QBQ 2454 – Bioquímica: Estrutura de

Biomoléculas e Metabolismo

Relatório II – Proteínas:
Eletroforese, Dosagem
pelo método do biureto
e Fracionamento

Carolina Domeniche Romagna N° USP: 5122141

Pedro Lazzarin Marani N° USP: 5122238
Thiago Carita Correra N° USP: 5122026
 QBQ – 2454: Bioquímica: Estrutura de
Biomoléculas e Metabolismo

IV – ELETROFORESE DE PROTEÍNAS EM ACETATO DE

CELULOSE
Objetivo
Executar uma eletroforese em fita de acetato de celulose e a partir dela
determinar as proteínas do soro bovino.

Introdução
Esta técnica de separação e identificação de proteínas (e outros compostos)
consiste na migração de íons num campo elétrico. Foi usada a eletroforese em folha de
acetato de celulose embebida numa solução tamponada em pH 8,4. As proteínas com
carga líquida positiva no pH do tampão migram para o pólo negativo, as com carga
líquida negativa, para o positivo. A migração depende também da mobilidade do
composto sobre o suporte. Proteínas com mesma carga líquida e estruturas diferentes
podem não formar bandas iguais.
O ponto isoelétrico da albumina é: 4,9, da γ -Globulina é: 6,6, da Hemoglobina:
7,1, do Citocromo C: 10,6. A solução utilizada estava tamponada em pH 8,4.

Resultado e discussão
A fita de acetato de celulose com a revelação da eletroforese onde foram
aplicados da esquerda para a direita, com o corte na parte superior esquerda, amostra,
padrão e soro está em anexo.
Onde foi aplicado soro, houve formação de uma nuvem de proteína, umas
migradas para o pólo positivo, poucas para o negativos, e uma quantidade apreciável
manteve-se sem mover-se. Houve formação de uma banda mais intensa na mesma
região que há uma banda na amostra e uma banda da mistura padrão.
Na faixa de onde foi adicionada mistura padrão, choveram formações de três
bandas distintas, uma que migrou para o pólo positivo (a mesma da amostra), uma que
migrou muito pouco para o pólo positivo, e uma que migrou para o pólo negativo.
Na faixa onde foi adicionada amostra houve formação de uma única banda,
coincidente com uma da mistura padrão.
Notou-se que nem na amostra nem no soro apareceu a banda que migrou para o
pólo negativo na mistura padrão, notando-se que nem num nem noutra há citocromo c
(proteína presente no interior das mitocôndrias).
1) Sabendo que todas as globulinas tem pH menor que o do tampão, e também a
albumina, e a hemoglobina, em teoria, espera-se que todas as proteínas do soro
encontrassem-se migradas para o pólo positivo umas mais que outras, já que têm carga
líquida negativa no pH do tampão. Sabendo que a mistura padrão contem albumina de
soro bovino, Hemoglobina e Citocromo C e sabendo seus pI’s, espera-se que tenha três
bandas, uma que migrou bastante para o pólo positivo (albumina), uma que migrou um
pouco para o pólo positivo (hemoglobina) e uma que migrou para o pólo negativo
(citocromo c). Na o se pode prever o comportamento da amostra.
2) Vendo o resultado da eletroforese (anexo), pode-se notar que há uma banda da
mistura padrão que é muito parecida com a da amostra, esta é a mancha do padrão que
mais migrou para o pólo positivo (albumina). Pode-se então adotar que na amostra
havia albumina de soro bovino, mas ressalta-se que poderia haver uma outra proteína
com razão carga liquida/fricção molecular semelhante.
3) A fim de separar as proteínas do soro sangüíneo poderia-se usar uma coluna de
troca iônica, usando um tampão com pH adequado, já que neste pH a grande maioria
das proteínas estão com carga liquida negativa, seria interessante usar um gradiente para
retirar frações de proteínas. Poderia-se usar também a coluna de gel, ainda que não se
tenha informação acerca do tamanho das proteínas, haveria uma separação, é necessário
saber se a desejada.

V – DOSAGEM DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO BIURETO

Objetivos
Esta etapa do experimento tem como objetivo a determinação da concentração
de proteínas em amostras desconhecidas.

Introdução
Existem diversos métodos para dosagem de proteínas, como o ensaio de fixação
do verde de bromocresol e o teste de biureto, entre outros.
Ambos os testes estão baseados na absorbância das espécies formadas da reação
dos corantes com as proteínas da solução.
Neste experimento foi utilizado o método do biureto (solução básica de sulfato
de cobre e tartarato, que funciona como estabilizante), que consiste numa reação
colorimétrica, gerando a espécie abaixo:

O R O R
C C C C
N H N H
H 2+ H
Cu
H H
H N H N
C C C C
R O R O 1

Tal reação dos íons Cu2+ em meio alcalino com os nitrogênios das proteínas
produz uma coloração púrpura (absorve em 540nm), o que possibilita o uso da
fotometria para determinar a absorbância da amostra de proteínas simples, já que as
soluções de proteínas conjugadas possuem coloração, impedindo o uso do método.
Pela lei de Lambert e Beer2, a absorbância de uma amostra será dada por:
A = a.b.c, onde a é a absortividade molar do composto, b é o caminho ótico
atravessada pela luz e c é a concentração molar.
Como o caminho ótico depende da cubeta utilizada no espectrofotômetro e a
absortividade molar será a mesma para o composto estudado3, basta construir uma curva

1
Adaptado do roteiro experimental da disciplina DB-105 (Bioquímica) Unicamp
2
http://www.sherwood-scientific.com/chroma/chromaoperation.html
3
Como a e b são constantes no experimento, temos A = K.c.
padrão de absorbância por concentração, utilizando para isso diversas amostras de
concentração conhecida previamente preparadas.
O coeficiente angular da regressão linear desta curva padrão será uma relação
entre concentração e absorbância, o que possibilitara a dosagem de amostras uma vez
que suas absorbâncias tenham sido medidas.

Experimento
Para dosar a quantidade de albumina foi construído uma curva padrão, e para
tanto cinco soluções de concentração conhecida tiveram sua absorbância medida no
espectrofotômetro previamente calibrado. Uma amostra sem proteína foi utilizada como
branco.
Essa amostra tem a função de corrigir a absorbância correspondente a todas as
espécies presentes na solução que não a proteína que reagiu com os íons cobre II. Caso
isso não tivesse sido feito, seria necessário descontar de todos os dados um b que seria:
A = C*k + b
O espectrofotômetro desconta o valor de absorbância obtido dessa amostra dos
valores obtidos nas amostras que continham proteínas, assim obtemos somente a
absorbância relativa às proteínas que desejamos quantificar.
Após as amostras serem preparadas estas foram colocadas em banho-maria á
37ºC por 15 minutos para que ocorra a reação.
Após o banho e as amostras terem voltado à temperatura ambiente (já que a
absorbância também depende da temperatura) as absorbâncias foram medidas, dando
origem aos dados abaixo:

Absorbância (A) C/mg.mL-1

0,0586 0,2
0,0933 0,4
0,1427 0,6
0,1842 0,8
0,3361 1,4

0,35 Y = 0,23815*X
R = 0,99837
0,30

0,25
Absorbância

0,20

0,15

0,10

0,05

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

-1
C/mg.ml
Resultados e discussão
A curva padrão encontrada é uma reta que passa pela origem, devido à amostra
branco, de concentração de proteína 0 mg/mL, mas ocasionalmente poderia não passar
pela origem devido aos erros experimentais ocorridos.
Mesmo assim, uma curva não deve ser usada, pois pela lei de Lambert e Beer a
absorbância será linearmente proporcional a concentração (A = k.C) e sabemos que esta
é uma equação de uma reta que passa pela origem.
A absorbância da amostra desconhecida foi medida sendo 0,2726. Portanto a
concentração da albumina será:
C = A/K, onde K foi obtido do gráfico anterior.
Logo
C = 0,2726/0,23815 = 1,14 mg.mL-1
Porém, como a solução de concentração desconhecida foi diluída antes de ser
colocada no espectrofotômetro, a concentração real da solução será:
C = (Cf.Vf)/Vi
C = 1,14*4/1 = 4,56 mg.mL-1
Este experimento tem sua importância na medida que através da dosagem de
albumina no soro humano pode-se diagnosticar diversos quadros patológicos,
simplesmente comparando as concentrações obtidas com os valores obtidos de
pacientes saudáveis.
Da literatura4 temos que os valores esperados são:

Idade C/mg.mL-1
Adultos 18-60anos 35-50
>60anos 34-48
Crianças 14-18anos 32-45
4dias-14 38-54
Recém-nascidos 0-4dias 28-44

Variações na taxa de albumina no soro humano são dados importantes já que

esta proteína representa 55 a 65% de todas as proteínas plasmáticas5, transportando e
armazenando uma série de ligantes, ligando-se e solubilizando compostos e fármacos, o
que explica sua importância farmacocinética.
Por esse motivos e muitos outros a hipoalbuminemia é freqüente em muitas
doenças, como má-absorção de aminoácidos (doença de Crohn), proteinúria devida à
síndrome nefrótica, perda de proteínas nas fezes (doença neoplásica), possibilitando que
tais doenças sejam diagnosticados.

VI – FRACIONAMENTO DE PROTEÍNAS
Introdução
A fim de separar proteínas um dos métodos usados é o fracionamento por
“salting out”. Uma solução contendo uma mistura de proteínas tem sua força iônica
alterada a fim de precipitar uma delas, retira-la e posteriormente precipitar mais uma,

4
Tietz NW, ed. Clinical Guide to Laboratory Tests. 2nd ed.
Philadelphia: WB Saunders; 1990:26-29. et al.
5
Manual do kit de reagentes COBAS® INTEGRA Albumin,Versão 3.0, 05/1998.
etc. Isto ocorre pois diferentes proteínas respondem ao aumento da força iônica de
formas diferentes, devido às alterações que o meio causa nas interações da solvente -
proteína e proteína - proteína.
O sal usado geralmente é o sulfato de amônia devido à sua capacidade de formar
soluções de alta força iônica. Esta precipitação depende também da temperatura.

Experimento
Aos cinco mililitros de soro que foram disponibilizados, adicionou-se cinco
mililitros de solução saturada de sulfato de amônio a fim de obter uma solução 50% do
sal. Após a primeira centrifugação o precipitado foi diluído em cinco mililitros de
solução de NaCl 2% com esta solução foi feita a analise quantitativa por meio do
método do biureto considerando que no precipitado havia apenas uma proteína com o
numero de resíduos similar ao da albumina, usando a curva padrão feita no experimento
5. Daí obteve-se uma concentração de proteína no precipitado centrifugado de 16,35
mg/ml (ver contas).
1- Volume de precipitado: 3,5 ml.
2- Volume de precipitado + Solução de NaCl 2%: 8,5 ml.
3- Volume de solução usada para preparar a solução de biureto para analise: 0,5 ml. A
solução final tem 4 ml.
4- Absorbância excetuando-se o branco: 0,2864.
5- Equação do experimento V: A=0,2382*C.
6- Concentração do analito: 1,202 mg/ml.
7- Concentração da solução 2: 9,618 mg/ml.
8- Concentração de globulina na solução: 16,35 mg/ml.
Cálculo:
Da concentração de analito:
C = m/V 1,202 = m/4 m = 4,809 mg de globulina.
Ajuste do volume:
Os 8,5 mL têm a mesma concentração:
m = (8,5/0,5)*4,809 m = 81,76 mg de globulina.
Esta era a massa de globulina presente nos 5ml de soro iniciais.
C = m/V C = 81,76 / 5 C = 16,35 mg/ml
Notar que para que a consideração de que a absorbância desta solução pode se
referir à concentração conforme a curva padrão feita no experimento 5 seja valida é
necessário considerar que esta tem numero de ligações peptídicas comparável, e
portanto numero de resíduos comparável com a albumina. A γ -globulina tem massa
próxima à do dímero de albumina de soro6.
Aos demais seis e meio mililitros de sobrenadante, foram adicionados outros seis
e meio mililitros de solução saturada de sulfato de amônia. Após a segunda
centrifugação o precipitado foi solubilizado em cinco mililitros de solução 2% de NaCl
e foi analisado com o mesmo método a quantidade de albumina.
1- Volume de precipitado: 2,0 ml.
2- Volume de precipitado + solução de NaCl 2%: 7,0 ml.
3- Volume de solução usada para preparar a solução de biureto para analise: 0,5 ml. E
1,0 ml. A solução final tem 4 ml.
4- Absorbâncias excetuando-se o branco: 0,1510. E 0,2001.
5- Equação do experimento V: A=0,2382*C.
6- Concentração do analito: 0,6339 mg/ml. E 0,8400 mg/ml.
7- concentração da solução 2: 5,0714 mg/ml. E 3,3602.
6
Voet, Donald, Biochemistry, third ediction, 2004, Wiley international edition, Figure 6-10, page 138.
8- Concentração da albumina no soro: 5,902 mg/ml. (media)
Calculo:
Da concentração de analito para 0,5 ml:
C = m/V 0,6339 = m/4 m = 2,536 mg de albumina.
Ajuste do volume:
Os 7 mL têm a mesma concentração:
m = (7,0/0,5)*2,536 m = 35,50 mg de albumina.
Esta era a massa de albumina presente nos 5mL de soro iniciais.
C = m/V C = 35,50 / 5 C = 7,10 mg/ml

Da concentração de analito para 1 mL:

C = m/V 0,8400 = m/4 m = 3,3602 mg de albumina.
Ajuste do volume:
Os 7 mL têm a mesma concentração:
m = (7,0/1)*3,3602 m = 23,52 mg de albumina.
Esta era a massa de albumina presente nos 5mL de soro iniciais.
C = m/V C = 23,52 / 5 C = 4,70 mg/ml

Media:
C = (7,10 + 4,70)/2 C = 5,09 mg/ml
Notar que este precipitado continha albumina, portanto a curva padrão se aplica
sem aproximações. A fim de facilitar foram feitas duas soluções de biureto com o
precipitado da centrifugação, uma com 0,5 ml de solução e uma de 1 mL já que não era
sabido qual delas seria compatível com a curva padrão feita no experimento 5. No
entanto as duas forneceram pontos na curva, mas os resultados foram diferentes, a
primeira (0,5 mL) forneceu concentração inicial de 7,10 mg/mL e a segunda, de 4,70
mg/mL. Em não se sabendo qual é o dado correto fez-se uma media entre eles.

Resultados e Discussão
1) a- Segundo o gráfico, log s ~ 0,1 portanto, shemoglobina ~ 1,26 g/ml.
Ver figura:

b- Analisando o gráfico, vemos que numa solução de força iônica igual a 8, a

solubilidade de mioglobina é aproximadamente igual a 7,08 g/ml, portanto, não pode ter
havido precipitação, pois a concentração de mioglobina é necessariamente menor que
3,5 g/ml, já que uma solução com esta concentração foi diluída para obter aquela.
2) O gráfico abaixo foi construído com os dados do roteiro:

NaCl 1mM
NaCl 5mM
NaCl 10mM
3,0 NaCl 20mM

2,5
-1

2,0
Solubilidade/mg.mL

1,5

1,0

0,5

0,0

4,8 5,0 5,2 5,4 5,6 5,8

pH

a- Há um mínimo das curvas num pH entre 5,2 e 5,4 (aproximadamente 5,26). O

que já era esperado, pois o pI da β -lactoglobulina é 5,27.
b- Este pH é o ponto isoelétrico onde a solubilidade de proteínas em meios com
sais tem um mínimo pois em pH’s acima e abaixo dele elas têm carga liquida diferente
de zero mas neste ponto sua carga liquida é zero. Representando um mínimo de
interação com o sal e, portanto, um mínimo de solubilidade.
c- Num mesmo pH, a solubilidade da proteína aumenta com o aumento da
concentração de sal. O fenômeno observado poderia ser diferente se fossem estudadas
concentrações menores.
d- O efeito em que em soluções mais ricas em sal a solubilidade de proteínas é
maior é chamado “salting in” e consiste em aumentar a solubilidade de uma proteína
pela adição de um composto iônico devido à interação entre a proteína e o composto
iônico. Essa interação entre as duas substâncias faz com que hajam mais moléculas de
solvente livres, que solvatariam um maior número de moléculas de proteína,
aumentando a sua solubilidade.
O efeito da diminuição da solubilidade da proteína com a variação do pH
havendo um mínimo de solubilidade é chamado de precipitação isoelétrica, pois quanto
mais próximo o pH está do pI menos carregada estará a proteína, e, portanto, menos
solúvel em solução de solvente polar e soluto iônico ela será.

Bibliografia
1.Roteiro experimental da disciplina DB-105 (Bioquímica) Unicamp
2. http://www.sherwood-scientific.com/chroma/chromaoperation.html
3. Tietz NW, ed. Clinical Guide to Laboratory Tests. 2nd ed.
Philadelphia: WB Saunders; 1990:26-29. et al.
4. Manual do kit de reagentes COBAS® INTEGRA Albumin,Versão 3.0, 05/1998.
5. Voet, Donald, Biochemistry, Third Ediction, 2004, Wiley international edition.
6. Lehninger, Principles of Biochemistry, Third Edition, 2000, Worth Plublishers
7
Lehninger, Principles of Biochemistry, Third Edition, 2000, Worth Plublishers, Table 5-6, page 135
7. ZAIA, Dimas A. M., ZAIA, Cássia Thaïs B. V. and LICHTIG, Jaim. Determination
of total protein by spectrophotometry: advantages and disadvantages of proposed
methods. Quím. Nova, Nov./Dec. 1998, vol.21, no.6, p.787-793