de la différenciation, puis diminue, traduisant le passage des cellules
à un état de différenciation plus avancé. Les taux d’activité de l’ALP mesurés sont du même
ordre de grandeur pour les échantillons témoins et revêtus ; le profil de différenciation
apparaît cependant décalé dans le temps pour les échantillons NanoAp-EtOH avec un
maximum d’activité après environ 14 jours d’incubation contre 7 jours pour les céramiques
non revêtues.
Ces résultats indiquent que la BMP-2 adsorbée sur les granulés témoins et revêtus conserve
une forte capacité de différenciation.
Nous avons mis en évidence dans le paragraphe précédent que, lors des premiers jours
d’incubation, la quantité de cellules présentes à la surface des granulés était plus faible en
présence du revêtement. Nous avons donc cherché à évaluer l’influence de l’état de
confluence des cellules à l’intérieur des matériaux sur la trans-différenciation des C2C12
induite par la BMP-2 adsorbée.

Figure IV.6 : Résultats du test MTT (correspondant à la quantité de cellules sur les
échantillons) (a) et mesure de l’activité spécifique ALP (b) des C2C12 cultivées sur les
granulés contenant la rhBMP-2 pré-adsorbée en fonction de la confluence cellulaire. Les
cellules ont été ensemencées à 10000, 20000 ou 40000 cellules/granulé et entretenues dans
du milieu DMEM 1% SVF, 1%P/S pendant 7 jours. Les résultats correspondent à la moyenne
± écart-type de 3 échantillons pour chaque point.

111
Tout d’abord, la présence de BMP-2 adsorbée sur les granulés ne modifie pas les différences
observées entre les deux types d’échantillons concernant l’adhésion et la prolifération
cellulaires : la quantité de cellules est plus faible sur les granulés revêtus après 24h
d’incubation, ce qui se traduit par une confluence plus faible sur ces échantillons lors des
premiers jours de croissance. Nous pouvons observer sur la figure IV.6a que pour les
ensemencements initiaux les plus faibles (10000 et 20000 cellules par granulé), le nombre de
cellules à J7 est inférieur sur les granulés revêtus. Pour un ensemencement de 40000
cellules/granulé, le nombre de cellules apparaît équivalent à J7 mais il semble probable qu’il
ait été plus faible lors des premiers jours d’incubation sur ces granulés. La figure IV.6b
montre, par ailleurs, que l’augmentation de l’activité ALP des C2C12 en réponse à la BMP-2
adsorbée est corrélée à l’état de confluence des cellules. En effet, l’activité ALP augmente
lorsque la quantité initiale de cellules ensemencées augmente. La réponse apparaît d’autre part
toujours plus faible sur les granulés revêtus.

5. Discussion

5.1. Biocompatibilité générale des céramiques étudiées

Dans la première partie de cette étude, nous avons cherché à déterminer si les granulés revêtus
présentaient une biocompatibilité suffisante pour leur utilisation ultérieure in vivo. Cette
évaluation a été réalisée par comparaison des réponses cellulaires obtenues sur les matériaux
revêtus avec celle des céramiques de BCP, témoins, déjà commercialisées. Dans la littérature,
la biocompatibilité d’un matériau est souvent évaluée par l’étude de l’adhésion, la
prolifération et la morphologie des cellules au contact de l’échantillon. Rosa et al., par
exemple, indiquent que des céramiques phosphocalciques peuvent être décrites comme
biocompatibles à partir du moment où celles-ci permettent l’adhésion, la prolifération et la
différenciation ostéoblastique de cellules (Rosa et al. 2003).

Dans notre étude, les pourcentages d’adhésion cellulaire sont peu différents entre les
matériaux témoins et revêtus et sont d’au minimum 41 % pour les C3H10T1/2 et 55 % pour
les C2C12, ce qui correspond aux valeurs classiquement obtenues sur des céramiques
phosphocalciques (compris en général entre 30 et 60 % au cours des premières heures
d’incubation) (Sous et al. 1998, Rosa et al. 2003, Pellenc et al. 2006). Les différents types
cellulaires sont par ailleurs capables de proliférer à l’intérieur des pores des céramiques
témoins et revêtues, jusqu’à la colonisation quasi-complète du matériau. La différenciation

112
ostéoblastique en réponse à la rhBMP-2 ou au milieu ostéogénique respectivement pour les
C2C12 et cellules souches mésenchymateuses humaines a aussi été observée après leur
croissance sur les deux matériaux (résultats qualitatifs non montrés).
D’autre part, nous n’avons pas constaté de différences de morphologie des hMSCs après 3
jours de croissance sur les matériaux témoins et revêtus : les cellules apparaissent bien étalées
et bien accrochées à la surface des matériaux, ce qui confirmerait une bonne biocompatibilité
des céramiques étudiées.
Des expériences préliminaires visant à évaluer directement le pourcentage de mortalité
cellulaire au cours des premiers jours d’incubation sur nos matériaux ont par ailleurs été
effectuées (Figure IV.7).

Figure IV.7 : Pourcentage de viabilité des C2C12 (a) et C3H10T1/2 (b) ensemencées sur les
granulés témoins et revêtus. Les cellules ont été ensemencées à 20000 cellules par granulé et
maintenues dans du DMEM complet. Les expériences ont été effectuées par test d’exclusion
au bleu trypan sur les cellules préalablement décrochées des matériaux. Les résultats sont
représentés sous forme de moyenne ± écart-type sur trois expériences indépendantes (avec n
= 3 pour chaque expérience) pour les C2C12 (a) et sur une expérience avec n = 3
échantillons pour les C3H10T1/2 (b).

Dans ces expériences, nous n’avons pas constaté de différence significative de la viabilité
cellulaire entre les deux types d’échantillons. Celle-ci est supérieure à 50% après 24h
d’incubation et augmente significativement au cours du temps pour atteindre un taux
d’environ 90% à partir de J3 pour les deux types de matériaux. Il faut toutefois noter que ces
résultats ne concernent que les cellules entières décrochées du matériau (ce qui ne représente
pas la totalité des cellules ensemencées) et la présence de débris issus des matériaux rend le
dénombrement cellulaire délicat. Dans les conditions de l’étude, la sensibilité de cette

113
méthode est par conséquent assez faible et ne permet pas d’effectuer une comparaison fine de
la cytotoxicité des matériaux témoins et revêtus.
En conclusion, tous ces résultats indiquent que les deux types de matériaux présentent une
bonne biocompatibilité, suffisante pour leur utilisation in vivo.

5.2. Adhésion et prolifération cellulaires

Des modifications de l’adhésion et la prolifération des cellules ont cependant été observées
sur les échantillons en présence du revêtement. Liu et al. expriment un principe selon lequel la
compatibilité cellule-matériau peut être évaluée par le temps nécessaire à l’adhésion,
l’étalement et la prolifération des cellules sur l’échantillon : plus le temps requis est long,
moins le matériau est compatible (Liu et al. 2007a). En ce basant sur ce principe, il semblerait
donc que les matériaux revêtus présentent une compatibilité plus faible que les céramiques de
BCP.
Comme nous l’avons mentionné dans la partie introductive, beaucoup de paramètres peuvent
être reliés à l’adhésion et la prolifération des cellules sur des biomatériaux : la composition
chimique, l’énergie de surface, la rugosité, les micro- et nano-topographie, la taille des
cristallites, le pourcentage de porosité, notamment, sont susceptibles d’induire des
modifications de la réponse cellulaire à l’égard d’un biomatériau. Dans notre étude, tous ces
paramètres sont modifiés en présence du revêtement et plusieurs hypothèses peuvent être
formulées pour expliquer les différences observées.

La présence de micro-environnements particuliers à l’intérieur des pores des céramiques


pourrait fournir une première explication. En effet, dans notre étude, les cellules sont
ensemencées directement à l’intérieur des pores des matériaux et sont cultivées dans des
conditions statiques. Le renouvellement du milieu est par conséquent assez limité et les
conditions locales de culture (à l’intérieur des pores) peuvent s’avérer très différentes en
présence ou absence du revêtement. Quelques auteurs ont suggéré que les concentrations
ioniques en calcium et phosphate pouvaient être modifiées à l’intérieur des pores de
céramiques phosphocalciques (Duan et al. 2004, Habibovic et al. 2005). Or, les ions calcium
et phosphate sont connus pour avoir une action sur la prolifération, la différenciation
ostéoblastique et la mortalité cellulaires. Dans une gamme donnée, l’addition de calcium dans
le milieu s’accompagne d’une augmentation de la prolifération et de la différenciation
ostéoblastique (Yamaguchi et al. 1998, Chang et al. 2000). Par contre, une diminution de la

114
concentration en calcium dans le milieu tout comme un excès d’ions calcium et phosphate
peuvent limiter la prolifération cellulaire et même s’avérer toxique pour les cellules aussi bien
in vitro qu’in vivo (Midy et al. 2001, Le Nihouannen et al 2007, Yuan et al. 2001a.). De par
leur nature, il est possible que les nanocristaux de notre revêtement puissent se dissoudre plus
facilement dans le milieu de culture ou induire des échanges ioniques importants, modifiant
ainsi de manière significative la composition ionique locale du milieu de culture et ayant un
effet délétère sur l’adhésion et la prolifération cellulaires.
De même, les pH locaux pourraient être différents entre les deux types de matériaux. Nous
avons, en effet, constaté que les nanocristaux présentaient à leur surface un pH plutôt acide
après immersion dans le milieu de culture. Une pré-incubation des échantillons dans du milieu
avant l’ensemencement des cellules a été effectuée afin d’équilibrer la surface des
échantillons. Toutefois, et bien que nous n’ayons pas distingué de différence globale de pH
dans le milieu de culture, il est possible que lors des premiers temps d’incubation, celui-ci soit
différent à l’intérieur des pores des céramiques témoins ou revêtues.
D’autre part, un des principaux enjeux de l’ingénierie tissulaire concerne l’apport en
nutriments et oxygène nécessaires à la survie, prolifération et différenciation ostéoblastique
des cellules progénitrices cultivées au sein d’un matériau. Dans notre cas, la forte réactivité de
surface des céramiques revêtues peut s’accompagner d’une adsorption importante des
protéines sériques, nécessaires à la survie et à la prolifération cellulaires et donc contribuer à
un appauvrissement du milieu de culture, notamment lors de la phase d’ensemencement au
cours de laquelle le volume de milieu ajouté est faible.
De telles modifications du milieu de culture pourraient donc être responsables d’une
cytotoxicité apparente des matériaux.

Une autre hypothèse concerne l’adsorption de protéines impliquées dans l’adhésion cellulaire
à la surface des céramiques. Dans leurs études, la majorité des auteurs attribuent, en effet, les
différences d’adhésions, de prolifération et même de différenciation observées entre plusieurs
types d’échantillons à des modifications de l’adsorption de certaines protéines du sérum dont
la fibronectine ou la vibronectine. Les différents facteurs cités précédemment (topographie,
énergie de surface, composition…) sont, en effet, susceptibles d’influencer l’adsorption de
protéines par les matériaux. Dans notre étude, nous avons mis en évidence que la présence du
revêtement augmentait de manière significative l’adsorption de BSA ou de BMP-2 ; nous
n’avons cependant pas étudié l’adsorption de protéines contenues dans le milieu de culture sur
les échantillons revêtus. Il est probable qu’évaluée de manière globale, l’adsorption des

115
protéines du sérum soit favorisée en présence du revêtement ; une adsorption sélective
différente entre les deux types de matériaux ne peut cependant pas être exclue. Quelques
études ont montré que la composition chimique ainsi que la taille des cristallites pouvaient en
effet conduire une adsorption préférentielle de certaines protéines du sérum au détriment
d’autres, et modifier ainsi la réponse cellulaire obtenue (Webster et al. 2000b, Zhu et al.
2007). D’autre part, il peut être suggéré que, bien que présentes en plus grandes quantités, les
protéines d’adhésion s’associent plus difficilement aux intégrines sur les granulés revêtus en
raison de leur pénétration dans les pores de dimension nanométrique ou de modifications
conformationnelles, consécutives à leur adsorption, limitant leur interaction avec les
récepteurs (Garcia et al. 1999).
D’autres auteurs ont montré toutefois que l’adsorption de protéines telles que la fibronectine à
la surface des échantillons ne semblait pas être l’élément discriminant des différences
d’adhésion observées entre différents échantillons. Dos Santos et al. n’ont pas trouvé de
corrélation directe entre l’adsorption de fibronectine sur des échantillons d’HA ou β-TCP,
revêtus ou non d’un film d’or, et l’adhésion ou l’étalement de cellules d’ostéosarcomes
humains (dos Santos et al. 2008). De même, dans leur étude sur des échantillons de titane
présentant différentes échelles de nanoporosités, Lim et al. suggèrent que l’adsorption de
protéines influencerait peu l’adhésion cellulaire pour des surfaces de même composition
chimique et qu’un effet direct de la topographie de surface sur les cellules jouerait un rôle
plus important (Lim et al. 2007). Une influence de la topographie de surface sur les réponses
cellulaires (adhésion, prolifération et différenciation) est maintenant clairement admise et ce
paramètre, différent pour nos échantillons témoins et revêtus, pourrait par conséquent
intervenir dans les différences d’adhésion et de prolifération cellulaires observées.

5.3. La différenciation intrinsèque

Plusieurs études ont montré que des matériaux étaient capables d’induire la différenciation
ostéoblastique de cellules progénitrices et la maturation d’ostéoblastes sans ajout d’agents
différenciants. La croissance d’ostéoblastes ou de cellules souches mésenchymateuses sur des
matériaux phosphocalciques s’accompagne souvent d’une différenciation accrue, caractérisée
par une augmentation de l’expression des marqueurs de différenciation (Collagène de type I,
ostéocalcine, ostéopontine) et de l’activité ALP (Chou et al. 2005, Lin et al. 2008, Muller et
al. 2008). Dans cette étude, nous avons cherché à évaluer le potentiel de différenciation
ostéoblastique intrinsèque de nos échantillons. Nous n’avons pas pu mettre en évidence

116
d’augmentation significative de l’activité ALP après croissance de cellules souches
mésenchymateuses (C3H10T1/2) ou ostéoblastes (MG63) sur nos deux types de granulés.
La mesure de l’activité ALP est une méthode simple et très couramment utilisée pour évaluer
la différenciation ostéoblastique de cellules en réponse à des matériaux ou agents de
différenciation. Cependant, la détection de cette activité enzymatique n’apparaît pas assez
sensible dans nos conditions expérimentales pour évaluer de manière précise la différenciation
ostéoblastique en réponse à nos matériaux. Pour palier ce manque de sensibilité, une étude de
l’expression d’autres marqueurs de différenciation ostéoblastique a été entreprise. Une
première expérience a été effectuée par qRT-PCR (Quantitative Reverse Transcription-
Polymerase Chain Reaction). Cette technique permet d’évaluer de manière semi-quantitative
la quantité d’un ARN messager donné - codant pour une protéine donnée - qui a été
synthétisée par les cellules. Cette technique, de sensibilité supérieure à celle de la mesure de
l’activité ALP, permet d’étudier l’expression de différents marqueurs ostéoblastiques, et donc
d’évaluer l’état de différenciation des cellules. Les résultats préliminaires, issus de ces
expériences, indiquent une augmentation de l’expression génique des trois marqueurs étudiés
(ALP, collagène de type I et ostéocalcine) après 3 ou 7 jours d’incubation des C3H10T1/2 sur
nos matériaux témoins et revêtus, par rapport aux puits contrôle. Quelques différences
d’expression peuvent aussi être détectées en fonction du type de matériau sur lequel les
cellules ont été cultivées : nous avons observé une augmentation de la quantité d’ARNm
codant pour le collagène de type I et l’ALP sur les granulés revêtus après 3 jours d’incubation
et une augmentation de l’expression de l’ostéocalcine sur les granulés témoins à 7 jours. Ces
résultats, certes préliminaires, sont encourageants et suggèrent une initiation de la
différenciation ostéoblastique en réponse aux deux types de matériaux et indiquent des profils
différents en présence ou absence du revêtement.

5.4. Différenciation en réponse à la rhBMP-2 adsorbée

Peu d’études s’intéressent à la réponse cellulaire in vitro induite par l’association de BMP-2
sur des matériaux. Ces études concernent en général la réponse des cellules à la BMP-2
libérée dans le milieu de culture (Schliephake et al. 2007, Ziegler et al. 2008). Nous avons
aussi, dans notre étude, évalué la réponse des C2C12 - cultivées dans des puits de culture
TCPS - à la BMP-2 libérée des échantillons (résultats non montrés). Dans ces expériences, la
BMP-2 libérée à partir des échantillons induit une augmentation de l’activité ALP, mais cette
augmentation reste faible et nous n’avons pas constaté de différence entre les deux types

117
d’échantillons. Ceci peut facilement s’expliquer par la cinétique de libération de la BMP-2 qui
n’est pas linéaire. A partir de J4, pour les échantillons revêtus comme pour les témoins, la
concentration en BMP-2 dans le milieu est inférieure aux concentrations couramment utilisées
pour induire la différenciation des C2C12 (300 ng/ml). Ceci ne permet donc pas d’avoir une
différenciation soutenue dans le temps et peut expliquer le peu de différences observées entre
les deux échantillons. La différenciation de cellules directement ensemencées sur les
échantillons est susceptible d’apporter une réponse plus proche de celle observée in vivo. La
BMP-2 libérée des échantillons devrait, en effet, agir essentiellement sur les cellules qui
auront migré à l’intérieur des pores du matériau. Nous constatons, dans cette situation, que la
différenciation des C2C12 en réponse à la BMP-2 adsorbée est importante sur les deux types
d’échantillons, ce qui montre que l’activité de la protéine n’est pas altérée par l’adsorption sur
les substrats. Même si les capacités de différenciation de la BMP-2 apparaissent équivalentes
pour les deux échantillons, nous constatons cependant, un retard de la réponse sur les
échantillons revêtus. La libération plus lente de la BMP-2 adsorbée sur les échantillons
revêtus peut expliquer en partie le décalage de différenciation observé. Mais comme nous
l’avons montré, par ailleurs, la confluence cellulaire joue un rôle non négligeable dans la
réponse des C2C12 à la BMP-2 adsorbée. La confluence des cellules, plus faible sur les
granulés revêtus, pourrait donc aussi participer à ce retard de différenciation.

6. Conclusions et perspectives
Les expériences de culture cellulaires effectuées ici nous ont permis de comparer
macroscopiquement la réponse des cellules incubées sur nos échantillons témoins et revêtus.
Nous avons pu, tout d’abord, mettre en évidence une bonne biocompatibilité des matériaux
revêtus vis-à-vis des différents types cellulaires étudiés. Ce résultat est particulièrement
important puisqu’il constitue un pré-requis indispensable aux expérimentations chez l’animal
prévues à la suite de cette étude cellulaire in vitro.
Quelques différences d’adhésion et de prolifération cellulaires ont toutefois été observées en
présence du revêtement. Les raisons de ces différences pourraient faire l’objet d’études plus
approfondies. Il n’est, tout d’abord, pas exclu que le revêtement induise une légere
cytotoxicité au cours des premiers jours d’incubation avec les cellules. Des mesures de
l’activité de la LDH (lactate déshydrogénase) libérée dans le milieu ou présente dans les
cellules ainsi que l’utilisation de kits permettant de visualiser les cellules viables et les
cellules mortes in situ par marquage fluorescent (kit live/dead®, Invitrogen) pourraient donc

118
être envisagées. Dans un autre registre, il pourrait être intéressant d’effectuer une
caractérisation plus précise de l’adhésion cellulaire sur nos matériaux. Une cinétique à des
temps précoces de l’interaction cellules/matériaux pourrait être réalisée. Ainsi l’étude de
l’étalement des cellules ainsi que la quantité et la répartition des points focaux pourraient nous
fournir des informations sur l’affinité des cellules pour le revêtement nanocristallin. De telles
expériences font appel à des techniques d’imagerie (par immunoflurorescence ou MEB)
suivies d’une analyse comparative. L’utilisation de matériaux ayant une surface plane est par
conséquent nécessaire. L’équipe du CIRIMAT travaille actuellement sur le développement du
procédé permettant d’obtenir des pastilles denses à partir de cristaux d’apatite nanocristalline
similaires à ceux qui constituent notre revêtement. Une fois le procédé mis au point, il sera
possible de synthétiser des pastilles denses ou poreuses d’apatites nanocristallines présentant
des caractéristiques données parfaitement contrôlées et modifiables (différence de rapport
Ca/P, taux de carbonate modifié, taille des cristallites….) et donc d’effectuer des corrélations
entre la réponse obtenue et les propriétés des matériaux.

Nous avons d’autre part cherché à déterminer si les céramiques de notre étude étaient
capables d’induire une différenciation ostéoblastique de cellules souches mésenchymateuses
ou d’ostéoblastes sans addition d’agent différenciant. L’étude de l’activité de la phosphatase
alcaline exprimée par les cellules cultivées sur les matériaux n’a pas permis de mettre en
évidence une éventuelle capacité de différenciation de l’un ou l’autre de nos matériaux. Les
études préliminaires, impliquant la détection d’autres marqueurs de la différenciation
ostéoblastique (collagène de type I, ALP, ostéocalcine) par RT-PCR sont cependant très
encourageantes. Des cinétiques de différenciation doivent maintenant être effectuées, et les
marqueurs de différenciation ostéoblastique seront évalués par RT-PCR quantitative pour plus
de précision. Si, comme les résultats préliminaires le suggèrent, nous observons des
différences de profil entre les deux matériaux, nous pourrons évaluer l’expression d’autres
marqueurs (bone sialoproteine, osteopontine…) et de facteurs de transcription (runx-2,
osterix, msx-2, dlx-3 ou -5) classiquement impliqués dans la différenciation ostéoblastique.

Dans cette étude, nous avons enfin pu mettre en évidence que la BMP-2 adsorbée sur nos
échantillons conservait son potentiel de différenciation, et ce, quelque soit le type
d’échantillon. Les résultats obtenus pourraient être confirmés sur d’autres types cellulaires et
plus particulièrement sur des cellules mésenchymateuses (C3H10T1/2) ou des pré-
ostéoblastes (MC3T3). Nous avons, par ailleurs, suggéré que l’adsorption de la BMP-2 sur les

119
échantillons revêtus pouvait permettre à une libération de la protéine plus progressive et
soutenue dans le temps. Afin de déterminer si la présence du revêtement apporte un avantage
de cet ordre, nous pourrions envisager d’évaluer la différenciation cellulaire consécutive à une
pré-libération de la BMP-2 avant l’ensemencement des cellules sur les échantillons.

120
Chapitre 5

Etude du potentiel ostéoinducteur des


céramiques de BCP revêtues avec un dépôt
d’apatite carbonatée nanocristalline avec ou
sans rhBMP-2 chez l’animal
Dans ce chapitre, nous avons comparé le potentiel ostéoinducteur des céramiques de BCP
témoins et revêtues par le procédé NanoAp-EtOH, en présence ou absence de rhBMP-2 lors
d'implantation d'échantillons en site ectopique chez le mouton. Dans la partie bibliographique
de ce chapitre, nous ne reviendrons pas sur les paramètres majeurs qui influencent le potentiel
ostéoinducteur des biomatériaux (déjà décrits dans le chapitre 1). Nous indiquons ici des
éléments plus pratiques qui ont influencé nos choix lors de la préparation de cette étude
animale.

1. Introduction bibliographique
Comme nous l’avons déjà mentionné, le phénomène d’ostéoinduction est décrit comme la
capacité d’un matériau à induire la différenciation de cellules souches progénitrices en
ostéoblastes. En pratique, le potentiel ostéoinducteur d’un matériau est déterminé par sa
capacité à initier une formation d’os dans un site ectopique chez l’animal.
Les caractéristiques des matériaux, associés ou non avec des facteurs de croissances
ostéogéniques, sont déterminantes dans la réponse obtenue. Mais celle-ci est aussi dépendante
d’autres facteurs, à savoir, le site d’implantation, la taille de l’implant, le modèle animal
choisi ou encore la durée d’implantation.

1.1. Les modèles animaux

Différents modèles animaux sont utilisés pour évaluer le potentiel ostéoinducteur des
matériaux. Les réponses obtenues sont cependant très variables en fonction de l’espèce
étudiée et les modèles animaux préférentiellement utilisés sont différents en fonction du type
de substitut osseux étudié.

1.1.1. Les modèles d’ostéoinduction par les BMPs

Comme nous l’avons indiqué dans la partie introductive, la BMP-2 est capable d’initier la
formation d’os dans des sites ectopiques dans différents modèles animaux. L’ostéoinduction
par les BMPs est couramment étudiée chez les rongeurs (souris, rat, lapin) (Boyan et al. 1999,
Yuan et al. 2001c, Liu et al. 2005). Ces animaux constituent en effet un modèle de choix pour
comparer l’efficacité d’un matériau à induire une croissance osseuse ectopique en réponse aux
BMPs. Cela permet notamment d’évaluer l’influence des caractéristiques du matériau ou de la
méthode d’association du facteur de croissance sur la réponse obtenue. La stimulation de la

121
formation osseuse est en effet très importante chez ces animaux : l’implantation de quelques
microgrammes de BMP-2 suffit à initier un phénomène d’ostéoinduction (Alam et al. 2001).
Ces modèles présentent donc un grand intérêt pour effectuer une première comparaison de
l’efficacité des matériaux associés aux protéines avec des temps d’implantation courts et à
faible coût.
Toutefois, ces animaux apparaissent beaucoup plus sensibles aux BMP-2 que les grands
animaux (moutons, chèvres, chiens , primates, …), et que l’homme en particulier. Les
quantités nécessaires pour obtenir une réponse sont supérieures à 1 mg chez l’homme et sont
de plusieurs centaines de microgrammes chez les grands animaux. Les modèles de grands
animaux peuvent alors être préférés pour évaluer la capacité des matériaux à incorporer et
conserver une grande quantité de facteur de croissance et ainsi avoir une réponse plus proche
de celle espérée en application clinique chez l’homme. Quelques études ont mis en évidence
le potentiel ostéoinducteur des BMP-2 (ou -7) chez le singe ou le babouin (Miyamoto et al.
1993, Ripamonti et al. 2001), chez la chèvre (Kempen et al. 2009) ou le chien (Yuan et al.
1998). Chez le mouton, la seule étude décrite, à notre connaissance, concerne le revêtement
de pastilles de titane avec un polymère (poly (D,L-lactide)) (PDLLA)) dans lequel est
incorporé de la rhBMP-2. Dans cette étude, les auteurs n’ont pas observé de formation d’os à
la suite d’une implantation intramusculaire de 3 mois. Ils indiquent cependant que la faible
dose de BMP-2 utilisée (50 µg) et sa libération trop rapide (50% en seulement 48h) seraient
responsables du manque d’efficacité du facteur de croissance (Wildemann et al. 2004). La
capacité de la BMP-2 à induire une différenciation ostéoblastique chez le mouton est toutefois
suggérée par d’autres études.
Kirker-Head et al. ont montré, en effet, qu’une perte de substance importante responsable
d'une pseudarthrose pouvait être reconstruite par l’association de BMP-2 recombinante avec
du poly[D,L(lactide-co-glycolide)] (PLGA) (Kirker-Head et al. 1998). Plusieurs études ont
montré, en outre, un effet de la BMP-2 sur la reconstruction osseuse en site orthotopique. Les
quantités de protéines utilisées dans ces études sont variables mais sont en général supérieures
à 100 µg/implant et plus couramment d’environ 400 µg/ml de zone de comblement (Kessler
et al. 2004, Sachse et al. 2005, Toth et al. 2009).

1.1.2. Les modèles d’ostéoinduction par les matériaux

De même que pour l’ostéoinduction en réponse aux BMPs, des phénomènes d’ostéoinduction
par les matériaux ont pu être mis en évidence dans plusieurs modèles animaux. Mais dans ce

122
cas-ci, ce sont les grands animaux qui constituent les modèles de choix pour ces études. La
capacité intrinsèque d’un matériau à initier une formation osseuse dans un site ectopique est,
en effet, très dépendante de l’espèce considérée et s’avère être particulièrement faible chez les
rongeurs. Ripamonti a implanté des échantillons d’hydroxyapatite dérivée de coraux dans
l’abdomen (rectus abdominis = muscle droit de l’abdomen) de lapin, de chien ou de babouin
(papio ursinus). Après 3 mois d’implantation, la croissance osseuse à l’intérieur des pores des
céramiques était particulièrement faible chez le lapin et le chien mais apparaissait très
importante chez le babouin (environ 10 fois supérieure) (Ripamonti 1996). Yuan et al. ont
d’autre part évalué le potentiel ostéoinducteur de céramiques d’HA ou de BCP après
implantation sous-cutanée chez la souris, et intramusculaire chez le rat, le lapin et le chien
pendant 90 jours. L’ostéoinduction en réponse à l’HA n’a pu être observée que chez le chien
alors que les échantillons de BCP induisaient une formation osseuse dans plusieurs des
espèces étudiées. La réponse restait toutefois supérieure chez le chien où la présence d’os
néoformé était visible dans tous les échantillons alors que 6 échantillons sur 8 contenaient de
l’os chez le lapin et seulement 3 sur 16 chez la souris. Aucune ostéoinduction n’a d’autre part
été observée chez le rat dans cette étude (Yuan et al. 2006b).
Les modèles les plus couramment utilisés sont le chien, la chèvre et le babouin (Ripamonti
1996, Yuan et al. 2006a, Habibovic et al. 2008). Des expériences chez le cochon ou le mouton
ont aussi montré que ces animaux avaient la capacité d’induire une croissance osseuse
importante après implantation intramusculaire de céramiques de BCP pendant 3 ou 6 mois
(Yuan et al. 1998, Le Nihouannen et al. 2005).

1.2. Le site d’implantation

Pour évaluer le potentiel ostéoinducteur des substituts osseux, leur implantation dans un site
ectopique est nécessaire. Ces implantations sont faites généralement dans le tissu sous-cutané
ou dans le muscle des animaux mais des différences de réponses peuvent être observées en
fonction du site choisi. Okubo et al. ont montré, par exemple, que le site d’implantation avait
une influence sur l’ampleur de la réponse obtenue après implantation d’éponges de collagène
avec de la BMP-2 (5µg) chez le rat. Ils ont observé que la quantité d’os néoformé était plus
importante pour les échantillons après implantation intramusculaire puis intermusculaire.
L’implantation dans le tissu sous-cutané ou dans les tissus adipeux s’accompagnait d’une
formation d’os plus faible (Okubo et al. 2000). Des observations similaires ont été faites pour
la formation d’os ectopique par des céramiques de BCP. Habibovic et al. ont montré que le

123
site d’implantation était d’une importance capitale dans les résultats obtenus dans leurs étude
chez la chèvre. Alors que l’implantation intramusculaire de céramiques de BCP (HA/β-TCP :
70/30) induisait une formation osseuse dans 7 des 10 animaux, chez aucun de ces animaux, la
présence d’os n’a pu être visualisée après implantation sous-cutanée de ces mêmes
échantillons (Habibovic et al. 2006a).

1.3. La taille de l’implant

La taille de l’implant semble, par ailleurs, avoir une influence sur la formation d’os ectopique
induite par les matériaux. Habibovic et al. ont étudié l’implantation intramusculaire chez la
chèvre de cylindre macro- et micro-poreux de BCP (HA/β-TCP : 80/20) de 6,5 mm de
diamètre et de longueur variable : 10 mm ou 5 mm. Dans cette étude, 9 animaux sur 10
présentaient une formation d’os à l’intérieur des pores des substituts de grande taille alors que
la présence d’os néoformé n’était visible que dans 7 animaux sur 10 pour les « demi-
cylindres » après 3 mois d’implantation. Le pourcentage d’os par pore et la vitesse de
formation osseuse étaient par ailleurs plus importants pour les implants de grande taille
(Habibovic et al. 2006a).

1.4. Le temps d’implantation

Le temps d’implantation a aussi une forte influence sur la réponse obtenue. Après une phase
d’initiation plus ou moins longue, une croissance osseuse est observée au sein du matériau
lors de son implantation en site ectopique. S’en suit un ralentissement de la formation osseuse
puis à terme une résorption de l’os néoformé en raison de l’absence de contraintes
mécaniques qui assurent le remodelage et le maintien du capital osseux. Pour comparer le
potentiel ostéoinducteur d’un matériau, il est donc conseillé d’étudier la quantité d’os formé à
l’issue de temps d’implantation différents. Chez les grands animaux, les durées
d’implantations classiquement étudiées sont 6 et 12 semaines. La durée de 6 semaines
correspond à un temps précoce qui donne des informations sur la cinétique de croissance,
alors que le temps de 12 semaines, pour lequel la formation osseuse est bien établie, permet
d’effectuer une comparaison fiable du potentiel ostéoinducteur des échantillons. Une
comparaison à plus long terme est aussi parfois effectuée.
Yuan et al. ont réalisé une cinétique détaillée des phénomènes reliés à l’ostéoinduction par
des céramiques de BCP (HA/β-TCP : 62/38) après implantation intramusculaire chez le chien.

124
Après 7 jours d’implantation, ils ont observé une infiltration de fibres et de cellules sanguines
dans les pores du matériau ; après 14 jours, des cellules ont adhéré à la surface des pores et la
présence de vaisseaux sanguins est détectée. La prolifération et la différenciation
ostéoblastique débutent à J21 et à J30. La matrice osseuse (tissu ostéoïde et ostéoblastes)
apparaît se minéraliser après 45 jours d’implantation. A J60, un début de remodelage osseux
est visible mais la maturation de l’os formé se poursuit : après 6 mois d’implantation, la
présence de moelle osseuse est clairement distinguée au centre des pores et après 1 an, l’os
apparaît mature avec présence de canaux haversiens (Yuan et al. 2006a).

2. Objectifs
L’objectif de cette étude était de confirmer la biocompatibilité et d’évaluer le potentiel
ostéoinducteur des biomatériaux réalisés et caractérisés au cours de ce travail. Pour cela, des
implantations intramusculaires de nos céramiques ont été effectuées chez des brebis. Le
modèle animal ovin apparaissait parfaitement adapté pour cette étude étant donné que cettre
dernière avait deux finalités : 1) comparer l’effet de notre revêtement sur l’ostéoinduction
induite par la rhBMP-2 associée au matériau par deux méthodes distinctes et 2) évaluer le
potentiel ostéoinducteur intrinsèque du revêtement nanocristallin. Afin tout d’abord
d’effectuer une comparaison des différents échantillons contenant la protéine et de leur
efficacité potentielle en application clinique, il semblait nécessaire d’utiliser un modèle
animal dont les capacités d’ostéogénèse en réponse à la BMP-2 apparaissaient proches de
celles de l’homme. C’est le cas du modèle animal ovin : celui-ci est sensible à l’action de la
rhBMP-2 (Kirker-Head et al. 1998) mais la protéine doit être administrée en quantité
importante pour être efficace (Toth et al. 2009). Le modèle animal ovin posséde, en outre, la
capacité d’induire une formation d’os dans un site ectopique en réponse à certains matériaux
phosphocalciques (Le Nihouannen et al. 2005), ce qui nous a permis d’évaluer le potentiel
ostéoinducteur intrinsèque de notre revêtement.
Différents types d’échantillons ont été implantés : des céramiques de BCP témoins et revêtues
seules ou en présence de rhBMP-2. La BMP-2 a été associée aux matériaux par deux
méthodes distinctes : la méthode de dépôt d’une goutte concentrée de solution protéique puis
séchage, ou la méthode d’adsorption. Après 1 et 3 mois d’implantation, des observations
histologiques ont été réalisées sur des coupes non-minéralisées des prélèvements et une
analyse quantitative de l’os néoformé a été effectuée.

125
3. Matériel et méthodes

3.1. Implants

3.1.1. Les céramiques

Les implants de BCP (CERAFORM - HA/β-TCP : 65/35) fournis par la société Teknimed
sont des parallélépipèdes de 5 mm x 5 mm x 20 mm (implantation A) ou des cylindres de 6
mm de diamètre et 20 mm de long (implantation B). Ces implants ont été coupés en deux dans
la largeur pour obtenir des échantillons longs de 9 à 10 mm (Figure V.1). Après la découpe,
les échantillons ont été calcinés à 900°C pendant 5 minutes puis une partie a été revêtue avec
le procédé NanoAp-EtOH. Les céramiques ont ensuite été stérilisées par rayonnement gamma
avant utilisation.

Figure V.1 : Photographie des échantillons placés dans les muscles paravertébraux des
brebis lors de l’implantation A (a) et de l’implantation B (b).

3.1.2. Association avec la rhBMP-2

Une partie de ces échantillons a été utilisée en association avec la rhBMP-2. L’association de
la protéine a été réalisée par dépôt de solution concentrée ou par adsorption sur les implants
en conditions stériles (utilisation de solutions et matériels stériles sous hôte à flux laminaire).

• Dépôt d’une solution de rhBMP-2 sur les échantillons (implantation A)


Une solution de rhBMP-2 à 3 mg/ml dans de l’eau milliQ est préparée. 50 µl de cette solution
sont déposés à l’aide d’une micropipette sur l’échantillon parallélépipédique en effectuant 5
dépôts de 10 µl en différents points le long de la céramique. De ce fait, la solution pénètre à
l’intérieur de la majorité des pores de la céramique sans traverser cette dernière. La quantité
de protéine déposée est alors parfaitement contrôlée. La solution protéique sèche pendant 24h

126
à température ambiante sous une hôte à flux laminaire et les échantillons sont ensuite
conservés à 4°C pendant 48h avant leur implantation.
La quantité de BMP-2 déposée est de 150 µg/ échantillon (600µg/cm3) quel que soit le type
de céramiques considérées (témoins ou revêtues).

• Adsorption de rhBMP-2 sur les échantillons (implantation B)


Les cylindres sont immergés dans 550 µl de solution à 300 µg/ml de protéines dans un
tampon NaCl 1M, TRIS 25 mM, CaCl2 10mM, pH 7,4 pendant 24h à 37°C. La quantité
initiale de protéine mise en contact correspond à 600 µg/cm3 d’échantillon. La solution
d’adsorption est ensuite retirée et les échantillons sont lavés à deux reprises pendant une
minute dans de l’eau ultrapure (Gibco). Les échantillons sont séchés pendant 24h à
température ambiante, conservés à 4°C pendant 48h puis implantés. La quantité de protéine
restant en solution est déterminée par la méthode de Bradford (Biorad assay) dans des
microplaques.
La quantité de BMP-2 adsorbée est respectivement de 68 ± 14 µg/échantillon et
138 ± 10 µg/échantillon pour les cylindres témoins et revêtus.

3.2. Implantations intramusculaires

Les implantations ont été réalisées par le service de chirurgie de l’Ecole Nationale Vétérinaire
de Toulouse sur 9 brebis tarasconnaises calibrées et agées de 4 à 5 ans (GAC L’isle-en-
Dodon).
Les brebis ont été anesthésiées par une injection de 15 à 20 mg/kg de Thiopental
(NesdonalND, Merial) par voie veineuse. Après intubation endotrachéale et connexion à une
machine d’anesthésie par inhalation, l’anesthésie est entretenue avec de l’isoflurane à une
concentration moyenne de 2,5% dans du dioxygène pur.
Après désinfection et préparation de la zone chirurgicale, les
échantillons sont implantés le long du rachis de la brebis dans les
muscles paravertébraux. Deux exemplaires de chaque type
d’échantillon (CERAFORM ou CERAFORM revêtu ± rhBMP-2) sont
implantés par brebis (un de chaque côté du rachis). Les implants sont
Figure V.2 :
espacés d’au moins 5 cm les uns des autres pour éviter des interactions Photographie de
l’emplacement des
potentielles entre les échantillons (Figure V.2).
implants

127
Au total, pour chaque type et durée d’implantation, 6 échantillons ont été utilisés et répartis
sur 3 brebis. Deux séries d’implantations ont été réalisées (Tableau V.1).

Tableau V.1 : Description des échantillons implantés.


Implantation B
Implantation A
(cylindres)
(parallélépipèdes)
nombre
nombre d'échantillons
Implants d'échantillons
1 mois 3 mois 3 mois
Moutons 1,2,3 Moutons 4,5,6 Moutons 7,8,9
Témoins 6 6
Revêtus 6 6
Témoins+BMP-2déposée (150 µg) 6 6
Revêtus +BMP-2déposée (150 µg) 6 6
Témoins+BMP-2adsorbée (68 ± 14 µg) 6
Revêtus+BMP-2adsorbée (138 ± 10 µg) 6

Les différentes brebis ont reçu d’autres types d’échantillons en plus de


ceux décrits ici. Au maximum, 16 céramiques ont été implantées dans
le muscle du rachis d’une même brebis. Les autres échantillons ne
seront pas analysés dans ce manuscrit.

Pour l’implantation intramusculaire, la peau, le fascia lombaire et le


muscle long du dos sont incisés au bistouri dans le sens des fibres
(Figure V.3a). Les échantillons sont alors placés au sein du tissu
musculaire (Figure V.3b). L’aponévrose lombaire et le tissu conjonctif
sous-cutané sont suturés avec un fil irrrésorbable (Ethilon déc. 3,
Ethicon) afin de faciliter le repérage des sites d’implantation lors de
l’extraction des échantillons ex vivo (Figure V.3c). La peau est aussi
suturée avec un fil irrésorbable (Ethilon déc. 3, Ethicon) (Figure V.3d).
La zone opératoire est ensuite recouverte d’un pansement collé
surveillé quotidiennement pendant 10 jours puis retiré définitivement. Figure V.3 : Etapes
de l’implantation
chirurgicale

128
A la fin du temps d'implantation choisi (1 mois ou 3 mois), les brebis ont été sacrifiées par
overdose de thiopental (DoléthalND, Merial) et les échantillons récupérés immédiatement ont
été conservés dans une solution de formol à 10% avant les études d’histologie.

3.3. Etude histologique

L’inclusion des implants et la découpe des blocs obtenus ont été effectués en collaboration
avec le laboratoire d’anatomie et cytologie pathologique de l’hôpital de Rangueil.

• Inclusion des échantillons


L’étude histologique a été réalisée sur coupes non-déminéralisées. Pour cela, les échantillons,
conservés dans la solution de formol, sont déshydratés puis inclus dans une résine de méthyl-
méthacrylate. Deux techniques d’inclusion ont été réalisées. Les échantillons extraits après 1
mois d’implantation ont été inclus par la méthode utilisée classiquement au laboratoire. Cette
méthode comporte la fixation des échantillons dans de l’alcool à 80°C pendant 24h puis leur
déshydratation par immersion dans des bains successif d’alcool de concentration croissante
pendant 24h puis dans du xylène pur pendant 4h. Les prélèvements sont ensuite placés dans
différents bains de méthyl-méthacrylate à température ambiante puis la dernière solution est
placée à 35°C jusqu’à polymérisation complète de la résine.
En raison de la forte toxicité des solutions employées et du nombre important d’échantillons à
traiter, un kit d’inclusion (Kit historésine Leica) a ensuite été utilisé pour l’inclusion des
autres échantillons. L’inclusion a été réalisée selon les instructions du fabricant : après
déshydration des échantillons par immersion dans des bains successifs d’alcool, les
prélèvements sont inclus dans une résine de méthyl-méthacrylate et placés dans une étuve à
30°C pendant 2 heures.

• Réalisation des coupes


Des coupes d’environ 5 µm ont ensuite été effectuées sur ces blocs à l’aide d’un microtome
Leica. Une technique particulière à été utilisée pour éviter que l’implant ne s’effrite lors de la
coupe. Celle-ci a été réalisée en appliquant sur la surface à découper un morceau de scotch qui
assure l’intégrité de la céramique (Figure V.4). Les coupes des implants, collées sur ces
morceaux de scotch, sont ensuite colorées pour l’analyse histologique.

129
Figure V. 4: Photographie de la préparation d’une coupe à partir d’un bloc de résine.

• Coloration des échantillons


Les coupes ont été traitées par la coloration Trichrome de Masson. Brièvement, pour réaliser
la coloration, les morceaux de scotch sur lesquels sont collées les coupes sont d’abord placés
dans une solution Hémalun de Mayer pendant 5 minutes. Après lavage dans de l’eau
désionisée, les coupes sont trempées quelques secondes dans une solution saturée en
carbonate de lithium, lavées à nouveau et trempées pendant quelques secondes dans une
solution de Morrel et Bassal diluée au tiers. Après lavage, les échantillons sont placés dans
une solution de rouge ponceau de xylidine pendant 5 minutes. Les coupes sont lavées puis
placées dans de l’acide phosphomolybdique à 1% pendant 5 minutes. Les échantillons sont
ensuite récupérés et directement placés dans une solution de bleu d’aniline ou de vert lumière,
qui colorent la matrice collagénique en bleu ou vert foncés respectivement. Une fois ces
colorations effectuées, l’analyse histologique des coupes peut être réalisée. Le noyau des
cellules est coloré en rose foncé ou violet, le cytoplasme, le muscle et les érythrocytes sont
colorés en rouge vif et les fibres de collagène apparaissent en bleu ou vert, selon le dernier
colorant utilisé.

• Analyse quantitative de l’os néoformé


L’évaluation de la quantité d’os néoformé a été effectuée par histomorphométrie sur les
coupes histologiques. Il s’agit d’une méthode de quantification semi-automatique développée
sous le langage de programmation MATLAB® au laboratoire de biomécanique.
La réalisation de ce travail a été effectuée en plusieurs étapes (Figure V.5).

130
Figure V.5 : Méthodologie pour la quantification de l’os néoformé.

131
Cette analyse a été effectuée informatiquement à partir des photographies des coupes
histologiques prises au microscope. Après assemblage des photographies pour obtenir une
image globale de l’implant, des zones d’intérêt ont été déterminées manuellement. Ces zones
correspondent aux pores de la céramique dans lesquelles la présence d’os sera quantifiée. Un
nettoyage de l’image (manuel et semi-automatique) a ensuite été réalisé à l’intérieur de ces
zones d’intérêt. Un programme de quantification des pixels colorés est ensuite mis en place et
le résultat obtenu correspond au pourcentage d’os formé par rapport à l’aire globale de la
céramique.

• Constitution de l’image
Nous avons cherché à obtenir des images de la céramique complète pour lesquelles les détails
pouvaient être visualisés. Pour cela, à l’aide d’une caméra montée sur un microscope (Nikon,
microscopie 80i ; logiciel elipse net), des photographies au grossissement x 40 ont été
réalisées successivement pour toutes les zones de l’implant (Figure V.6a).
L’image de la céramique complète a ensuite été reconstituée par assemblage en utilisant
l’extension Photomerge du logiciel Adobe Photoshop® 09. Cet outil permet de fusionner
plusieurs images possédant des parties communes. L’image finale est constituée d’environ
2400x1700 pixels et est enregistrée en format jpeg (Figure V.6b).

Figure V.6 : Constitution de l’image.

• Détermination des zones d’intérêt


Différents contours ont été tracés manuellement sur chaque image à l’aide du logiciel The
Gimp® et d’une tablette graphique Cintiq 21UX (Wacom Co.Ltd.). Un premier contour de
couleur bleue délimite le bord de l’implant. Des contours rouges correspondant aux pores de
la céramique ont ensuite été tracés afin de délimiter les zones d’intérêt dans lesquelles l’os
sera quantifié (Figure V.7).

132
Figure V.7 : Détermination des zones d’intérêt.

• Nettoyage de l’image
Le programme de quantification réalisé mesure le nombre de pixels colorés (c'est-à-dire, les
pixels qui ne sont pas blancs). Il est donc nécessaire d’effectuer un nettoyage du fond ou des
colorations non spécifiques pour obtenir un résultat fiable.
Dans un premier temps, un seuillage dans l’espace de couleur TSV (Teinte-Valeur-Saturation)
a été effectué. Tous les pixels ayant des valeurs de Teinte ou de Valeur inférieures à 0,3 sont
alors transformés en pixels blancs. Une fois ce seuillage réalisé, la majorité des pixels non
spécifiques sont éliminés sans modification des pixels présentant les couleurs d’intérêt.
Un nettoyage manuel a ensuite été réalisé pour éliminer les colorations non spécifiques
(fibrose, céramique…) qui possèdent des caractéristiques trop proches de la couleur d’intérêt
et qui sont donc toujours présentes après la mise en place des seuils. C’est cette image
nettoyée qui correspond au fond utilisé pour la quantification finale (Figure V.8).

Figure V.8 : Photographie de l’image nettoyée utilisée comme image de fond pour la
quantification

133
• Quantification du pourcentage d’os néoformé
Une fois ces différentes étapes effectuées, la quantification peut être réalisée de manière
automatique. Le programme informatique crée des masques binaires à partir des contours
précédemment définis et effectue des opérations booléennes pour transformer tous les pixels
qui ne sont pas contenus dans les zones d’intérêts en pixels blancs (Figure V.9).
La quantification de l’os néoformé se fait alors par dénombrement du nombre de pixels
colorés. Cette valeur est enfin rapportée au nombre de pixels contenus dans la zone bleue, qui
caractérise la surface de l’implant. Le résultat obtenu correspond au pourcentage d’os
néoformé par rapport à l’aire de la céramique pour chaque coupe histologique.
Les résultats sont ensuite transférés dans un fichier excel où ils peuvent être récupérés puis
traités.

Figure V. 9 : Application des masques et transformation de l’image pour la quantification.

3.4. Etude statistique

La comparaison de la quantité d'os néoformé a été réalisée par analyse de variances globale
(ANOVA). La comparaison a porté, pour un temps d'implantation donné, sur les différents
échantillons et sur les moutons. Lorsque les résultats étaient significatifs (p<0,05), un test de
comparaison des moyennes (test de Bonferoni) a été utilisé pour déterminer la hiérarchisation
des implants et éventuellement des moutons.

134
4. Résultats

4.1. Observations générales

Aucun problème majeur n’est survenu lors de l’anesthésie, du réveil ou du suivi


postopératoire. Les brebis se portaient bien dès leur réveil après l’opération et sur toute la
durée de l’implantation. Seuls deux sites d’infections ont été constatés lors de l’extraction des
échantillons : il s’agissait d’abcès superficiels sous-cutanés sans communication apparente
avec les implants (pas de contact entre le site de réaction inflammatoire et la céramique).
Les implants semblaient par ailleurs parfaitement intégrés dans les tissus musculaires.

4.2. Inflammation et fibrose

L’étude histologique confirme la bonne intégration des implants dans le muscle : quelle que
soit la durée d’implantation et le type d’échantillon, nous observons un contact direct entre la
céramique et le tissu musculaire, avec peu d’inflammation et de fibrose. La présence d’une
fibrose limitée ou de fibro-œdèmes inflammatoires est parfois constatée au niveau de certains
pores. Cependant, nous n’observons pas de réaction cellulaire importante et la présence de
zones de résorption ou de macrophages n’est pas détectée. Ceci témoigne d’une bonne
tolérance de l’organisme vis-à-vis des différents types de matériaux étudiés.

4.3. Comparaison de l’efficacité des échantillons – quantification de


l’os néoformé (ostéoinduction)

4.3.1. Implants intramusculaires 1 mois

Pour la série d’expérimentation A, les échantillons ont été implantés pendant 1 ou 3 mois. Le
temps précoce de 1 mois a été choisi afin d’évaluer la cinétique de formation de l’os dans ce
site ectopique en fonction des échantillons.

4.3.1.1. Echantillons avec rhBMP-2 déposée


L’ajout de la BMP-2 déposée et séchée sur les échantillons s’accompagne d’une formation
d’os après leur implantation en site intramusculaire pendant 1 mois (Figure V.10).

A l’intérieur des pores des échantillons - témoins et revêtus – contenant la BMP-2 déposée,
nous constatons la présence d’os néoformé. Nous observons distinctement une coloration de

135
la matrice collagénique en bleu surmontée d’un liserai rose (vers l’intérieur des pores) qui
peut être attribué à la présence d’une barrière ostéoblastique. Ces observations sont
caractéristiques d’une formation d’os normale avec une matrice collagénique minéralisée
entourée de tissu ostéoïde.
En plus de la formation d’os au contact des pores du matériau, nous pouvons aussi constater
une formation d’os dans les tissus fibreux bordant l’implant sans contact direct avec la
céramique.

Figure V.10 : Photographies de l’os néoformé après 1 mois d’implantation intramusculaire


des céramiques contenant la rhBMP-2 déposée. Photographie des échantillons témoins (a, c,
d) et revêtus (b). Les coupes non-déminéralisées ont été colorées avec la méthode trichrome
de masson et les photographies ont été prises au grossissements x 40 (a,b), x10 (c) et x100
(d).

136
4.3.1.2. Echantillons sans rhBMP-2
Après 1 mois d’implantation, nous ne détectons pas d’os néoformé en l’absence d’agent
ostéogénique (de BMP-2) sur les échantillons témoins dépourvus de BMP-2.

Figure V.11 : Photographies des pores des implants revêtus après 1 mois d’implantation
intramusculaire. Les coupes non-déminéralisées ont été colorées avec la méthode trichrome
de masson avec le vert lumière et les photographies ont été prises au grossissements x 40 (a),
x200 (b).

Pour les échantillons revêtus, une légère coloration bleutée ou verte (selon la méthode de
coloration) est observée au niveau de la surface des pores de la céramique (Figure V.11). Ces
zones apparaissent cependant pour la plupart craquelées et semblent correspondre à des
artefacts liés à une coloration non-spécifique de l’apatite nanocristalline du revêtement (qui
serait donc toujours présent après 1 mois d’implantation). Au niveau de certains pores,
toutefois, nous distinguons la présence de fins liserés bleu ou vert homogènes surmontés
d’une bande rose qui semble correspondre à un tissu fibro-ostéoblastique ce qui pourrait
indiquer une initiation de formation d’os à la surface de la céramique revêtue en certains
points.

4.3.1.3. Evaluation quantitative


L’évaluation quantitative de l’os néoformé sur ces coupes confirme les observations
effectuées (Figure V.12). La présence de BMP-2 déposée sur les échantillons conduit à une
augmentation significative du pourcentage d’os néoformé (p<0,05). Pour les échantillons
contenant la BMP-2, nous n’observons pas de différences significatives entre les céramiques
témoins et revêtues. L’aire occupée par l’os représente, respectivement, 2,1 ± 0,3 % et 1,5 ±
0,3 % de l’aire totale de la céramique.

137
Figure V.12 : Pourcentage d’os formé par rapport à l’aire de l’implant après 1 mois
d’implantation intramusculaire des différents échantillons. Les résultats sont représentés
par des boîtes à moustache.

4.3.2. Implants intramusculaires 3 mois

Deux séries d’implantations différentes ont été effectuées :


- une étude sur des parallélépipèdes avec les échantillons témoins, revêtus, témoins +
BMP-2 déposée et revêtus + BMP-2 déposée (implantation A).
- une implantation dans laquelle sont utilisés des échantillons cylindriques contenant la
BMP-2 adsorbée (implantation B).
La durée d’implantation de 3 mois a été choisie, en accord avec la littérature, afin de
comparer l’efficacité d’ostéoinduction de nos différents échantillons.

4.3.2.1. Echantillons avec rhBMP-2 déposée ou adsorbée


Quelle que soit la méthode d’association de la protéine, après 3 mois d’implantation, les
échantillons contenant la BMP-2 conduisent à une formation d’os importante (Figure V.13).
Contrairement aux observations précédentes sur les échantillons contenant la BMP-2 déposée
implantés pendant 1 mois, la formation d’os est observée exclusivement à l’intérieur des
pores, en contact direct avec la céramique pour tous les échantillons.

138
Figure V.13 : Photographies de l’os néoformé après 3 mois d’implantation intramusculaire
des céramiques témoins et revêtues en présence ou absence de rhBMP-2. Les coupes non-
déminéralisées ont été colorées avec la méthode trichrome de masson et les photographies
ont été prises au grossissements x 40.

4.3.2.2. Echantillons sans rhBMP-2


Sur les échantillons témoins sans BMP-2, une très faible quantité d’os peut être observée au
niveau de quelques joints de grains (Figure V.13). Cette incapacité à former de l’os après
implantation dans un site intramusculaire est en corrélation avec les résultats classiquement
obtenus pour les céramiques de BCP commercialisées à l’heure actuelle, qui possèdent un bon
potentiel ostéoconducteur mais ne présentent pas de capacité d’ostéoinduction.

139
Par contre et de manière très intéressante, nous pouvons constater, pour cette durée
d’implantation, une très grande quantité d’os formée dans les pores des échantillons revêtus
seuls – ne contenant pas de BMP-2 (Figure V.13). Cette formation d’os apparaît normale :
nous distinguons sur les échantillons revêtus (comme sur les différents échantillons contenant
la BMP-2) l’os néoformé délimité par un front ostéoblastique. La structure est caractéristique
de l’os lamellaire et nous pouvons voir la présence d’ostéocytes à l’intérieur de la matrice
(Figure V.14).
Cette formation d’os ectopique au sein des implants revêtus, est révélatrice d’un fort potentiel
ostéoinducteur de la céramique revêtue avec le procédé NanoAp-EtOH.

Figure V.14 : Photographie de l’os néoformé à l’intérieur d’un pore des céramiques
revêtues après implantation intramusculaire pendant 3 mois (Grossissement x200).

4.3.2.3. Evaluation quantitative


La quantification de l’os néoformé sur les coupes histologiques confirme que les différences
observées sont très fortement significatives (p<0,005) entre les témoins et les autres implants.
Par ailleurs, il n’y a pas de différence significative entre les échantillons revêtus seuls et les
échantillons contenant la BMP-2. Le revêtement seul est aussi ostéoinducteur que les
échantillons contenant la BMP-2 et nous n’observons pas d’effet synergique de l’association
du revêtement avec la BMP-2 (R = R+BMP-2) (Figure V.15a).

140
Figure V.15 : Pourcentage d’os formé par rapport à l’aire de l’implant après 3 mois
d’implantation intramusculaire des différents échantillons. Les résultats sont représentés
par des boîtes à moustache.

Après 3 mois d'implantation, l’analyse statistique indique des différences significatives du


pourcentage d’os néoformé entre les différents animaux de l’étude (p=0,04). Dans ces
conditions, il semble difficile de comparer statistiquement les résultats des deux séries
d’implantation.
Pour la série d’implantation B, le pourcentage d’os néoformé est significativement plus faible
pour les échantillons témoins contenant la BMP-2 adsorbée que pour les céramiques revêtues
traitées dans les mêmes conditions (p<0,05) (Figure V.15b). Dans ce cas-ci, nous ne
distinguons pas de différences significatives entre les animaux. La quantité d’os néoformé sur
les échantillons revêtus avec la BMP-2 adsorbée est du même ordre de grandeur que les
résultats obtenus pour les échantillons ostéoinducteurs de la série d’implantation A
(céramiques contenants la BMP-2 ou/et revêtues).

5. Discussion
Dans ce chapitre, nous avons évalué l’effet ostéoinducteur de notre revêtement associé ou non
avec la rhBMP-2. Les études histologiques montrent que le potentiel ostéoinducteur des
céramiques de BCP utilisées dans notre étude peut être significativement augmenté par

141
association de ces matériaux avec la rhBMP-2 et/ou par revêtement de leur surface par une
couche d’apatite nanocristalline carbonatée.

5.1. Effet ostéoinducteur de la rhBMP-2

Nous avons mis en évidence que l’association de rhBMP-2 - par adsorption ou simple
imprégnation et séchage - sur des céramiques phosphocalciques permettait d’induire une
formation d’os importante après implantation intramusculaire des échantillons chez le
mouton. Dans ce modèle animal, plusieurs études suggéraient un effet ostéogénique de la
BMP-2, puisque la formation d’os est supérieure en sa présence lors d’implantations en sites
orthotopiques ou dans des modèles de comblement de pseudarthrose (Kirker-Head et al. 1998,
Sachse et al. 2005) ; cependant, aucune étude n’avait montré, à notre connaissance, leur
potentiel ostéoinducteur dans une implantation ectopique. Dans la seule étude décrite dans ce
modèle, aucune croissance osseuse n’a pu être obervée après 3 mois d’implantation
intramusculaire d’échantillons de titane revêtus de PDLLA et contenant de la BMP-2
(Wildemann et al. 2004). Cette absence d’effet a été attribuée à une quantité de BMP
administrée et conservée au niveau du site d’implantation insuffisante. Comme nous l’avons
déjà indiqué, il est en effet clairement admis que le temps de rétention du facteur de
croissance est un paramètre clé dans l’efficacité des BMPs.
Dans notre étude, nous avons cherché à augmenter ce temps de rétention par adsorption de la
rhBMP-2 sur les céramiques revêtues. Nous avons pu observer des différences significatives
de la quantité d’os néoformé entre les implants « Témoins + BMP-2 adsorbée » et les
échantillons « Revêtus + BMP-2 adsorbée ». La formation osseuse est largement supérieure
sur les échantillons revêtus qui ont adsorbés une quantité plus grande de BMP-2 et
assureraient une rétention plus soutenue dans le temps que les échantillons témoins. D’après
les résultats obtenus, il semble que la quantité d’os néoformé soit principalement dépendante
de la quantité de BMP-2 adsorbée sur les échantillons. En effet, dans l’expérimentation A qui
concerne l’implantation des échantillons sur lesquels la BMP-2 a été associée par simple
imprégnation et séchage, la quantité de protéine déposée est identique pour les céramiques
témoins et revêtues ; le pourcentage d’os néoformé apparaît, quand à lui, équivalent.
Dans notre étude, cette méthode d’association de la rhBMP-2 avec les céramiques permet une
formation osseuse importante et soutenue dans le temps. Certaines études montrent que le
degré de solubilité joue un rôle important dans la cinétique de libération de la protéine dans le
cas où l’association avec le matériau est effectuée par simple imprégnation et séchage. Dans

142
notre cas, l’imprégnation des céramiques a été réalisée avec la rhBMP-2 non-glycosylée qui
présente un degré de solubilité plus faible que celui de la rhBMP-2 glycosylée et un temps de
rétention plus long au niveau du site chirurgical. Dans nos études effectuées in vitro, les
quantités de BMP-2 libérées apparaissaient significativement différentes en fonction du type
d’échantillon et de la méthode d’association mais les différences observées restaient
cependant faibles et les profils de libérations globalement équivalents : nous n’avons pas
constaté de libération très rapide de la protéine quels que soient les échantillons étudiés. Ceci
pourrait expliquer que la formation d’os en réponse à la BMP-2 déposée sur les échantillons
soit aussi importante et que nous n’observions pas de différences majeures entre la méthode
d’adsorption et d’imprégnation sur les céramiques revêtues (même si les deux séries
d’implantations ne peuvent être directement comparées en raison de la variabilité inter-
animal).
Cette méthode simple d’association par imprégnation peut toutefois comporter quelques
inconvénients : après 1 mois d’implantation, la formation d’os n’est pas distinguée
uniquement au contact des céramiques contenant la BMP-2 déposée mais aussi dans le tissu
fibreux environnant. Ceci suggère que la BMP-2 est libérée de la céramique et qu’elle pourrait
diffuser dans les tissus. Dans notre cas, cet effet adverse est transitoire et localisé mais
démontre, un nouvelle fois, qu’il est important de contrôler la libération du facteur de
croissance associé pour optimiser le facteur efficacité/dose et limiter ainsi les risques
systémiques potentiellement liés à l’utilisation de protéines exogènes.

5.2. Effet ostéoinducteur du revêtement

Le résultat majeur de ce projet concerne la mise en évidence de l’effet ostéoinducteur


intrinsèque de notre revêtement d’apatite nanocristalline. Plusieurs études ont déjà montré que
des matériaux – phosphocalciques en particulier - étaient capables d’induire une formation
d’os dans un site ectopique mais les quantités d’os formé apparaissent plutôt faibles d’après
les images d’histologies présentées dans ces travaux. Dans notre cas, la croissance osseuse
apparaît normale et particulièrement importante : l’étude histomorphométrique nous indique
qu’après 3 mois d’implantation, le pourcentage d’os néoformé est aussi important pour les
échantillons révêtus (sans facteur de croissance) que pour les céramiques contenant la BMP-2.
La formation osseuse en réponse au revêtement semble débuter après 1 mois d’implantation
comme le montrent les images histologiques. L’initiation du phénomène apparaît donc

143
retardée par rapport à la formation d’os induite par la présence de la BMP-2 mais ces résultats
sont en accord avec ceux de la littérature (Yuan et al. 2006a).

Les raisons du fort potentiel ostéoinducteur de notre revêtement ne peuvent pas être
déterminées avec précision. Plusieurs paramètres sont susceptibles d’être impliqués dans
l’initiation de ce phénomène et différentes hypothèses sont proposées.
D’après Ripamonti, l’ostéoinduction par les matériaux serait reliée à leur capacité d’adsorber
des protéines ostéogéniques comme les BMPs à partir des fluides biologiques. Les protéines
endogènes pourraient s’accumuler dans les pores des céramiques et atteindre ainsi une
concentration suffisante pour induire la migration et la différenciation de cellules
progénitrices de l’os (Ripamonti 1996). Cette hypothèse pourrait être corroborée par la forte
influence de la microporosité sur le potentiel ostéoinducteur des matériaux. La présence de
cette microporosité est associée à une augmentation de la surface spécifique et des capacités
d’adsorption de l’implant vis-à-vis des protéines circulantes (Rouahi et al. 2006a, Zhu et al.
2008). Les capacités d’adsorption protéiques accrues observées sur nos matériaux revêtus de
surface spécifique importante pourraient expliquer la formation osseuse en ce site ectopique.
Il a, par ailleurs, été mentionné que la microporosité et la forte surface spécifique des
échantillons, qui lui est associée, permettraient de favoriser la formation d’apatite
nanocristalline carbonatée, souvent représentative de la bioactivité des matériaux. Selon
Habibovic et al., la formation de cette couche apatitique pourrait aussi s’accompagner d’une
co-précipitation de facteurs de croissance circulants, et ces facteurs seraient alors à l’origine
des phénomènes d’ostéoinduction observés (Habibovic et al. 2005). Dans notre étude, la
composition, la taille et la réactivité des cristallites de notre revêtement sont très proches des
caractéristiques du minéral osseux et des apatites formées sur les matériaux bioactifs.
Remarquons, en outre, que ces nanocristaux offrent une source de germes cristallins beaucoup
plus importante que les surfaces frittées et qu’ils pourraient présenter des capacités de
nucléation supérieures. Ceci pourrait expliquer la formation osseuse importante observée sur
ces échantillons après leur implantation intramusculaire chez le mouton, selon certains
auteurs. Remarquons toutefois que les capacités de nucléation ne sont pas le propre des
matériaux ostéoinductueurs et que la plupart des matériaux ostéoconducteurs ont aussi cette
propriété. La quantité de cristaux néoformés ferait-elle la différence? Rien ne permet de
l'assurer.
D’autre part, l’influence d’une libération éventuelle d’ions calcium et phosphate par les
céramiques, lors de la formation de cette phase, a été évoquée par certains auteurs. On

144
pourrait penser qu'un fort échange ionique des échantillons de BCP pourrait permettre la
formation de micro-environnements riches en ions calcium et phosphate dans les pores des
matériaux, comme cela a été écrit. Ces micro-environnements seraient alors susceptibles de
favoriser la prolifération et la différenciation ostéoblastique de cellules souches progénitrices
puis leur minéralisation (Chang et al. 2000, Midy et al. 2001, Muller et al. 2008). Dans notre
étude, la libération d’ions calcium et phosphate dans de milieu à partir des céramiques de
BCP ne paraît pas envisageable compte tenu de la sursaturation des fluides biologiques par
rapport à ces matériaux et de leur faible surface spécifique. Cette hypothèse ne peut, toutefois,
pas être exclue pour nos échantillons revêtus et pourrait expliquer les résultats obtenus. Le
comportement de ces céramiques après immersion dans du SBF ou sérum doit maintenant être
évalué pour répondre à cette question.

Une autre hypothèse est parfois évoquée pour expliquer les mécanismes d’ostéoinduction par
les matériaux. Elle concerne l’implication de la réaction inflammatoire sur l’initiation du
phénomène et s’appuie sur les observations effectuées lors de la réparation de fractures : au
cours des premiers jours, il y a recrutement de macrophage qui éliminent les débris par
phagocytose et expriment des facteurs inflammatoires susceptibles d’induire la migration et la
différenciation ostéoblastique de cellules progénitrices. Lors de l’implantation de matériaux in
vivo, un tel phénomène peut aussi se produire suite à l’intervention chirurgicale et pourrait
expliquer l’ostéoinduction par les matériaux d’après Le Nihouannen et al. (Le Nihouannen et
al. 2005). Les monocytes sont en effet capables de phagocyter de petites particules d’apatite et
d’exprimer de manière importante des cytokines pro-inflammatoires (Grandjean-Laquerriere
et al. 2005). Par ailleurs, quelques études ont montré que des matériaux présentant une forte
rugosité de surface induisaient la production de prostaglandine E2 (PGE2) par des
macrophages cultivés à leur contact, et que la PGE2 avait un effet chimioattractant sur les
cellules souches mésenchymateuses et induisait leur différenciation ostéoblastique (De Bruijn
et al. 2008). Dans notre étude, une augmentation de la production de cytokines par ces
cellules immunitaires en présence du revêtement nanoporeux peut tout à fait être envisagée.

A ce stade de notre étude, ces différentes hypothèses peuvent être envisagées et nous n’avons
pas assez d’éléments pour proposer un mécanisme d’action plutôt qu’un autre.

145
6. Conclusions et perspectives
Dans cette étude, nous avons cherché à évaluer le potentiel ostéoinducteur des différents
échantillons préparés et caractérisés au cours de notre travail. Nous avons pu constater une
très forte ostéoinduction en réponse à la rhBMP-2 chez le mouton. Nous avons montré que
l’adsorption de la protéine sur les échantillons revêtus conduisait à une quantité d’os
néoformé plus importante que pour les échantillons témoins avec la BMP-2 adsorbée. Ces
observations apparaissent directement reliées à la capacité d’adsorption du revêtement et de la
forte quantité de BMP-2 alors implantée. Nous n’avons cependant pas pu mettre en évidence
un avantage potentiel de la méthode d’adsorption par rapport à la technique d’imprégnation et
séchage de la protéine sur nos échantillons revêtus, qui conduit elle aussi à une formation d’os
importante avec la BMP-2 non-glycosylée. L’utilisation de rhBMP-2 glycosylée pourrait
donner lieu à des différences plus marquées (différence accentuée du profil de libération et
par suite de la réponse in vivo) entre les différents échantillons et méthodes d’association. Il
pourrait donc être intéressant de réaliser ces mêmes expériences avec la BMP-2 glycosylée,
mais le coût engendré par de telles expériences serait exorbitant si l’achat de la BMP-2 devait
être autofinancé.
Notre étude a surtout permis de mettre en évidence un potentiel ostéoinducteur très important
de notre revêtement d’apatite carbonatée nanocristalline, similaire au minéral osseux. Il a déjà
été montré que des céramiques phosphocalciques pouvaient posséder un potentiel
ostéoinducteur. Toutefois, ce phénomène nécessite la présence de micropores qui augmente la
surface spécifique des échantillons mais diminue aussi de manière drastique leurs propriétés
mécaniques. Notre méthode de revêtement d’apatite très réactive permet, en revanche,
d’augmenter de manière importante la surface spécifique des échantillons et leur confère un
fort potentiel ostéoinducteur sans pour autant modifier les caractéristiques initiales de la
céramique. Ces résultats sont donc très intéressants et novateurs. Ils se distinguent aussi par la
grande quantité d’os formé à l’intérieur des céramiques revêtues. Cette quantité apparaît
équivalente en présence du revêtement seul qu’en présence de BMP-2, protéine de référence
pour induire l’ostéoinduction.

Plusieurs études ont relié le potentiel ostéoinducteur de matériaux à leur capacité de


reconstruction une fois implantés en site orthotopique (Yuan et al. 2006a, Habibovic et al.
2008). Des études pour évaluer maintenant le potentiel ostéoconducteur de nos échantillons
revêtus sont en cours. Les échantillons ont été implantés dans les condyles fémoraux de

146
moutons pendant 3 mois et la quantification d’os formé doit maintenant être réalisée. Au
cours de l’opération, différents fluorochromes ont par ailleurs été injectés aux animaux pour
évaluer la cinétique de croissance osseuse. Enfin, les échantillons inclus dans la résine ont été
scannés dans un µCT (microcomputed tomography) avant la préparation des coupes pour
l’analyse histologique. La reconstruction des images obtenues devrait permettre d’évaluer la
quantité réelle d’os minéralisé sur la totalité de l’implant par analyse des niveaux de gris.
Il est enfin envisagé d’étudier la composition minérale de l’os néoformé par microscopie
infrarouge sur des coupes très fines. La préparation de ces coupes nécessite toutefois des
mises au point.

Une fois ces expériences finies, le comblement d’une grande perte de substance
mécaniquement chargé par nos matériaux revêtus pourrait être effectué. C’est en effet dans ce
genre d’application que l’ostéoinduction par notre revêtement est susceptible d’avoir le plus
grand intérêt.

Enfin, ces résultats ouvrent la voie pour la mise en place d’études théoriques plus
approfondies de manière à déterminer plus précisément les mécanismes mis en jeu dans ce
phénomène d’ostéoinduction apporté par le revêtement d’apatite nanocristalline. Quelques
propositions d’expérience sont présentées dans le chapitre « Conclusion et perspectives
générales » du manuscrit.

147
Conclusions et perspectives générales
L’objectif principal de ce travail était de développer un matériau phosphocalcique
biorésorbable de forte réactivité de surface lui conférant des propriétés ostéoinductrices.
Pour cela, nous avons choisi d’utiliser des céramiques de phosphate de calcium biphasique
déjà commercialisées, ayant prouvé leur efficacité en tant que substituts osseux, et
d’améliorer leur réactivité de surface, initialement faible. L’activation de la surface de ces
matériaux a été réalisée par l’addition d’un revêtement d’apatite carbonatée nanocristalline.
Un procédé permettant le revêtement de céramiques phosphocalciques poreuses par de
l’apatite carbonatée nanocristalline a donc été développé et une caractérisation des matériaux
a été réalisée. Nous avons montré que les cristaux qui constituent ces revêtements présentaient
des caractéristiques proches de celles du minéral osseux et améliorait les propriétés de surface
des céramiques de BCP. Nous avons observé la présence à la surface des cristaux d’une
couche hydratée, une augmentation significative de la surface spécifique des échantillons et la
présence d’une porosité additionnelle nanométrique en présence du revêtement. Ces différents
facteurs sont susceptibles d’intervenir dans les fortes capacités d’échange ionique et
d’adsorption protéique des matériaux revêtus mises en évidence dans cette étude. La présence
du revêtement d’apatite nanocristalline sur les céramiques de BCP permet d’augmenter
significativement la vitesse d’adsorption et la quantité de rhBMP-2 adsorbée s’accompagnant
d’une libération du facteur de croissance plus progressive dans le milieu de culture.
Après avoir établi la forte réactivité de surface des échantillons revêtus, nous avons voulu
étudier les réponses cellulaires in vitro et in vivo vis-à-vis de ces matériaux.
Nous avons montré in vitro que les deux types d’échantillons, témoins et revêtus, étaient
parfaitement biocompatibles. Ils permettent l’adhésion et la prolifération de différents types
cellulaires (C2C12, cellules souches mésenchymateuses et ostéoblastes) ainsi que leur
différenciation ostéoblastique en réponse à des agents différenciants. La bonne
biocompatibilité des matériaux étudiés a ensuite été confirmée in vivo.
Nous avons, d’autre part, montré que l’adsorption de BMP-2 sur les échantillons témoins et
revêtus induisait une forte différenciation ostéoblastique aussi bien in vitro sur les C2C12
qu’in vivo après implantation intramusculaire chez le mouton. Nous avons constaté que la
forte adsorption de la protéine sur les échantillons revêtus permettait la formation d’une
quantité d’os plus importante que celle obtenue par l’adsorption de la BMP-2 sur les
échantillons témoins dans ce site ectopique. Ces observations apparaissent directement reliées
à la capacité d’adsorption du revêtement et à la forte quantité de BMP-2 alors implantée.
Nous n’avons pas, cependant, pu mettre en évidence un avantage potentiel de la méthode

148
d’adsorption pour cette protéine par rapport à la technique d’imprégnation dans laquelle la
solution de facteur de croissance est simplement déposée à la surface des échantillons.
Enfin cette étude a surtout permis de mettre en évidence un potentiel ostéoinducteur très
important de notre revêtement d’apatite carbonatée nanocristalline, similaire au minéral
osseux. La quantité d’os néoformé à l’intérieur des pores des céramiques revêtues apparaît
particulièrement importante. Le pourcentage d’os formé après 3 mois d’implantation
intramusculaire est, en effet, équivalent sur ces échantillons que sur les implants contenant de
la BMP-2, facteur de croissance de référence pour l’ostéoinduction. Ces résultats, très
intéressants et novateurs, ouvrent la voie à de nouvelles études.

1. Evaluation de la capacité de reconstruction osseuse en site


orthotopique
Dans un premiers temps, une évaluation des propriétés des céramiques revêtues développées
dans ce travail devrait être réalisée en site orthotopique dans des conditions qui correspondent
à celles des applications cliniques potentielles. Les substituts osseux sont généralement
utilisés en milieu osseux pour combler de petites ou de grandes pertes de substance osseuses.
Plusieurs études indiquent qu’il existe une corrélation entre le potentiel ostéoinducteur des
matériaux et leur capacité de reconstruction des petites pertes de substance en milieu osseux
(Yuan et al. 2006a, Habibovic et al. 2008). Nous avons donc voulu vérifier cette hypothèse
dans ce travail. Les échantillons ont été implantés dans les condyles fémoraux de moutons
pendant 3 mois, durée classique pour l’étude des propriétés ostéoconductrices des céramiques
phosphocalciques, et l’analyse des résultats est en cours (Habibovic et al. 2008).

Figure VI.1 : Photographies de l’os néoformé au contact des échantillons témoins (a) et
revêtus (b) après 3 mois d’implantation dans les condyles fémoraux de moutons. Les
photographies ont été effectuées au grossissement x10 sur des coupes non-déminéralisées
colorées avec la méthode trichrome de Masson.

149
L’analyse histologique et l’étude des coupes obtenues par µCT confirment la parfaite
biocompatibilité et le potentiel ostéoconducteur des différents échantillons. Les matériaux
apparaissent bien intégrés dans l’os et la présence d’os néoformé minéralisé est observée en
contact direct avec les pores des différents échantillons étudiés (Figure VI.1). Par contre, en
raison du bon potentiel ostéoconducteur des céramiques de BCP seules (échantillons
témoins), nous n’avons pas pu, par ces seules observations macroscopiques, déterminer si la
capacité de reconstruction des matériaux revêtus était supérieure ou non à celle des
échantillons témoins dans ce contexte. Une analyse quantitative de l’os néoformé, similaire à
celle réalisée pour évaluer le potentiel ostéoinducteur des échantillons, doit maintenant être
effectuée pour déterminer avec précision les propriétés ostéoconductrices des matériaux
revêtus.

D’autre part, en application clinique le principal avantage des matériaux ostéoinducteurs


réside dans leur capacité à reconstruire de larges pertes de substances osseuses. Il apparaît
donc important d’évaluer les capacités de reconstruction de notre matériau revêtu dans un
modèle de pseudarthrose, en situation de mise en charge. Dans de tels modèles, une grande
perte de substance dans le tibia ou le métatarse est créée et celle-ci ne peut être reconstruite en
totalité sans la présence de matériaux capables d’induire la différenciation ostéoblastique de
cellules progénitrices. Le modèle ovin est parfaitement adapté à ce genre d’expérience.
L’étude du potentiel de reconstruction de nos céramiques revêtues dans une telle situation a
été envisagée. Dans cette expérience, un défaut osseux de 2 cm de long pourrait être réalisé au
niveau du métatarse du mouton et être comblé par des petits granulés de céramiques de BCP
témoins ou revêtues. Afin de contrôler la zone à reconstruire et favoriser la reconstruction
osseuse, nous avons prévu de contenir les granulés entre deux membranes en poly-lactide
(PLA, PDLLA…) poreuses biorésorbables qui permettent la migration cellulaire (Figure
VI.2) (Meinig 2002).
Les capacités de reconstruction de nos matériaux dans ce contexte devraient alors être
déterminées par l’évaluation de la quantité d’os néoformé (analyse quantitative par
histomorphométrie ou µCT) mais aussi par l’étude de la résistance des échantillons explantés
aux contraintes mécaniques. Des éprouvettes pourraient être réalisées par découpe des
explants d’os néoformé et analysées pour leur résistance mécanique. La perméabilité de ces
échantillons avant et après implantation pourrait enfin être étudiée et rapportée aux réponses
obtenues.

150
Figure VI.2 : Schéma du modèle de reconstruction de pseudarthrose envisagé.

2. Transfert industriel
Il a déjà été montré que certaines céramiques phosphocalciques pouvaient posséder un
potentiel ostéoinducteur. Toutefois, ce phénomène nécessite la présence de micropores
augmentant la surface spécifique des échantillons mais diminuant aussi de manière drastique
leurs propriétés mécaniques, ce qui constitue un frein à l’utilisation clinique. Notre méthode
de revêtement d’apatite très réactive, par contre, présente l’avantage d’augmenter de manière
importante la surface spécifique des échantillons qui acquièrent alors un fort potentiel
ostéoinducteur sans pour autant modifier leurs caractéristiques initiales. D’autre part, le
procédé de revêtement est simple et peu coûteux. Il est donc parfaitement transposable à
l’échelle industrielle. Un brevet concernant la méthode de revêtement vient d’être déposé et
un transfert industriel de ce procédé a été entrepris par la société Teknimed. Une optimisation
du procédé a été réalisée dans le cadre du transfert industriel. Les caractéristiques générales
du revêtement obtenu par le procédé industriel apparaissent comparables à celles présentées
dans ce travail et une commercialisation de ces céramiques revêtues est prévue à court ou
moyen terme.

3. Etude des mécanismes d’ostéoinduction


En parallèle de ces perspectives appliquées, les résultats obtenus incitent à participer à la
recherche des mécanismes d’ostéoinduction par les matériaux. Et en raison de l’ampleur de la
réponse observée sur les échantillons revêtus, ceux-ci pourraient servir de modèle pour ces
études.

151
3.1. Etudes chez l’animal

Une cinétique des évènements liés au phénomène d’ostéoinduction sur les matériaux revêtus
constituerait la première étude à réaliser. Il serait particulièrement intéressant d’étudier les
phénomènes précoces qui permettent d’initier la formation osseuse. Des implantations
intramusculaires des échantillons avec des durées d’implantation rapprochées (1 à 2 jours, 1
semaine, 2 semaines et ainsi jusqu’à 6 semaines ou plus) pourraient être effectuées dans ce
but. Les échantillons prélevés à ces différents temps pourraient d’abord être étudiés par
histologie ou histomorphométrie sur des coupes non-déminéralisées préparées à l’aide de
techniques plus précises (découpe avec une scie diamantée ou préparation de coupes épaisses
puis polissage). Ceci devrait permettre de visualiser les cellules à fort grossissement, et ainsi
de déterminer avec une plus grande précision les phénomènes cellulaires intervenant dans le
processus de l’ostéoinduction. D’autre part, des analyses par immunohistochimie ou
hybridation in situ pourraient aussi être réalisées. L’inclusion classique en méthyl-
méthacrylate effectuées dans ce travail n’étant pas adaptée pour ces études, les analyses
devraient être effectuées sur des coupes non-déminéralisées préparées avec des techniques
d’inclusion particulières qui permettent ces études (Bareille et al. 2000, Knabe et al. 2008). Ce
travail pourrait apporter des informations complémentaires sur les évènements mis en jeu lors
du phénomène d’ostéoinduction en permettant notamment la détection de marqueurs de
l’ostéogenèse produits par les cellules au contact du matériau (ALP, collagène de type I,
ostéocalcine, ostéopontine, bone sialoprotéine, BMPs…). L’expression de différents facteurs
de transcription exprimés au cours de la différenciation ostéoblastique (runx-2, osterix, msx-2,
dlx-3,dlx-5) pourrait aussi être évaluée et les réponses obtenues pourraient apporter des
informations sur les voies de signalisation activées lors de l’ostéoinduction.
Afin de faciliter les études chez l’animal (disponibilité des anti-corps et des sondes…) et
diminuer leur coût, le passage vers un modèle murin peut être envisagé. Toutefois, en raison
de la faible réactivité de ces animaux vis-à-vis des matériaux, des études préliminaires
devraient être réalisées afin de déterminer si nos matériaux revêtus sont capables d’induire la
formation d’os en site ectopique dans le modèle choisi. En outre, les résultats concernant la
cicatrisation des fractures et l’ostéointégration des matériaux de comblement étant différents
entre les rongeurs et les modèles de grands animaux, il n’est pas évident que les mécanismes
d’action des phénomènes d’ostéoinduction soient totalement transposables. Il conviendrait
donc de conforter les résultats préliminaires obtenus chez les souris par des études chez des
grands animaux.

152
De plus en plus d’auteurs estiment que la réaction inflammatoire associée à l’implantation des
matériaux pourrait servir de déclencheur au phénomène d’ostéoinduction (De Bruijn et al.
2008). Nous pourrions donc étudier l’influence de cette réaction sur le potentiel
ostéoinducteur de nos échantillons revêtus. Des expériences comparatives de la quantité d’os
néoformé après implantation intramusculaire des échantillons en présence ou absence de
molécules anti-inflammatoires pourraient être effectuées dans ce but. Des anti-inflammatoires
pourraient être administré de manière générale (injection chez l’animal ou prise orale) ou
locale par dépôt sur les céramiques comme nous l’avons fait pour la BMP-2. Cette deuxième
méthode présenterait l’avantage d’étudier chez un même animal l’influence d’anti-
inflammatoires sur la réponse obtenue. Cette étude in vivo permettrait d’évaluer l’effet des
anti-inflammatoires sur la réponse inflammatoire et ses conséquences sur l’ostéoinduction. Il
faudrait également la corréler au potentiel propre des molécules sur la différenciation
ostéoblastique. En effet, plusieurs études in vitro sur des ostéoblastes ont montré que certains
anti-inflammatoires non-stéroïdiens (indomethacine, parecoxib,…) induisaient directement
une inhibition de la différenciation ostéoblastique et dans ce cas, l’interprétation des résultats
obtenus pourrait être compromise (Kellinsalmi et al. 2007).
La comparaison de l’ostéoinduction chez des souris sauvages et des souris dépourvues de
système immunitaire ou de macrophages pourrait, d’autre part, donner lieu à des résultats
intéressants. Quelques études ont en effet montré que des macrophages cultivés sur des
matériaux rugueux produisait la prostaglandine E2, molécule capable d’induire la migration et
la différenciation ostéoblastique de cellules souches mésenchymateuses humaines (De Bruijn
et al. 2008). L’implication de la production de cette protéine dans les phénomènes
d’ostéoinduction pourrait être évaluée, par immunohistochimie au cours des différentes étapes
de la formation osseuse ectopique.

3.2. Etudes in vitro

En parallèle de ces différentes expérimentations animales proposées, des études en culture


cellulaire plus poussées permettraient aussi de recueillir des données sur la capacité de nos
matériaux à induire la différenciation ostéoblastique et sur les mécanismes mis en jeu.
Comme nous l’avons déjà mentionné, la première partie de ce travail consisterait, par le suivi
des marqueurs par RT-PCR, à évaluer la différenciation ostéoblastique de cellules souches
mésenchymateuses humaines et murines cultivées sur les matériaux témoins et revêtus. Nous

153
pourrons ensuite entreprendre une étude plus précise des voies de signalisation ou au moins
de différents facteurs de transcription nécessaires à cette différenciation (runx2, msx-2,
osterix, dlx-3 et -5). Il serait, par exemple, intéressant d’évaluer l’effet de runx2 sur la
différenciation ostéoblastique liée aux matériaux. En effet, dans la majorité des études, ce
facteur de transcription, ne semble pas être surexprimé en réponse aux matériaux alors que ce
facteur est primordial pour la différenciation ostéoblastique induite par les BMPs.
Lin et al. ont montré d’autre part que la différenciation ostéoblastique de C3H10T1/2 induite
par les matériaux serait liée à la production et la sécrétion de facteurs différenciants par les
cellules au contact de l’échantillon. Dans cette étude, ils n’ont cependant pas déterminé les
facteurs susceptibles d’être responsables de cet effet paracrine (Lin et al. 2008). Ces résultats
mériteraient d’être confirmés et approfondis. La sécrétion de protéines, telles que les BMPs,
la PGE2, le TGFβ,…, favorisant la différenciation ostéoblastique dans le milieu de culture
pourrait être détectée par test ELISA et des antagonistes de leurs récepteurs pourraient être
utilisés. Dans un même registre, l’étude de l’interaction de macrophages avec les matériaux et
de la sécrétion de ces protéines dans le milieu complèterait ce travail.

Enfin, le procédé de revêtement utilisé dans ce travail présente l’avantage de permettre la


réalisation de dépôts ayant des caractéristiques variées. Pour compléter ces études biologiques
à caractère fondamental, il serait intéressant également de travailler sur la nature du
revêtement pour déterminer le rôle de ses caractéristiques physico-chimiques sur l'activité
biologique. Bien des hypothèses ont été émises concernant cette relation mais il est
particulièrement difficile d’observer de manière distincte l’influence des différents paramètres
sur le comportement cellulaire. Concernant l’influence des modifications du milieu par les
matériaux, une étude du comportement cellulaire en présence de milieu préalablement incubé
avec les nanocristaux pourrait être effectuée. Les réponses obtenues devraient alors être
comparées aux caractéristiques physico-chimiques du milieu après immersion des
échantillons (pH, concentrations ionique et protéique).

Dans une approche plus orientée "science des matériaux", nous pourrions aussi étudier le rôle
des caractéristiques physiques et/ou chimiques du dépôt, comme par exemple, la taille des
nanocristaux, leur état d'agglomération, le développement de la couche hydratée, sa
composition chimique, mais également l'évolution de ces caractéristiques in vivo puisqu’un
des aspects essentiels de ces systèmes est leur évolutivité. Cette tâche nécessiterait la mise en

154
œuvre de méthodes physico-chimiques particulières adaptées à l'étude de ces couches très
fines.

Il est indéniable que l'ensemble de ces projets nécessite la collaboration d'équipes


interdisciplinaires de compétences diverses mais aussi et surtout, au delà de visions
parcellaires du problème, une vision d'ensemble, seule apte à reconstituer un scénario complet
et crédible de ces phénomènes.

155
Liste des publications et communications
issues de ce projet

Publication
Autefage H, Briand-Mesange F, Cazalbou S, Drouet C, Fourmy D, Gonçalvès S, Salles
JP, Combes C, Swider P, Rey C
Adsorption and Release of BMP-2 on Nanocrystalline Apatite-Coated and Uncoated
Hydroxyapatite/β-Tricalcium Phosphate Porous Ceramics
Journal of Biomedical Materials Research : Part B - Applied Biomaterials, 2009 July 6.

Brevet
Autefage H, Cazalbou S, Combes C, Rey C
Activation de surface de biomatériaux poreux par dépôt d'apatites nanocristallines.
Brevet français déposé et extensions en cours.

Proceedings

Autefage H, Briand-Mésange F, Gomez Brouchet A, Palierne S, Briot J, Gonçalvès S,


Cazalbou S, Combes C, Mathon D, Autefage A, Rey C, Swider P
Nanocrystalline Apatite-Coated Biphasic Calcium Phosphate Ceramics for the Delivery of
rhBMP. Adsorption and Release, in vitro and in vivo Behaviour.
Ceramics, Cells and Tissues, 12th Seminar and meeting proceedings book “surface-reactive
biomaterials as scaffolds and coatings : interactions with cells and tissues”, 2009, Faenza,
Italie.

Errassifi F, Menbaoui A, Autefage H, Santran V, Sarda S, Lebugle A, Combes C,


Barroug A, Sfihi H, Rey C
Adsorption on apatitic calcium phosphates: applications to drug delivery.
8th pacific rim conference on ceramic and glass technology proceedings book, 2009,
Vancouver, Canada.

Autefage H, Briand-Mésange F, Combes C, Cazalbou S, Drouet C, Gonçalvès S, Salles


JP, Swider P, Rey C
Nanocrystalline Apatite-Coated Biphasic Calcium Phosphate Ceramics for the Adsorption
and Release of rhBMP-2 Growth Factor
Third International Workshop on Advanced Ceramics (IWAC03) proceedings book, 2008,
Limoges, France.

Pelletier I, Autefage H, Drouet C, Cazalbou S, Combes C, Rey C


Activation de surface de biomatériaux poreux tridimensionnels à partir de phosphates de
calcium biomimétiques
Matériaux, livre de proceedings, 2006, Dijon, France.

156
Communications orales

Autefage H, Briand-Mésange F, Gomez Brouchet A, Palierne S, Briot J, Gonçalvès S,


Cazalbou S, Combes C, Mathon D, Autefage A, Rey C, Swider P
Nanocrystalline Apatite-Coated Biphasic Calcium Phosphate Ceramics for the Delivery of
rhBMP. Adsorption and Release, in vitro and in vivo Behaviour.
Ceramics, Cells and Tissues, 12th Seminar and meeting, 19-22 Mai 2009, Faenza, Italie
Présentation orale récompensée par le premier prix pour les jeunes chercheurs (7th CCT
Prize)

Autefage H, Briand-Mésange F, Combes C, Cazalbou S, Drouet C, Gonçalvès S, Salles


JP, Swider P, Rey C
Nanocrystalline Apatite-Coated Biphasic Calcium Phosphate Ceramics for the Adsorption
and Release of rhBMP-2 Growth Factor
Third International Workshop on Advanced Ceramics (IWAC03), 6-8 Novembre 2008,
Limoges, France.

Posters:

Bonnevialle N, Autefage H, Briot J, Rey C, Swider P


Hydraulic permeability of coated macro-porous biphasic phosphate scaffold
Orthopaedic Research Society - 55th Annual Meeting, 22-25 Février 2009, Las Vegas, USA.

Autefage H, Briand-Mesange F, Combes C, Cazalbou S, Drouet C, Fourmy D,


Gonçalvès S, Salles JP, Swider P, Rey C
Improvement of rhBMP-2 Adsorption on Calcium Phosphate Ceramics Coated with
Nanocrystalline Apatite
8th World Biomaterials Congress 2008, 28 Mai - 1 Juin 2008, Amsterdam, Pays-Bas.

Pelletier I, Autefage H, Drouet C, Cazalbou S, Combes C, Rey C


Activation de surface de biomatériaux poreux tridimensionnels à partir de phosphates de
calcium biomimétiques
Matériaux 2006, 13-17 Novembre 2006, Dijon, France.

157
Références
Abbatiello S. E. and Porter T. J. (1997). Anion-mediated precipitation of recombinant human
bone morphogenetic protein (rhBMP-2) is dependent upon the heparin binding N-terminal region.
Protein science 6 suppl 2

Abe E., Yamamoto M., Taguchi Y., Lecka-Czernik B., O'Brien C. A., Economides A. N., Stahl
N., Jilka R. L. and Manolagas S. C. (2000). Essential requirement of BMPs-2/4 for both
osteoblast and osteoclast formation in murine bone marrow cultures from adult mice: antagonism
by noggin. J Bone Miner Res 15 (4):663-73

Alam M. I., Asahina I., Ohmamiuda K., Takahashi K., Yokota S. and Enomoto S. (2001).
Evaluation of ceramics composed of different hydroxyapatite to tricalcium phosphate ratios as
carriers for rhBMP-2. Biomaterials 22 (12):1643-51

Arinzeh T. L., Tran T., McAlary J. and Daculsi G. (2005). A comparative study of biphasic
calcium phosphate ceramics for human mesenchymal stem-cell-induced bone formation.
Biomaterials 26 (17):3631-8

Asahina I., Sampath T. K., Nishimura I. and Hauschka P. V. (1993). Human osteogenic protein-1
induces both chondroblastic and osteoblastic differentiation of osteoprogenitor cells derived from
newborn rat calvaria. J Cell Biol 123 (4):921-33

Bareille R., Lafage-Proust M. H., Faucheux C., Laroche N., Wenz R., Dard M. and Amedee J.
(2000). Various evaluation techniques of newly formed bone in porous hydroxyapatite loaded
with human bone marrow cells implanted in an extra-osseous site. Biomaterials 21 (13):1345-52

Barrere F., Layrolle P., van Blitterswijk C. A. and de Groot K. (1999). Biomimetic calcium
phosphate coatings on Ti6AI4V: a crystal growth study of octacalcium phosphate and inhibition
by Mg2+ and HCO3. Bone 25 (2 Suppl):107S-111S

Barroug A., Fastrez J., Lemaitre J. and Rouxhet P. (1997). Adsorption of Succinylated Lysozyme
on Hydroxyapatite. Journal of colloid and interface science 189 37-42

Barroug A., Lernoux E., Lemaitre J. and Rouxhet P. G. (1998). Adsorption of Catalase on
Hydroxyapatite. J Colloid Interface Sci 208 (1):147-152

Biggs M. J., Richards R. G., Gadegaard N., McMurray R. J., Affrossman S., Wilkinson C. D.,
Oreffo R. O. and Dalby M. J. (2008). Interactions with nanoscale topography: Adhesion
quantification and signal transduction in cells of osteogenic and multipotent lineage. J Biomed
Mater Res A

Boix T., Gomez-Morales J., Torrent-Burgues J., Monfort A., Puigdomenech P. and Rodriguez-
Clemente R. (2005). Adsorption of recombinant human bone morphogenetic protein rhBMP-2m
onto hydroxyapatite. J Inorg Biochem 99 (5):1043-50

Bonnevialle N., Autefage H., Briot J., Rey C. and Swider P. (2009). Hydraulic permeability of
coated macro-porous biphasic phosphate scaffold. Proceeding of the Orthopaedic Research
Society - 55th Annual Meeting, Las Vegas, USA

158
Boyan B. D., Bonewald L. F., Paschalis E. P., Lohmann C. H., Rosser J., Cochran D. L., Dean D.
D., Schwartz Z. and Boskey A. L. (2002). Osteoblast-mediated mineral deposition in culture is
dependent on surface microtopography. Calcif Tissue Int 71 (6):519-29

Boyan B. D., Lohmann C. H., Somers A., Niederauer G. G., Wozney J. M., Dean D. D., Carnes
D. L., Jr. and Schwartz Z. (1999). Potential of porous poly-D,L-lactide-co-glycolide particles as a
carrier for recombinant human bone morphogenetic protein-2 during osteoinduction in vivo. J
Biomed Mater Res 46 (1):51-9

Cao X. and Chen D. (2005). The BMP signaling and in vivo bone formation. Gene 357 (1):1-8

Capuccini C., Torricelli P., Sima F., Boanini E., Ristoscu C., Bracci B., Socol G., Fini M.,
Mihailescu I. N. and Bigi A. (2008). Strontium-substituted hydroxyapatite coatings synthesized
by pulsed-laser deposition: in vitro osteoblast and osteoclast response. Acta Biomater 4 (6):1885-
93

Cazalbou S. (2000). Echanges cationiques impliquant des apatites nanocristallines analogues au


minéral osseux. Thèse CIRIMAT, Institut National Polytechnique de Toulouse, Toulouse

Cazalbou S., Combes C., Eichert D., Rey C. and Glimcher M. J. (2004). Poorly crystalline
apatites: evolution and maturation in vitro and in vivo. J Bone Miner Metab 22 (4):310-7

Cazalbou S., Eichert D., Ranz X., Drouet C., Combes C., Harmand M. F. and Rey C. (2005). Ion
exchanges in apatites for biomedical application. J Mater Sci Mater Med 16 (5):405-9

Chang Y. L., Stanford C. M. and Keller J. C. (2000). Calcium and phosphate supplementation
promotes bone cell mineralization: implications for hydroxyapatite (HA)-enhanced bone
formation. J Biomed Mater Res 52 (2):270-8

Charlot G. (1974). Chimie analytique quantitative. Masson, 2: 366-478

Cho G., Wu Y. and Ackerman J. L. (2003). Detection of hydroxyl ions in bone mineral by solid-
state NMR spectroscopy. Science 300 (5622):1123-7

Chou Y. F., Huang W., Dunn J. C., Miller T. A. and Wu B. M. (2005). The effect of biomimetic
apatite structure on osteoblast viability, proliferation, and gene expression. Biomaterials 26
(3):285-95

Combes C. and Rey C. (2003). Biomimétisme et biocéramiques. Materiaux et biologie

Cunningham N. S., Paralkar V. and Reddi A. H. (1992). Osteogenin and recombinant bone
morphogenetic protein 2B are chemotactic for human monocytes and stimulate transforming
growth factor beta 1 mRNA expression. Proc Natl Acad Sci U S A 89 (24):11740-4

Dawson J. I. and Oreffo R. O. (2008). Bridging the regeneration gap: stem cells, biomaterials and
clinical translation in bone tissue engineering. Arch Biochem Biophys 473 (2):124-31

De Bruijn J. D., Shankar K., Yuan H. and Habibovic P. (2008). Osteoinduction and its evaluation.
Bioceramics and their clinical applications, Kokubo T., Woodhead publishing in materials: 199-
219

159
Deckers M. M., van Bezooijen R. L., van der Horst G., Hoogendam J., van Der Bent C.,
Papapoulos S. E. and Lowik C. W. (2002). Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis
through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor A. Endocrinology 143 (4):1545-53

Dellinger J. G., Wojtowicz A. M. and Jamison R. D. (2006). Effects of degradation and porosity
on the load bearing properties of model hydroxyapatite bone scaffolds. J Biomed Mater Res A 77
(3):563-71

Dong X., Wang Q., Wu T. and Pan H. (2007). Understanding adsorption-desorption dynamics of
BMP-2 on hydroxyapatite (001) surface. Biophys J 93 (3):750-9

dos Santos E. A., Farina M., Soares G. A. and Anselme K. (2008). Surface energy of
hydroxyapatite and beta-tricalcium phosphate ceramics driving serum protein adsorption and
osteoblast adhesion. J Mater Sci Mater Med 19 (6):2307-16

dos Santos E. A., Farina M., Soares G. A. and Anselme K. (2009). Chemical and topographical
influence of hydroxyapatite and beta-tricalcium phosphate surfaces on human osteoblastic cell
behavior. J Biomed Mater Res A 89 (2):510-20

Duan Y. R., Zhang Z. R., Wang C. Y., Chen J. Y. and Zhang X. D. (2004). Dynamic study of
calcium phosphate formation on porous HA/TCP ceramics. J Mater Sci Mater Med 15 (11):1205-
11

Eichert D., Sfihi, H., Banu, M., Cazalbou, S., Combes, C., Rey, C. (2002). Surface structure of
nanocristalline apatites for bioceramics and coating. Proceeding of CIMTEC, Materials in clinical
applications, Faenza, Italie

Eidelman N., Chow L. C. and Brown W. E. (1987). Calcium phosphate saturation levels in
ultrafiltered serum. Calcif Tissue Int 40 (2):71-8

Errassifi F., Menbaoui A., Autefage H., Santran V., Sarda S., Lebugle A., Combes C., Barroug A.,
Sfihi H. and Rey C. (2009). Adsorption on apatitic calcium phosphates: applications to drug
delivery. Proceeding of the 8th pacific rim conference on ceramic and glass technology,
Vancouver, Canada

Fiedler J., Roderer G., Gunther K. P. and Brenner R. E. (2002). BMP-2, BMP-4, and PDGF-bb
stimulate chemotactic migration of primary human mesenchymal progenitor cells. J Cell Biochem
87 (3):305-12

Frolik C. A., Wakefield L. M., Smith D. M. and Sporn M. B. (1984). Characterization of a


membrane receptor for transforming growth factor-beta in normal rat kidney fibroblasts. J Biol
Chem 259 (17):10995-1000

Fujibayashi S., Neo M., Kim H. M., Kokubo T. and Nakamura T. (2004). Osteoinduction of
porous bioactive titanium metal. Biomaterials 25 (3):443-50

Garcia A. J., Vega M. D. and Boettiger D. (1999). Modulation of cell proliferation and
differentiation through substrate-dependent changes in fibronectin conformation. Mol Biol Cell 10
(3):785-98

160
Gautier H., Guicheux J., Grimandi G., Faivre-Chauvet A., Daculsi G. and Merle C. (1998). In
vitro influence of apatite-granule-specific area on human growth hormone loading and release. J
Biomed Mater Res 40 (4):606-13

Gautschi O. P., Cadosch D., Zellweger R., Joesbury K. A. and Filgueira L. (2009). Apoptosis
induction and reduced proliferation in human osteoblasts by rhBMP-2, -4 and -7. J Musculoskelet
Neuronal Interact 9 (1):53-60

Ge Z., Jin Z. and Cao T. (2008). Manufacture of degradable polymeric scaffolds for bone
regeneration. Biomed Mater 3 (2):22001

Ginebra M. P., Traykova T. and Planell J. A. (2006). Calcium phosphate cements: competitive
drug carriers for the musculoskeletal system? Biomaterials 27 (10):2171-7

Goldberg V. M., Stevenson S., Feighan J. and Davy D. (1995). Biology of grit-blasted titanium
alloy implants. Clin Orthop Relat Res (319):122-9

Goobes R., Goobes G., Campbell C. T. and Stayton P. S. (2006). Thermodynamics of statherin
adsorption onto hydroxyapatite. Biochemistry 45 (17):5576-86

Grandjean-Laquerriere A., Laquerriere P., Guenounou M., Laurent-Maquin D. and Phillips T. M.


(2005). Importance of the surface area ratio on cytokines production by human monocytes in vitro
induced by various hydroxyapatite particles. Biomaterials 26 (15):2361-9

Grellier M., Granja P. L., Fricain J. C., Bidarra S. J., Renard M., Bareille R., Bourget C., Amedee
J. and Barbosa M. A. (2009). The effect of the co-immobilization of human osteoprogenitors and
endothelial cells within alginate microspheres on mineralization in a bone defect. Biomaterials 30
(19):3271-8

Habibovic P. and de Groot K. (2007). Osteoinductive biomaterials--properties and relevance in


bone repair. J Tissue Eng Regen Med 1 (1):25-32

Habibovic P., Kruyt M. C., Juhl M. V., Clyens S., Martinetti R., Dolcini L., Theilgaard N. and
van Blitterswijk C. A. (2008). Comparative in vivo study of six hydroxyapatite-based bone graft
substitutes. J Orthop Res 26 (10):1363-70

Habibovic P., Sees T. M., van den Doel M. A., van Blitterswijk C. A. and de Groot K. (2006a).
Osteoinduction by biomaterials--physicochemical and structural influences. J Biomed Mater Res
A 77 (4):747-62

Habibovic P., Woodfield T., de Groot K. and van Blitterswijk C. (2006b). Predictive value of in
vitro and in vivo assays in bone and cartilage repair--what do they really tell us about the clinical
performance? Adv Exp Med Biol 585 327-60

Habibovic P., Yuan H., van der Valk C. M., Meijer G., van Blitterswijk C. A. and de Groot K.
(2005). 3D microenvironment as essential element for osteoinduction by biomaterials.
Biomaterials 26 (17):3565-75

Hartmann S., Hardy-Dessources, A., Baba, M., Hüsing, N., Nedelec, J.M. (2008). Multiscale
characterization of porous ceramics using a calorimetric approach. Proceeding of the Third
International Workshop on Advanced Ceramics (IWAC03), Limoges, France.

161
Hench L. L., Splinter R. J., Allen W. C. and Greenlee T. K. (1972). Bonding mechanisms at the
interface of ceramic prosthetic materials. J Biomed Mater Res 2 177-141

Hughes Wassel D. T., Hall R. C. and Embery G. (1995). Adsorption of bovine serum albumin
onto hydroxyapatite. Biomaterials 16 697-702

Jarcho M. (1981). Calcium phosphate ceramics as hard tissue prosthetics. Clin Orthop Relat Res
(157):259-78

Johnson K. D., Frierson K. E., Keller T. S., Cook C., Scheinberg R., Zerwekh J., Meyers L. and
Sciadini M. F. (1996). Porous ceramics as bone graft substitutes in long bone defects: a
biomechanical, histological, and radiographic analysis. J Orthop Res 14 (3):351-69

Kandori K., A. M. and T. I. (2005). Study on Adsorption Mechanism of Proteins Onto Synthetic
Calcium Hydroxyapatites Through Ionic Concentration Measurements. Calcified Tissue
International 76 194-206

Kellinsalmi M., Parikka V., Risteli J., Hentunen T., Leskela H. V., Lehtonen S., Selander K.,
Vaananen K. and Lehenkari P. (2007). Inhibition of cyclooxygenase-2 down-regulates osteoclast
and osteoblast differentiation and favours adipocyte formation in vitro. Eur J Pharmacol 572 (2-
3):102-10

Kempen D. H., Kruyt M. C., Lu L., Wilson C. E., Florschutz A. V., Creemers L. B., Yaszemski
M. J. and Dhert W. J. (2009). Effect of autologous bone marrow stromal cell seeding and bone
morphogenetic protein-2 delivery on ectopic bone formation in a microsphere/poly(propylene
fumarate) composite. Tissue Eng Part A 15 (3):587-94

Kessler S., Koepp H. E., Mayr-Wohlfart U., Ignatius A., Claes L., Puhl W. and Gunther K. P.
(2004). Bone morphogenetic protein 2 accelerates osteointegration and remodelling of solvent-
dehydrated bone substitutes. Arch Orthop Trauma Surg 124 (6):410-4

Kim H. M., Kim Y., Park S. J., Rey C., Lee H. M., Glimcher M. J. and Ko J. S. (2000). Thin film
of low-crystalline calcium phosphate apatite formed at low temperature. Biomaterials 21
(11):1129-34

Kim H. M., Kim Y. S., Woo K. M., Park S. J., Rey C., Kim Y., Kim J. K. and Ko J. S. (2001).
Dissolution of poorly crystalline apatite crystals by osteoclasts determined on artificial thin-film
apatite. J Biomed Mater Res 56 (2):250-6

Kirker-Head C. A., Gerhart T. N., Armstrong R., Schelling S. H. and Carmel L. A. (1998).
Healing bone using recombinant human bone morphogenetic protein 2 and copolymer. Clin
Orthop Relat Res (349):205-17

Klenke F. M., Liu Y., Yuan H., Hunziker E. B., Siebenrock K. A. and Hofstetter W. (2008).
Impact of pore size on the vascularization and osseointegration of ceramic bone substitutes in
vivo. J Biomed Mater Res A 85 (3):777-86

Knabe C., Koch C., Rack A. and Stiller M. (2008). Effect of beta-tricalcium phosphate particles
with varying porosity on osteogenesis after sinus floor augmentation in humans. Biomaterials 29
(14):2249-58

162
Kokubo T. (1991). Bioactive glass ceramics: properties and applications. Biomaterials 12 (2):155-
63

Kokubo T. (2008). Bioceramics and their clinical applications. Woodhead Publishing:

Kuhn L. T., Grynpas M. D., Rey C. C., Wu Y., Ackerman J. L. and Glimcher M. J. (2008). A
comparison of the physical and chemical differences between cancellous and cortical bovine bone
mineral at two ages. Calcif Tissue Int 83 (2):146-54

Lai C. F. and Cheng S. L. (2005). Alphavbeta integrins play an essential role in BMP-2 induction
of osteoblast differentiation. J Bone Miner Res 20 (2):330-40

Lamoureux F., Baud'huin M., Duplomb L., Heymann D. and Redini F. (2007). Proteoglycans: key
partners in bone cell biology. Bioessays 29 (8):758-71

Layrolle P., De Groot K., De Bruijn J. D., Van Blitterswijk C. A. and Yuan H. (2004). Method for
coating medical implants. 6733503, United States,09/757344

Nihouannen D., Duval L., Lecomte A., Julien M., Guicheux J., Daculsi G., Layrolle P. (2007).
Interactions of total bone marrow cells with increasing quantities of macroporous calcium
phosphate ceramic granules. J Mater Sci Mater Med 18(10):1983-90

Le Nihouannen D., Daculsi G., Saffarzadeh A., Gauthier O., Delplace S., Pilet P. and Layrolle P.
(2005). Ectopic bone formation by microporous calcium phosphate ceramic particles in sheep
muscles. Bone 36 (6):1086-93

Lee D. H., Park B. J., Lee M. S., Lee J. W., Kim J. K., Yang H. C. and Park J. C. (2006).
Chemotactic migration of human mesenchymal stem cells and MC3T3-E1 osteoblast-like cells
induced by COS-7 cell line expressing rhBMP-7. Tissue Eng 12 (6):1577-86

Leeuwenburgh S. C. G., Wolke J. G. C., Jansen J. A. and De Groot K. (2008). Calcium phosphate
coatings. Bioceramics and their clinical applications, Kokubo T., Woodhead Publishing in
Materials: 464-484

LeGeros R. Z. (2002). Properties of osteoconductive biomaterials: calcium phosphates. Clin


Orthop Relat Res (395):81-98

Legros R., Balmain N. and Bonel G. (1986). Structure and composition of the mineral phase of
periosteal bone. J. Chem. Res.

Lim J. Y., Dreiss A. D., Zhou Z., Hansen J. C., Siedlecki C. A., Hengstebeck R. W., Cheng J.,
Winograd N. and Donahue H. J. (2007). The regulation of integrin-mediated osteoblast focal
adhesion and focal adhesion kinase expression by nanoscale topography. Biomaterials 28
(10):1787-97

Lin L., Chow K. L. and Leng Y. (2008). Study of hydroxyapatite osteoinductivity with an
osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A

Liu X., Lim J. Y., Donahue H. J., Dhurjati R., Mastro A. M. and Vogler E. A. (2007a). Influence
of substratum surface chemistry/energy and topography on the human fetal osteoblastic cell line
hFOB 1.19: Phenotypic and genotypic responses observed in vitro. Biomaterials 28 (31):4535-50

163
Liu Y., Enggist L., Kuffer A. F., Buser D. and Hunziker E. B. (2007b). The influence of BMP-2
and its mode of delivery on the osteoconductivity of implant surfaces during the early phase of
osseointegration. Biomaterials 28 (16):2677-86

Liu Y., de Groot K. and Hunziker E. B. (2005). BMP-2 liberated from biomimetic implant
coatings induces and sustains direct ossification in an ectopic rat model. Bone 36 (5):745-57

Liu Y., Hunziker, E.B., Van de Vall, C., de Groot, K. (2004). biomimetic coatings vs collagen
sponges as a carrier for BMP-2: a comparison of the osteogenic responses triggered in vivo using
an ectopic rat model Bioceramics 16 Key engineering Materials

Loong C. K., Rey C., Kuhn L. T., Combes C., Wu Y., Chen S. and Glimcher M. J. (2000).
Evidence of hydroxyl-ion deficiency in bone apatites: an inelastic neutron-scattering study. Bone
26 (6):599-602

Lou J., Tu Y., Li S. and Manske P. R. (2000). Involvement of ERK in BMP-2 induced
osteoblastic differentiation of mesenchymal progenitor cell line C3H10T1/2. Biochem Biophys
Res Commun 268 (3):757-62

Luu H. H., Song W. X., Luo X., Manning D., Luo J., Deng Z. L., Sharff K. A., Montag A. G.,
Haydon R. C. and He T. C. (2007). Distinct roles of bone morphogenetic proteins in osteogenic
differentiation of mesenchymal stem cells. J Orthop Res 25 (5):665-77

Matsumoto T., Okazaki M., Inoue M., Yamaguchi S., Kusunose T., Toyonaga T., Hamada Y. and
Takahashi J. (2004). Hydroxyapatite particles as a controlled release carrier of protein.
Biomaterials 25 (17):3807-12

Matsuo K. and Irie N. (2008). Osteoclast-osteoblast communication. Arch Biochem Biophys 473
(2):201-9

Meinig R. P. (2002). Polylactide membranes in the treatment of segmental diaphyseal defects:


animal model experiments in the rabbit radius, sheep tibia, Yucatan minipig radius, and goat tibia.
Injury 33 Suppl 2 B58-65

Midy V., Dard M. and Hollande E. (2001). Evaluation of the effect of three calcium phosphate
powders on osteoblast cells. J Mater Sci Mater Med 12 (3):259-65

Midy V., Rey C., Bres E. and Dard M. (1998). Basic fibroblast growth factor adsorption and
release properties of calcium phosphate. J Biomed Mater Res 41 (3):405-11

Miyamoto S., Takaoka K. and Ono K. (1993). Bone induction in monkeys by bone morphogenetic
protein. A trans-filter technique. J Bone Joint Surg Br 75 (1):107-10

Monchau F., Lefevre A., Descamps M., Belquin-myrdycz A., Laffargue P. and Hildebrand H. F.
(2002). In vitro studies of human and rat osteoclast activity on hydroxyapatite, beta-tricalcium
phosphate, calcium carbonate. Biomol Eng 19 (2-6):143-52

Moroni A., Cadossi M., Romagnoli M., Faldini C. and Giannini S. (2008). A biomechanical and
histological analysis of standard versus hydroxyapatite-coated pins for external fixation. J Biomed
Mater Res B Appl Biomater 86B (2):417-21

164
Muller P., Bulnheim U., Diener A., Luthen F., Teller M., Klinkenberg E. D., Neumann H. G.,
Nebe B., Liebold A., Steinhoff G. and Rychly J. (2008). Calcium phosphate surfaces promote
osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J Cell Mol Med 12 (1):281-91

Murphy M. G., Mailhot J., Borke J., Wataha J., Sharawy M. and Smith A. (2001). The effects of
rhBMP-2 on human osteosarcoma cells and human gingival fibroblasts in vitro. J Oral Implantol
27 (1):16-24

Murphy W. L., Hsiong S., Richardson T. P., Simmons C. A. and Mooney D. J. (2005). Effects of
a bone-like mineral film on phenotype of adult human mesenchymal stem cells in vitro.
Biomaterials 26 (3):303-10

Nakamura T., Takemoto, M. (2008). Osteoconduction and its evaluation. Bioceramics and their
clinical applications, Kokubo T., Woodhead publishing in materials

Navarro M., Engel E., Planell J. A., Amaral I., Barbosa M. and Ginebra M. P. (2008). Surface
characterization and cell response of a PLA/CaP glass biodegradable composite material. J
Biomed Mater Res A 85 (2):477-86

Nguyen H., Morgan D. A. and Forwood M. R. (2007). Sterilization of allograft bone: effects of
gamma irradiation on allograft biology and biomechanics. Cell Tissue Bank 8 (2):93-105

Niyibizi C. and Eyre D. R. (1994). Structural characteristics of cross-linking sites in type V


collagen of bone. Chain specificities and heterotypic links to type I collagen. Eur J Biochem 224
(3):943-50

Ohta K., Monma H. and Takahashi S. (2001). Adsorption characteristics of proteins on calcium
phosphates using liquid chromatography. J Biomed Mater Res 55 (3):409-14

Ohta K., Monma H., Tanaka J. and Eda H. (2002). Interaction between hydroxyapatite and
proteins by liquid chromatography using simulated body fluids as eluents. J Mater Sci Mater Med
13 (7):633-7

Okamoto M., Murai J., Yoshikawa H. and Tsumaki N. (2006). Bone morphogenetic proteins in
bone stimulate osteoclasts and osteoblasts during bone development. J Bone Miner Res 21
(7):1022-33

Okubo Y., Bessho K., Fujimura K., Konishi Y., Kusumoto K., Ogawa Y. and Iizuka T. (2000).
Osteoinduction by recombinant human bone morphogenetic protein-2 at intramuscular,
intermuscular, subcutaneous and intrafatty sites. Int J Oral Maxillofac Surg 29 (1):62-6

Okuda T., Ioku K., Yonezawa I., Minagi H., Gonda Y., Kawachi G., Kamitakahara M., Shibata
Y., Murayama H., Kurosawa H. and Ikeda T. (2008). The slow resorption with replacement by
bone of a hydrothermally synthesized pure calcium-deficient hydroxyapatite. Biomaterials 29
(18):2719-28

Oreffo R. O. and Triffitt J. T. (1999). In vitro and in vivo methods to determine the interactions of
osteogenic cells with biomaterials. J Mater Sci Mater Med 10 (10/11):607-11

Osyczka A. M., Diefenderfer D. L., Bhargave G. and Leboy P. S. (2004). Different effects of
BMP-2 on marrow stromal cells from human and rat bone. Cells Tissues Organs 176 (1-3):109-19

165
Ouizat S., Barroug A., Legrouri A. and Rey C. (1999). Adsorption of bovine serum albumin on
poorly crystalline apatite : influence of maturation. Materials Research Bulletin 34 (14/15):2279-
2289

Ozeki N., Jethanandani P., Nakamura H., Ziober B. L. and Kramer R. H. (2007). Modulation of
satellite cell adhesion and motility following BMP2-induced differentiation to osteoblast lineage.
Biochem Biophys Res Commun 353 (1):54-9

Park J. W., Suh J. Y. and Chung H. J. (2008). Effects of calcium ion incorporation on osteoblast
gene expression in MC3T3-E1 cells cultured on microstructured titanium surfaces. J Biomed
Mater Res A 86 (1):117-26

Pellenc D., Giraudier S., Champion E., Anselme K., Larreta-Garde V. and Gallet O. (2006).
Removal of surface by-products from sintered hydroxyapatite: effect of a chelation treatment on
fibronectin adsorption and cell adhesion. J Biomed Mater Res B Appl Biomater 76 (1):136-42

Rawadi G., Vayssiere B., Dunn F., Baron R. and Roman-Roman S. (2003). BMP-2 controls
alkaline phosphatase expression and osteoblast mineralization by a Wnt autocrine loop. J Bone
Miner Res 18 (10):1842-53

Redey S. A., Nardin M., Bernache-Assolant D., Rey C., Delannoy P., Sedel L. and Marie P. J.
(2000). Behavior of human osteoblastic cells on stoichiometric hydroxyapatite and type A
carbonate apatite: role of surface energy. J Biomed Mater Res 50 (3):353-64

Redey S. A., Razzouk S., Rey C., Bernache-Assollant D., Leroy G., Nardin M. and Cournot G.
(1999). Osteoclast adhesion and activity on synthetic hydroxyapatite, carbonated hydroxyapatite,
and natural calcium carbonate: relationship to surface energies. J Biomed Mater Res 45 (2):140-7

Rey C., Combes C., Drouet C. and Somrani S. (2008). Tricalcium phosphate-based ceramics.
Bioceramics and their clinical applications, Kokubo T., Woodhead publishing in materials: 326-
366

Rey C., Combes, C., Drouet, C., Sfihi, H., Barroug, A. (2007). Physico-chemical properties of
nanocristalline apatites: implications for biominerals and biomaterials. Mater Sci and Eng 27 198-
205

Rey C., Hina, A., Tofighi, A., Glimcher, M.J. (1995). Maturation of poorly crystalline apatites:
chemical and structural aspects in vivo and in vitro. Cells and Materials 5 (4):345-356

Rey C., Kim H. M., Gerstenfeld L. and Glimcher M. J. (1995). Structural and chemical
characteristics and maturation of the calcium-phosphate crystals formed during the calcification of
the organic matrix synthesized by chicken osteoblasts in cell culture. J Bone Miner Res 10
(10):1577-88

Rey C., Renugopalakrishnan V., Shimizu M., Collins B. and Glimcher M. J. (1991). A resolution-
enhanced Fourier transform infrared spectroscopic study of the environment of the CO3(2-) ion in
the mineral phase of enamel during its formation and maturation. Calcif Tissue Int 49 (4):259-68

Rey C., Collins B., Goehl T., Dickson I. R. and Glimcher M. J. (1989). The carbonate
environment in bone mineral: a resolution-enhanced Fourier Transform Infrared Spectroscopy
Study. Calcif Tissue Int 45 (3):157-64

166
Rezwan K., Chen Q. Z., Blaker J. J. and Boccaccini A. R. (2006). Biodegradable and bioactive
porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials 27
(18):3413-31

Ricci J. L., Grew J. C. and Alexander H. (2008). Connective-tissue responses to defined


biomaterial surfaces. I. Growth of rat fibroblast and bone marrow cell colonies on microgrooved
substrates. J Biomed Mater Res A 85 (2):313-25

Riddle R. C. and Donahue H. J. (2009). From streaming-potentials to shear stress: 25 years of


bone cell mechanotransduction. J Orthop Res 27 (2):143-9

Ripamonti U. (1996). Osteoinduction in porous hydroxyapatite implanted in heterotopic sites of


different animal models. Biomaterials 17 (1):31-5

Ripamonti U., Crooks J. and Rueger D. C. (2001). Induction of bone formation by recombinant
human osteogenic protein-1 and sintered porous hydroxyapatite in adult primates. Plast Reconstr
Surg 107 (4):977-88

Rosa A. L., Beloti M. M. and van Noort R. (2003). Osteoblastic differentiation of cultured rat
bone marrow cells on hydroxyapatite with different surface topography. Dent Mater 19 (8):768-72

Rouahi M., Champion E., Gallet O., Jada A. and Anselme K. (2006a). Physico-chemical
characteristics and protein adsorption potential of hydroxyapatite particles: influence on in vitro
biocompatibility of ceramics after sintering. Colloids Surf B Biointerfaces 47 (1):10-9

Rouahi M., Gallet O., Champion E., Dentzer J., Hardouin P. and Anselme K. (2006b). Influence
of hydroxyapatite microstructure on human bone cell response. J Biomed Mater Res A 78
(2):222-35

Royer P. (1993). Etude du recouvrement à basse température de matériaux orthopédiques par des
phosphate de calcium. Thèse E.N.S.C., Institut National Polytechnique de Toulouse, Toulouse

Ruppert R., Hoffmann E. and Sebald W. (1996). Human bone morphogenetic protein 2 contains a
heparin-binding site which modifies its biological activity. Eur J Biochem 237 (1):295-302

Sachse A., Wagner A., Keller M., Wagner O., Wetzel W. D., Layher F., Venbrocks R. A.,
Hortschansky P., Pietraszczyk M., Wiederanders B., Hempel H. J., Bossert J., Horn J., Schmuck
K. and Mollenhauer J. (2005). Osteointegration of hydroxyapatite-titanium implants coated with
nonglycosylated recombinant human bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) in aged sheep. Bone
37 (5):699-710

Sader M. S., Legeros R. Z. and Soares G. A. (2008). Human osteoblasts adhesion and
proliferation on magnesium-substituted tricalcium phosphate dense tablets. J Mater Sci Mater
Med

Saito N. and Takaoka K. (2003). New synthetic biodegradable polymers as BMP carriers for bone
tissue engineering. Biomaterials 24 (13):2287-93

Sarda S., Banu M., Combes C. and Rey C. (2000). Low temperature ceramics and composites
made of biomimetic apatites. Proceeding of the 6th Biomaterials congress, Kona, Hawai

167
Scheufler C., Sebald W. and Hulsmeyer M. (1999). Crystal structure of human bone
morphogenetic protein-2 at 2.7 A resolution. J Mol Biol 287 (1):103-15

Schliephake H., Weich H. A., Schulz J. and Gruber R. (2007). In vitro characterization of a slow
release system of polylactic acid and rhBMP2. J Biomed Mater Res A 83 (2):455-62

Schmidmaier G., Herrmann S., Green J., Weber T., Scharfenberger A., Haas N. P. and
Wildemann B. (2006). Quantitative assessment of growth factors in reaming aspirate, iliac crest,
and platelet preparation. Bone 39 (5):1156-63

Schmoekel H., Schense J. C., Weber F. E., Gratz K. W., Gnagi D., Muller R. and Hubbell J. A.
(2004). Bone healing in the rat and dog with nonglycosylated BMP-2 demonstrating low
solubility in fibrin matrices. J Orthop Res 22 (2):376-81

Schreiweis M. A., Butler J. P., Kulkarni N. H., Knierman M. D., Higgs R. E., Halladay D. L.,
Onyia J. E. and Hale J. E. (2007). A proteomic analysis of adult rat bone reveals the presence of
cartilage/chondrocyte markers. J Cell Biochem 101 (2):466-76

Schwartz Z., Simon B. J., Duran M. A., Barabino G., Chaudhri R. and Boyan B. D. (2008). Pulsed
electromagnetic fields enhance BMP-2 dependent osteoblastic differentiation of human
mesenchymal stem cells. J Orthop Res 26 (9):1250-5

Seeherman H. and Wozney J. M. (2005). Delivery of bone morphogenetic proteins for orthopedic
tissue regeneration. Cytokine Growth Factor Rev 16 (3):329-45

Sous M., Bareille R., Rouais F., Clement D., Amedee J., Dupuy B. and Baquey C. (1998).
Cellular biocompatibility and resistance to compression of macroporous beta-tricalcium
phosphate ceramics. Biomaterials 19 (23):2147-53

Sumner D. R., Turner T. M., Urban R. M., Turek T., Seeherman H. and Wozney J. M. (2004).
Locally delivered rhBMP-2 enhances bone ingrowth and gap healing in a canine model. J Orthop
Res 22 (1):58-65

Sun H., Ye F., Wang J., Shi Y., Tu Z., Bao J., Qin M., Bu H. and Li Y. (2008). The upregulation
of osteoblast marker genes in mesenchymal stem cells prove the osteoinductivity of
hydroxyapatite/tricalcium phosphate biomaterial. Transplant Proc 40 (8):2645-8

Suzuki T., Hukkanen M., Ohashi R., Yokogawa Y., Nishizawa K., Nagata F., Buttery L. and
Polak J. (2000). Growth and adhesion of osteoblast-like cells derived from neonatal rat calvaria on
calcium phosphate ceramics. J Biosci Bioeng 89 (1):18-26

Takadama H. and Kokubo T. (2008). in vitro evaluation of bone bioactivity. Bioceramics and
their clinical applications, Kokubo T., Woodhead publishing in materials: 165-182

Takemoto M., Fujibayashi S., Neo M., Suzuki J., Kokubo T. and Nakamura T. (2005).
Mechanical properties and osteoconductivity of porous bioactive titanium. Biomaterials 26
(30):6014-23

Tominaga H., Maeda S., Miyoshi H., Miyazono K., Komiya S. and Imamura T. (2009).
Expression of osterix inhibits bone morphogenetic protein-induced chondrogenic differentiation
of mesenchymal progenitor cells. J Bone Miner Metab 27 (1):36-45

168
Toth J. M., Boden S. D., Burkus J. K., Badura J. M., Peckham S. M. and McKay W. F. (2009).
Short-term osteoclastic activity induced by locally high concentrations of recombinant human
bone morphogenetic protein-2 in a cancellous bone environment. Spine 34 (6):539-50

Tsujigiwa H., Nagatsuka H., Gunduz M., Rodriguez A., Rivera R. S., Legeros R. Z., Inoue M. and
Nagai N. (2005). Effects of immobilized recombinant human bone morphogenetic protein-
2/succinylated type I atelocollagen on cellular activity of ST2 cells. J Biomed Mater Res A 75
(1):210-5

Uludag H., Gao T., Porter T. J., Friess W. and Wozney J. M. (2001). Delivery systems for BMPs:
factors contributing to protein retention at an application site. J Bone Joint Surg Am 83-A Suppl 1
(Pt 2):S128-35

Urist M. R. (1965). Bone: formation by autoinduction. Science 150 (698):893-9

Urist M. R., Silverman B. F., Buring K., Dubuc F. L. and Rosenberg J. M. (1967). The bone
induction principle. Clin Orthop Relat Res 53 243-83

Viguet-Carrin S., Garnero P. and Delmas P. D. (2006). The role of collagen in bone strength.
Osteoporos Int 17 (3):319-36

Vohra S., Hennessy K. M., Sawyer A. A., Zhuo Y. and Bellis S. L. (2008). Comparison of
mesenchymal stem cell and osteosarcoma cell adhesion to hydroxyapatite. J Mater Sci Mater Med
19 (12):3567-74

Webster T. J., Ergun C., Doremus R. H., Siegel R. W. and Bizios R. (2000a). Enhanced functions
of osteoblasts on nanophase ceramics. Biomaterials 21 (17):1803-10

Webster T. J., Ergun C., Doremus R. H., Siegel R. W. and Bizios R. (2000b). Specific proteins
mediate enhanced osteoblast adhesion on nanophase ceramics. J Biomed Mater Res 51 (3):475-83

Webster T. J., Ergun C., Doremus R. H., Siegel R. W. and Bizios R. (2001). Enhanced osteoclast-
like cell functions on nanophase ceramics. Biomaterials 22 (11):1327-33

Wildemann B., Kandziora F., Krummrey G., Palasdies N., Haas N. P., Raschke M. and
Schmidmaier G. (2004). Local and controlled release of growth factors (combination of IGF-I and
TGF-beta I, and BMP-2 alone) from a polylactide coating of titanium implants does not lead to
ectopic bone formation in sheep muscle. J Control Release 95 (2):249-56

Wilson C. E., Kruyt M. C., de Bruijn J. D., van Blitterswijk C. A., Oner F. C., Verbout A. J. and
Dhert W. J. (2006). A new in vivo screening model for posterior spinal bone formation:
comparison of ten calcium phosphate ceramic material treatments. Biomaterials 27 (3):302-14

Xue W., Dahlquist K., Banerjee A., Bandyopadhyay A. and Bose S. (2008). Synthesis and
characterization of tricalcium phosphate with Zn and Mg based dopants. J Mater Sci Mater Med
19 (7):2669-77

Yamada S., Heymann D., Bouler J. M. and Daculsi G. (1997). Osteoclastic resorption of calcium
phosphate ceramics with different hydroxyapatite/beta-tricalcium phosphate ratios. Biomaterials
18 (15):1037-41

169
Yamaguchi T., Chattopadhyay N., Kifor O. and Brown E. M. (1998). Extracellular calcium
(Ca2+(o))-sensing receptor in a murine bone marrow-derived stromal cell line (ST2): potential
mediator of the actions of Ca2+(o) on the function of ST2 cells. Endocrinology 139 (8):3561-8

Yin G., Liu, Z., Zhan, J., Ding, F., Yuan, N. (2002). Impacts of the surface property on protein
adsorption on hydroxyapatite. Chemical Engineering Journal 87 181-186

Yuan H., van Blitterswijk C. A., de Groot K. and de Bruijn J. D. (2006a). A comparison of bone
formation in biphasic calcium phosphate (BCP) and hydroxyapatite (HA) implanted in muscle
and bone of dogs at different time periods. J Biomed Mater Res A 78 (1):139-47

Yuan H., van Blitterswijk C. A., de Groot K. and de Bruijn J. D. (2006b). Cross-species
comparison of ectopic bone formation in biphasic calcium phosphate (BCP) and hydroxyapatite
(HA) scaffolds. Tissue Eng 12 (6):1607-15

Yuan H., De Bruijn J. D., Li Y., Feng J., Yang Z., De Groot K. and Zhang X. (2001a). Bone
formation induced by calcium phosphate ceramics in soft tissue of dogs: a comparative study
between porous alpha-TCP and beta-TCP. J Mater Sci Mater Med 12 (1):7-13

Yuan H., de Bruijn J. D., Zhang X., van Blitterswijk C. A. and de Groot K. (2001b). Bone
induction by porous glass ceramic made from Bioglass (45S5). J Biomed Mater Res 58 (3):270-6

Yuan H., De Bruijn J. D., Zhang X., Van Blitterswijk C. A. and De Groot K. (2001c). Use of an
osteoinductive biomaterial as a bone morphogenetic protein carrier. J Mater Sci Mater Med 12
(9):761-6

Yuan H., de Bruijn, J.D., Zhang, X., van Blitterswijk, C.A., de Groot, K. (2001d). Osteoinduction
by porous alumina ceramics. Trans European Conference of biomaterials, 209

Yuan H., Zou P., Yang Z., Zhang X., De Bruijn J. D. and De Groot K. (1998). Bone
morphogenetic protein and ceramic-induced osteogenesis. J Mater Sci Mater Med 9 (12):717-21

Zhang F., Qiu T., Wu X., Wan C., Shi W., Wang Y., Chen J., Wan M., Clemens T. L. and Cao X.
(2009). Sustained BMP Signaling in Osteoblasts Stimulates Bone Formation by Promoting
Angiogenesis and Osteoblast Differentiation. J Bone Miner Res

Zhang Q., Leng Y. and Xin R. (2005). A comparative study of electrochemical deposition and
biomimetic deposition of calcium phosphate on porous titanium. Biomaterials 26 (16):2857-65

Zhao F., Grayson W. L., Ma T., Bunnell B. and Lu W. W. (2006). Effects of hydroxyapatite in 3-
D chitosan-gelatin polymer network on human mesenchymal stem cell construct development.
Biomaterials 27 (9):1859-67

Zhu X., Eibl, O., Berthold, C., Scheideler, L., Geis-Gerstorfer, J. (2006). Structural
characterization of nanocrystalline hydroxyapatite and adhesion of pre-osteoblast cells.
Nanotechnology 17 2711-2721

Zhu X. D., Fan H. S., Xiao Y. M., Li D. X., Zhang H. J., Luxbacher T. and Zhang X. D. (2008).
Effect of surface structure on protein adsorption to biphasic calcium-phosphate ceramics in vitro
and in vivo. Acta Biomater

170
Zhu X. D., Fan H. S., Zhao C. Y., Lu J., Ikoma T., Tanaka J. and Zhang X. D. (2007).
Competitive adsorption of bovine serum albumin and lysozyme on characterized calcium
phosphates by polyacrylamide gel electrophoresis method. J Mater Sci Mater Med 18 (11):2243-9

Ziegler J., Anger D., Krummenauer F., Breitig D., Fickert S. and Guenther K. P. (2008).
Biological activity of recombinant human growth factors released from biocompatible bone
implants. J Biomed Mater Res A 86 (1):89-97

Zinger O., Anselme K., Denzer A., Habersetzer P., Wieland M., Jeanfils J., Hardouin P. and
Landolt D. (2004). Time-dependent morphology and adhesion of osteoblastic cells on titanium
model surfaces featuring scale-resolved topography. Biomaterials 25 (14):2695-711

Zisch A. H., Schenk U., Schense J. C., Sakiyama-Elbert S. E. and Hubbell J. A. (2001).
Covalently conjugated VEGF--fibrin matrices for endothelialization. J Control Release 72 (1-
3):101-13

171