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ETUDE FAO: ALIMENTATION ET NUTRITION 14/io

ISSN 10142
-90*

manuels
sur le contrôle de la qualité
des •produits alimentaires

gagiss®

ORGANISATION DES NATIONS UNIES POUR


L'ALIMENTATION ET L'AGRICULTURE ROME
ÉTUDE FAO: ALIMENTATION ET NUTRITION 14/io

manuels
sur le contrôle de la qualité
des produits alimentaires
10. cours de formation
sur l'analyse des mycotoxines

ORGANISATION DES NATIONS UNIES POUR L'ALIMENTATION ET L'AGRICULTURE


Rome, 1992
Les appellations employées dans cette publication et la présentation
des données qui y figurent n'impliquent de la part de l'Organisation
des Nations Unies pour l'alimentation et l'agriculture aucune prise de
position quantaustatutjuridique des pays, territoires, villes ou zones,
ou de leurs autorités, ni quant au tracé de leurs frontières ou limites.

M-82
ISBN 92-5-202947-8

Tous droits réservés. Aucune partie de cette publication ne peut être reproduite,
mise en mémoire dans un système de recherche bibliographique ni transmise sous
quelque forme ou par quelque procédé que ce soit: électronique, mécanique, par
photocopie ou autre, sans autorisation préalable. Adresser une demande motivée
au Directeur de la Division des publications, Organisation des Nations Unies pour
l'alimentation et l'agriculture, Vlale delle Terme dl Caracalla, 00100 Rome, Italie, en
indiquant les passages ou illustrations en cause.

© FAO 1992
AVANT-PROPOS

Dans la plupart des pays en développement, l'économie repose sur


l'agriculture et l'on compte beaucoup sur les cultures d'exportation comme
source de devises étrangères pour financer les activités productives et autres
services essentiels.

La plupart de ces cultures sont des céréales et des oléagineux qui sont
extrêmement vulnérables aux champignons et à la production de mycotoxines. Non
seulement les mycotoxines sont dangereuses pour la santé du consommateur, mais
de plus elles altèrent la qualité des produits alimentaires, entrainant
d'énormes pertes économiques pour ces pays.

Le présent Manuel a été préparé pour le compte de l'Organisation des


Nations Unies pour l'alimentation et l'agriculture en vue d'offrir un module
de formation aux gouvernements des pays en développement qui cherchent à
améliorer leurs programmes de prévention et de surveillance des mycotoxines.
Il est destiné à la formation aux niveaux national et régional.

La FAO tient à remercier M. H.P. van Egmond, du Laboratoire d'analyse


des résidus, Institut national de la Santé publique et de la protection de
l'environnement, à Bilthoven (Pays-Bas), qui était chargé de préparer le
texte. Une partie de la section III reproduit, avec l'autorisation des
éditeurs, l'article "Determination of mycotoxins" de H. P. van Egmond, qui
figurait dans "Developments in Food Analysis Techniques III", R.D. King
(Directeur de la publication), Applied Science Publishers Ltd. , Barking,
Essex, Angleterre (1984), 99-144.

J.W. Dickens (North Carolina State University, Raleigh, Caroline du


Nord, Etats-Unis d'Amérique) et E. Mulders (CIVO-TNO, Zeist, Pays-Bas) ont
communiqué respectivement les figures 9-13 et la figure 26.

La FAO remercie aussi de leur contribution au présent Manuel Karen Kool,


qui a dactylographié le texte, ainsi que le Service de mise en page et le
Service de photographie de l'Institut national de la Santé publique et de
l'Hygiène de l'environnement.

Cette publication est à la disposition des particuliers et des


organisations. On y trouvera à la fin une liste des publications et documents
sur les mycotoxines. Toutes suggestions pour d'éventuelles éditions
ultérieures de cette publication doivent être envoyées à l'adresse suivante:

Le Chef du
Service de la qualité des aliments et des normes alimentaires
Division des Politiques alimentaires et de la nutrition
Organisation des Nations Unies pour l'alimentation et l'agriculture
00100 Rome, Italie
iv -

NOTE SPECIALE

Les méthodes et procédures d'analyse décrites dans le présent Manuel


sont conçues pour être appliquées par un personnel dûment formé travaillant
dans un laboratoire équipé de façon adéquate. Comme c'est le cas pour de
nombreuses procédures de laboratoire, les méthodes citées impliquent
fréquemment l'emploi de substances dangereuses.

Pour que ces méthodes soient exécutées correctement et en toute


sécurité, il est indispensable que le personnel de laboratoire observe les
normes de sécurité applicables à la manutention des substances dangereuses.

Bien que les informations figurant dans le Manuel aient été préparées
avec le plus grand soin, la FAO décline expressément toute responsabilité à
l'égard des usagers de ces procédures pour les dommages de quelque sorte que
ce soit pouvant résulter de leur application.

L'inclusion de méthodes dans le présent Manuel n'implique nullement


qu'elles soient officielles; il s'agit simplement de méthodes que l'usage à
révélé comme étant applicables dans un laboratoire de type moyen.
- V -

TABLE DES MATIERES

Pages

I. BUT ET CHAMP D'APPLICATION 1

II. ASPECTS ORGANISATIONNELS DES COURS DE FORMATION 2

1. Généralités 2
2. Equipement du laboratoire 2
3. Réactifs et matériel de base 2
4. Niveau d'instruction des participants 2
5. Enseignements tirés des cours antérieurs 3

III. LES MYCOTOXINES: LEUR IMPORTANCE ET LEUR ANALYSE 5

1. Introduction 5
2. Croissance des champignons et production des toxines 7
3. Présence et toxicité des mycotoxines 11
4. Limites et réglementations 13
5. Echantillonnage 20
6. Techniques d'analyse 25
Titrages biologiques 25
Titrages chimiques 27
Extraction 27
Epuration 28
Dernières opérations de séparation,
de détection et de dosage 29
Méthodes chromatographiques 29
a. Chromatographie sur colonne ouverte 30
b. Chromatographie en couche mince 31
c. Chromatographie liquide sous haute pression 39
d. Chromatographie en phase gazeuse 44
Méthodes immunochimiques 44
a. Titrage immunoenzymatique 45
b. Titrage radio-immunologique 50
Conclusion 52
7. Caractéristiques 54
Sensibilité 54
Spécificité 55
Précision 56
Seuil de détection 58
Exactitude 60
8. Assurance de la qualité 61

IV. METHODES DE LABORATOIRE 64

1. Epreuve de liquéfaction des cristaux de sel pour


déterminer l'activité de l'eau (aw) dans les denrées
agricoles 64

But et champ d'application 64


Définition 64
- vi -

Principe 64
Réactifs 64
Equipement 65
Mode opératoire 65
Expression des résultats 65
Examen critique 65

2. Techniques de laboratoire pour la chromatographic en


couche mince 67

Préparation des plaques en couche mince 67


a. Matériel et produit chimiques 67
b. Mode opératoire 67
Préparation des étalons 68
a. Equipement 68
b. Vérification de la pureté 68
c. Préparation des étalons pour chromatographie en
couche mince 70
d. Détermination de la concentration d'aflatoxine 71
e. Détermination de la pureté chromatographique 72
f. Préparation et stockage des solutions étalons 72
g. Préparation de l'étalon de référence pour résolution 73
Chromatographie en couche mince 73
a. Dépôt des taches et développement 73
b. Interprétation et calcul 74
Confirmation de l'identité 75
a. Principes généraux 75
b. Méthode de l'AOAC pour l'aflatoxine B,
(unidimensionnelle) 76
Mode opératoire 77

3. Méthodes de chromatographie en couche mince pour le


dosage de l'aflatoxine B, dans les produits
d'alimentation humaine et animale 78

Mode opératoire pour la chromatographie


unidimensionnelle en couche mince 78
a. But et champ d'application 78
b. Principe 78
c. Réactifs 79
d. Equipement 80
e. Mode opératoire 81
f. Calcul des résultats 87
Chromatographie bidimensionnelle en couche mince
(dépôt de taches pour densimétrie) 88
a. But et champ d'application 88
b. Principe 88
c. Réactifs 88
d. Equipement 89
e. Mode opératoire 90
f. Calcul des résultats 93
- vi i -

Chromatographie bidimensionnelle en couche mince


(dépôt antidiagonal des taches) 93
a. But et champ d'application 93
b. Principe 94
c. Réactifs 94
d. Equipement 94
e. Mode opératoire 94
f. Calcul des résultats 97
Observations concernant les opérations de
chromatographie en couche mince 97
a. Délipidation 97
b. Répétabilité des résultats 97
c. Reproductibilité des résultats 98
d. Application de l'épreuve de confirmation à l'acide
trifluoracétique 98

4. Titrage avec immunoadsorbant lié à une enzyme pour


le dosage de l'aflatoxine B, dans les produits
d'alimentation humaine et animale 98

But et champ d'application 99


Principe 99
Réactifs 99
Equipement 100
Mode opératoire . 100
Interprétation des résultats 102
Notes concernant la sécurité 102

V. EXPOSES 103

1. Les mycotoxines: Introduction 103


2. Techniques de chromatographie en couche mince 109
3. Techniques ELISA 117
4. Caractéristiques des méthodes 122

VI. PROGRAMME D'ETUDES PROPOSE POUR UN STAGE DE FORMATION DE


TROIS SEMAINES 127

ANNEXES

I. FORMES DE QUESTIONNAIRE 130-135


II. EXERCICES DE CALCUL 136-137
III. BIBLIOGRAPHIE 138-143
1

I. BUT ET CHAMP D'APPLICATION

Depuis plusieurs années, le Service de la qualité des aliments et des


normes alimentaires de la FAO aide les pays en développement à renforcer les
moyens dont ils disposent pour empêcher et combattre la contamination des
aliments par les mycotoxines, en particulier les aflatoxines. Plusieurs
conférences et cours de formation internationaux ont eu lieu pendant cette
période. Les cours étaient organisés suivant les besoins, avec la
participation de consultants et de conférenciers invités qui y apportaient
leur propre documentation. Toutefois, il a été jugé qu'une approche plus
uniforme serait souhaitable, tout en conservant un certain degré de souplesse
et de spécificité par pays. On a donc entrepris de préparer un programme
d'enseignement de base pour un module de formation qui correspondrait aux
besoins de ces pays.

Le présent Manuel est conçu pour des cours d'une durée d'environ trois
semaines et il est destiné à former des analystes des pays en développement.
L'accent a été mis sur l'analyse des aflatoxines dans les produits
d'alimentation humaine et animale.
- 2 -

II. ASPECTS ORGANISATIONNELS DES COURS DE FORMATION

1. Généralités

Pour qu'un cours de formation sur les mycotoxines se déroule dans des
conditions de travail satisfaisantes, il faut veiller à un certain nombre
d'aspects organisationnels. Il est indispensable pour le directeur du cours
de se faire une idée précise des installations au lieu proposé et qu'il soit
avisé du budget disponible pour l'achat de fournitures supplémentaires dès le
stade initial. Si les délais impartis et les ressources le permettent, il est
préférable que le directeur du cours se rende sur place peu •après son
recrutement, éventuellement six mois avant la date prévue pour le cours, afin
d'estimer si les installations conviennent, de prendre note de tous problèmes
éventuels, de suggérer des adaptations, de prendre contact avec les autorités
locales et de commander les fournitures supplémentaires nécessaires. Au lieu
de se rendre sur place en personne, ou en plus, il peut utiliser des
questionnaires pour se faire une idée de la situation à l'endroit proposé pour
le cours de formation (voir annexe I B).

2. Equipement du laboratoire

Un cours de formation sur l'analyse des mycotoxines nécessite une salle


de classe simple où seront donnés les exposés théoriques et un laboratoire
pour les expériences. Le laboratoire doit posséder l'équipement ci-après:

- une alimentation régulière en eau et en électricité;


- au moins une hotte;
- la possibilité d'occulter la lumière du jour;
- un dispositif de climatisation dans les régions à climat chaud et
humide ;
- un espace de travail suffisant pour chaque participant;
- des moyens d'élimination des déchets.

Un questionnaire conforme au modèle B (voir annexe I) peut se révéler utile


pour estimer si les installations du laboratoire sont adéquates.

3. Réactifs et matériel de base

Bien que ces documents de formation mettent l'accent sur les méthodes
d'analyse des aflatoxines, qui sont relativement faciles à appliquer, il est
impossible de procéder au titrage des aflatoxines sans un minimum de réactifs
et de matériel. Un questionnaire conforme au modèle C (voir annexe I) pourra
se révéler utile pour déterminer si les fournitures essentielles sont
disponibles. La section IV contient des listes détaillées de réactifs et de
matériel pour certaines procédures de laboratoire.

4. Niveau d'instruction des participants

Il est difficile, surtout pour des étrangers, d'évaluer les diplômes


officiels qui sont décernés dans divers pays en développement, mais en général
un diplôme de fin d'études secondaires devrait être exigé pour participer à
des cours de formation sur les mycotoxines. Il n'est pas indispensable de
posséder déjà une expérience du titrage des mycotoxines. Toutefois, pour bien
- 3 -

profiter d'un stage de formation de trois semaines, il est bon d'avoir une
certaine expérience de la chimie analytique, et de préférence de l'analyse des
oligo-éléments. Un questionnaire conforme au modèle A (annexe I) pourrait se
révéler utile pour obtenir quelques informations sur les participants.

5. Enseignements tirés des cours antérieurs

Divers cours de formation sur les aflatoxines ont été organisés dans des
pays africains et autres entre 1982 et 1988. Les points ci-après reflétant les
enseignements pratiques tirés des cours antérieurs méritent d'être signalés,
car ils pourront guider la programmation de futurs cours de formation sur les
mycotoxines dans les pays en développement.

a. Il faut au minimum deux semaines pour que des analystes sans


expérience se familiarisent avec le dosage des aflatoxines dans les produits
d'alimentation humaine et animale par chromatographie en couche mince. Une
durée de trois semaines sera préférable si l'on désire aussi enseigner et
mettre en pratique d'autres techniques telles que le titrage avec immuno-
adsorbant lié à une enzyme.

b. Un groupe de six stagiaires par enseignant est considéré comme


étant un maximum pour garantir toute l'attention individuelle nécessaire. Pour
des raisons d'efficacité, il faudrait que soit présent un assistant local au
laboratoire où se déroule le cours. S'il s'agit d'un cours de portée
nationale, il est souhaitable qu'il regroupe des participants de différentes
institutions. Cela pourrait stimuler à l'avenir la coopération entre ces
institutions qui peuvent avoir des tâches, des responsabilités et des
installations différentes.

c. Les produits chimiques et le matériel simple non disponibles sur


place mais qui sont indispensables pour le cours de formation doivent être
achetés en Europe ou ailleurs et expédiés dans le pays en développement par
fret aérien car on a constaté que ce moyen de transport était sûr et qu'il
était le plus facile à contrôler. (Par exemple, les prix des produits
chimiques qui auraient été achetés à Nairobi en 1984 étaient supérieurs de
40% aux prix des mêmes produits chimiques achetés en Europe, fret aérien
inclus). Quand c'est possible, l'expédition doit être faite deux mois avant
la date du début du cours pour prévoir le temps nécessaire aux formalités sur
place, lesquelles peuvent être d'assez longue durée. Arrivés à destination,
les lots expédiés doivent être stockés en lieu sûr et il ne faut rien ouvrir
avant l'arrivée du directeur du cours.

d. Le directeur du cours doit arriver sur place trois à cinq jours


ouvrables avant la date d'ouverture du cours de formation, ce qui lui laissera
un temps minimum pour s'acclimater et s'occuper des inévitables affaires
administratives et questions d'organisation.

e. On constate fréquemment que certains stagiaires sont incapables


de faire des calculs arithmétiques simples. En pareil cas, il est très utile
qu'ils fassent quelques devoirs: l'annexe II contient quelques exemples
d'exercices.

f. La chimie analytique, et singulièrement l'analyse des oligo-


éléments, exige le plus grand soin et beaucoup d'ordre dans le laboratoire
- 4 -

ainsi qu'une solide faculté d'autocritique. Il faudra probablement un certain


effort pour obtenir des stagiaires qu'ils se conforment à ces exigences, même
s'ils manifestent un vif intérêt et se montrent disposés à tirer pleinement
parti du cours.

g. A l'issue d'un cours de formation il faut procéder à une


évaluation en tenant compte des observations des participants. Pour obtenir
ces informations, on peut utiliser un questionnaire simple comme le modèle E
dans 1'annexe I.
- 5 -

III. LES MYCOTOXINES: LEUR IMPORTANCE ET LEUR ANALYSE

1. Introduction

Les mycotoxines peuvent être définies comme étant des métabolites de


champignons qui engendrent des mutations pathologiques chez l'homme et les
animaux. Le mot "mycotoxine" est tiré des mots grecs "mykes" (champignon) et
"toksikon" (poison). Les mycotoxicoses peuvent être définies comme étant les
syndromes de toxicité résultant de l'absorption de mycotoxines par l'homme et
les animaux, généralement par ingestion.

Les maladies causées par les mycotoxines sont connues de longue date.
La première mycotoxicose reconnue était probablement l'ergotisme, une maladie
caractérisée par la nécrose et la gangrène et mieux connue au moyen-âge en
Europe sous le nom de "feu sacré"; elle était provoquée par l'absorption de
céréales contaminées par les sclérotes de Claviceps purpurea.

Une autre mycotoxicose reconnue comme ayant gravement atteint les


populations humaines est l'aleucie toxique alimentaire (ATA). Chez l'homme,
les symptômes revêtent de multiples aspects, dont la leucopénie, des lésions
nécrotiques de la cavité buccale, de l'oesophage et de l'estomac, la
septicémie, la diathèse hémorragique et l'épuisement de la moelle osseuse.
La maladie était provoquée par l'ingestion de céréales moisies stockées
pendant l'hiver et elle a frappé de nombreuses régions de la Russie, en
particulier pendant la Deuxième Guerre mondiale. Les champignons qui sont à
l'origine de ces accidents appartiennent aux genres Fusarium et Cladosporium.

Au Japon, la toxicité associée au riz moisi de couleur jaune a posé un


problème, surtout au lendemain de la Deuxième Guerre mondiale quand le riz
devait être importé de divers pays. L'ingestion de "riz jaune" par l'homme
provoquait des vomissements, des convulsions et une paralysie ascendante. La
mort pouvait survenir dans les un à trois jours suivant l'apparition des
premiers signes de la maladie. Les champignons produisant la toxine dans le
riz jaune font partie du genre Pénicillium.

Malgré les exemples susmentionnés de maladies provoquées par des


mycotoxines chez l'homme, les mycotoxicoses sont restées les "maladies
négligées" jusqu'au début des années 1960, quand cette attitude fut modifiée
de façon draconienne par la flambée de maladie X du dindon en Grande-
Bretagne. En l'espace de quelques mois, plus de 100 000 dindons sont morts,
surtout dans l'East Anglia et dans le sud de l'Angleterre. En outre, on a
signalé la mort de milliers de canetons et de jeunes faisans (Asplin, 1961).
L'apparition de la maladie X du dindon a entraîné une enquête
pluridisciplinaire pour déterminer la cause du problème. Ces recherches ont
été couronnées de succès et l'origine de la maladie a été imputée à un facteur
toxique présent dans de la farine d'arachides brésilienne qui était utilisée
comme source de protéines pour l'alimentation des volailles atteintes. Le
facteur toxique semblait être produit par deux champignons, Aspergillus
parasiticus et Aspergillus f lavus. d'où le nom d'"aflatoxine" qui lui futt
donné, étant une contraction du nom du second champignon mentionné. L'étude
plus poussée du facteur toxique a révélé que la substance en cause pouvait
être séparée en quatre taches distinctes par chromatographie. Ces quatre
éléments ont tous reçu le nom d'"aflatoxine" afin d'en identifier l'origine
- 6 -

générique. La distinction entre les quatre substances a été effectuée en


fonction de leur fluorescence avec des indices indiquant leur mobilité
chromatographique relative. Par la suite, il est apparu clairement que le
groupe des aflatoxines comprend au moins 17 composés étroitement apparentés.

Les deux décennies qui ont suivi la flambée de maladie X du dindon ont
donné naissance à une abondance d'informations sur les aflatoxines et beaucoup
d'autres mycotoxines ont également été isolées et caractérisées. On connaît
aujourd'hui plus de 200 mycotoxines différentes accusant une grande diversité
de structures chimiques. La figure 1 contient des exemples de quelques-unes
de ces structures.

CO OCH3
CH3

0C0CM3
OCOCH3

Atlatoxine B, Toxine T-2

^O' "O' OCH3

Sterigmatocystine Ochratoxine A

Figure 1. Structure chimique de quelques mycotoxines.

Les nombreuses mycotoxines différentes ont produit divers effets


biologiques chez les animaux de laboratoire: effets toxiques aigus, effets
mutagènes, cancérogènes, tératogènes, hallucinogènes, émétiques et
oestrogènes.

L'homme et les animaux peuvent être exposés aux mycotoxines par


l'ingestion de produits alimentaires contaminés par les toxines, par
inhalation ou par contact cutané.

La présence de mycotoxines dans les produits d'alimentation humaine


peut être le résultat:
- 7 -

a. De la contamination directe par des champignons de cultures sur


pied, de matières premières, de produits manufacturés ou de produits finis.
Comme exemple de contamination en plein champ, on peut citer la présence
d'aflatoxines dans les arachides, culture importante dans de nombreux pays en
développement. Comme exemple de contamination d'un produit semi-manufacturé,
on peut citer la présence de stérigmatocystine dans le fromage.

b. De la contamination de produits animaux provoquée par la


contamination du fourrage consommé par l'animal. On peut citer comme exemple
la contamination du lait et des produits laitiers par l'aflatoxine M,, qui est
le métabolite hydroxylé de l'aflatoxine B, et qui est formée dans l'organisme
de la vache laitière après qu'elle ait ingéré du fourrage contaminé par
l'aflatoxine B, (Allcroft, 1963). Ces faits ont conduit de nombreux pays à
promulguer une législation pour contrôler la contamination par les mycotoxines
des produits d'alimentation humaine ou animale (voir section III.4). Les pays
en développement qui exportent dans le monde industrialisé de grandes
quantités de produits d'alimentation animale ou de constituants de ces
produits doivent reconnaître qu'il importe de contrôler la teneur en
aflatoxines non seulement des produits d'alimentation humaine, mais aussi des
produits d'affouragement.

Des méthodes efficaces d'analyse sont nécessaires pour les enquêtes, la


surveillance et les programmes de contrôle. Le degré de simplicité de la
méthode influera sur le volume de données produit et sur l'applicabilité des
mesures de contrôle qui seront prises par la suite. L'existence de méthodes
d'analyse joue un rôle capital dans les enquêtes et les programmes de
recherche. Néanmoins, pour s'attaquer efficacement au problème des
mycotoxines, il faut une approche pluridisciplinaire où la mycologie, la
toxicologie et la chimie jouent chacune un rôle de grande importance.
Cependant, dans les sections qui suivent, les aspects mycologiques et
toxicologiques ne sont pas traités de façon très détaillée, l'accent étant mis
sur l'analyse pour rechercher les mycotoxines, en particulier les aflatoxines,
groupe de mycotoxines extrêmement cancérogènes qui ont fait l'objet d'études
très poussées.

2. Croissance des champignons et production des toxines

Les moisissures toxinogènes peuvent envahir les produits agricoles


pendant la croissance des végétaux ou la moisson, ou plus tard. La
contamination est due aux spores ou aux fragments de conidies ou de mycélium
présents dans l'environnement. La présence de grands nombres de spores ou de
fragments de conidies et de mycélium dans des produits qui ne sont pas
visiblement moisis peut être le signe d'une contamination générale de
l'environnement, d'une part, ou du traitement de matières premières moisies,
d'autre part. Pendant le traitement, il se peut que les champignons soient
inactivés et, dans ce cas, ils ne sont plus viables. La croissance des
champignons n'a lieu que dans des conditions favorables. Les champignons ont
besoin de divers nutriments pour leurs besoins énergétiques et pour fabriquer
des macro-molécules telles que les protéines et l'ADN. Puisque les champignons
ne peuvent pas synthétiser les glucides, le substrat doit contenir ces
composés, encore que les champignons puissent se développer dans un substrat
riche en protéines en utilisant les acides aminés comme source de carbone. Les
composés azotés organiques peuvent être assimilés par tous les champignons,
alors que les composés minéraux ne peuvent être assimilés que par un nombre
- 8 -

restreint d'espèces. Certaines vitamines doivent être présentes dans le


substrat, d'autres pouvant être synthétisées selon les espèces. Presque tous
les produits alimentaires contiennent les nutriments susmentionnés et peuvent
donc servir de substrat.

Un grand nombre de métabolites se forment pendant la décomposition des


glucides. Ils comprennent ceux qui sont toxiques pour l'homme et les animaux
(les mycotoxines) et ceux qui sont toxiques pour les micro-organismes (les
antibiotiques). Les champignons qui produisent notoirement des mycotoxines
sont au nombre d'environ 150. Le tableau 1 donne quelques exemples de
certaines moisissures bien connues et de leurs mycotoxines (voir aussi la
figure 1 pour la structure chimique des mycotoxines mentionnées).

Tableau 1

Moisissures toxigènes et leurs toxines

Espèces de champignons Toxines

Aspergillus flavus Aflatoxines


Aspergillus versicolor Sterigmatocystine
Pénicillium verrucosum Ochratoxines
Fusarium roseum Zéaralénone
Fusarium tricinctum Trichothécènes

Outre la présence de nutriments, les facteurs les plus importants pour


la croissance et pour la production de mycotoxines sont l'oxygène, la
température et l'activité de l'eau. La plupart des champignons ont besoin
d'oxygène, encore que quelques-uns puissent se développer en anaérobiose en
utilisant un processus de fermentation où se forment de l'éthanol et des
acides organiques. Les températures minimale, optimale et maximale pour la
croissance peuvent différer considérablement d'une espèce à l'autre. Certaines
peuvent se développer à des températures inférieures à 0° C, tandis que
d'autres exigent un minimum de 10° C. La plupart des Penicillia ont un
éventail de températures minimales plus bas que les Aspergilli. La température
optimale est de 25-30° C pour la plupart des Penicillia et de 30-40° C pour
la plupart des Aspergilli et ces gammes de températures seront souvent
rencontrées dans les pays tropicaux. Pour les diverses espèces de Fusarium.
la température optimale oscille entre 8 et 15° C, de sorte qu'on les trouve
dans les zones à climat tempéré.

L'activité de l'eau (aw) a remplacé l'hygrométrie comme expression la


plus utile de l'eau disponible pour la croissance des micro-organismes (Scott,
1957). La figure 2 illustre les diverses notions (Northolt, 1984). La notion
d'humidité relative s'applique à l'atmosphère. L'humidité relative d'équilibre
ou la pression de vapeur d'eau relative d'équilibre concerne l'atmosphère dans
un lieu clos où la pression de vapeur d'eau est en équilibre avec l'humidité
des substances entreposées. La a w équivaut au quotient de la pression de
vapeur d'eau autour du produit alimentaire quand elle est en équilibre avec
l'humidité du produit alimentaire, et la pression de vapeur de l'eau libre à
- 9 -

la même température. Chez les champignons, la a w minimale est généralement


beaucoup plus basse que chez les bactéries. C'est ce qui explique pourquoi
beaucoup de produits qui ne sont pas avariés par les bactéries peuvent l'être
par les champignons. On peut empêcher la croissance des champignons en séchant
les produits agricoles pour y ramener la a w à un niveau inférieur à 0,65 et
la maintenir au-dessous de ce seuil. La figure 3 récapitule les conditions de
a w et de température propice à la croissance de certaines espèces de
champignons et à la production de mycotoxines (Northolt, 1982). Il convient
de noter que l'éventail de a w et de températures indiqué englobe les valeurs
les plus basses et les plus élevées obtenues avec les diverses souches et les
divers substrats. L'aflatoxine B, peut être produite à des conditions de a w
et de température proches de celles qui sont le minimum pour la croissance.
La patuline et 1'orchratoxine A (voir figure 1) sont produites avec un
éventail de a w et de températures plus faible que pour la croissance.
Toutefois, il semble que la patuline ne soit produite que sur des substrats
à a w élevée.

Humidité relative 60%

Hygrométrie d'équilibre 88%

Activité de l'eau 0,88

Figure 2. Différents paramètres relatifs à la vapeur d'eau


(d'après Northolt, 1984).

Le Comité de l'hygiène alimentaire de la Commission du Codex


Alimentarius a proposé comme norme une aw de 0,70 pour les arachides, en vue
d'empêcher la contamination par les aflatoxines. Cette norme d'une a w de 0,70
est également utile pour assurer le stockage en toute sécurité d'autres
produits agricoles. Toutefois, l'introduction de normes pour la a w est gênée
soit par la complexité et le prix des instruments de détermination du point
de rosée, soit par la nécessité d'étalonner souvent ces instruments. Aussi
Northolt (1982) a-t-il mis au point pour vérifier l'activité de l'eau dans les
produits alimentaires une méthode simple qui peut être appliquée sur le
terrain, à savoir l'épreuve dite de liquéfaction des cristaux de sel. Cette
méthode repose sur la propriété qu'ont les cristaux de sel d'attirer la vapeur
d'eau et de la liquéfier si la pression de vapeur d'eau dans l'atmosphère
environnante dépasse la pression de vapeur d'eau d'une solution saturée du sel
utilisé. Cette deuxième pression de vapeur d'eau est spécifique des divers
types de sel et on l'exprime le plus souvent sous forme de vapeur d'eau
relative d'équilibre ou de a w du sel. On procède à l'épreuve simplement en
10 -

plaçant dans un bocal un mélange de cristaux secs et d'échantillons du produit


alimentaire. Si la aw de l'échantillon de produit alimentaire est plus élevée
que celle du sel, les cristaux vont se liquéfier au bout de quelques heures,
phénomène aisément visible à l'oeil nu. Pour vérifier la aw des arachides, on
utilise des cristaux de CUC12.H20 qui se liquéfient à une aw d'environ 0,70
(voir aussi la section IV.1 pour le mode opératoire). Quand 50% au moins des
cristaux sont liquéfiés, l'épreuve est considérée comme ayant donné un
résultat positif.

Croissance Production de mycotoxines

3 Qw

1. A. flavus AFLATOXINEB,
2. A. parasiticus

0.80
0 10 20 30 0 10 2 0 30
Température fC)

Croissance Production de mycotoxines


Qw

1. A. clavatus
2. P. expansum PATULINE
3. P. patulum

10 20 30 0 10 20 30
Température (-C)

Croissance Production de mycotoxines


V:y ' V \ Qw
P
1. A. ochraceus mmMi
2. P. cyclopium OCHRATOXINE A
3. P. viridicatum
Ww0 a
10 20 30 0 10 20 30
Température ("C)

Figure 3. Conditions d'activité de l'eau (a„) et de température


propices (hachures) à la croissance de différentes espèces de
champignons et à la production de différentes mycotoxines
(d'après Northolt, 1981).

L'épreuve de liquéfaction des cristaux de sel est une épreuve physique


indirecte applicable sur le terrain qui indique seulement l'éventualité de la
présence d'une ou plusieurs mycotoxines. Outre ce type d'épreuve, il existe
de nombreuses méthodes d'analyse pour déceler et déterminer la présence
effective d'une ou plusieurs mycotoxines dans le produit à inspecter. Ces
méthodes sont décrites dans la section III.6.
- 11 -

3. Présence et toxicité des mycotoxines

La contamination des produits d'alimentation humaine et animale par les


mycotoxines dépend en grande partie des conditions écologiques qui sont
propices à la croissance des moisissures et à la production des toxines. Les
données sur l'incidence et l'ampleur de la contamination sont limitées par de
nombreux facteurs, parmi lesquels les ressources disponibles pour mener les
enquêtes, l'existence de moyens de laboratoire pour procéder aux analyses, les
méthodes d'échantillonnage appliquées, la fiabilité et la sensibilité des
méthodes d'analyse utilisées, et la compétence des analystes. Néanmoins, de
nombreuses publications ont été consacrées à la présence de diverses
mycotoxines dans les produits d'alimentation humaine et animale depuis la
découverte des aflatoxines au début des années 1960. Il est probable qu'aucune
substance comestible ne peut être considérée comme étant absolument à l'abri
d'une éventuelle contamination par des mycotoxines, celles-ci pouvant être
produites en plein champ ou pendant la récolte, le traitement, le stockage ou
le transport d'un produit donné. Il serait impossible et injustifié de passer
en revue ici toutes les données concernant la présence des mycotoxines.
Certaines de ces données sont récapitulées dans "Critères d'hygiène de
l'environnement, document N° 11: Mycotoxines" (OMS, 1980). La plupart des
données concernent les redoutables aflatoxines, qui se développent plus
particulièrement dans les arachides et les produits à base d'arachides, le
maïs et d'autres céréales comme le riz, le blé, le sorgho et le millet en
quantités variant du /¿g/kg au mg/kg. Dans beaucoup de pays, le seuil de
tolérance pour les aflatoxines dans les produits d'alimentation humaine se
situe entre 5 et 25 /¿g/kg, mais il est souvent plus élevé pour les produits
d'alimentation animale (voir section III.4).

Les effets aigus et chroniques de l'exposition aux aflatoxines ont été


bien étudiés et l'on trouvera des informations précises dans certains ouvrages
détaillés (Heathcote, 1978) (Stoloff, 1977). L'aflatoxine B, est la plus
toxique, suivie des aflatoxines G,, B2 et G2 par ordre d'activité décroissante.
Pour ces mycotoxines, la valeur de la DL50 chez des canetons d'un jour était
respectivement de 0,36, 0,78, 1,70 et 3,45 mg par kilogramme de poids corporel
(Carnaghan, 1963). La vulnérabilité des animaux aux aflatoxines varie d'une
espèce à l'autre, les lapins, les canetons, les porcs, les truites et les rats
étant modérément sensibles, tandis que les souris, les hamsters et les
poussins sont relativement résistants. Les aflatoxicoses aiguës produisent une
hémorragie générale et une stéatose hépatique avec issue fatale.

Encore plus alarmante que les faits concernant les effets aigus des
aflatoxines fut la découverte que l'aflatoxine B, est un hépatocancérogène
très puissant chez le rat (Butler, 1968), et chez toutes les autres espèces
d'animaux de laboratoire soumises aux épreuves (Wogan, 1973). Le tableau 2
récapitule les données concernant la tumorigénicité hépatique de l'aflatoxine
B, chez diverses souches de rats.

Le cancer primitif du foie est l'un des cancers les plus répandus chez
l'homme dans les pays en développement. Les études épidémiologiques menées
dans les années 1970 confirment du point de vue statistique une association
entre l'incidence des carcinomes hépatocellulaires et la consommation
d'aliments contaminés par les aflatoxines. On a estimé pour ces études qu'il
était justifié de comparer l'exposition actuelle aux aflatoxines avec les taux
actuels de cancer, puisque les observations se limitaient à des populations
12 -

rurales stables dont le régime alimentaire et les habitudes en matière de


stockage et de cuisine n'avaient pas changé dans un passé récent (Dil, 1986).
On pense aujourd'hui qu'il existe un effet synergique entre l'aflatoxine et
l'infection due au virus de l'hépatite B provoquant un cancer primitif du
foie. Cette théorie de l'étiologie plurifactorielle gagne rapidement du
terrain par suite des résultats de récentes études de génétique moléculaire
portant sur les mécanismes de l'hépatocancérogenèse (Hsieh, 1986). Il semble
de plus en plus démontré que chez l'homme l'aflatoxine agissant isolément
exerce un effet hépatocancérogène très limité (Van Rensburg, 1986).

Tableau 2

Données sur le cancer du foie provenant d'études sur des rats


recevant de l'aflatoxine B, (AFB) (d'après Hsieh, 1986)

Etude N° Souche AFB dans Incidence du Référence


de rats la ration cancer du foie
(MgAg)

I Fischer 0 0/18 (0) Wogan (1974)


1 2/22 (0,09)
5 1/22 (0,05)
15 4/21 (0,19)
50 20/25 (0,80)
100 28/28 (1,0).

II Fischer 0 0/16 (0) Nixon (1974)


20 5/13 (0,38)

III Wistar 0 0/17 (0)


20 0/20 (0)
100 7/17 (0,41)

IV Porton 0 0/46 (0) Butler (1968)


100 17/26 (0,47)
500 25/25 (1,0)

V use 0 0/9 (0) Alfin-Slater


1 0/16 (0) (1969)
10 0/10 (0)

Les effets aigus et chroniques de quelques autres mycotoxines


importantes (voir figure 1) ont aussi été étudiés et signalés. Il a été
démontré que 1'ochratoxine A est une néphrotoxine puissante chez toutes les
espèces animales soumises aux épreuves, y compris des oiseaux, des poissons
et des mammifères (Krogh, 1977). L'hypothèse a été émise qu'il y aurait une
association entre 1'ochratoxine A et la néphropathie endémique balkanique,
maladie du rein observée dans certains pays des Balkans (Krogh, 1974). Par
ailleurs, des rapports sur la cancérogénicité de 1 'ochratoxine chez la souris
ont été publiés (Bendele, 1985). La patuline est un indicateur de méthodes de
fabrication défectueuses (utilisation de matières premières moisies) plutôt
qu'une menace sérieuse pour la santé humaine et animale, ainsi que l'ont
- 13 -

révélé de récentes études sur la toxicité subaiguë et semi-chronique (Speyers,


1987, 1988). Néanmoins, huit pays ont imposé officiellement un seuil de
tolérance pour la patuline (van Egmond, 1987). La stérigmatocystine est une
substance cancérogène qui se développe occasionnellement dans les céréales et
dans la croûte des fromages à pâte dure. La structure chimique de cette toxine
est apparentée à celle des aflatoxines. Parmi les trichothécènes, la toxine
T-2 et le déoxynivalénol sont celles qui ont attiré le plus d'attention. Ces
composés accusent un large éventail d'effets toxiques chez les animaux
d'expérience, dont le refus de s'alimenter, les vomissements, la diarrhée et
des hémorragies graves. D'autre part, ces composés sont extrêmement
tératogènes et ils perturbent le système immunitaire.

Pour les pays en développement, les aflatoxines sont les mycotoxines les
plus importantes du point de vue de leur présence dans l'environnement, de
leur toxicité et de l'économie nationale. Etant donné les conditions
climatiques favorables à la croissance des champignons et à la production de
toxines dans les aliments et leurs ingrédients, et compte tenu des méthodes
peu satisfaisantes utilisées pour la manutention des produits alimentaires,
il est probable qu'une partie de la population de ces pays soit exposée à un
certain degré d'intoxication par les aflatoxines. Il est beaucoup plus
difficile que dans les pays développés de réduire le risque d'exposition aux
aflatoxines. Pour l'heure, tout au moins, il est presque impossible pour
certains des habitants des pays en développement d'éviter tous les produits
alimentaires contaminés par les aflatoxines.

Outre les dangers que font peser sur la santé les mycotoxines en général
et les aflatoxines en particulier, il faut mentionner l'impact négatif sur
l'économie de ces pays. Dans la plupart d'entre eux, les technologies
applicables pendant et après la récolte et qui empêcheraient la croissance des
moisissures et la production des mycotoxines sont parfois insuffisantes, ou
bien tout simplement inexistantes. Pour de tels pays qui exportent des
produits alimentaires ou autres vers des pays qui ont des programmes efficaces
de contrôle de la contamination et qui mettent en pratique un système de
contrôle de la qualité des denrées alimentaires, les conséquences économiques
peuvent être catastrophiques. D'autre part, la présence de mycotoxines dans
les produits d'alimentation animale peut avoir un effet défavorable sur la
productivité animale. En prenant pour hypothèse une réduction de poids de 3%
chez les poulets de chair en raison d'une faible contamination par les
mycotoxines, Hesseltine (1986) a estimé le montant annuel des pertes à plus
de 140 millions de dollars des Etats-Unis. Ces aspects et d'autres concernant
la réglementation applicable en matière de mycotoxines sont examinés dans la
section 4.

4. Limites et réglementations

Les risques que comporte pour l'homme ou les animaux l'ingestion de


produits agricoles contaminés par des mycotoxines ont conduit de nombreux pays
à instaurer des mesures pour contrôler la contamination des produits
d'alimentation humaine et animale.

Les divers facteurs ci-après interviennent dans la détermination des


limites et des réglementations applicables aux mycotoxines:
- 14 -

a. Données d'enquête: Les données sur la présence des mycotoxines


indiquent les produits sur lesquels doit porter la législation. De plus, ces
données permettront d'estimer les effets des mesures de contrôle sur les
disponibilités de produits d'alimentation humaine, y compris les produits
d'origine animale, et de produits d'alimentation animale. Toutefois, dans les
pays en développement où les disponibilités alimentaires sont déjà
restreintes, l'imposition de mesures légales draconiennes pourrait conduire
à des pénuries alimentaires et à une hausse des prix.

b. Données toxicologiques: En l'absence d'informations


toxicologiques, il n'est pas possible de déterminer avec exactitude si la
substance en question est ou non dangereuse. Les mesures sont prises
logiquement en fonction d'effets toxicologiques spécifiques, sauf quand le
sujet d'inquiétude est le cancer comme c'est le cas pour les aflatoxines.
Selon les hypothèses actuelles, il n'y a pas de seuil pour les aflatoxines en-
deçà duquel certains effets ne pourraient pas se manifester, si bien que
n'importe quelle dose peu élevée rendra probable un effet quelconque, ne
serait-ce que dans une faible mesure. Une tolérance nulle semblerait dès lors
appropriée, mais le problème réside dans le fait que les aflatoxines sont des
contaminants naturels qui ne peuvent pas être totalement éliminés sans
interdire tout simplement le produit d'alimentation humaine ou animale
sensible. C'est ce qui rend particulièrement difficiles les jugements en
matière de réglementation.

c. Méthodes d'analyse: Pour que l'inspection des produits soit


possible, il faut disposer de méthodes d'analyse précises. S'il n'existe pas
de méthodes d'analyse fiables, il n'est pas possible de respecter les
tolérances fixées. D'autre part, il ne faut pas perdre de vue qu'en fait une
tolérance ne peut pas être inférieure à la limite effective de dépistage de
la méthode d'analyse appliquée.

d. Distribution des mycotoxines: La distribution des mycotoxines


dans les produits peut poser des problèmes très difficiles en ce qui concerne
la fixation des critères régissant la réglementation. Si une telle
distribution n'est pas homogène, comme c'est le cas pour les aflatoxines dans
les arachides, il y a de fortes chances pour que la concentration de
mycotoxines dans le lot à inspecter soit estimée de façon erronée en raison
des difficultés que soulève un échantillonnage représentatif. Il faut tenir
compte du risque à la fois pour le consommateur et pour le producteur quand
on fixe des critères pour l'échantillonnage et l'analyse des arachides (voir
section 5).

e. Législation: Enfin, il faut prendre en considération la


réglementation en vigueur chez les autres partenaires commerciaux et, si
possible, l'harmoniser avec la législation à l'étude. En dépit de leur
nécessité, les réglementations constituent une entrave pour le commerce
international puisqu'elles créent:

- des difficultés pour les pays exportateurs qui recherchent des marchés
pour leurs produits;

- des difficultés pour les pays importateurs qui veulent


s'approvisionner en produits essentiels comme les céréales et les
produits d'alimentation animale.
- 15 -

Il est clair qu'il n'existe aucune formule simple pour peser ces
facteurs. Toute décision est surtout question de bon sens. Le personnel des
services de santé publique est confronté à un problème complexe: les
mycotoxines, et singulièrement les aflatoxines, doivent être exclues des
produits d'alimentation humaine dans toute la mesure possible, mais puisque
les substances sont présentes dans les aliments sous forme de contaminants
naturels, on ne peut pas empêcher totalement l'homme d'y être exposé. Il
s'ensuit donc qu'il faut tolérer l'exposition de la population à un certain
degré d'aflatoxines. L'adoption de réglementations pour le contrôle des
aflatoxines est un processus en continuelle évolution dans certains pays. La
plupart des pays n'ont pas rendu publiques les informations qui ont servi de
base aux décisions concernant la fixation de tolérances. Il faut citer comme
exception les Etats-Unis d'Amérique où tous les problèmes et toutes les
difficultés ont été exposés dans des publications, de sorte que la raison
d'être des décisions prises est connue (Stoloff, 1980).

En 1981, les efforts tentés pour obtenir un aperçu de la législation sur


les mycotoxines dans le monde entier ont abouti à une publication de Schuller
(1983) sur la question. Cette synthèse contient des renseignements sur la
législation relative aux mycotoxines dans 46 pays. Depuis 1981, la
réglementation en matière de mycotoxines a été modifiée, complétée ou créée
dans divers pays. Aussi a-t-il été préparé pour la Deuxième Conférence
internationale mixte FAO/OMS/PNUE sur les mycotoxines un document actualisé
qui reflète la situation telle qu'elle se présentait en mai 1987 (van Egmond,
Bangkok, 1987) . Ce document à jour contient des informations sur la
réglementation en vigueur ou sur des propositions détaillées de réglementation
en matière de mycotoxines dans 56 pays. Le fait que de nombreux pays n'qient
pas promulgué une législation spécifique sur la question ne signifie pas
nécessairement qu'ils ne soient pas conscients du problème, ni que le problème
ne se pose pas chez eux. Beaucoup de pays se contentent d'une législation de
caractère général comme la suivante: "Le produit doit être exempt de micro-
organismes capables de se développer dans des conditions d'entreposage
normales et il ne doit contenir aucune substance provenant de micro-
organismes en quantités susceptibles de constituer un danger pour la santé".

Les documents de travail de la FAO Myc 87/9.1 et Myc 87/9.2 contiennent


des précisions pour le monde entier sur les tolérances, les bases juridiques,
les autorités compétentes, le degré de perfectionnement des méthodes
d'échantillonnage et d'analyse, et l'élimination des denrées contenant des
quantités inadmissibles de mycotoxines. Ces renseignements portent sur les
aflatoxines dans les produits d'alimentation humaine, l'aflatoxine M, dans les
produits laitiers, les aflatoxines dans les produits d'alimentation animale
et d'autres mycotoxines dans les produits d'alimentation humaine ou animale.
Certains renseignements sur les diverses tolérances sont récapitulés sous la
forme d'une distribution de fréquence dans les figures 4 à 8. Pour ces
figures, les restrictions et simplifications suivantes ont été opérées afin
de rendre possibles les comparaisons.

Dans les cas où les pays ont fixé des tolérances différentes pour les
aflatoxines selon les produits, on a retenu la tolérance applicable aux
produits d'alimentation humaine "principaux" (s'agissant souvent de produits
à base d'arachides), ce choix ayant pu avoir occasionnellement un caractère
subjectif. Pour les pays qui avaient indiqué une tolérance nulle pour la somme
des aflatoxines Bi, B2, G, et G2, on a considéré automatiquement que la
tolérance était nulle pour l'aflatoxine B,, si ce n'était pas spécifié
séparément.
16

Nombre de pays

U• N =30

12

10 •

10 15 20 25 30 35 40 ¿5 50
Tolérance (ng/kg)

F i g u r e 4 . D i s t r i b u t i o n de f r é q u e n c e des q u a n t i t é s t o l é r é e s
(en v i g u e u r ou p r o p o s é e s ) d ' a f l a t o x i n e B, d a n s les p r o d u i t s
d'alimentation humaine dans divers pays.

Nombre de pays

14

12
N = 35
10

10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tolérance (ng/kg)

F i g u r e 5 . D i s t r i b u t i o n de f r é q u e n c e d e s q u a n t i t é s t o l é r é e s
(en v i g u e u r o u p r o p o s é e s ) de la s o m m e d e s a f l a t o x i n e s
B ^ B j + G ^ G g d a n s les p r o d u i t s d ' a l i m e n t a t i o n h u m a i n e
dans divers pays.
- 17 -

Dans les cas où les pays ont fixé des tolérances différentes pour les
aflatoxines selon les produits, on a retenu la tolérance applicable aux
produits d'alimentation humaine "principaux" (s'agissant souvent de produits
à base d'arachides), ce choix ayant pu avoir occasionnellement un caractère
subjectif. Les tolérances applicables à la somme de l'aflatoxine B, et des
autres aflatoxines ont été considérées comme correspondant aux tolérances
applicables à la somme des aflatoxines B,, B2, G, et G2.

Nombre de pays
I
N =13

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 06 0.7 0.8 0.9 1.0

Tolérance (ng/kg)

Figure 6. Distribution de fréquence des quantités tolérées


(en vigueur ou proposées) d'aflatoxine M, dans le lait dans
divers pays.

Seules ont été incluses les tolérances pour l'aflatoxine M, dans le lait
de consommation (pas pour des produits spécifiés contenant du lait tels que
les préparations pour nourrissons).
- 18 -

Nombre de pays

12
N = 18
10

10 20 25 30 35 Í.0 ¿5 50
Tolérance (wj/kg)

Figure 7. Distribution de fréquence des quantités tolérées


(en vigueur ou proposées) d'aflatoxine B, dans les produits
d'alimentation animale (pour bovins laitiers) dans divers pays.

Seules ont été incluses les tolérances pour l'aflatoxine B, dans les
produits d'alimentation animale pour bovins laitiers (ou pour les produits
d'alimentation animale en général, si aucune précision n'a été fournie).

Nombre de pays

12
N=6

10

10 15 20 25 30 35 ¿0 ¿5 50

Tolérance (ng/kg)

Figure 8. Distribution de fréquence des quantités tolérées


(en vigueur ou proposées) d'aflatoxines B ^ B J + G J + G J dans
les produits d'alimentation animale (pour bovins laitiers)
dans divers pays.

Voir les observations pour la figure 4.


- 19

On peut constater d'après la figure 4 que le seuil de tolérance de


5 /¿g/kg pour l'aflatoxine B, est celui qui est le plus souvent appliqué par
les auteurs de la réglementation régissant les aflatoxines dans les produits
d'alimentation humaine. Dans les pays qui appliquent des limites pour la somme
des aflatoxines, on ne constate pas une telle uniformité dans les valeurs de
tolérance (figure 5). Il n'est pas absolument certain qu'une tolérance pour
la somme des aflatoxines, qui nécessite plus de travaux d'analyse que pour la
seule aflatoxine B,, contribue de façon appréciable à mieux protéger la santé
publique qu'une tolérance applicable uniquement à l'aflatoxine B,.
L'aflatoxine B, est la plus importante des aflatoxines, considérée du double
point de vue de la toxicologie et de la présence dans l'environnement. Il est
peu probable que des produits contiennent les aflatoxines B2, G, et G2 et non
l'aflatoxine B,, tandis que la concentration de la somme des aflatoxines B2,
G, et G2 est généralement inférieure à la concentration de la seule aflatoxine
B, (van Egmond, données inédites).

La distribution de fréquence de la figure 6 montre que, pour


l'aflatoxine M, dans le lait, il se produit deux pics principaux de tolérance,
à 0,05 et 0,5 /¿g/kg. En fait, il est étonnant de constater ces très grandes
différences en ce qui concerne la tolérance à l'égard de l'aflatoxine M, entre
certains pays d'Europe occidentale (0,05 /¿g/kg) et certains pays américains,
l'URSS et la Tchécoslovaquie (0,5 /¿g/kg). La tendance des pays d'Europe
occidentale à fixer à 0,05 /¿g/kg le seuil de tolérance pour l'aflatoxine M,
dans le lait a abouti à une réglementation plus stricte de la Communauté
européenne pour les produits d'alimentation animale, la tolérance pour
l'aflatoxine B, dans les produits complémentaires pour bovins laitiers ayant
été fixée en 1984 à 10 /¿g/kg (voir le pic maximal de 10 /¿g/kg dans la
figure 7). Un autre fait récent dans la législation communautaire est
l'introduction d'une tolérance de 200 /¿g/kg pour l'aflatoxine B, dans les
ingrédients de produits d'alimentation animale, mesure qui a force de loi
depuis la fin de 1988. Il se peut que l'évolution de la réglementation
internationale sur les mycotoxines suscite des problèmes croissants pour les
pays en développement qui seront contraints de fixer à l'exportation des
limites correspondant aux exigences de la clientèle.

Les aflatoxines constituent le groupe principal de mycotoxines pour


lesquelles il existe une réglementation. Toutefois, 15 pays avaient proposé
ou appliqué effectivement des tolérances pour d'autres mycotoxines en 1987.
Il s'agissait de la patuline, de 1'ochratoxine A, du déoxynivalénol, de la
toxine T-2 et de la zéaralénone (voir figure 1), ainsi que des mycotoxines
moins connues que sont la chétomine, la stachiobotriotoxine et la phomopsine.
Cependant, ces réglementations ne seront pas évoquées davantage dans le
présent document. Les lecteurs que cela intéresse pourront se reporter aux
documents de travail présentés par la FAO à la Deuxième Conférence
internationale mixte FAO/OMS/PNUE sur les mycotoxines, qui s'est tenue à
Bangkok en 1987.

Il ressort des figures 4 à 8 que la législation en matière d'aflatoxines


accuse des différences très nettes selon les pays dans le monde. On a parfois
l'impression que les auteurs de la réglementation ont eu le souci de faire
preuve d'originalité dans leur travail, sans accorder beaucoup d'attention à
la législation existant dans d'autres pays. Il serait hautement souhaitable
d'harmoniser la réglementation applicable aux aflatoxines. Cet effort
d'harmonisation doit s'appuyer sur une connaissance des motifs des décisions
- 20 -

qui ont conduit à l'application de la réglementation actuellement en vigueur


dans les divers pays du monde. La réglementation promulguée et celle qui est
en cours d'élaboration doivent être le résultat d'une coopération rationnelle
entre les parties intéressées, c'est-à-dire l'industrie, les consommateurs,
le secteur scientifique et les milieux officiels. C'est seulement dans ces
conditions que l'on pourra parvenir à une législation réaliste.

5. Echantillonnage

L'échantillonnage fait partie intégrante des procédés d'analyse.


L'échantillonnage a pour objet d'obtenir un échantillon de laboratoire (prise
d'essai) représentatif du lot sur lequel il a été prélevé. Normalement, la
décision d'accepter ou de rejeter un lot repose sur les preuves issues de
l'analyse de l'échantillon. Quand les mycotoxines sont réparties d'une manière
homogène dans tout le lot à inspecter, l'échantillonnage est facilité. La
distribution est homogène dans le cas de l'aflatoxine M, contenue dans le lait
et les produits laitiers, en raison de la liquidité originelle de ces
produits. Cette situation est exceptionnelle. Malheureusement, la plupart des
mycotoxines ont une distribution hétérogène et il se peut qu'elles ne se
présentent que dans une fraction des éléments constituant le lot à inspecter.
On peut citer comme exemple la distribution très inégale de l'aflatoxine B,
dans un lot d'arachides (Cucullu, 1966) et dans certaines autres denrées se
présentant en particules comme les céréales. Comme le problème le plus grave
est celui de la distribution de l'aflatoxine B, dans les arachides, celle-
ci a fait l'objet d'études assez poussées et c'est sur cet exemple qu'on se
fondera dans tout le reste de la présente section pour mettre en évidence les
difficultés de l'échantillonnage et la démarche qu'il faudra suivre pour
parvenir à des procédés d'échantillonnage pratiques en dépit des problèmes qui
se posent.

L'erreur totale d'un processus analytique comprend trois termes:


l'erreur d'échantillonnage, l'erreur de sous-échantillonnage (on entend par
sous-échantillonnage que l'échantillon originel est broyé, après quoi cette
fraction broyée fait l'objet d'un échantillonnage) et l'erreur d'analyse
proprement dite. En se basant sur de nombreuses analyses, Whitaker (1977) a
pu calculer la part de chaque erreur dans l'erreur totale lors de
l'échantillonnage et de l'analyse d'un lot d'arachides contaminé par
l'aflatoxine B,. Comme on le voit dans la figure 9, le facteur d'erreur
principal est l'erreur d'échantillonnage, tandis que l'erreur de sous-
échantillonnage et l'erreur d'analyse proprement dite (intra-laboratoire) ne
varient que fort peu quelles que soient les concentrations. (N.B.: l'erreur
d'analyse inter-laboratoires dépend beaucoup plus de la concentration.)

Il est possible de tracer une courbe indiquant la relation entre la


probabilité d'acceptation d'un lot et la concentration d'aflatoxine dans ce
lot, eu égard à une tolérance donnée. La figure 10 donne l'exemple d'une telle
courbe du mode opératoire (Whitaker, 1977). On peut voir d'après la figure 10
que le degré de probabilité d'acceptation d'un lot avoisine l'unité quand la
concentration d'aflatoxine est presque nulle, et qu'à mesure que la
concentration s'accroit la probabilité d'acceptation se rapproche du zéro. Il
ressort en outre de la figure 10 qu'il y a deux risques, le risque pour le
producteur et le risque pour le consommateur. Pour le producteur, il y a le
risque que le lot soit rejeté à tort du fait que la quantité d'aflatoxine
mesurée dans la prise d'essai est supérieure à la tolérance, bien que la
21 -

concentration moyenne dans le lot soit en-deçà du seuil fixé. Le consommateur,


quant à lui, court le risque qu'un lot soit accepté à tort parce que la
quantité d'aflatoxine mesurée dans la prise d'essai est inférieure à la
tolérance, bien que la concentration moyenne dans le lot dépasse celle-ci. En
augmentant la taille de l'échantillon, on réduira le risque aussi bien pour
le consommateur que pour le producteur (figure 11) (Dickens, 1978).

100

80
c Echantillonnage (21,8 kg)
o
•S 6 0
CO
>

CD
"O
c
2 40
o
it
ai
O
o Sous-échantillonnage (1100 g)
20
Analyse (18,3 g avec répétition)

0 20 40 60 80
Concentration d'aflatoxine ((ig/kg)

Figure 9. Part relative de l'erreur d'échantillonnage, de


l'erreur de sous-échantillonnage et de l'erreur d'analyse
proprement dite dans l'erreur totale (d'après Whitaker, 1977)
(communiqué par l'UICPA).

Tolérance

Concentration d'aflatoxine (|ig/kg)

Zone représentant le risque pour le producteur

Zone représentant le risque pour le consommateur

Figure 10. Probabilité d'acceptation d'un lot au regard de la


concentration d'aflatoxine (courbe du mode opératoire)
(d'après Whitaker, 1977) (communiqué par l'UICPA).
- 22 -

Tolérance

Taille de l'échantillon
3.2 kg
9.1 kg
3 4 kg

10 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 100
Concentration d'aflatoxine (p.g/kg) j g / k g )

Figure 11. Effet de la taille de l'échantillon sur la courbe


du mode opératoire (d'après Dickens, 1978) (communiqué par
l'Institut für Toxikologie, Zürich).

On obtient la courbe idéale pour le mode opératoire quand le lot tout


entier est broyé et analysé (figure 12) (Dickens, 1978). Cette situation
théoriquement idéale a manifestement des conséquences très peu pratiques: il
ne resterait plus rient à vendre ou à acheter, tout au moins sous sa forme
initiale. Le choix de la taille de l'échantillon dépend des risques qui
peuvent être acceptés et du coût qu'on est disposé à assumer. Une autre
possibilité d'influer sur le risque pour le producteur et le risque pour le
consommateur consiste à modifier le seuil de décision (il s'agit d'un seuil
de toxine critique qui a pour conséquence que, si le résultat de l'analyse de
la prise d'essai dépasse le seuil de décision, le lot sera rejeté).

En abaissant le seuil de décision, on réduit le risque pour le


consommateur mais, par contre, le risque s'accroît pour le producteur
(figure 13) (Dickens, 1978). Pour limiter ces risques, on a mis au point des
plans d'échantillonnage comportant deux (ou plus) seuils de décision, un seuil
d'acceptation et un seuil de rejet. En pareil cas, un lot est accepté si le
résultat de l'analyse de la prise d'essai est en-deçà du seuil d'acceptation
et il est rejeté si le résultat est au-dessus du seuil de rejet, une nouvelle
analyse étant effectuée quand le résultat se situe entre les deux seuils.
- 23 -

1.00 r

0.90 Tolérance
o
0.80
3
T3 0 . 7 0
c
O
ra0 . 6 0
Q. Faible
O 0.50
ra
b 0.40
S
S 0.30
ra
-O
o 0.20
CL
0.10

10 20 30 40 50 60 70 80
Concentration d'aflatoxine (p.g/kg)

Figure 12. Courbe idéale du mode opératoire: le lot tout entier


est broyé et analysé (d'après Dickens, 1978) (communiqué par
l'Institut für Toxikologie, Zürich).

Tolérance

c
13
T3
C
O Seuil de décision
ra
o. 50 jug/kg
25 / j g / k g
ra 10 > j g / k g
-<D
-O
ra
-O
O

10 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 70 8 0 9 0 100
Concentration d'aflatoxine (ng/kg)

Figure 13. Effet du seuil de décision sur la courbe du mode


opératoire (d'après Dickens, 1978) (communiqué par
l'Institut für Toxikologie, Zürich).
- 24 -

On peut citer comme exemple d'un tel plan d'échantillonnage celui du PAC
(Peanut Administrative Committee - Commission administrative sur les
arachides) qui est appliqué aux Etats-Unis d'Amérique pour l'échantillonnage
des lots importants d'arachides avant qu'ils soient expédiés à l'usine de
traitement (Dickens, 1977). Ce procédé d'échantillonnage comporte des
opérations multiples d'échantillonnage et de titrage effectuées sur des unités
représentatives de 22 kg du lot avec application d'une tolérance de 25 pg/kg
pour la somme des aflatoxines B,, B2, G, et G2.

Bien que l'opération soit parfois coûteuse, il est hors de doute qu'il
faut prélever de très grands échantillons d'arachides pesant plusieurs
kilogrammes pour ramener à un niveau minimal le risque d'une décision erronée
tant pour le consommateur que pour le producteur. Avec ces échantillons de
grande taille, il est nécessaire de procéder à un sous-échantillonnage pour
rendre possible une analyse adéquate. Vu l'éventualité d'une hétérogénéité,
il faut broyer et homogénéiser la totalité de l'échantillon. On a mis au point
à cet effet des instruments spéciaux et des techniques spéciales tels que la
meule de sous-échantillonnage de Dickens -Satterwhite (Dickens, 1969) et
l'appareil vertical de coupe et malaxage de Hobart (Francis, 1979). Ensuite,
ou bien on analyse la totalité du sous-échantillon, ou bien on réduit de
nouveau la taille du sous-échantillon jusqu'à ce qu'on obtienne une prise
d'essai dont la taille se situe généralement entre 20 et 100 g. Il semble
qu'on ait fixé la taille à 50 g pour parvenir à un compromis entre l'économie
de solvant et l'obtention d'un échantillon représentatif. Dans le programme
d'essai de la PAC pour les arachides, on procède à l'extraction de la totalité
du sous-échantillon (1 100 g) au moyen d'un mélange de 1 650 ml de méthanol,
1 350 ml d'eau, 1 000 ml d'hexane et 22 g de chlorure de sodium. Outre qu'ils
soient coûteux, les solvants sont une importante source d'énergie et ils est
difficile de s'en débarrasser après usage sans polluer l'environnement. Aussi
Whitaker (1980) a-t-il proposé une méthode qui consiste à extraire les
aflatoxines au moyen d'un solvant à partir d'un échantillon de 130 g d'une
boue qu'on obtient en mélangeant 1 100 g de graines d'arachides broyées,
1 500 ml d'eau et 22 g de chlorure de sodium dans un malaxeur Waring. Il
semble que la variance parmi les analyses avec cette méthode ne différait pas
sensiblement de la variance constatée entre les analyses effectuées selon le
procédé officiel de la PAC.

Outre les Etats-Unis d'Amérique où l'on applique le plan


d'échantillonnage de la PAC, plusieurs autres pays ont indiqué en 1987 qu'ils
avaient proposé ou approuvé des plans d'échantillonnage pour la lutte contre
les mycotoxines (uniquement pour les aflatoxines) (van Egmond, 1987). Les pays
africains ayant des plans d'échantillonnage pour les produits d'alimentation
humaine sont le Kenya, le Malawi et le Nigéria. Les pays africains ayant des
plans d'échantillonnage pour les produits d'alimentation animale sont la Côte
d'Ivoire, le Nigéria et le Sénégal.

On peut supposer que la conception de ces plans d'échantillonnage


s'inspire des informations concernant les facteurs essentiels suivants: un
seuil critique (contrôle, tolérance, directive, etc. pour les aflatoxines);
une définition d'un lot satisfaisant (acceptable) ou non satisfaisant (à
rejeter); un énoncé des risques acceptables ou souhaités pour le consommateur
et pour le producteur. En l'absence de telles informations, le choix d'un plan
d'échantillonnage quelconque serait arbitraire.
- 25 -

6. Techniques d'analyse

Des procédures biologiques et techniques ont été établies pour la


détection et le dosage des mycotoxines. Les méthodes biologiques peuvent se
révéler utiles pour la recherche des mycotoxines connues ou inconnues. On peut
citer à titre d'exemple qu'elles ont joué un rôle important pendant la période
de découverte initiale des aflatoxines (Carnaghan, 1963). Cependant, si l'on
connaît la mycotoxine ou les mycotoxines qu'il faut rechercher, il est
préférable de recourir aux techniques d'épreuve chimique, si c'est possible,
parce qu'elles sont généralement beaucoup plus spécifiques, plus rapides et
plus reproductibles et qu'elles possèdent un seuil de détection plus bas.
Ainsi, les titrages chimiques jouent un rôle de grande importance dans le
dosage des mycotoxines. Par conséquent, les épreuves biologiques ne seront
passées en revue que brièvement, tandis que les dosages chimiques seront
décrits d'une façon plus détaillée.

Titrages biologiques

D'une manière générale, les systèmes de titrage biologique s'appliquent


à cinq catégories d'organismes: les micro-organismes, les animaux aquatiques,
les animaux terrestres, les systèmes de culture d'organes et de tissus et les
végétaux. Watson (1982) donne un aperçu de l'utilité de ces organismes pour
la détection des mycotoxines.

Il semble que les micro - organismes soient assez insensibles aux


mycotoxines. Burmeister (1966) a enquêté sur plus de 300 espèces de micro-
organismes pour déterminer leur sensibilité aux aflatoxines et il n'a trouvé
qu'une souche de Bacillus brevis et deux de Bacillus megaterium qui soient
sensibles aux aflatoxines. Toutefois, une méthode de titrage fondée sur
l'action antibactérienne observée (Clements, 1968) avait un seuil de détection
absolu élevé (1 ¿¿g) et n'était pas suffisamment reproductible lors d'études
concertées pour justifier des recherches plus poussées. D'autres mycotoxines
peuvent entraver la croissance des micro-organismes d'une manière telle que
des méthodes de titrage utiles peuvent être mises au point.

Quelques animaux aquatiques comme la crevette d'eau saumâtre (Artemia


salina) et certaines espèces de poissons (truite, Brachydano rerio. gambusie)
sont utilisés dans des systèmes de titrage biologique pour déceler les
mycotoxines (Brown, 1968). D'une manière générale, les larves des poissons ou
des crevettes d'eau saumâtre sont exposées à diverses concentrations de
toxines dissoutes dans l'eau d'aquarium et, après un certain temps, on estime
le pourcentage d'animaux tués pour chaque dilution (Waart, 1972). L'épreuve
à laquelle sont soumises les crevettes d'eau saumâtre est l'un des titrages
les plus simples, mais elle est relativement insensible aux mycotoxines,
hormis quelques trichothécènes, la stérigmatocystine et les aflatoxines. L'un
des problèmes que soulève l'épreuve avec les crevettes d'eau saumâtre est
peut-être le fait que beaucoup de mycotoxines ne sont que légèrement
hydrosolubles. L'épreuve dure environ une journée et aucune compétence
technique particulière n'est requise.

Parmi les animaux terrestres, il semble que les plus sensibles aux
mycotoxines soient les canetons et les embryons de poulet. Lors de l'épreuve
biologique initialement mise au point à l'occasion de la flambée de maladie X
du dindon (Carnaghan, 1963), on a utilisé des canetons nouvellement éclos
- 26 -

comme animaux d'expérience pour déterminer la présence d'aflatoxine isolée


dans des aliments douteux, la réaction mesurée spécifique étant 1'hyperplasie
des canaux biliaires. La dose minimale de 0,4 /¿g/jour pendant 5 jours
constitue l'apport minimal nécessaire à l'induction d'une lésion décelable des
canaux biliaires. Dans l'épreuve sur embryon de poulet, on applique à la
seringue une petite quantité d'extrait sur la membrane de l'oeuf. Après une
incubation de 3 à 4 semaines, on dénombre les survivants. Il semble que
l'épreuve sur embryon de poulet soit l'un des systèmes de titrage biologique
les plus sensibles pour les mycotoxines. En outre, elle est reproductible et
particulièrement utile pour le dosage de l'aflatoxine B,, puisqu'on observe
des lésions typiques dans l'embryon avec des niveaux subaigus d'aflatoxine B,,
moins de 0,1 /¿g/oeuf. L'épreuve sur embryon de poulet a fait l'objet d'études
concertées avec succès (Verret, 1973) et l'Association of Official Analytical
Chemists l'a adoptée comme méthode finale officielle (AOAC, 1984). En raison
de la longue période d'incubation, l'épreuve sur embryon de poulet est l'un
des titrages biologiques les plus lents, ce qui en constitue l'inconvénient
majeur. Pour le dépistage des trichothécènes, groupe de mycotoxines provoquant
des dermatites, l'épreuve cutanée sur l'animal expérimental s'est révélée
utile (Chung, 1974) . Des extraits de produits douteux et de cultures sont
appliqués sur la peau rasée d'un lapin ou d'un rat qui est ensuite inspectée
pendant quelques jours. Les réactions comme l'érythème, l'oedème et la nécrose
indiquent la présence de trichothécènes dans l'extrait. Cette méthode est
fiable et son seuil de détection absolu est d'environ 0,01 /¿g par épreuve.

L'emploi de cultures cellulaires pour déceler les mycotoxines a pour


avantage que de faibles concentrations peuvent provoquer une réaction
perceptible. Des cultures de cellules hépatiques, rénales et musculaires
peuvent servir de matériel d'épreuve. On procède à ce titrage in vitro en
ajoutant des extraits de denrées douteuses ou de cultures fongiques au milieu
de culture. La culture se poursuit pendant plusieurs jours et l'on relève
périodiquement le degré de cytotoxicité ainsi que les effets cytopoïétiques
et les transformations morphologiques (Umeda, 1977). L'exposition de cellules
hépatiques de rat à des concentrations de 0,1 /¿g d'aflatoxine B, par
millilitre de milieu de culture entraine des lésions marquées (Umeda, 1971).
La méthode avec culture cellulaire a pour limitation le fait que beaucoup des
milieux utilisés pour la culture des champignons semblent être toxiques et ne
peuvent donc pas servir de moyen de contrôle.

La dernière catégorie à mentionner est celle des végétaux. Les titrages


de phytotoxicité reposent sur l'aptitude de certaines mycotoxines à freiner
la croissance et la germination des semences de végétaux supérieurs. Schoental
(1965) a découvert que des suspensions d'aflatoxines dans l'eau à une
concentration de 25 /¿g/ml ajoutées à un milieu gélosé contentant des graines
de cresson provoquaient l'arrêt total de la germination, tandis qu'on relevait
une carence en chlorophylle dans la plantule ("albinisme") à des
concentrations de 1 à 2,5 ¿¿g/ml. Burmeister (1970) a signalé que 0,5 /¿g de
toxine T-2 ralentissait de 50% la germination de graines de pois quand celles-
ci étaient trempées pendant toute une nuit dans la solution.

Les titrages biologiques peuvent être utiles quand il n'est pas possible
de procéder à un titrage chimique. Les titrages biologiques se sont révélés
surtout utiles pour le dépistage des mycotoxines. Cependant, leur emploi pour
la surveillance des produits d'alimentation humaine et animale est de peu
d'importance car ces méthodes manquent généralement de spécificité, de
reproductibilité et de rapidité.
27

Titrages chimiques

Les limitations des techniques de titrage biologique pour déceler et


doser les mycotoxines ont conduit les chimistes à mettre au point des méthodes
d'analyse plus sélectives et plus fiables. En règle générale, toutes les
méthodes d'analyse chimique utilisées pour la détection et le dosage des
mycotoxines comportent les étapes fondamentales indiquées sur la figure 14.
Les problèmes d'échantillonnage ont déjà été exposés. Les prises d'essai
homogénéisées qui sont prélevées pour analyse ont habituellement un poids qui
se situe entre 20 et 100 g, cette fourchette étant le résultat d'un compromis
entre les exigences d'homogénéité et les besoins pratiques.

Echantillonnage

1
Extraction

1
Epuration de l'extrait

\
Concentration

\
Séparation des composants de l'extrait

J
Détection et dosage

I
Confirmation de l'identité

Figure 14. Procédure d'analyse pour le dosage des mycotoxines.

Extraction

La première étape de l'analyse chimique comporte l'extraction de la


prise d'essai pour séparer les composantes intéressantes de l'ensemble des
constituants de la matrice et pour obtenir le matériel sous une forme
utilisable. En règle générale, les mycotoxines sont extraites avec des
solvants organiques comme le chloroforme, le dichlorométhane, 1'acétonitrile,
l'acétate d'éthyle, l'acétone et le méthanol. Le contact entre le solvant et
le substrat solide s'effectue soit pendant une brève période (1 à 3 minutes)
dans un malaxeur à grande vitesse, soit pendant une durée plus longue (30
minutes) par agitation dans une fiole. Les liquides peuvent être épuisés dans
- 28 -

une ampoule à décantation ou absorbés sur un milieu hydrophile qui est placé
au préalable dans une colonne, après quoi l'extraction est effectuée par
élution au solvant. On peut citer comme exemple de cette dernière technique
d'extraction la procédure employée pour doser l'aflatoxine M, dans le lait,
où l'on utilise une colonne de Celite préparée en laboratoire (Schuller,
1973).

Le choix du solvant est dicté par les propriétés chimiques de la toxine


à extraire autant que par les propriétés du support. On constate souvent que
les mélanges de solvants ou les solvants ajoutés à de faibles quantités d'eau
et d'acides sont les plus efficaces. Bien que beaucoup de mycotoxines ne
soient que faiblement hydrosolubles, les solvants aqueux peuvent pénétrer dans
les tissus hydrophiles, conduisant à une extraction extrêmement efficace par
les solvants non aqueux. Deux des méthodes d'analyse les mieux connues et les
plus employées pour le dépistage des aflatoxines, la méthode CB (méthode dite
de la Contamination Branch) (Eppley, 1966) et la méthode des Communautés
européennes (Commission des Communautés européennes, 1976), emploient un
mélange de chloroforme et d'eau pour l'extraction des aflatoxines.

Epuration

Les mycotoxines n'étant normalement présentes qu'en quantités très


faibles, une forte concentration de l'extrait est nécessaire pour pouvoir les
déceler. La présence fréquente de lipides et d'autres substances qui risquent
de gêner la détection finale rend nécessaire l'épuration de l'extrait avant
la concentration, s'agissant d'épuration en colonne, de techniques
d'extraction liquide-liquide et/ou de précipitation simultanée des impuretés.
Plusieurs étapes d'épuration chromatographique en colonne sont possibles avec
des substances telles que le gel de silice, le gel de silice modifié, l'oxyde
d'aluminium, le polyamide FlorisilR et SephadexR. C'est le gel de silice qui
est le plus fréquemment utilisé. Les colonnes peuvent être garnies dans le
laboratoire. Toutefois, il existe désormais dans le commerce des colonnes déjà
prêtes; l'emploi de ces colonnes est indiqué dans un assez grand nombre de
méthodes d'analyse pour mycotoxines ayant récemment fait l'objet de
publications. Les avantages de ces colonnes déjà garnies, par exemple
SEP-pakR, BakerR, sont évidents. Les différences de préparation des colonnes
d'un analyste à l'autre sont évitées et l'on économise le temps nécessaire
pour préparer les colonnes. Cependant, des variations entre lots de colonnes
déjà garnies ont été signalées (Scott, 1984) et il existe effectivement la
possibilité d'introduire aisément de légères variations dans la composition
de la colonne (par exemple un ajustement de la teneur en eau ou de la taille
de la colonne). L'extrait de l'échantillon est habituellement ajouté à la
colonne dans un solvant approprié, après quoi la colonne est lavée au moyen
d'un ou plusieurs solvants dans lesquels les toxines sont insolubles ou moins
solubles que les impuretés. La composition des solvants est ensuite modifiée
de telle façon que les toxines soient éluées sélectivement de la colonne.
L'éluat est recueilli et concentré.

La technique d'extraction liquide - liquide peut aussi être pratiquée dans


des ampoules à décantation, par exemple le pentane contre un mélange méthanol-
eau. La plupart des mycotoxines n'étant pas lipophiles, la délipidation peut
être effectuée de cette manière sans perte de toxine. Dans certaines méthodes
d'analyse, on utilise des réactifs de précipitation. On peut citer comme
exemples l'acétate de plomb' et le gel basique ferrique frais pour précipiter
- 29 -

les p i g m e n t s de g o s s y p o l d a n s des e x t r a i t s de g r a i n e s de c o t o n ( P o n s , 1 9 6 5 )
( W i s e m a n , 1 9 6 7 ) , le c a r b o n a t e de c u i v r e p o u r é l i m i n e r la c h l o r o p h y l l e
( V e l a s c o , 1 9 7 0 ) e t le n i t r a t e d ' a r g e n t p o u r e x t r a i r e la t h é o b r o m i n e d u c a c a o
(Scott, 1969).

L e s t e c h n i q u e s d ' é p u r a t i o n s u s m e n t i o n n é e s s o n t e n f a i t des p r o c é d u r e s
de s é p a r a t i o n p e r m e t t a n t de s é p a r e r l ' u n de l ' a u t r e d e s g r o u p e s de s u b s t a n c e s
p o s s é d a n t c e r t a i n e s p r o p r i é t é s p h y s i c o c h i m i q u e s . Il e s t p o s s i b l e de c e t t e
m a n i è r e d ' é l i m i n e r la m a j e u r e p a r t i e d e s s u b s t a n c e s e x t r a i t e s s i m u l t a n é m e n t .
Le c h o i x de la t e c h n i q u e d ' é p u r a t i o n p o u r r a d é p e n d r e de la m é t h o d e e m p l o y é e
p o u r la d é t e c t i o n e t le d o s a g e , d u s e u i l de d é t e c t i o n r e q u i s , de la r a p i d i t é
de l ' a n a l y s e e t d u d e g r é de r é c u p é r a t i o n .

Les extraits qui ont été épurés sont généralement concentrés par
évaporation du solvant dans un évaporateur rotatif sous pression réduite, ou
à l ' é t u v e , t a n d i s q u e l ' e x t r a i t e s t m a i n t e n u s o u s u n c o u r a n t d ' a z o t e . Le
r é s i d u e s t r e d i s s o u s d a n s u n p e t i t v o l u m e de s o l v a n t , p u i s transféré
quantitativement dans une petite fiole et amené à un v o l u m e spécifié. Selon
la t o x i n e e t l ' é t a p e u l t i m e de s é p a r a t i o n e t de d é t e c t i o n p r é v u e , il p e u t
s ' a v é r e r n é c e s s a i r e de p r o c é d e r à la d é r i v a t i o n de la m y c o t o x i n e à l a q u e l l e
o n s ' i n t é r e s s e a f i n de p o u v o i r la m e s u r e r o u e n o p t i m i s e r le c o m p o r t e m e n t
chromatographique.

D e r n i è r e s o p é r a t i o n s de s é p a r a t i o n , de d é t e c t i o n et de d o s a g e

M a l g r é l ' e x t r a c t i o n e t l ' é p u r a t i o n , il se p e u t q u e l ' e x t r a i t f i n a l


c o n t i e n n e de g r a n d e s q u a n t i t é s d ' a u t r e s s u b s t a n c e s e x t r a i t e s s i m u l t a n é m e n t e t
q u i p o u r r a i e n t g ê n e r le d o s a g e d e s m y c o t o x i n e s . Il e x i s t e plusieurs
p o s s i b i l i t é s p o u r s é p a r e r les m y c o t o x i n e s de la m a t r i c e a f i n de p e r m e t t r e u n
dosage qualitatif et quantitatif. Les méthodes chromatographiques, qui
r e p o s e n t s u r des p r i n c i p e s de s é p a r a t i o n p h y s i q u e , s o n t c e l l e s q u i s o n t le
plus souvent appliquées. Elles sont utilisées en association avec u n dosage
v i s u e l ou a u x i n s t r u m e n t s d e s m y c o t o x i n e s r e c h e r c h é e s . C e p e n d a n t , les m é t h o d e s
i m m u n o c h i m i q u e s , q u i r e p o s e n t s u r des p r i n c i p e s c o m p l e x e s de s é l e c t i o n e t de
l i a i s o n b i o c h i m i q u e , g a g n e n t r a p i d e m e n t d u t e r r a i n d a n s la r e c h e r c h e s u r les
mycotoxines.

Méthodes chromatographiques

L e s p r o c é d é s c h r o m a t o g r a p h i q u e s i m p l i q u e n t u n p a r t a g e b a s é s u r la
s o l u b i l i t é d i f f é r e n t i e l l e d ' u n e s u b s t a n c e v i s - à - v i s d ' u n e p h a s e f i x e (le
s u p p o r t c h r o m a t o g r a p h i q u e ) e t d ' u n e p h a s e m o b i l e ( l i q u i d e o u g a z e u s e ) , les
s u b s t a n c e s à s é p a r e r p a s s a n t à t r a v e r s le s u p p o r t c h r o m a t o g r a p h i q u e . L a p h a s e
f i x e r e t a r d e p l u s o u m o i n s le p a s s a g e des s u b s t a n c e s s e l o n l e u r s p r o p r i é t é s
p h y s i c o c h i m i q u e s , de s o r t e q u e la s é p a r a t i o n d e s c o n s t i t u a n t s p e u t ê t r e
r é a l i s é e . P o u r le t i t r a g e des m y c o t o x i n e s , o n p e u t d i s t i n g u e r les t y p e s de
chromatographie suivants:

- chromatographie sur colonne ouverte;


- chromatographie en couche mince ;
- c h r o m a t o g r a p h i e l i q u i d e sous h a u t e p r e s s i o n ;
- chromatographie gaz-liquide.
30

a. Chromatographic sur colonne ouverte

Il a déjà été fait état de la chromatographie sur colonne ouverte comme


technique souvent utilisée dans les procédés d'épuration. On peut recourir à
une conception spéciale - la minicolonne en verre ayant un diamètre interne
d'environ 5 mm - pour la détection de quelques mycotoxines dans certains
produits. Dans la méthode d'épreuve recommandée par Romer (1975), la
minicolonne est garnie de couches successives d'adsorbants tels que l'alumine,
le gel de silice et le FlorisilR avec un dessiccateur au sulfate de calcium
à chaque extrémité, le tout maintenu en place avec de la laine de verre
(figure 15). Un extrait au chloroforme appliqué à l'extrémité supérieure de
la colonne est entraîné par gravité. Puis on applique une chromatographie
descendante avec un mélange de chloroforme et d'acétone, fixant les
aflatoxines sous forme de bande serrée à la partie supérieure de la couche de
FlorisilR où elles peuvent être décelées par la couleur bleue de leur
fluorescence sous un éclairage ultraviolet (figure 16) . En comparant une
colonne d'échantillon avec une colonne contenant une quantité connue
d'aflatoxine, il est possible de juger si l'échantillon contient plus
d'aflatoxine ou moins que l'étalon. contrairement aux techniques de
chromatographie en couche mince, la méthode de Romer sur minicolonne (1975)
ne distingue pas entre les différentes aflatoxines. La méthode de Romer (1975)
a fait l'objet d'une étude concertée réussie (Romer, 1976) et elle a été
adoptée par l'AOAC comme méthode officielle d'action initiale pour la
détection des aflatoxines dans les amandes, le maïs blanc et jaune, les
farines d'arachides et de graines de coton, les arachides, le beurre
d'arachides, les pistaches et les aliments composés pour animaux (AOAC, 1984).
Outre les aflatoxines, des procédés analogues sur minicolonne ont été mis au
point pour quelques autres mycotoxines qui deviennent fluorescentes quand
elles sont exposées à un rayonnement ultraviolet, par exemple 1'ochratoxine
A (voir figure 1) dans tout un éventail de produits (Holaday, 1976) et la
zéaralénone (voir figure 1) dans le maïs, le blé et le sorgho (Holaday, 1980).
Les seuils de détection atteints varient d'environ 5 à 15 /¿g/kg pour la
zéaralénone.

Les méthodes sur minicolonne sont des méthodes "tout ou rien" qui ne
prennent que peu de temps et ne nécessitent aucun matériel complexe. Aussi
sont-elles utiles pour les épreuves de dépistage à effectuer sur le terrain
par des spécialistes scientifiques et des techniciens dans les pays en
développement. En conséquence, l'Organisation de coopération et de
développement économiques (OCDE) a décrit quelques méthodes sur minicolonne
pour les aflatoxines dans un manuel sur le dépistage rapide des mycotoxines
(OCDE, 1982). En dépit de quelques avantages, les méthodes sur minicolonne ont
certaines limitations: l'interprétation de l'image sur la colonne exige une
certaine expérience et elle peut se révéler particulièrement difficile quand
sont appliqués sur la colonne des extraits "souillés" contenant des composés
fluorescents autres que la toxine recherchée. En pareil cas, on risque
d'obtenir des résultats faussement positifs. Les méthodes sur minicolonne sont
au mieux semi- quantitatives et en général leur seuil de détection est plus
élevé et la sensibilité, le pouvoir de résolution et la sélectivité sont
inférieurs à ce qu'on obtient avec la chromatographie en couche mince et la
chromatographie liquide sous haute pression. On peut s'attendre à ce que le
titrage immuno-enzymatique remplace les méthodes sur minicolonne pour le
dépistage rapide.
31

Laine de verre

Sulfate de calcium
Alumine

Gel de silice

FlorisilR

Sulfate de calcium

Laine de verre —

Figure 15. Garniture d'une minicolonne Figure 16. Adsorption de l'afla-


selon Romer (1975) . toxine B, sur la couche de FlorisilR
d'une minicolonne.

b. Chromatographic en couche mince

Dans la chromatographie en couche mince, la phase fixe se compose d'une


couche mince de particules adsorbantes étalées sur une plaque et la phase
mobile passe au travers de cette couche par capillarité. Au cours des
premières années de recherche sur les mycotoxines, la chromatographie en
couche mince est devenue une technique très courante et très appréciée pour
séparer les constituants d'un extrait et elle a aujourd'hui encore de
nombreuses applications. A l'origine, les séparations étaient opérées en une
seule dimension avec utilisation d'un solvant unique. Par la suite, la
recherche sur les mycotoxines a fait appel à la chromatographie en couche
mince bidimensionnelle (Kiermeier, 1970). C'est une technique de séparation
puissante comportant un second développement à angle droit par rapport au
premier avec utilisation d'un solvant différent. On obtient ainsi une bien
meilleure séparation qu'avec la chromatographie en couche mince
unidimensionnelle et on y a recours en particulier dans les cas où il faut
déceler des niveaux très faibles, par exemple l'aflatoxine M, dans le lait,
ou encore si les extraits contiennent de nombreuses substances gênantes, par
exemple les produits d'alimentation animale et les arachides grillées
(cacahuètes).
- 32

Pour la chromatographie en couche mince, on peut utiliser tout un


éventail d'adsorbants. Pour la recherche des mycotoxines, on utilise le plus
souvent des plaques de chromatographie en couche mince au gel de silice car
ce type d'adsorbant offre généralement la meilleure possibilité de séparer la
toxine recherchée des autres constituants de la matrice. On peut utiliser des
plaques préenduites ou sur lesquelles on effectue soi-même l'étalement. Les
plaques qui doivent être enduites par l'opérateur permettent de choisir
librement les adsorbants et les additifs. Du sulfate de calcium peut être
ajouté pour fixer le gel de silice à la plaque de verre. Stubblefield (1979b)
a utilisé l'EDTA comme chélateur des contaminants dans le gel de silice pour
éviter que des taches de citrinine ne soient disposées en rangées. D'un autre
côté, les plaques préenduites sont prêtes à l'emploi; elles possèdent
généralement une couche plus uniforme et rigide et laissent quand même un
certain choix pour le support, par exemple du verre, du plastique ou de
l'aluminium. Les caractéristiques des plaques à antigène préfixé, tout comme
celles des plaques enduites par l'opérateur, peuvent différer d'une marque à
l'autre et parfois même d'un lot à l'autre, d'où un comportement différent en
matière de séparation comme on le voit sur la figure 17 où un mélange
d'aflatoxines B,, B2, G, et G2 a été séparé sur trois types différents de
plaques, après quoi celles-ci sont examinées sous rayonnement ultraviolet.
(Ces quatre principales aflatoxines ont été désignées d'après la couleur de
leur fluorescence (bleue, c'est-à-dire B pour "blue" en anglais, ou verte,
c'est-à-dire G pour "green" en anglais) et leur mobilité relative sur la
plaque de chromatographie en couche mince (valeur R,) .

Figure 17. Séparation d'un mélange d'étalons d'aflatoxine


sur plusieurs types de plaques de chromatographie en couche
mince au Si02.
- 33

Les plaques de chromatographie en couche mince peuvent avoir différents


formats. On peut résoudre la plupart des problèmes de séparation en utilisant
une plaque de 20 x 20 cm; toutefois, on pourra aussi obtenir souvent des
résultats satisfaisants avec des plaques de 10 x 10 cm ou même en découpant
soi-même des plaques de 7 x 7 cm. L'emploi de plaques de taille plus
restreinte fait gagner beaucoup de temps, surtout pour les opérations de
séparation bidimensionnelle. Comme exemples de méthodes d'analyse où la
séparation bidimensionnelle est effectuée sur de petites plaques de
chromatographie en couche mince, on peut citer la méthode multi-mycotoxines
de Patterson (1979) , les méthodes de van Egmond (1980) pour le dosage de la
stérigmatocystine dans le fromage, la méthode de Stubblefield (1981) pour le
dosage des aflatoxines dans les tissus animaux et la méthode de Paulsch (1982)
pour le dosage de 1'ochratoxine A dans les rognons de porc. De plus, l'emploi
de plaques de taille plus restreinte offre la possibilité de les développer
non seulement dans des dispositifs spécialement conçus à cet effet, mais aussi
dans de simples béchers, ce qui est très intéressant pour les laboratoires ne
possédant que peu de verrerie. Elles peuvent aussi être utilisées par séries
de 10 simultanément sur un support multiplaques (figure 18) , ce qui réduit
notablement la durée totale requise pour une série d'opérations de
chromatographie en couche mince.

iSséW

Figure 18. Support en acier inoxydable pour la chromatographie


parallèle de 10 plaques de chromatographie en couche mince
de 6,7 x 6,7 cm.
34

Pour le dosage des mycotoxines en général par chromatographie en couche


mince, on dispose sur la plaque de 5 à 15/il d'extrait. Selon le degré
d'exactitude et de précision voulu, on utilise différents types d'étaleurs.
Pour le criblage, on utilise les pipettes capillaires qualitatives à usage
unique ou seringues de précision, qui permettent d'opérer avec plus
d'exactitude et de précision. Qui plus est, les seringues permettent
d'appliquer des volumes plus importants par intermittence sous atmosphère
inerte en les utilisant avec un distributeur à répétition incorporé dans le
dispositif servant à déposer les taches. Le dépôt des taches d'échantillon et
d'étalon est normalement effectué selon un certain schéma prescrit dans le
cadre de l'opération d'analyse dans son ensemble. Différents schémas de
répartition des taches sont applicables pour la chromatographie en couche
mince unidimensionnelle ou bien, dans le cas des extraits "souillés", la
chromatographie en couche mince bidimensionnelle. Dans la chromatographie en
couche mince bidimensionnelle, l'extrait d'échantillon est déposé à un angle
de la plaque et deux opérations de développement sont effectuées
successivement parallèlement aux deux côtés de la plaque avec deux solvants
différents. Les deux solvants doivent être compatibles et indépendants, c'est-
à-dire qu'il ne doit y avoir que peu de corrélation entre les schémas de
rétention des deux systèmes, faute de quoi les taches ont tendance à
s'agglomérer le long de la bissectrice de la plaque.

On peut citer comme exemple de l'utilisation de la chromatographie en


couche mince bidimensionnelle la procédure suivie en conformité avec la
méthode officielle des Communautés européennes pour le dosage de
l'aflatoxine B, dans les produits d'alimentation animale (Commission des
Communautés européennes, 1976) (figure 19): on dépose en taches une aliquote
d'extrait en A et des quantités connues de l'étalon d'aflatoxine B, en B. La
plaque est ensuite développée selon la première orientation avec un mélange
d'éther éthylique, de méthanol et d'eau (94+4,5+1,5) et, après séchage, on
fait décrire à la plaque un angle de 90° et on la développe selon la seconde
orientation avec un mélange de chloroforme et d'acétone (9+1). La détection
et le dosage sont effectués sous exposition à un rayonnement ultraviolet dans
la région des grandes longueurs d'ondes (365 nm). La figure 20 illustre le
résultat d'une séparation par chromatographie en couche mince bidimensionnelle
d'un extrait de beurre d'arachides contaminé par de l'aflatoxine B,. Avec
l'aide des étalons d'aflatoxine B, développés simultanément, il est possible
de localiser la tache d'aflatoxine B, bien séparée provenant de l'échantillon.
Un densimètre permet de comparer l'intensité de la fluorescence de la tache
d'aflatoxine B, provenant de l'échantillon et de la tache provenant de
l'étalon et l'on peut ainsi calculer la concentration d'aflatoxine B, dans
l'échantillon initial.

Si l'on ne dispose pas d'un densimètre, ce qui sera souvent le cas dans
les pays en développement, on peut recourir au schéma de taches disposées
perpendiculairement à la diagonale tel que l'avait mis au point à l'origine
Beljaars (1973) pour le dosage de l'aflatoxine B, dans les arachides
(figure 21): on dispose en taches une aliquote d'un extrait de l'échantillon
en A et différentes quantités de l'étalon d'aflatoxine B, en B. La plaque est
soumise à un développement bidimensionnel et la détection et le dosage sont
de nouveau effectués sous rayonnement ultraviolet (figure 22). Avec l'aide de
la rangée d'étalons d'aflatoxine B, soumis à un développement bidimensionnel,
il est possible de localiser l'aflatoxine B, provenant de l'extrait et
d'estimer sa concentration en comparant l'intensité de sa fluorescence avec
- 35 -

celle des différents étalons d'aflatoxine B,. Etant donné que toutes les
taches d'aflatoxine B, sont alignées et assez proches l'une de l'autre, une
telle estimation est plus facile qu'une comparaison visuelle avec des taches
d'étalon développées dans les bandes latérales, comme c'est le cas pour le
schéma de taches densimétrique. Toutefois, cette technique n'est applicable
que si les taches d'étalon apparaissent dans une partie "libre" de la plaque
après le développement bidimensionnel.

Orientation 1
>•

B

• m

A B B

A
• • •

A : extrait de l'échantillon . . . • • .
B: étalon d'aflatoxine 0 5 cm

Figure 19. Disposition des taches Figure 20. Séparation d'un extrait
pour la chromatographie en couche de beurre d'arachides soumis à la
mince bidimensionnelle (dosage chromatographie en couche mince
densimétrique). bidimensionnelle avec utilisation
d'un schéma de répartition des
taches densimétrique.

Des méthodes de chromatographie en couche mince bidimensionnelle ont


également été mises au point pour le dosage d'autres mycotoxines telles que
la zéaralénone (Jemmali, 1977), la stérigmatocystine (van Egmond, 1980) et
1'ochratoxine A (Paulsch, 1982) (figure 1), ainsi que pour une méthode
multimycotoxines (Patterson, 1979).
- 36 -

Les aflatoxines ayant h e u r e u s e m e n t pour caractéristique d'émettre sous


f o r m e de f l u o r e s c e n c e l ' é n e r g i e d u r a y o n n e m e n t u l t r a v i o l e t à g r a n d e s l o n g u e u r s
d'ondes qu'elles ont absorbé, l'opérateur effectuant l'analyse peut déceler
c e s c o m p o s é s à de f a i b l e s n i v e a u x . M a l h e u r e u s e m e n t , t o u t e s les m y c o t o x i n e s n e
peuvent pas être décelées par une méthode aussi simple. Beaucoup de
m y c o t o x i n e s ne deviennent pas fluorescents sous rayonnement ultraviolet;
c e r t a i n e s a b s o r b e n t les r a y o n n e m e n t s u l t r a v i o l e t s o u la l u m i è r e v i s i b l e ,
t a n d i s q u e d ' a u t r e s n e le f o n t p a s . D a n s ce d e r n i e r c a s , o n p e u t p a r f o i s
r e n d r e l a m y c o t o x i n e v i s i b l e e n p u l v é r i s a n t u n r é a c t i f s u r la p l a q u e o u e n
e x p o s a n t c e l l e - c i à d e s v a p e u r s de r é a c t i f . O n p e u t c i t e r c o m m e e x e m p l e de
c e t t e p r o d u c t i o n d ' u n d é r i v é la t e c h n i q u e de p u l v é r i s a t i o n u t i l i s é e p o u r
r e n d r e v i s i b l e la s t é r i g m a t o c y s t i n e , u n e t o x i n e p a r f o i s p r é s e n t e d a n s les
c é r é a l e s ( S c o t t ) e t d a n s le f r o m a g e ( N o r t h o l t , 1 9 8 0 ) . S t a c k ( 1 9 7 1 ) a d é c o u v e r t
q u e la p u l v é r i s a t i o n d ' u n e s o l u t i o n de A 1 C 1 3 c o n d u i t à u n c o m p l e x e A l a v e c les
g r o u p e m e n t s c é t o e t h y d r o x y l e de la m o l é c u l e de s t é r i g m a t o c y s t i n e ( f i g u r e 1 ) ,
ce q u i a c c e n t u e e n v i r o n c e n t f o i s l ' i n t e n s i t é de la f l u o r e s c e n c e . D ' a u t r e
p a r t , la c o u l e u r de la f l u o r e s c e n c e v i r e d u r o u g e b r i q u e a u j a u n e . U n e a u t r e
a p p l i c a t i o n d u r é a c t i f A 1 C 1 3 e s t i n c l u s e d a n s la p r o c é d u r e de d o s a g e d u
d é o x y n i v a l é n o l ( D O N ) ( f i g u r e 1 ) , o ù l ' o n u t i l i s e d e s p l a q u e s a u g e l de s i l i c e
i m p r é g n é e s d e A 1 C 1 3 ( T r u c k s e s s , 1 9 8 4 ) . U n e f o i s c h a u f f é e la p l a q u e de
c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e d é v e l o p p é e , le D O N a p p a r a î t s o u s é c l a i r a g e
u l t r a v i o l e t à g r a n d e l o n g u e u r d ' o n d e s s o u s la f o r m e d ' u n e t a c h e de
fluorescence bleue.

M a l g r é t o u t e s les t e c h n i q u e s d ' é p u r a t i o n a u x q u e l l e s o n a r e c o u r s , il
subsiste des substances qui se comportent pendant la séparation
c h r o m a t o g r a p h i q u e e n c o u c h e m i n c e de la m ê m e f a ç o n q u e la m y c o t o x i n e q u ' o n
c h e r c h e à d o s e r . P o u r r é d u i r e a u m i n i m u m le r i s q u e de r é s u l t a t s f a u s s e m e n t
p o s i t i f s , il f a u t c o n f i r m e r l ' i d e n t i t é de la m y c o t o x i n e d a n s les é c h a n t i l l o n s
p o s i t i f s , surtout quand l'opérateur n'a pas une grande expérience du titrage
d e s m y c o t o x i n e s . L a m é t h o d e la p l u s f i a b l e à c e t t e f i n e s t la s p e c t r o m é t r i e
de m a s s e à h a u t e r é s o l u t i o n . T o u t e f o i s , la s p e c t r o m é t r i e de m a s s e à h a u t e
r é s o l u t i o n a s s o c i é e à la c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e e s t u n e p r o c é d u r e
a s s e z l o n g u e e t la p l u p a r t d e s l a b o r a t o i r e s d a n s les p a y s e n d é v e l o p p e m e n t n e
s e r o n t p a s d o t é s de ce t y p e d ' é q u i p e m e n t c o m p l e x e . Il l e u r f a u d r a d o n c
a p p l i q u e r d e s t e c h n i q u e s p l u s s i m p l e s . S a n s d o u t e les m o y e n s les p l u s s i m p l e s
de c o n f i r m e r la p r é s e n c e de m y c o t o x i n e s s o n t - i l s l ' u t i l i s a t i o n de s y s t è m e s de
solvants supplémentaires ou l'application d'une chromatographie
s u p p l é m e n t a i r e , l ' o p é r a t i o n de c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e é t a n t a l o r s
r é p é t é e a v e c u n é t a l o n i n t e r n e q u i e s t s u r i m p o s é s u r la t a c h e d ' e x t r a i t a v a n t
le développement de la p l a q u e . A p r è s achèvement de l'opération de
c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e , c e t é t a l o n s u r i m p o s é e t la t a c h e " p r é s u m é e "
de t o x i n e p r o v e n a n t de l ' é c h a n t i l l o n d o i v e n t c o ï n c i d e r . U n e a u t r e p o s s i b i l i t é
c o n s i s t e à p u l v é r i s e r u n r é a c t i f s u r la p l a q u e de c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e
m i n c e d é v e l o p p é e , de s o r t e q u e la c o u l e u r (de f l u o r e s c e n c e ) de la t a c h e de
m y c o t o x i n e c h a n g e . C o m m e e x e m p l e de c e t t e d e r n i è r e p o s s i b i l i t é , o n p e u t c i t e r
l ' é p r e u v e de p u l v é r i s a t i o n a v e c u n e s o l u t i o n d i l u é e d ' a c i d e s u l f u r i q u e ( S m i t h ,
1 9 6 2 ) q u i e n t r a î n e u n c h a n g e m e n t de c o u l e u r de la f l u o r e s c e n c e , les t a c h e s
d ' a f l a t o x i n e v i r a n t d u b l e u a u j a u n e . B i e n q u e les é p r e u v e s d é c r i t e s p l u s
h a u t , s i e l l e s d o n n a i e n t u n r é s u l t a t n é g a t i f , e x c l u r a i e n t la p r é s e n c e de la
m y c o t o x i n e r e c h e r c h é e , c e l l e - c i n e s e r a i t t o u t e f o i s p a s c o n f i r m é e e n c a s de
résultat positif.
37

Orientation 1

• CD

B

B

•B
A
• B

A: extrait de l'échantillon
B: étalon d'aflatoxine O 5 cm

Figure 21. Disposition des taches Figure 22. Séparation d'un extrait
selon un schéma antidiagonal pour la de beurre d'arachides soumis à la
chromatographic en couche mince chromatographie en couche mince
bidimensionnelle (dosage visuel). bidimensionnelle avec utilisation
du schéma de répartition des taches
antidiagonal.

L'identification positive peut être obtenue par formation de dérivés


spécifiques possédant des propriétés chromatographiques modifiées. L'étalon
de mycotoxine et l'échantillon suspect sont tous deux soumis à la même
réaction de dérivation. En conséquence, dans les échantillons positifs on
devrait observer l'apparition d'un dérivé de la mycotoxine identique au dérivé
provenant de l'étalon. Les réactions de confirmation peuvent être effectuées
dans des éprouvettes ou, de préférence, directement sur une plaque de
chromatographie en couche mince, exploitant ainsi le pouvoir de séparation de
la chromatographie en couche mince. Comme exemple de cette dernière technique,
on peut citer la procédure de confirmation adoptée pour la méthode
officiellement préconisée par les Communautés européennes pour le dosage de
l'aflatoxine dans les produits d'alimentation animale et publiée à l'origine
par Verhülsdonk (1977). Cette méthode comporte une procédure dite de
séparation-réaction-séparation (figure 23). On pulvérise de l'acide
chlorhydrique après la première opération de séparation et la réaction a lieu.
On procède ensuite à une deuxième séparation selon la seconde orientation dans
des conditions identiques, après quoi la tache isolée à fluorescence bleue de
l'aflatoxine BZa, un "adduct aqueux" de l'aflatoxine B,, est visible et peut
être identifiée à l'aide d'un étalon d'aflatoxine B, déposé en taches sur la
- 38 -

même plaque et ayant subi la même procédure. D'autres constituants (non soumis
à réaction) sont disposés en diagonale, formant une bissectrice sur la plaque,
du fait que la séparation a été effectuée selon les deux orientations dans des
conditions rigoureusement identiques. La figure 24 illustre le résultat d'une
telle épreuve de confirmation appliquée à un produit d'alimentation animale
contaminé par les aflatoxines B, et G,.

Séparation Réaction Séparation


r
B

A B
• •

A: dépôt des taches de l'échantillon ^ o Produit de réaction spécifique


B: dépôt des taches de l'étalon Zone à pulvériser

Figure 23. Représentation schématique


de l'épreuve de confirmation bidimen-
sionnelle de Verhülsdonk (1977).
t

Figure 24. Résultat de l'épreuve de


confirmation de Verhülsdonk (1977
appliqué à un produit d'alimentation
pour lapins.

Les techniques décrites pour confirmer la présence d'aflatoxine B, sont


également applicables à l'aflatoxine G,, mais non aux aflatoxines B2 et G2 dont
l'anneau furannique terminal est saturé. Une épreuve de confirmation in situ
a aussi été mise au point pour l'aflatoxine M, par Trucksess (1976). Une
réaction est effectuée entre l'acide trifluoroacétique et l'aflatoxine M, sur
la tache d'origine d'une plaque de chromatographie en couche mince avant
développement de la plaque.
39 -

Les méthodes de dérivation in situ sur plaques suivies de la


chromatographie en couche mince des produits de réaction pour déterminer
l'identité des mycotoxines autres que les aflatoxines sont assez rares. Van
Egmond (1980) a décrit une épreuve de confirmation de l'identité de la
stérigmatocystine (voir figure 1) dans un extrait de fromage. Pour cette
épreuve, qui repose sur les principes de la procédure de séparation-réaction-
séparation (voir figure 23), un mélange d'acide trifluoroacétique et de
benzène est pulvérisé sur une plaque de chromatographie en couche mince et,
après la réaction et une seconde opération de développement, le produit de
réaction est rendu visible au moyen d'une pulvérisation de A1C13 (Stack,
1971) . Paulsch (1982) a mis au point une épreuve de confirmation pour
1'ochratoxine A (voir figure 1) dans les rognons de porc en s'inspirant des
découvertes de Kleinau (1981). Les taches d'ochratoxine A séparées après
chromatographie en couche mince bidimensionnelle sont estérifiées sur la
plaque de chromatographie en couche mince au moyen d'un mélange de méthanol
et d'acide sulfurique, après quoi la plaque est développée pour la troisième
fois. L'ester méthylique de 1 'ochratoxine A est visible sous rayonnement
ultraviolet dans les grandes longueurs d'ondes sous forme d'une tache
fluorescente ayant une valeur R, supérieure à celle de 1'ochratoxine A. Comme
1'ochratoxine A, l'ester méthylique change de couleur de fluorescence, virant
du vert au bleu quand on fait passer le pH de la plaque de l'acide à l'alcalin
en l'exposant à-la vapeur d'ammoniac; ce phénomène peut alors être considéré
comme une confirmation d'identité supplémentaire.

Depuis quelques années, la chromatographie en couche mince en tant que


technique utilisable pour séparer les mycotoxines des autres composantes de
la matrice a cédé le pas à la chromatographie liquide sous haute pression et,
dans une moindre mesure, à la chromatographie gaz-liquide (en particulier
pour le dosage des trichothécènes). Un nouveau recul sera probablement
enregistré dans un proche avenir en faveur des titrages immunologiques,
surtout le titrage avec immunoadsorbant lié à une enzyme. Néanmoins, la
chromatographie en couche mince est une technique fiable, relativement simple
et encore souvent utilisée pour le dosage des mycotoxines, surtout dans son
application bidimensionnelle qui offre une bonne résolution et, par
conséquent, des seuils de détection bas. La chromatographie en couche mince
a pour avantages particuliers la possibilité d'effectuer des opérations de
dérivation in situ pour confirmer la présence des mycotoxines, l'aptitude à
garder des plaques en réserve pour interprétation ultérieure et le fait que
l'opérateur a un certain "contact" avec le résultat de la séparation, puisque
l'oeil humain lui-même peut agir comme détecteur. La chromatographie en couche
mince est particulièrement recommandée aux personnes qui n'ont que peu
d'expérience de l'analyse des produits d'alimentation humaine et animale pour
le dosage des mycotoxines et qui ne peuvent pas se permettre d'acheter un
appareillage de haute technicité.

c. Chromatographie liquide sous haute pression

Dans la chromatographie liquide sous haute pression, des particules


d'adsorbant sont fortement comprimées dans un tube (colonne) et la phase
mobile est pompée à travers la colonne sous haute pression. La chromatographie
liquide sous haute pression a commencé à pouvoir être utilisée pour l'analyse
des produits d'alimentation humaine au début des années 1970 et le premier
document décrivant son application pour la recherche sur les mycotoxines date
probablement de 1973 (Seiber, 1973). Après des débuts quelque peu hésitants,
cette technique a revêtu une importance croissante pour le dosage des
- 40 -

mycotoxines, surtout à partir de l'époque où l'on a pu disposer de plusieurs


types de supports et de détecteurs de fluorescence. L'introduction d'auto-
échantillonneurs et de systèmes de recherche des données informatisées a fait
de la chromatographic liquide sous haute pression en principe un outil très
utile pour les analyses de grande envergure.

Lors des premières applications pour le titrage des aflatoxines, on a


utilisé des colonnes de Si02 associées à des phases mobiles contenant du
chloroforme ou du dichlorométhane, le dépistage étant effectué au moyen de
détecteurs ultraviolets (A = 254 nm ou 365 nm) (Seiber, 1973) (Pons, 1976)
(Kmieciak, 1976). Cependant, la détection aux ultraviolets n'est pas très
sélective alors que les seuils de détection obtenus pour les aflatoxines sont
relativement élevés (de l'ordre d'environ 1 à 2 ng pour chaque aflatoxine
(Pons, 1976) ou, exprimés comme seuils de détection limites, environ 50 /ig
d'aflatoxine B, par kilogramme d'arachides (Kmieciak, 1976)). Aussi a-t-on
dans une large mesure renoncé à employer les détecteurs aux ultraviolets pour
le titrage des aflatoxines dès qu'on a pu disposer des détecteurs de
fluorescence plus sélectifs. Au départ, le pouvoir de détection des détecteurs
de fluorescence était également limité parce que les aflatoxines B, et B2 ne
développent pas une forte fluorescence dans les solvants de phase normale et
que les aflatoxines B, et G, n'ont pas une fluorescence marquée dans les
solvants de phase inverse. Par conséquent, les seuils de détection pour ces
aflatoxines ne pouvaient en aucune façon concurrencer ceux qu'on obtenait avec
la chromatographie en couche mince. Des efforts ont été entrepris pour
améliorer l'intensité de la fluorescence des aflatoxines et ils ont abouti
aux quatre principales techniques suivantes:

1) Dans les méthodes d'épreuve de Takahashi (1977) et de Haghighi


(1981), la solution échantillon et la solution témoin sont traitées à l'acide
(acide trifluoroacétique) pour que les aflatoxines B, et G, soient transformées
en leurs hémiacétals respectifs B2a et G2a. Les hémiacétals deviennent
fluorescents aussi fortement que les aflatoxines B2 et G2 dans des solvants de
phase inverse. Cette technique a pour inconvénient qu'elle nécessite une étape
supplémentaire pour la transformation chimique. En outre, on peut se demander
si la transformation a toujours lieu sur le plan quantitatif.

2) Panalaks (1977) et Zimmerli (1977) ont introduit l'emploi de


supports au gel de silice pour la détection fluorimétrique des aflatoxines
dans des solvants de phase normale. A l'état adsorbé, les aflatoxines B, et
B2 développent une fluorescence beaucoup plus intense qu'en solution. Les
seuils de détection ainsi atteints sont du même ordre de grandeur que ceux
qu'on obtient avec la chromatographie en couche mince avec détection de
fluorescence. La durée de vie de la cellule contenant le support peut varier
selon le nombre et l'état des échantillons qui sont injectés. Dans la
pratique, la cellule est contaminée du fait que des dépôts provenant
d'extraits souillés s'accumulent sur le gel de silice à la longue, ce qui
nécessite des changements fréquents. Cet inconvénient restreint l'emploi de
cette technique, surtout quand le détecteur n'a pas de cellule aisément
accessible. Panalaks (1977) a indiqué qu'on pouvait utilement régénérer la
cellule en y pompant un solvant plus polaire, parce qu'ainsi la transparence
du gel de silice était modifiée.

3) Manabe (1978) a introduit une nouvelle phase mobile qui empêchait


l'extinction habituelle des aflatoxines B, et B2. Avec un solvant composé d'un
mélange de toluène, d'acétate d'éthyle, d'acide formique et de méthanol, la
41 -

quantité décelable minimale d'aflatoxine B, serait d'environ 0,3 ng, alors que
l'application de la méthode de Manabe aux produits d'alimentation humaine et
animale a révélé que des quantités des quatre afltoxines B,, B2, G, et G2 de
10 à 20 /¿g/kg étaient encore décelables. Par rapport aux autres techniques
utilisées pour accentuer la fluorescence des aflatoxines B, et B2, les seuils
de détection indiqués par Manabe (1978) ne sont pas très impressionnants;
toutefois, cette technique est la plus facile à appliquer. Elle a pour
inconvénient la décomposition possible des aflatoxines B, et G, sur la colonne
par suite de la présence d'acide dans la phase mobile. Il faut veiller à ne
pas employer de trop grandes quantités d'acide et vérifier avec des témoins
s'il se produit une décomposition dans les conditions de séparation optimales.

4) Davis (1979) a signalé le traitement des aflatoxines B, et G, à


l'iode pour produire des dérivés dotés d'une fluorescence plus intense. Davis
a appliqué cette découverte à la chromatographie liquide sous haute pression
de phase inverse (1980) et cette application a été encore affinée par Thorpe
(1982) qui a décrit la dérivation en aval de la colonne pour la détection des
aflatoxines par chromatographie liquide sous haute pression de phase inverse.
L'addition d'iode accroit d'environ 50 fois la fluorescence des aflatoxines
B, et G, sans modifier la fluorescence des aflatoxines B2 et G2. Cette méthode
a pour avantage que le dérivé se forme à partir d'un pic d'aflatoxine déjà
séparée, ce qui signifie que les conditions de réaction pour l'échantillon et
pour le témoin sont les mêmes, l'apparition de produits de réaction multiples
n'étant pas importante tant que la réaction est renouvelable. Comme autres
avantages il convient de mentionner qu'il est seulement nécessaire de dériver
la fraction de l'échantillon à injecter dans le dispositif de chromatographie
liquide et qu'il est possible de pratiquer des injections consécutives dans
l'appareil avec ou sans addition de réactif en aval, ce qui confirme la
présence ou l'absence des aflatoxines B, et G,. Cette méthode s'est révélée
satisfaisante pour l'analyse d'échantillons de maïs et de beurre de cacahuètes
(contaminés à des niveaux variant de 0,5 à 2,0 /¿g/kg) et, par ailleurs, on a
mis au point des méthodes qui permettent de doser les aflatoxines dans des
aliments composés pour animaux contenant des agrumes à raison d'environ
1 /¿g/kg (Tuinstra, 1983) (van Egmond, 1987b). La pulpe d'agrumes est un
ingrédient très apprécié en Europe pour les produits d'alimentation animale
et elle perturbe notoirement nombre d'opérations de chromatographie en couche
mince et de chromatographie liquide sous haute pression. Aussi la méthode de
van Egmond (1987b) est-elle actuellement envisagée pour une étude concertée
de la Communauté européenne en vue de son adoption comme méthode officielle
de la Communauté. La figure 25 montre un chromatogramme obtenu par
chromatographie liquide sous haute pression de phase inverse, à parti d'un
extrait de produit d'alimentation animale contenant de la pulpe d'agrumes
préparé selon cette méthode.

Les méthodes de chromatographie liquide sous haute pression sont


désormais applicables aussi à l'analyse du lait et des produits laitiers pour
la détection de l'aflatoxine M! (voir figure 1). La plupart de ces méthodes
font appel à la chromatographie liquide sous haute pression de phase inverse,
ce qui n'entraine aucun problème du point de vue de la détection. L'aflatoxine
M, produit une fluorescence beaucoup plus intense dans les solvants de phase
inverse que l'aflatoxine B,, de sorte qu'aucune disposition particulière en
matière de dérivation ne s'impose. Les seuils de détection sont comparables
à ceux qu'on obtient avec la chromatographie en couche mince
(bidimensionnelle) et certaines de ces méthodes sont déjà largement utilisées
dans les programmes de surveillance. La figure 26 montre à titre d'exemple une
- 42

excellente séparation par chromatographic liquide sous haute pression d'un


extrait de lait en poudre préparé selon la méthode de Stubblefield (1979a).
Outre les aflatoxines, des méthodes de séparation par chromatographie liquide
sous haute pression ont également été mises au point pour d'autres
mycotoxines. La plupart de ces méthodes font appel à la détection aux
ultraviolets; toutefois, pour diverses mycotoxines (à savoir 1'ochratoxine A,
la zéaralénone, quelques alcaloïdes de l'ergot et quelques toxines
d'Alternaría). les détecteurs de fluorescence se sont révélés utiles. Il n'y
a pas lieu de passer en revue ici toutes les méthodes existantes qui ont fait
l'objet de publications; les personnes que la question intéresse pourront se
reporter à une étude complète de Scott (1981) contenant de nombreuses
précisions techniques.

La chromatographie liquide sous haute pression a remplacé en partie la


chromatographie en couche mince pour l'analyse des produits d'alimentation
humaine en vue de la détection des mycotoxines. Les raisons sont évidentes.
La séparation ne prend que quelques minutes, les méthodes de chromatographie
liquide sous haute pression fournissent généralement des données chiffrées
satisfaisantes et le matériel employé dans ces systèmes peut être automatisé
très facilement, ce qui rend cette technique attrayante pour les laboratoires
procédant à des épreuves systématiques et pour les laboratoires de contrôle
de la qualité.

La chromatographie liquide sous haute pression comporte aussi des


limitations. Bien que le pouvoir de résolution soit bien meilleur qu'avec la
chromatographie en couche mince unidimensionnelle, l'utilisation de la méthode
bidimensionnelle n'est guère possible avec la chromatographie liquide sous
haute pression. Or, c'est précisément cette dernière technique qui s'est
révélée être un puissant instrument de séparation lorsqu'elle est appliquée
avec la chromatographie en couche mince, surtout quand des seuils de détection
bas sont nécessaires pour des extraits d'échantillons "souillés". Le coût du
matériel pour la chromatographie en couche mince (hormis les densimètres) est
relativement peu élevé par rapport à celui des instruments très onéreux
nécessaires pour la chromatographie liquide sous haute pression. La vaste
expérience requise pour profiter au maximum d'un système de chromatographie
liquide sous haute pression constitue un autre obstacle, alors qu'on peut
apprendre assez facilement à utiliser la chromatographie en couche mince. Les
quelques études dont les résultats ont été publiés et qui comparent la
chromatographie liquide sous haute pression à la chromatographie en couche
mince pour le dosage des aflatoxines dans les arachides (Crosby, 1978) et dans
le maïs et les arachides (De Vries, 1982) ont indiqué que les deux techniques
fournissent des résultats qui concordent d'une manière assez satisfaisante.
Dans les pays en développement, il ne faut pas renoncer à la légère à la
simplicité et au bas prix de la chromatographie en couche mince en faveur de
la chromatographie liquide sous haute pression qui parait plus séduisante. Il
faut garder présent à l'esprit que les systèmes de haute technicité comportent
des points faibles s'il est difficile d'obtenir des fournitures, des pièces
de rechange et des services, comme cela peut être le cas dans beaucoup de pays
en développement, si bien que le choix ne doit pas se porter en premier lieu
sur la chromatographie liquide sous haute pression lorsqu'on se prépare dans
ces pays à mettre en place un système de surveillance et de contrôle des
mycotoxines dans les denrées agricoles. Il faut veiller à ne pas choisir au
hasard une technique complexe par simple amour de la haute technicité!
- 43 -

O 5 10 15 20

>. min.
Figure 25. Chromatogramme (chromatographie liquide sous haute pression de
phase inverse) C18 d'un extrait de produit d'alimentation animale contenant de
la pulpe d'agrumes et contaminé par les aflatoxines B,, B2 , G, et G2 à raison
d'environ 12, 3, 8 et 1 pg/kg respectivement, préparé selon van Egmond
(1987) .

Pic M

0 5 10
Durée de rétention (min.)

Figure 26. Chromatogramme (chromatographie liquide sous haute pression de


phase inverse) C18 d'un extrait de lait en poudre contenant environ 0,4 ¡ug
d'aflatoxine M,/kg, préparé selon Stubblefield (1979) (reproduit avec
l'aimable autorisation du Dr Mulders, Pays-Bas).
- 44 -

d. Chromatographie en phase gazeuse

Dans la chromatographie en phase gazeuse, la phase mobile est un gaz


porteur, acheminé à travers une colonne contenant un adsorbant solide ou une
phase fixe liquide. La chromatographie en phase gazeuse n'a connu qu'un emploi
limité pour l'analyse des mycotoxines car la plupart de celles-ci ne sont pas
volatiles et doivent donc être dérivées avant de pouvoir faire l'objet d'une
chromatographie en phase gazeuse. De plus, le fait que beaucoup des
mycotoxines sont aisément décelées et dosées à de faibles concentrations avec
les techniques de chromatographie en couche mince et de chromatographie
liquide sous haute pression, ainsi qu'il a été exposé dans les paragraphes qui
précèdent, n'a guère stimulé le développement des titrages par chromatographie
en phase gazeuse.

Bien que quelques méthodes de chromatographie en phase gazeuse aient été


mises au point dans les années 1970 pour la détection et le dosage de la
patuline (voir figure 1) dans le jus de pomme (Pohland, 1970), de l'acide
pénicillique dans le maïs et dans le riz (Pero, 1972) et de la zéaralénone
dans le maïs (Mirocha, 1974), le seul avantage appréciable par rapport à la
chromatographie en couche mince et à la chromatographie liquide sous haute
pression est la possibilité d'utiliser des spectromètres de masse comme
détecteurs hautement sélectifs et sensibles. Toutefois, la situation est tout
autre pour un groupe important de mycotoxines, les trichothécènes, dont font
partie la toxine T-2 et le déoxynivalénol (voir figure 1). L'emploi de la
chromatographie en couche mince et de la chromatographie liquide sous haute
pression est difficile pour le dosage chimique des trichothécènes parce que
ces composés ne produisent aucune fluorescence, pas plus qu'ils n'absorbent
de façon appréciable les rayons ultraviolets. Bien qu'on ait mis au point des
méthodes de chromatographie en couche mince utilisant des réactifs de
visualisation, les seuils de détection obtenus sont relativement élevés par
rapport à la chromatographie en phase gazeuse. Celle-ci permet de déceler et
de doser la plupart des trichothécènes les plus courants. Les trichothécènes
peuvent être soumis à une chromatographie en phase gazeuse par le biais de
leurs dérivés triméthylsilvyl- (TMS) ou heptafluorobutyryl- (HBF), tandis que
pour la détection il faut s'en remettre à des détecteurs à ionisation de
flamme et à des détecteurs de capture d'électrons. Etant donné que les
trichothécènes ne revêtent qu'une importance mineure dans les pays en
développement, nous n'insisterons pas davantage ici sur les techniques de
chromatographie en phase gazeuse utilisables pour leur dosage. Nous
n'examinerons pas non plus la possibilité d'employer la chromatographie en
phase gazeuse en association avec des spectromètres de masse pour le titrage
quantitatif des mycotoxines dans les denrées agricoles. L'utilisation pratique
de ces systèmes complexes est limitée aux laboratoires qui disposent des
moyens financiers leur permettant d'acheter ces instruments très onéreux
commandés par ordinateur.

Méthodes immunochimiques

Par rapport à la chromatographie, les méthodes immunochimiques reposent


sur des principes tout à fait différents. Elles mettent en jeu une liaison
réversible entre des antigènes (la substance à analyser, par exemple une
mycotoxine) et des anticorps sélectifs, ce qui aboutit à un complexe
spécifique antigène-anticorps. On peut produire des anticorps en immunisant
des animaux d'expérience au moyen d'un immunogène. On peut alors obtenir à
partir de leur sang un immunsérum. Parfois 1'immunogène est identique à
45 -

l'antigène, par exemple pour les protéines ou les polypeptides d'un poids
moléculaire supérieur à 5000 Dalton. En règle générale, les mycotoxines ont
un poids moléculaire trop faible pour produire directement des anticorps quand
elles sont administrées à des animaux. Ces substances qu'on appelle des
haptènes doivent être conjuguées par covalence avec des protéines avant que
l'immunisation puisse se produire. Les anticorps (immunsérums) sont un groupe
de protéines sériques aussi appelées immunoglobulines. La plupart des
immunoglobulines appartiennent à la classe IgG. Du fait qu'il existe pour ces
immunoglobulines des sites de réaction non seulement pour les anticorps mais
aussi pour les déterminants antigéniques, elles peuvent elles-mêmes servir
d'antigènes quand elles sont injectées dans un organisme animal étranger.
Cette possibilité est exploitée dans certains types de titrages immunologiques
(par exemple le titrage avec immunoadsorbant lié à une enzyme opérant par
immuno cap ture, dont il est question plus loin). Il n'entre pas dans les
limites du présent chapitre d'exposer en détail la conjugaison des haptènes
et la production d'anticorps dirigés contre les mycotoxines. Plus important
est de savoir que des immunsérums dirigés contre certaines des mycotoxines
(des aflatoxines en particulier) ont été produits (Chu, 1983). Certains de ces
immunsérums sont aujourd'hui disponibles dans le commerce, quoique le plus
souvent uniquement dans des nécessaires d'épreuve.

Les techniques immunoanalytiques classiques reposent sur l'interaction


(en solution) des antigènes originels et d'anticorps spécifiques, aboutissant
à la précipitation du complexe antigénique. Cette précipitation est fonction
de la concentration d'antigène ou d'anticorps et permet de mesurer des
concentrations antigéniques (en solution) de l'ordre du /i g-mg/ml. Quand
l'antigène est présent en faibles concentrations, comme c'est habituellement
le cas pour les mycotoxines, il faut mettre en compétition l'antigène marqué
avec l'antigène à doser pour mesurer indirectement la formation du complexe.
Le marqueur peut être une enzyme, un radio-isotope ou quelque autre substance
susceptible d'être décelée et mesurée. Pour le dosage des mycotoxines,
l'utilisation des titrages immunologiques a été limitée à ce jour (1987) au
titrage immunoenzymatique et au titrage radio-immunologique.

a. Titrage immunoenzymatique

Dans le titrage immunoenzymatique, la liaison réversible entre antigène


et anticorps joue un rôle primordial, comme c'est le cas pour toutes les
méthodes immunochimiques. On peut mesurer indirectement la formation du
complexe antigène - anticorps en mettant en compétition l'antigène marqué par
une enzyme et l'antigène à doser. La quantité d'enzyme reflète l'importance
du complexe antigène-anticorps. Elle peut être mesurée au moyen d'un support
chromogène. A l'heure actuelle, la plupart des titrages immunoenzymatiques
utilisés pour le dosage des mycotoxines sont du type titrage avec
immunoadsorbant lié à une enzyme (ELISA). Dans la méthode ELISA, l'anticorps
ou l'antigène (conjugué) est immobilisé sur un support solide. On utilise
souvent comme support solide des microplaques ou des barrettes de
microtitrage. Il s'agit de plaques transparentes en polystyrène ou en chlorure
de polyvinyle comportant 96 petites cupules (dans le cas des barrettes: de 8
à 12 cupules) (voir figure 27) . Les plaques et barrettes de microtitrage
présentent plusieurs avantages par rapport aux tubes séparés. Elles sont plus
faciles à manipuler, elles peuvent être lavées et lues plus aisément et elles
conviennent pour de grandes séries d'analyses. On peut fixer d'une manière
assez uniforme et reproductible un anticorps ou un antigène conjugué à une
protéine sur les cupules des plaques ou barrettes de microtitrage. On obtient
- 46 -

••n — ^

> R ^ ^

Figure 27. Plaque et barrette de microtitrage pour


titrage avec immunoadsorbant lié à une enzyme.

KOE + KO
K K t OE :
Produit coloré
K O E + SLJ PP ort

Anticorps spécifique AE
K (fixé à la paroi)
O Antigène
Antigène marqué
par une enzyme (antigène)

Figure 28. Principe du titrage avec immunoadsorbant lié à


une enzyme avec mise en compétition.
- 47

cette fixation en déposant une solution contenant l'anticorps ou l'antigène


conjugué dans les cupules pendant une durée variant de quelques heures à une
journée. La solution est évacuée des cupules creuses après la fixation et la
phase solide est lavée à plusieurs reprises. Les plaques sèches ainsi enduites
peuvent être conservées. Généralement, les nécessaires d'épreuve ELISA vendus
dans le commerce contiennent des plaques et barrettes où l'anticorps ou
l'antigène a déjà été fixé en usine.

Au moment de la rédaction du présent ouvrage (1987) , des descriptions


de méthodes ELISA pour mycotoxines avaient été publiées non seulement pour
1 ' aflatoxine B, (Biermann, 1980a, 1980b), (Pestka, 1981), (Neogen Corporation,
1986), mais aussi pour l'aflatoxine M, (Harder, 1979), (Frémy, 1984),
(Jackman, 1985), (Màrtlbauer, 1985), 1'ochratoxine A (Morgan, 1982), (Lee,
1984), (Morgan, 1986), la stérigmatocystine (Kang, 1984) et la toxine T-2
(Pestka, 1981). L'application de la méthode ELISA pour la détection des
mycotoxines comporte plusieurs variantes: le titrage avec mise en compétition,
le titrage par saturation séquentielle, variante du précédent, et le titrage
par immunocapture (appelé aussi titrage immunométrique). Les principes
régissant ces méthodes sont décrits ci-après d'une manière concise:

Titrage avec mise en compétition (voir figure 28)

On fixe sur une plaque de microtitrage une quantité connue d'anticorps


dirigé contre la mycotoxine recherchée (l'antigène). Après lavage, on ajoute
la solution d'épreuve contenant une quantité inconnue de la mycotoxine,
conjointement avec une quantité connue de mycotoxine marquée par une enzyme.
La mycotoxine marquée et la mycotoxine libre sont en compétition pour se fixer
sur les sites actifs de l'anticorps. Après incubation, on lave de nouveau la
plaque et l'on procède au dosage de l'enzyme capturée en ajoutant un support
chromogène. L'intensité de la couleur qui en résulte peut être mesurée de
façon photométrique, par exemple au moyen d'un lecteur ELISA dans lequel on
peut disposer la plaque de microtitrage. On peut aussi mesurer la couleur ou
l'intensité de couleur de façon visuelle. Plus la concentration du produit de
la réaction enzymatique est faible, plus est faible la quantité d'enzyme liée
et plus est élevée la concentration de mycotoxine dans la prise d'essai.
Normalement, le dosage de la mycotoxine dans la prise d'essai s'effectue au
moyen d'une courbe type. On peut citer comme exemple du titrage avec mise en
compétition la méthode AgriscreenR de la Neogen Corporation (1986) , un
nécessaire vendu dans le commerce pour déceler l'aflatoxine B, dans les
produits d'alimentation humaine et animale (voir aussi section IV.d). Ce
nécessaire d'épreuve comporte des barrettes de microtitrage où l'anticorps est
préfixé en usine.

Titrage de saturation (voir figure 29)

Le titrage de saturation séquentielle est une variante du titrage avec


mise en compétition. On fixe sur une plaque de microtitrage une quantité
connue d'anticorps dirigé contre la mycotoxine recherchée. Après lavage, on
ajoute la solution d'épreuve contenant une quantité inconnue de la mycotoxine.
La mycotoxine à doser réagit avec une partie de l'anticorps fixé. Ensuite, les
anticorps restés libres sont titrés au moyen de la mycotoxine marquée par une
enzyme. La méthode se poursuit ensuite de la même façon que le titrage avec
mise en compétition. On peut citer comme exemple de ce titrage la méthode de
Biermann (1980a,b) pour le dosage de l'aflatoxine B, dans les produits
d'alimentation humaine.
- 48 -

K + 0 KO+ OE KO
K K KOE
+ support
Produit coloré
AE'

K Anticorps spécifique
O (fixé à la paroi)
Antigène (antigène)
O E Antigène marqué
par une enzyme

Figure 29. Principe du titrage avec immunoadsorbant lié


à une enzyme avec titrage de saturation.

Titrage par immunocapture (voir figure 30)

Pour le titrage par immunocapture, on fixe sur la plaque de microtitrage


la mycotoxine et non l'anticorps comme c'est le cas pour le titrage avec mise
en compétition et le titrge de saturation. (Pour que la fixation de la
mycotoxine soit possible, il faut d'abord la conjuguer à une protéine). On
ajoute aux cupules de la plaque de microtitrage où est fixée la mycotoxine la
solution d'épreuve contenant une quantité inconnue de mycotoxine et une
quantité fixe d'anticorps. L'anticorps qui n'a pas réagi avec la mycotoxine
de la solution d'épreuve se fixe sur la surface interne des cupules enduite
de mycotoxine. Cet anticorps capturé est habituellement une immunoglobuline
de lapin. Après incubation et lavage, la plaque est incubée avec un second
anticorps (anti-lapin) marqué par une enzyme. On obtient ainsi une sorte de
cascade: l'anticorps marqué par une enzyme a réagi à l'anticorps
antimycotoxine qui, à son tour, s'est lié à la mycotoxine fixée sur la paroi
de la cupule. Le dosage de l'enzyme capturée est effectué par addition d'un
support chromogène. Plus la concentration du produit de la réaction
enzymatique est faible, plus la concentration de mycotoxine dans la prise
d'essai est élevée. Là encore, on se sert d'une courbe type pour doser la
quantité de mycotoxine dans la solution d'épreuve. L'épreuve ELISA par
immunocapture ne nécessite pas une mycooxine marquée par une enzyme;
toutefois, un conjugé mycotoxine-protéine est nécessaire pour permettre la
fixation aux cupules de la plaque de microtitrage. On trouve dans le commerce
un anticorps anti-lapin marqué par une enzyme. On peut citer comme exemple du
titrage par immunocapture la méthode utilisée par Morgan (1982) pour le dosage
de 1'ochratoxine A (voir figure 1) dans l'orge.
- 49 -

IO + > + ) E ^ l<C>»E
+ support
O Antigène Produit coloré
l O Antigène fixé à la paroi AE
)>-° Anticorps spécifique
Anticorps anti-immunoglobuline
marqué par une enzyme (antigène)

Figure 30. Principe du titrage ELISA par immunocapture.

Outre les nécessaires ELISA disponibles dans le commerce, il existe


désormais un nécessaire de titrage immunoenzymatique pour les aflatoxines, où
l'on utilise des "Quick-CardsR" au lieu de plaques ou de barrettes de
microtitrage (International Diagnostics, 1987). Dans cette méthode "Quick-
Card11", on fixe une quantité connue d'anticorps anti-aflatoxine sur chacune
des deux parties d'une carte en plastique de la taille d'une carte de crédit.
On ajoute une goutte de solution témoin exempte d'aflatoxine à la partie
gauche et une goutte de la solution d'épreuve à la partie droite. On ajoute
de l'aflatoxine marquée par une enzyme aux deux parties de la carte, puis une
solution de support, a mesure que les quantités d'aflatoxine augmentent, la
couleur apparaîtra plus claire. A l'inverse, s'il n'y a pas d'aflatoxine, on
verra se développer une tache de teinte gris-bleu. La solution témoin exempte
d'aflatoxine produira une tache gris-bleu foncé. L'épreuve "Quick-CardR" est
conçue pour déceler des quantités d'aflatoxines B,, B2, G, et M, d'environ 5
ou 10 ^g/kg. Cette méthode donne des résultats rapides et son exécution ne
requiert aucun matériel ni aucune expérience technique. Le coût par analyse
est peu élevé. La méthode n'a pas encore été validée (en 1987) par une étude
concertée. Il est prévu que seront bientôt disponibles aussi dans le commerce
des nécessaires d'épreuve comportant des cartes pour la détection de la
zéaralénone, du déoxynivalénol et de la toxine T-2 (voir figure 1).

En général, les méthodes d'extraction et d'épuration appliquées au


titrage immunoenzymatique pour les mycotoxines sont plus simples que celles
dont on a besoin pour appliquer les techniques chromatographiques. On utilise
souvent un mélange méthanol-eau comme solvant d'extraction pour le titrage
immunoenzymatique de 1'aflatoxine, encore que les extractions au méthanol
soient moins efficaces que le chloroforme pour les aflatoxines (Trinder,
1985). On applique quelquefois une simple étape de délipidation à l'hexane,
mais l'épuration sur colonne n'est généralement pas nécessaire. A la
50 -

différence de nombre des extraits préparés pour les méthodes


chromatographiques, les extraits finals utilisés dans le titrage
i m m u n o e n z y m a t i q u e sont des solutions aqueuses (tamponnées).

A l ' é p o q u e de la rédaction du présent ouvrage (1987), aucune p u b l i c a t i o n


n ' a v a i t e n c o r e r e n d u compte de méthodes ELISA pour les m y c o t o x i n e s validées
p a r des études c o n c e r t é e s . C e p e n d a n t , les résultats (provisoires) de la
p r e m i è r e é t u d e concertée A O A C - U I C P A portant sur une m é t h o d e ELISA (méthode
A g r i s c r e e n p o u r le dosage de l'aflatoxine B, dans certains produits
d ' a l i m e n t a t i o n h u m a i n e et animale) semblent prometteurs (Park, 1 9 8 7 ) .

E n r a i s o n de la simplicité de la méthode ELISA et du grand nombre


d ' é c h a n t i l l o n s qu'elle p e r m e t de traiter en une j o u r n é e , d'où un coût
r e l a t i v e m e n t bas par a n a l y s e , cette technique revêt une importance c r o i s s a n t e .
Les seuils de détection des méthodes ELISA pour les aflatoxines sont
s u f f i s a m m e n t b a s pour p e r m e t t r e le dosage aux niveaux de tolérance (van
E g m o n d , 1987) fixés pour ces s u b s t a n c e s . En r e v a n c h e , avec les méthodes ELISA
o n n o t e u n e plus grande v a r i a t i o n des résultats d'épreuves qu'avec les
m é t h o d e s c h r o m a t o g r a p h i q u e s classiques de sorte qu'une v i g i l a n c e permanente
s ' i m p o s e . B e a u c o u p de m y c o t o x i n e s ont des structures chimiques étroitement
a p p a r e n t é e s et elles sont donc groupées e n s e m b l e , par exemple les a f l a t o x i n e s ,
les o c h r a t o x i n e s et les t r i c h o t h é c è n e s . De ce f a i t , il existe en p r i n c i p e une
p o s s i b i l i t é de réactions croisées entre les anticorps dirigés contre une
c e r t a i n e m y c o t o x i n e et d'autres toxines du même groupe é g a l e m e n t p r é s e n t e s .
Il semble dans la p r a t i q u e que cela se produise lors de certains titrages
d ' a f l a t o x i n e o ù l'anticorps dirigé contre l'aflatoxine B, accuse une certaine
r é a c t i v i t é c r o i s é e avec d'autres a f l a t o x i n e s . Par c o n s é q u e n t , u n résultat
d ' a n a l y s e p o s i t i f ne fournit aucune information sélective quant à la
c o n c e n t r a t i o n des différentes a f l a t o x i n e s . Il y a là une différence avec la
c h r o m a t o g r a p h i e e n couche mince et la chromatographie liquide sous h a u t e
p r e s s i o n , l e s q u e l l e s p e r m e t t e n t de distinguer entre les aflatoxines B,, B 2 , G,
et G 2 p r é s e n t e s à l'état n a t u r e l . On peut s'attendre à ce que les méthodes
E L I S A d e v i e n n e n t très utiles pour le dosage rapide des mycotoxines m a i s , pour
l ' h e u r e , les m é t h o d e s et systèmes ELISA devront encore être soumis à des
é p r e u v e s de v a l i d a t i o n très poussées avant que leurs mérites p u i s s e n t être
pleinement évalués.

b . Titrage radio-immunologique

A v e c le titrage r a d i o - i m m u n o l o g i q u e , on p e u t mesurer la formation du


c o m p l e x e a n t i g è n e - a n t i c o r p s en m e t t a n t un antigène marqué par u n isotope
r a d i o a c t i f en c o m p é t i t i o n avec l'antigène à d o s e r . Le m é c a n i s m e du titrage
r a d i o - i m m u n o l o g i q u e est esquissé sur la figure 3 1 .

La p r i s e d ' e s s a i , c o n t e n a n t une quantité connue d'antigène marqué


(indiqué comme é t a n t actif) et une quantité inconnue d'antigène libre (la
m y c o t o x i n e r e c h e r c h é e ) , est mise en contact avec une quantité fixe
d ' a n t i c r o p s . L ' a n t i g è n e m a r q u é et l'antigène l i b r e , c'est-à-dire n o n m a r q u é ,
s o n t en c o m p é t i t i o n pour se fixer sur les sites actifs de l ' a n t i c o r p s . A u b o u t
d ' u n c e r t a i n t e m p s , l'équilibre est réalisé et il subsistera u n p e u d'antigène
l i b r e , le reste é t a n t lié à l'anticorps. Le taux relatif de liaison de
l ' a n t i g è n e m a r q u é et de l'antigène libre avec l'anticorps dépend du taux
r e l a t i f de c o n c e n t r a t i o n de l'antigène marqué et de l'antigène l i b r e . Plus est
f a i b l e la r a d i o a c t i v i t é du complexe a n t i g è n e - a n t i c o r p s . Après séparation du
- 51 -

complexe antigène-anticorps et de la fraction libre, on mesure la


radioactivité du complexe dans un compteur à scintillation. Cette
radioactivité est fonction de la quantité d'antigène libre (la mycotoxine
recherchée) dans la prise d'essai. Normalement, on évalue au moyen d'une
courbe type la quantité de mycotoxine dans un échantillon inconnu.

100% actif
• • • • • • + I I I
100% actif
I I I SWT
50% actif
f 91 50% actif
•oo««o + II I
ottoo* irâr
33% actif
oootot II I 9f 9
ottooo + 33% actif
•ooo«o "5751r
17% actif
O•OOOO
•ooooo 999
ootooo , 17% actif
oooo«o T II 1
ooo*oo
ooooo*
Complexe Anticorps Antigène contenant
antigène-anticorps la prise d'essai

# Antigène marqué
O Antigène libre

Figure 31. Mécanisme du titrage radio-immunologique.

Il n'existe que peu de publications consacrées à l'emploi du titrage


radio-immunologique pour la détection des mycotoxines, à savoir une méthode
pour le dosage de l'aflatoxine B, (Langone, 1976) et une méthode pour le
dosage de la toxine T-2 (Lee, 1981). Cela s'explique probablement par le fait
que l'application du titrage radio-immunologique oblige les laboratoires à
opérer avec de faibles concentrations de substances radioactives.
L'application du titrage immunologique présente donc quelques inconvénients
tels que la durée d'activité réduite des isotopes radioactifs, les problèmes
liés à l'élimination des déchets radioactifs ou à la délivrance des
autorisations requises, et la nécessité de disposer d'un coûteux compteur à
scintillation. La méthode ELISA, au contraire, peut être appliquée presque
partout. Cet avantage, joint au fait que le seuil de détection est plus bas
avec la méthode ELISA (Chu, 1984), a stimulé le développement des épreuves
- 52 -

ELISA pour les mycotoxines au détriment du titrage radio-immunologique dans


les années 1980. Aussi ne sera-t-il plus question des techniques de titrage
radio-immunologique dans la présente section.

Conclusion

L'état actuel de la méthodologie pour le dosage des mycotoxines dans les


produits d'alimentation humaine et animale peut se résumer ainsi:

1. Les méthodes de titrage biologique peuvent être utiles pour découvrir


les sources de mycotoxines connues et inconnues, toutefois, leur
emploi pour déceler la présence de mycotoxines dans les produits
d'alimentation humaine et animale ne revêt qu'une importance mineure.

2. Les titrages chimiques sont d'une grande importance pour le dosage


des mycotoxines. Les techniques le plus employées sont celles qui
comportent une étape chromatographique pour séparer la mycotoxine
recherchée des autres constituants de la matrice.

3. Les méthodes de chromatographie sur minicolonne sont utiles comme


épreuves de vérification des denrées agricoles quand il est
nécessaire de décider rapidement s'il faut accepter ou rejeter un
lot. Elles ont été mises au point principalement pour les
aflatoxines.

4. Bien qu'étant l'une des plus anciennes méthodes employées pour les
mycotoxines, la chromatographie en couche mince est une technique de
séparation fiable, aisément réalisable et relativement simple,
offrant un large chanmp d'application. C'est la technique de choix
pour les pays en développement. Son application bidimensionnelle
offre une résolution particulièrement bonne, d'où un seuil de
détection assez bas.

5. La chromatographie liquide sous haute pression peut remplacer


avantageusement la chromatographie en couche mince. Cette technique
plus onéreuse offre la possibilité d'automatiser les dernières étapes
de séparation et de dosage. Cependant, si l'obtention des services,
des pièces de rechange et des fournitures requis pose un problème,
ce qui peut être le cas dans beaucoup de pays en développement, il
faut accorder la préférence à la chromatographie en couche mince.

6. L'utilisation de la chromatographie en phase gazeuse est surtout


limitée à l'analyse des denrées agricoles pour déceler les
trichothécènes. Etant donné que ceux-ci ne revêtent qu'une importance
mineure dans les pays en développement et que la chromatographie en
phase gazeuse peut poser les mêmes problèmes que la chromatographie
liquide sous haute pression, cette méthode présente peu d'intérêt.

7. Le titrage avec immunoadsorbant lié à une enzyme (ELISA) est une


technique prometteuse qui peut être appliquée presque partout, bien
que la méthode ELISA soit encore récente, on peut s'attendre à ce
qu'elle joue un rôle important dans la détection des mycotoxines.
- 53 -

8. Le titrage radio - immu.nologique ne sera probablement pas une technique


importante pour le dosage des mycotoxines en raison des inconvénients
que présente le travail avec des substances radioactives.

Le tableau 3 contient une comparaison de quelques-unes des


caractéristiques des diverses catégories de méthodes qui ont été passées en
revue. Il ne faut pas perdre de vue que la classification de ces catégories
est une question assez subjective: influencée par l'expérience personnelle,
les opinions et les préférences de chacun, elle est donc sujette à
controverse.

Tableau 3

Comparaison de quelques caractéristiques de diverses catégories de


méthodes pour le dosage des mycotoxines dans les produits alimentaires

Catégorie Champ Fiabilité Seuil de Coût du Possibilité


d'appli- détection matériel d'automa-
cation tisation

Titrage
biologique Limité Faible Elevé Faible Non

Minicolonne Limité Modérée Modéré Faible Non

Chromatographie
en couche
mince Large Elevée Faible Faible Non

Chromatographie
liquide sous Partiel-
haute pression Large Elevée Faible Elevé lement

Chromatographie
en phase Partiel-
gazeuse Limité Elevée Faible Elevé lement

Titrage radio-
immunologique Limité * Faible Elevé Oui

ELISA Limité * Faible Bas Oui

* Inconnue actuellement.
- 54 -

7. Caractéristiques

Les méthodes d'analyse présentent des caractéristiques scientifiques et


pratiques. Les caractéristiques scientifiques déterminent la fiabilité des
données d'analyse et les caractéristiques pratiques déterminent l'utilité de
la méthode. C'est le but que s'est fixé l'analyste qui déterminera lequel de
ces aspects mérite qu'on lui accorde le plus d'attention. Aux fins de la
recherche et pour les activités visant à détrminer la conformité avec la
réglementation, il peut être important de déterminer le mieux possible la
valeur exacte, les aspects pratiques ne présentant dès lors qu'un intérêt
secondaire. On peut aussi concevoir une situation où il faut sacrifier
l'élégance scientifique au côté pratique, par exemple quand des épreuves
rapides "tout ou rien" sont requises sur le terrain pour permettre de vite
décider s'il convient d'accepter ou de rejeter un lot. Les caractéristiques
scientifiques des méthodes d'analyse sont la précision, l'exactitude, le seuil
de détection, la sensibilité et la spécificité; parmi les caractéristiques
pratiques figurent l'applicabilité, le coût d'exécution, la durée et le
matériel requis et le niveau de formation nécessaire. Les propriétés des
méthodes d'analyse sont parfois appelées "caractéristiques" ou "avantages
respectifs". Il ressort clairement de la littérature que les caractéristiques
scientifiques d'une méthode sont souvent l'objet de nombreux malentendus et
d'interprétations inexactes. Aussi ne semble-t-il pas inutile de définir ces
termes.

Sensibilité

Une analyse quantitative n'est possible que si l'on détermine la


relation entre la mesure x et la concentration c de la substance à doser
(c'est-à-dire le constituant recherché, par exemple 1'aflatoxine). Cette
relation est établie par une série de mesures d'étalonnage qui produisent la
fonction d'étalonnage x = f(c); la représentation graphique est appelée courbe
d'étalonnage analytique (figure 32). A chaque point de cette courbe, la
sensibilité peut être définie comme étant m = dx/dc, c'est-à-dire la pente de
la courbe d'étalonnage (Kaiser, 1972); en d'autres termes, c'est le changement
de signal analytique par rapport à la concentration par unité. C'est la valeur
que nous devons connaitre pour doser la substance analysée en fonction d'un
certain signal analytique. Les spécialistes de l'analyse chimique supposent
souvent à l'avance que la sensibilité à l'égard de la substance à analyser
dans l'extrait final de l'échantillon équivaut à la sensibilité de la
substance telle qu'elle est présente dans une solution type simple. Or, cette
hypothèse n'est pas toujours fondée et il faut au moins la vérifier. Des
effets dus à la matrice peuvent donner lieu à un étalonnage incorrect de
l'étape de dosage de la méthode d'analyse et, partant, à des estimations trop
élevées ou trop faibles de la substance à analyser.

L'unité où la sensiblité est mesurée c'est le quotient des unités pour


la mesure x et pour la concentration c. Il faut bien noter que la sensibilité
n'est pas une concentration, pas plus qu'elle n'indique la plus faible
différence entre des concentrations qui puisse être distinguée selon une
méthode déterminée. C'est là une question statistique sur laquelle nous
reviendrons dans le paragraphe intitulé "Précision".
55 -

Cu —-c

Figure 32. Courbe d'étalonnage analytique du signal x


par rapport à la concentration C.

Il ne faut pas confondre la sensibilité avec le "seuil de détection".


La relation entre sensibilité et seuil de détection sera examinée dans le
paragraphe intitulé "Seuil de détection".

Spécificité

Une méthode d'analyse est dite "pleinement spécifique" quand elle


fournit un signal analytique uniquement pour un constituant particulier, mais
est "inerte" pour tous les autres constituants qui peuvent aussi être présents
dans l'échantillon (Kaiser, 1972). Une méthode pleinement spécifique a une
probabilité nulle de réactions faussement positives. Souvent, les méthodes
d'analyse classiques pour mycotoxines faisant appel à la chromatographie en
couche mince et à la chromatographie liquide sous haute pression comme
techniques pour séparer les mycotoxines des autres constituants de la matrice
présents dans l'extrait final ne sont pas pleinement spécifiques puisque
d'autres substances se comportant de la même façon que ces mycotoxines peuvent
être présentes, même si l'on a recours à la chromatographie bidimensionnelle
en couche mince, technique de séparation puissante (voir III.6). Pour réduire
au minimum le risque de résultats faussement positifs, il faut confirmer
l'identité de la mycotoxine dans les échantillons positifs. Les méthodes
d'analyse chromatographique ont atteint un degré de spécificité satisfaisant
grâce à l'incorporation de plusieurs épreuves de confirmation faciles à
exécuter, par exemple la formation de dérivés in situ sur les plaques de
chromatographie en couche mince ou la dérivation en aval de la colonne dans
- 56 -

les systèmes de chromatographic liquide sous haute pression. Les titrages


immurtologiques pour le dosage des mycotoxines comme la méthode ELISA peuvent
être tout à fait spécifiques, surtout depuis qu'on utilise les anticorps
monoclonaux.

Précision

La précision est fonction de la variabilité. Elle concerne la dispersion


inévitable des résultats obtenus par appliction répétée d'une méthode
d'analyse soit dans le même laboratoire, soit dans des laboratoires
différents. On décrit couramment la précision en fonction de l'écart-type ou
de l'écart-type relatif (= écart-type/moyenne = coefficient de variation (CV))
d'une série de résultats successifs. Si les mesures sont normales, les deux
tiers environ d'entre elles seront en-deçà d'un écart-type de part et d'autre
de la moyenne et environ 95% d'entre elles seront en-deçà de deux écarts-
types de part et d'autre de la moyenne. La précision peut être en rapport avec
le degré d'erreur d'une méthode dans un laboratoire donné, c'est-à-dire la
répétabilité, ou avec le degré d'erreur d'une méthode entre laboratoires,
c'est-à-dire la reproductibilité (Organisation internationale de
normalisation, 1981). La répétabilité (r) peut être définie comme étant la
valeur en-deçà de laquelle on peut s'attendre à ce que se situe avec un degré
de probabilité spécifié la différence absolue entre deux résultats d'épreuve
unique obtenus par application de la même méthode à des substances identiques
dans les mêmes conditions (même opérateur, mêmes instruments, même laboratoire
et intervalles de brève durée). En l'absence de toute autre indication, la
probabilité est de 95%. Mathématiquement, la répétabilité r = 2,83 s, où s -
écart-type des résultats d'épreuve. On peut définir la reproductibilité (R)
comme étant la valeur de-deçà de laquelle on peut s'attendre à ce que se situe
avec un degré de probabilité spécifié la différence absolue entre deux
résultats d'épreuve unique obtenus par application de la même méthode à des
substances identiques mais dans des conditions différentes (opérateurs
différents, instruments différents, laboratoires différents et/ou durées
différentes). En l'absence de toute autre indication, la probabilité est de
95%. Mathématiquement, la reproductibilité R = 2,83 s, où s = écart-type des
résultats d'épreuve. La répétabilité et la reproductibilité d'une méthode
peuvent être appliquées de diverses manières. Elles peuvent servir:

à vérifier si la technique expérimentale d'un laboratoire est bien


conforme aux normes ;
à comparer avec une spécification les épreuves effectuées sur un
échantillon provenant d'un lot;
à comparer les résultats d'épreuves obtenus par différents
laboratoires.

Il faut obtenir des informations sur la précision d'une méthode


(détermination de la répétabilité et de la reproductibilité) en l'essayant
dans le cadre d'une étude concertée interlaboratoires (expérience de
précision) conçue selon des directives reconnues (ISO, AOAC). Dans le cas des
titrages de 1'aflatoxine, de nombreuses études concertées ont été consacrées
à des méthodes faisant appel à la chromatographie en couche mince, de sorte
qu'on a pu obtenir un assez bon aperçu de la précision de ces méthodes.
Jusqu'à présent (1987), seules quelques études concertées ont été consacrées
aux méthodes utilisant la chromatographie liquide sous haute pression pour le
dosage des aflatoxines et il n'existe qu'une seule étude sur l'emploi de la
- 57

méthode ELISA pour l'aflatoxine B,. Très intéressants sont les résultats d'une
étude rétrospective d'Horwitz (1980, 1981) qui a étudié les données en matière
de précision tirées d'environ 200 études concertées menées sous les auspices
de l'AOAC, dont plusieurs portant sur les aflatoxines. Il a pu en tirer deux
conclusions remarquables qui sont également applicables au titrage des
afltoxines (chromatographie en couche mince): 1) la précision
interlaboratoires (reproductibilité) semble être fonction de la concentration
(figure 33) et semble être indépendante de la nature de la substance à
analyser ou de la technique de mesure adoptée.

Conc. (en ng/kg)

Figure 33. Coefficient de variation interlaboratoires


en fonction de la concentration.

En règle générale, cette précision peut être représentée par l'équation


suivante: CV (%) = 2(1"°-slogc) où c est la concentration exprimée en puissances
de 10 (par exemple 1 ppm = 10"6) . 2) le rapport répétabilité/reproductibilité
se situe prncipalement entre 0,5 et 0,7. Un rapport inférieur à 0,5 dénote une
méthode très personnelle; les analystes peuvent très bien vérifier leur propre
travail, mais ils ne peuvent pas vérifier celui de leurs homologues d'autres
laboratoires. Cet état de choses donne à penser qu'il faut revoir les
instructions ou que les étalons diffèrent peut-être d'un laboratoire à
l'autre. Un rapport supérieur à 0,7 peut être l'indication que les répétitions
effectuées par un analyste individuel sont tellement médiocres qu'elles
éliminent l'élément interlaboratoires.
58 -

Ces conclusions ont une grande importance sur le plan pratique. Elles
signifient qu'à un niveau d'environ 10 ng/kg, niveau de contamination "normal"
pour l'aflatoxine B,, on peut s'attendre à un CV d'environ 20% dans un
laboratoire donné et à un CV interlaboratoires d'environ 32%. En outre, à un
niveau de 0,1 /¿g/kg, niveau de contamination "normal" pour l'aflatoxine M,,
on peut s'attendre à un CV dans un laboratoire donné d'environ 40% et à un
CV interlaboratoires d'environ 64%.

Seuil de détection

On entend par seuil de détection d'une méthode le niveau de


concentration le plus bas qui puisse être déterminé comme étant
statistiquement différent d'un dosage à blanc. Bien que cette définition
paraisse assez nette, l'expression de ces valeurs a soulevé des problèmes non
négligeables en raison des diverses interprétations du terme "statistiquement
différent".

L'UICPA précise que le seuil de détection, exprimé sous forme de


concentration CL, correspond à la plus petite mesure X L qu'une méthode
d'analyse donnée permette d'effectuer avec un degré de certitude raisonnable
(voir figure 34) (Kaiser, 1972; Long 1983).

*B X,

C, c,

Figure 34. Courbe de distribution normale pour une


variable x mesurée.
59

Mathématiquement x L = x B + 3sB (1), où x"B et s B sont respectivement une


estimation de la valeur moyenne des résultats à blanc et une estimation de
l'écart-type des résultats à blanc. En fin de compte, la concentration
significative la plus faible C L nous intéresse davantage que la mesure X L . Si
X L est connue, C L peut être déterminée directement par le biais de la courbe
d'étalonnage en chaque point de laquelle la sensbilité m est définie comme
étant m = dx/dc (2) (voir Sensibilité). En substituant l'équation (2) à
l'équation (1), la relation entre sensibilité et seuil de détection apparait
clairement :

m — dx/dc —• de = dx/m

C L - C0 - (XL - x B )/m

CL = 3s B /m

Au voisinage du seuil de détection, tous les dosages quantitatifs d'une


substance sont assez imprécis. Il est raisonnable de fixer un critère minimal
pour les dosages quantitatifs à quelque distance du seuil de détection. Il
n'existe pas encore de définition de ce seuil de dosage, mais le Sous-Comité
de l'ACS sur la chimie analytique environnementale a proposé de fixer le seuil
de dosage à 10sB de x B (ACS, 1980). Dès lors, les échantillons qui sont
mesurés comme ayant un signal x > à 10sB sont considérés comme étant dans les
limites de la zone de dosage, tandis que les échantillons où 3sB < x < 10sB
sont considérés comme étant dans la zone de détection (figure 35).

10SB
3Sb _ ,
i
\ i
\ i
\ i
\ i
\ i
\i
\i

Substance à analyser non décelée , Zone de détection i Zone de dosage

Figure 35. Zones de mesure de la substance à analyser.


- 60 -

Quand on applique des techniques de chromatographie en couche mince avec


une simple estimation visuelle, comme ce sera souvent le cas dans la plupart
des pays en développement, il n'est pas possible de déterminer le seuil de
détection selon cette méthode. En pareil cas, certains auteurs font
correspondre leur seuil de détection signalé à la quantité de mycotoxine la
plus faible qui soit visible sur une plaque de chromatographie en couche
mince, ce qui signifie le seuil à partir duquel, dans 50% des cas, la
mycotoxine (ne) sera (pas) observée. D'autres établissent leur seuil de
détection uniquement avec des étalons ou avec des "matrices faciles" qui ne
provoquent aucune gêne sérieuse dans l'étape de détection, alors que le seuil
de détection peut dépendre dans une large mesure de la matrice à l'étude.
Parmi d'autres complications figurent les différences d'intensité entre les
divers types de lampes à ultraviolets et (dans le cas des techniques avec
instruments) les différences de sensibilité des divers détecteurs utilisés
avec la chromatographie liquide sous haute pression. A cause de tout cela, il
est souvent difficile de procéder à une comparaison objective des seuils de
détection signalés avec diverses méthodes, de sorte que les données
communiquées ne fournissent que des indictions grossières.

Exactitude

L'exactitude (ou erreur systématique) est fonction de l'écart


systématique par rapport à la valeur réelle. Plus la partie systématique de
l'erreur expérimentale est faible, plus l'exactitude de la méthode est grande.
L'exactitude d'une méthode est habituellement exprimée en pourcentage de
récupération. Théoriquement, la récupération d'une méthode peut ne jamais être
supérieure à 100% puisqu'une partie de la substance à analyser est toujours
perdue au cours de l'analyse, si bien que l'erreur systématique est orientée
de façon négative. Dans la pratique, des récupérations de 70 à 80% sont
courantes avec l'analyse des mycotoxines; toutefois, la récupération dépasse
parfois 100%, probablement par suite d'interférences persistantes.

Pour déterminer l'exactitude, il faut procéder à un grand nombre


d'analyses afin d'atténuer la partie aléatoire de l'erreur expérimentale. Les
données relatives à l'exactitude des méthodes d'analyse doivent être tirées
d'études concertées grâce au calcul de la récupération moyenne de quantités
connues de substance ajoutée ayant subi tous les stades du processus. Le point
faible de cette épreuve est qu'elle n'est applicable que si l'on ajoute des
composés "purs". Dans le cas des mycotoxines, qui sont des composés présents
à l'état naturel, nous devons supposer que la fraction récupérée de la
mycotoxine présente à l'origine dans l'échantillon équivaut à celle de la
mycotoxine ajoutée. En fait, nous ignorons si la totalité de la mycotoxine
naturelle se prête à une extraction au moyen de nos solvants initiaux. Le
problème serait surmonté en partie si l'on pouvait disposer de substances de
référence homologuées dans lesquelles les mycotoxines seraient présentes "à
l'état naturel" (voir Assurance de la qualité). En tout état de cause,
l'exactitude de la méthode peut être calculée alors à l'aide d'une "valeur
vraie" convenue par homologation. Là encore, l'application pratique est plus
difficile parce que de telles substances de référence homologuées pour le
dosage des mycotoxines n'en sont encore qu'au stade de la mise au point.
- 61 -

8. Assurance de la qualité

Beaucoup de laboratoires effectuent un grand nombre de dosages


d'aflatoxines et d'autres mycotoxines et se flattent de leur expérience et de
leur fiabilité. Nous pouvons dès lors nous demander pourquoi des laboratoires
trouvent si souvent des valeurs tellement différentes, même avec des
échantillons qui ont fait l'objet d'une homogénéisation particulière en vue
d'études concertées. De plus, ceux qui doivent faire face aux dépenses
qu'entraînent ces déterminations souvent très coûteuses peuvent se demander
à quels résultats ils doivent se fier. Les programmes de vérification
d'échantillons organisés pour les mycotoxines par le Centre international de
recherche sur le cancer ont montré qu'une grande variabilité des résultats
doit être considérée comme la norme plutôt que l'exception (Friesen, 1982),
et cela n'est guère réconfortant pour ceux qui doivent payer pour les dosages
ou tabler sur ceux-ci pour des décisions importantes. Toutefois, cet état de
choses ne doit pas être jugé inévitable.

Il a été prouvé qu'en général les analystes sont responsables de la


moitié ou des deux tiers de la variabilité totale d'un système de
détermination analytique. L'homme n'est ni impartial ni objectif; par
conséquent, tout laboratoire opérant dans le domaine de l'analyse des oligo-
éléments doit élaborer un programme d'assurance de la qualité. Un programme
d'assurance de la qualité doit comprendre divers éléments, dont les suivants:

a. Un personnel qualifié; des méthodes consignées par écrit et validées;


un laboratoire bien construit, équipé et entretenu.

b. L'utilisation de verrerie, de solvants et d'autres matériaux


d'épreuve de haute qualité.

c. Vérification fréquente de l'exactitude des déterminations chimiques.

L'existence des deux premiers éléments pourra dépendre du lieu où


l'étude sera effectuée. Il faut prévoir de sérieux problèmes en certains
endroits dans des pays en développement où du matériel supplémentaire et un
appui scientifique seront peut-être nécessaires avant qu'un programme de
surveillance puisse être mis en route. La troisième condition indiquée sera
sans doute difficile à réaliser et à démontrer. Toutefois, il existe plusieurs
mécanismes possibles pour vérifier l'exactitude (Wagstaffe, 1987). Ils sont
récapitulés dans le tableau 4.

Pour que la fiabilité des résultats d'épreuve puisse être vérifiée selon
au moins deux méthodes indépendantes, il faut que celles-ci aient été
utilisées avec succès dans d'autres situations analogues comportant des
analyses (mêmes concentrations, mêmes interférences). On entend par
"indépendantes" des déterminations reposant sur différentes propriétés
physico-chimiques de la substance analysée, par exemple la chromatographie en
couche mince par opposition à la méthode ELISA. Il est très peu probable que
deux méthodes indépendantes puissent accuser une erreur systématique du même
ordre de grandeur et dans le même sens. Par conséquent, quand les résultats
de différentes analyses concordent, il est à peu près certain qu'ils sont
exacts. Les comparaisons faites dans un même laboratoire selon des méthodes
indépendantes sont un précieux élément dans un programme d'assurance de la
qualité.
62 -

Tableau 4

Quelques méthodes pour vérifier/améliorer l'exactitude des


déterminations chimiques (d'après Wagstaffe, 1987)

Méthode Observations

Vérification croisée des résul- Rarement possible dans la plupart


tats à l'intérieur du laboratoire des laboratoires; l'indépendance
par un analyste indépendant totale est difficile à réaliser
appliquant une méthode
parfaitement indépendante

Participation à un programme Pas toujours disponible quand


extérieur d'assurance de la c ' est nécessaire : la valeur "vraie"
qualité n'est pas toujours connue des
organisateurs

Utilisation d'une substance de Commode et économique; peut être


référence homologuée pour appliquée quand c'est nécessaire;
vérifier/améliorer l'exactitude l'éventail des substances de
de la méthode référence homologuées qui sont
disponibles est limité

Le Centre international de recherche sur le cancer (CIRC) applique un


programme permanent extérieur d'assurance de la qualité (Friesen, 1982).
Chaque année, des échantillons de denrées agricoles à analyser pour doser les
aflatoxines B,, B2, G, et G2 et de produits laitiers à analyser pour doser
l'aflatoxine M, sont envoyés à quelques dizaines de pays, dont plusieurs pays
en développement. La participation à ce programme de vérification
d'échantillons de mycotoxines du CIRC est gratuite et vivement recommandée
pour tout laboratoire procédant à des dosages de mycotoxines.

Le Bureau communautaire de référence (BCR) des Communautés européennes


entreprend actuellement un programme sur les mycotoxines qui a pour objectif
d'améliorer l'exactitude et, partant, la comparabilité des dosages de
mycotoxines. Ce programme comporte à cet effet la mise au point de substances
de référence homologuées. Le tableau 5 récapitule les mycotoxines et les
matrices choisies au départ pour le programme sur les mycotoxines (Wagstaffe,
1987) . Du lait en poudre dont la teneur en afaltoxine M, est certifiée est
disponible depuis peu.

Le BCR peut fournir de petites quantités de ces substances de référence


homologuées. D'autres substances de référence pour les mycotoxines, par
exemple de la farine d'arachides contenant de l'aflatoxine B1, sont en cours
de mise au point.
- 63

Tous les éléments de programmes destinés à assurer la précision et


l'exactitude imposent un surcroit de travail et de dépenses au laboratoire.
On a estimé que la durée néessaire pour les appliquer correspondait à environ
30% de la durée totale disponible pour l'analyse. Néanmoins, l'assurance de
la qualité est indispensable pour garantir la qualité et l'intégrité des
données d'analyse.

Tableau 5

Récapitulation des projets du BCR concernant les substances


de référence pour mycotoxines (d'après Wagstaffe, 1987)

Matrice : Lait en poudre Farine d'arachides et produits


d'alimentation animale blé

Mycotoxine: Aflatoxine M, Aflatoxine B,, Déoxynivalénol


certifiée 10-40 /xg/kg 400 Mg/kg
0,05; 0,31 et
0,76 Mg/kg

Préparation: Séchage par Produits présents Contamination


pulvérisation "à l'état naturelle et
de lait naturel" provoquée par
provenant de des champignons
bovins ayant
absorbé de
1'aflatoxine B,

Note: La zéaralénone et 1'ochratoxine A feront l'objet d'une


troisième phase.
- 64 -

IV. METHODES DE LABORATOIRE

1. Epreuve de liquéfaction des cristaux de sel pour déterminer l'activité


de l'eau (aw) dans les denrées agricoles

(D'après la méthode de Northolt et col. J. Food Prot. 45, 537-540,


1982); Manuel sur la détection rapide des mycotoxines 3-7, OCDE, Paris,
1982) .

But et champ d'application

Description d'une méthode pour mesurer l'activité de l'eau (aw) dans les
produits d'alimentation humaine. Cette épreuve convient pour vérifier la a w
de diverses denrées agricoles, laquelle doit être conforme aux normes fixées
en la matière pour empêcher la croissance des champignons et la production de
mycotoxines.

Définition

L'activité de l'eau (aw) est définie comme étant la pression de vapeur


d'eau relative d'équilibre d'un substrat.

pression de vapeur d'eau du substrat


a» =
pression de vapeur d'eau de l'eau libre
(à la même température)

Principe

Les cristaux de sel attirent la vapeur d'eau et se liquéfient quand ils


sont placés dans un bocal contenant un produit dont la a w est supérieure à la
a w spécifique du sel, équivalente à la a w de la solution saline saturée. On
peut déterminer la a w des échantillons en utilisant des sels ayant une a w
spécifique appropriée.

Réactifs

Vaseline

Sels pulvérisés, maille 105-210 ^m, le choix des sels étant fonction
d'étalons représentant les échantillons à soumettre aux épreuves.

CuCl2. 2H20 (a« * = 0,684)


NaCl (aw = 0,756)
NH4C1 (aw = 0,790)
(NH4)2S04 (aw - 0,807)
KC1 (aw - 0,856)
K2Cr 0 4 (aw = 0,870)
BaCl2. 2H20 (aw = 0,910)
(NH4)H2P04 (aw = 0,939)
K 2 SO 4 (aw = 0,982)

* Valeur de la a w de solutions salines saturées mesurée à une température de


18° C avec un instrument de mesure du point de rosée qu'on a étalonné en
utilisant le rapport généralement admis entre le point de rosée et la pression
de vapeur d'eau (CRC Manuel de chimie et de physique).
65

Equipement

Bocal étanche d'environ 500 ml à couvercle transparent

Spatule en acier inoxydable.

Mode opératoire

Placer 40-80 g de l'échantillon dans le bocal.

Fermer le bocal et équilibrer pendant au moins deux heures. Pour


l'épreuve comportant un sel dont la a^ est > à 0,91, l'équilibrage doit être
effectué dans une étuve avec une température égale à la température ambiante
ou inférieure à celle-ci de quelques degrés centigrades. L'épreuve comportant
un sel dont la a w est < à 0,91 peut être effectuée dans une pièce où la
température varie peu.

Ouvrir le bocal brièvement et étaler une très mince couche en vaseline


sur la surface interne de couvercle.

A l'aide de la spatule, étaler sur la vaseline quelques dizaines des


cristaux appropriés.

Fermer le bocal et équilibrer pendant 3 à 24 heures (selon le sel


utilisé, voir tableau 6).

Observer les cristaux pour voir s'ils sont liquéfiés ou non. Quand 50%
ou davantage des cristaux sont liquéfiés, le résultat de l'épreuve est jugé
positif.

Expression des résultats

Dans le cas d'une épreuve positive, 50% ou plus des cristaux du sel x
sont liquéfiés au bout de 3 à 24 heures selon le type de sel, le type de
produit et la température (voir tableau 6). La a w de l'échantillon peut être
exprimée ainsi:

a^ (échantillon) > a w (sel x) + 0 , 0 2

Examen critique

L'épreuve de liquéfaction des cristaux de sel est très simple;


néanmoins, quelques précautions s'imposent. L'épreuve comportant des sels
ayant une a w spécifique élevée (> 0,91) doit être effectuée dans une étuve
pour éviter que de brusques changements de température ne produisent des
résultats erronés. L'épreuve comportant des sels ayant une a w se situant entre
0,75 et 0,87 peut être effectuée dans une pièce où la température varie peu.
Quand on utilise des cristaux de CuCl2.2H20, l'épreuve n'est guère perturbée
par de brusques changements de température, de sorte qu'on peut l'utiliser
comme méthode sur le terrain pour vérifier une a w pouvant induire une
croissance de moisissures. C'est le cas, par exemple, pour les arachides, pour
lesquelles le Comité de l'hygiène alimentaire de la Commission du Codex
Alimentarius a proposé comme norme une a w de 0,70 pour éviter la contamination
par les aflatoxines.
- 66 -

Pour éviter des résultats inexacts, il faut empêcher le fond ou le


couvercle du bocal d'être exposé directement à la lumière solaire ou à un
rayonnement thermique. L'échantillon doit peser de 40 à 80 g parce que des
échantillons plus réduits pourraient avoir une a^ plus faible par suite de la
perte de vapeur d'eau pendant le remplissage et la réouverture du bocal. Des
résultats faussement positifs peuvent se produire avec des échantillons plus
importants quand la température diminue rapidement, par suite d'une
sursaturation de vapeur d'eau.

L'épreuve a une sensibilité de 0,04 a^ avec lecture de la a w au bout de


2 à 7 heures et de 0,02 a w avec lecture au bout de 3-24 heures, selon le type
de sel, le type de produit et la température.

Il convient de noter que cette épreuve indique la a w au moment de


l'échantillonnage uniquement et non pas telle qu'elle était précédemment. Par
conséquent, on ne saurait exclure que le produit ait été contaminé par des
mycotoxines auparavant.

Tableau 6

Durée de liquéfaction des cristaux de différents sels


déterminée avec différents produits à 18° C

Substance a w (substance) Sel a w (substance Durée de


d'épreuve d'épreuve) d'épreuve)-aw liquéfaction1
(sel) (heure)

Arachides non
décortiquées 0,702 CuCl2.2H20 0,018

Solution de
glycérol 0,776 NaCl 0,020 4

Pâtisserie 0,814 NH4C1 0,024 7

Pâtisserie 0,838 (NH4)2S04 0,031 3

Solution de
glycérol 0,876 KC1 0,020

Solution de
glycérol 0,890 K2Cr04 0,020 12

Pâtisserie 0,928 BaCl2.2H20 0,018 6

Saucisse
fermentée 0,960 (NH4)H2P04 0,021 4

Eau 1,000 K2S04 0,018 7 - 242

Durée nécessaire pour liquéfier 50% des cristaux.


La liquéfaction se produit quand la lecture se fait après une durée
se situant entre 7 et 24 heures.
- 67 -

2. Techniques de laboratoire pour la chromatographic en couche mince

Préparation des plaques en couche mince

a. Matériel et produit chimiques

Gel de silice pour chromatographie en couche mince


Fiole conique à bouchon de verre de 300 ml
Plateau d'alignement d'environ 112 x 22 cm
Etaleur de chromatographie en couche mince avec une fente de sortie de
0,25 mm ou ajustable
Cinq plaques de verre de 20 x 20 cm, épaisseur 4 mm
Deux plaques de verre de 5 x 20 cm, épaisseur 4 mm
Support pour plaques de chromatographie en couche mince
Four à 110° C
Dessiccateur avec pour dessiccatif du gel de silice actif.

b. Mode opératoire

Nettoyer soigneusement les plaques de verre avec un détergent ou une


solution de soude concentrée, rincer à l'eau distillée et laisser sécher. Les
plaques doivent être exemptes de graisse.

Disposer les plaques parallèlement l'une à l'autre et


perpendiculairement au fond du plateau d'alignement; disposer les petites
plaques aux extrémités gauche et droite de la rangée comme plaque de départ
et plaque d'arrivée.

Peser 30 g de gel de silice et le déposer dans une fiole conique,


ajouter la quantité d'eau recommandée par le fabricant, agiter vigoureusement
pendant une minute et verser dans l'étaleur avec la fente de sortie en
position fermée.

Placer l'étaleur sur la plaque de départ, basculer le levier de 180


degrés et enduire immédiatement les cinq plaques de verre avec une épaisseur
de 0,25 mm de suspension de gel de silice en l'espace de 5 à 6 secondes.
Laisser reposer les plaques jusqu'à ce que le gel ait pris (environ 10
minutes).

Dès l'étalement terminé, nettoyer l'étaleur immédiatement sous un jet


d'eau puissant. Dévisser l'extrémité du tube et retirer celui-ci. Nettoyer
l'appareil à fond avec un écouvillon en veillant à ne pas rayer le rebord de
la fente de sortie.

Disposer les plaques enduites sur un support, laisser reposer de


préférence pendant toute la nuit à la température ambiante, puis mettre le
support au four pendant une heure.

Vérifier que les couches minces soient bien lisses et étalées de façon
égale sur les plaques. conserver au dessiccateur jusqu'au moment de
1'utilisation.
- 68 -

Préparation des étalons

Plusieurs entreprises commerciales et institutions scientifiques peuvent


fournir des étalons de mycotoxines. On peut se les procurer sous diverses
formes, par exemple en pellicule sèche, cristaux, solutions types qualitatives
et quantitatives. Dans la présente section, la description de la préparation
des étalons pour la chromatographie en couche mince se limite aux AFLATOXINES.
Toutefois, pour l'essentiel, les principes et techniques sont les mêmes pour
la préparation d'étalons d'autres mycotoxines.

a. Equipement

Microbalance analytique, sensibilité de 0,001 mg

Spectrophotomètre, capable de déterminations se situant entre 200 et


400 nm, avec cellules de quartz de 1 cm.

Etalonner le spectrophotomètre comme suit:

Préparer trois solutions de K g C r ^ dans du H2S04

(1) K2Cr207, 0,25 mmol/L dans H2S04, 9 mmol/L (dissoudre 78 mg de K2Cr207


dans 1,0 L de H2S04, 9 mmol/L d'eau).
(2) K2Cr207, 0,125 mmol/L dans H2S04, 9 mmol/L (diluer 25 ml de (1) pour
50 ml avec du H2S04, 9 mmol/L d'eau).
(3) K2Cr207, 0,0625 mmol/L dans H2S04, 9 mmol/L (diluer 25 ml de (2)
pour 50 ml avec du H2S04, 9 mmol/L d'eau).

Déterminer le pouvoir absorbant (A) des solutions (1), (2) et (3) à


l'absorption maximale proche de 350 nm, avec H2S04, 9 mmol/L comme solvant
témoin. Calculer le coefficient d'absorption molaire (S) à chaque
concentration :
A
S = , où
c x 1

c = concentration en mmol/L
1 = trajet en mètres.

Si la variation des trois valeurs est supérieure à l'exactitude garantie


du barème A, vérifier soit la technique, soit l'instrument. Etablir la moyenne
des trois valeurs S pour obtenir S. Déterminer le facteur de correction (FC)
pour l'instrument et les cellules en fonction de l'équation: FC = 316 où
316 = la valeur de S pour des solution de K2Cr207 (S en m2/mol) . £

Si le FC est < à 0,95 ou > à 1,05, vérifier soit l'instrument, soit la


technique pour déterminer et éliminer la cause (utiliser la même série de
cellules pour l'étalonnage et pour la détermination de la pureté des étalons
de mycotoxine) .

b. Vérification de la pureté

Les aflatoxines à utiliser comme étalons primaires doivent répondre aux


critères de pureté suivants:
- 69 -

1) pureté chromatographique comme indiqué plus bas;


2) coefficients d'absorption molaire correspondant aux limites de confiance
données au tableau 7;
3) rapports des pics d'absorption correspondant aux limites de confiance
données au tableau 8.

Peser environ 1 mg de l'étalon d'aflatoxine au moyen d'une microbalance


analytique, puis transférer quantitativement à une fiole volumétrique de
100 ml. Dissoudre et diluer avec du méthanol. Calculer la concentration (c)
de la solution en jug/ml. Mesurer le pouvoir absorbant (A) de la solution avec
1'absorption maximale (voir tableau 7). Calculer les coefficients d'absorption
molaire :
A x PM
S = , où
c x 1

PM = poids moléculaire de l'aflatoxine considérée (voir tableau 9)


c = concentration en mmol/L
1 = trajet en mètres.

Calculer les rapports du pouvoir absorbant pour chaque aflatoxine aux


longueurs d'ondes données au tableau 8.

Tableau 7

Coefficients d'absorption molaire (S) des aflatoxines dans le méthanol


et limites de confiance à 95% prévues pour une détermination
unique du coefficient d'absorption molaire

Aflatoxine S ( m2/mo 1 ) Limites de confiance


dans MeOH à 95% (±)

B, 223 2210 160


265 1240 80
360 2180 110

222 1860 100


265 1210 60
362 2400 50

G, 216 2740 250


242 960 30
265 960 120
362 1770 70

214 2530 230


244 1050 30
265 900 110
362 1930 80
70 -

Tableau 8

Rapports des principaux pics de spectres d'absorption ultraviolets


des aflatoxines dans le méthanol et limites de confiance à 95%
prévues pour des spectres uniques

Principaus pics Paramètres Aflatoxines


comparés (nm)
B1 B2 G, G2

223/265 Rapport 1,77 1,54


Limites de confiance ±0,04 ±0,05
à 95%

214/265 Rapport 2,86 2,83


Limites de confiance ±0,15 ±0,13
à 95%

242/265 Rapport 1,00 1,20


Limites de confiance ±0,02 ±0,07
à 95%

362/265 Rapport 1,76 1,98 1,84 2,09


Limites de confiance ±0,04 ±0,08 ±0,06 ±0,18
à 95%

Tableau 9

Poids moléculaire (PM) de quelques aflatoxines

Aflatoxine PM

B, 312
B2 314
G, 328
G2 330
M, 328

c. Préparation des étalons pour chromatographie en couche mince

Préparation des solutions-mères :

Etalons d'aflatoxine livrés sous forme de pellicules sèches ou de


cristaux :
- 71

Ajouter dans le récipient d'aflatoxine sèche du chloroforme ou du


benzène-acétonitrile (98 + 2) calculé pour obtenir une concentration de 8 à
10 /¿g/ml. Pour l'aflatoxine M,, utiliser du chloroforme ou du benzène-
acétonitrile (90 + 10). Se guider sur l'indication portée sur l'étiquette pour
le poids d'aflatoxine. Agiter la solution vigoureusement pendant une minute
dans un agitateur Vortex et transférer sans rincer dans une fiole à bouchon
de verre de taille appropriée.

N.B.: Ne pas sécher l'aflatoxine pour la peser ou à d'autres fins à moins de


disposer des moyens nécessaires pour éviter la diffusion des aflatoxines aux
alentours par suite de la charge électrostatique sur les particules.

Etalons d'aflatoxine reçus sous forme de solution:

Transférer la solution dans une fiole appropriée à bouchon de verre. Au


besoin, diluer pour obtenir une concentration de 8 à 10 /¿g/ml.

d. Détermination de la concentration d'aflatoxine

Enregistrer un spectre ultraviolet de la solution d'aflatoxine obtenue


ci-dessus de 330 à 370 nm au regard du solvant utilisé pour la solution dans
la cellule de référence. Déterminer la concentration de la solution
d'aflatoxine en mesurant le pouvoir absorbant (A) à la longueur d'ondes
d'absorption maximale proche de 350 nm et en utilisant l'équation suivante:

(A x PM x FC)
/¿g d'aflatoxine/ml = , où
1 x S

FC = facteur de correction obtenu en étalonnant le spectrophotomètre


1 = trajet en mètres.

Le PM est lu sur le tableau 9 et les valeurs 2 (m2/mmol) sont les suivantes:

Aflatoxine S-(benzène - S(chloroforme)


acétonitrile

B, 1980 2100
B2 2090
G, 1710
G2 1820
M, 1882 1995

Remettre la solution d'aflatoxine dans la fiole d'origine à bouchon de


verre (l'exposition normale aux rayons ultraviolets pendant la détermination
du pouvoir absorbant n'entraîne aucune photosynthèse observable).
72 -

e. Détermination de la pureté chromatographique

Sur une plaque de chromatographie en couche mince, déposer des taches


de 5¿il de solution étalon sur une ligne imaginaire à environ 2 cm de la
surface du solvant révélateur. Développer la plaque dans l'un des solvants
indiqués au tableau 10. Renouveler l'opération avec une seconde plaque,
développée dans un système de solvant différent indiqué au tableau 10. Sous
rayons ultraviolets, les chromatogrammes n'indiqueront que les taches des
étalons d'aflatoxine individuels, aucune autre fluorescence n'étant
perceptible.

Tableau 10

Solvants révélateurs pour la chromatographie en couche mince


des aflatoxines
B7¡ B^i G, et G2 = ordre du R^ des aflatoxines à partir du sommet:

Chloroforme-acétone (90 + 10), cuve non saturée


Ether éthylique-méthanol-eau (96 + 3 + 1), cuve non saturée
Ether éthylique-méthanol-eau (94 + 4,5 + 1,5), cuve saturée
Chloroforme-méthanol (94 + 6), cuve saturée
Chloroforme-éthanol (97 + 3), cuve saturée
Benzène-méthanol-acide acétique (90 + 5 + 5), cuve non saturée
Dichlorométhane-trichloroéthène-n-alcool d'amyle-acide formique
( 8 0 + 1 5 + 4 + 1 ) , cuve non saturée (l'ordre du R^ devient B,, G,, B2, G2)
Chloroforme-trichloroéthène-n-acide amylalcoolique-acide formique
(80 + 1 5 + 4 + 1 ) , cuve saturée
Chloroforme-acétone-eau (88 + 12 + 1,5), cuve non saturée
Chloroforme-acétone-isopropanol-eau (88 + 12 + 1,5 + 1), cuve non saturée
Chloroforme-isopropanol (99 + 1), cuve non saturée
Toluène-acétate d'éthyle-acide formique ( 6 + 3 + 1 ) , cuve non saturée

Ether éthylique-méthanol-eau (95 + 4 + 1), cuve non saturée


Ether éthylique-hexane-méthanol-eau (85 + 1 0 + 4 + 1 ) , cuve non saturée
Chloroforme-acétone-méthanol (90 + 10 + 2), cuve non saturée
Chloroforme-acétone-isopropanol (87 + 1 0 + 3 ) , cuve non saturée

f. Préparation et stockage des solutions étalons

Diluer une fraction de la solution-mère à l'abri de la lumière avec le


solvant déjà utilisé pour la solution-mère, afin d'obtenir une solution étalon
de la même concentration que celle prescrite dans la méthode d'analyse en
cause (habituellement 0,1 ou 0,5 /¿g d'aflatoxine/ml). Après avoir retiré des
aliquotes pour dilution ou dépôt de taches, on pèse la fiole contenant la
solution-mère à un mg près et l'on enregistre le poids pour référence
ultérieure avant de mettre en réserve la solution-mère.

Envelopper la fiole dans une feuille d'aluminium bien serrée et la


stocker à moins de 4° C, mais non à 0° C pour les solutions au chloroforme,
quand la solution doit être utilisée après stockage, peser de nouveau la fiole
et noter tout changement. Pour éviter l'incorporation de la condensation de
l'eau, porter la solution-mère et la solution étalon à la température ambiante
avant utilisation. Ne pas retirer la feuille d'aluminium de la fiole avant que
73 -

le c o n t e n u s o i t à la t e m p é r a t u r e a m b i a n t e . L a s o l u t i o n - m è r e p e u t ê t r e
c o n s e r v é e 4 m o i s si e l l e e s t s t o c k é e d a n s u n r é f r i g é r a t e u r à l ' a b r i de la
l u m i è r e . L a s o l u t i o n é t a l o n p e u t ê t r e c o n s e r v é e a u m o i n s 14 j o u r s si e l l e e s t
s t o c k é e de la m ê m e f a ç o n .

g. P r é p a r a t i o n de l ' é t a l o n de r é f é r e n c e p o u r résolution

P r é p a r e r l ' é t a l o n de r é f é r e n c e p o u r r é s o l u t i o n e n m é l a n g e a n t les
s o l u t i o n s d ' a f l a t o x i n e s B,, B 2 , G, e t G 2 a f i n d ' o b t e n i r d e s c o n c e n t r a t i o n s de
1 , 0 , 4 , 1 e t 0 , 4 yLig/ml r e s p e c t i v e m e n t l o r s de la d i l u t i o n f i n a l e a v e c le
c h l o r o f o r m e o u le b e n z è n e - a c é t o n i t r i l e .

C h r o m a t o g r a p h i c en c o u c h e m i n c e

a. D é p ô t des t a c h e s et développement

P o u r l ' a n a l y s e d e s m y c o t o x i n e s p a r c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e , les
s u b s t a n c e s q u i s o n t a p p l i q u é e s sur la p l a q u e o n t g é n é r a l e m e n t u n v o l u m e
v a r i a n t de 5 à 25 /il. S e l o n l ' e x a c t i t u d e e t la p r é c i s i o n s o u h a i t é e s , o n p e u t
u t i l i s e r d i f f é r e n t s t y p e s d ' a p p l i c a t e u r s , t e l s que des p i p e t t e s c a p i l l a i r e s
q u a l i t a t i v e s , des p i p e t t e s c a p i l l a i r e s q u a n t i t a t i v e s o u d e s s e r i n g u e s de
précision.

S u r la m ê m e p l a q u e de c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e o n a p p l i q u e
d i r e c t e m e n t l ' u n e a p r è s l ' a u t r e des p a r t i e s a l i q u o t e s de l ' é c h a n t i l l o n , de
m ê m e q u e des p a r t i e s a l i q u o t e s de la s o l u t i o n é t a l o n , e n v e i l l a n t à ce q u e les
t a c h e s s o i e n t de t a i l l e r é d u i t e e t u n i f o r m e . De c e t t e f a ç o n , la c o m p a r a i s o n
de l ' é c h a n t i l l o n e t de l ' é t a l o n e s t p o s s i b l e e t j u s t i f i é e , é t a n t d o n n é q u e les
d e u x s o n t s o u m i s a u x m ê m e s c o n d i t i o n s de d é v e l o p p e m e n t e t que les v a r i a t i o n s
é v e n t u e l l e s d ' u n e p l a q u e à l ' a u t r e s o n t é l i m i n é e s . Il e s t de b o n n e p r a t i q u e
d a n s u n l a b o r a t o i r e d ' a p p l i q u e r les é c h a n t i l l o n s e t les é t a l o n s a u s s i v i t e que
p o s s i b l e s o u s u n f a i b l e é c l a i r a g e à i n c a n d e s c e n c e , de p r é f é r e n c e e n a t m o s p h è r e
i n e r t e p o u r é v i t e r la d é c o m p o s i t i o n . A c e t t e m ê m e f i n , il f a u t , a p r è s le d é p ô t
des t â c h e s , c o u v r i r c e l l e s - c i d ' u n e p l a q u e e n v e r r e . P o u r l ' e s t i m a t i o n
v i s u e l l e , il e s t n é c e s s a i r e que l ' i n t e n s i t é des t a c h e s d ' é c h a n t i l l o n s se s i t u e
d a n s la g a m m e des i n t e n s i t é s d ' u n e s é r i e c r o i s s a n t e de t a c h e s d ' é t a l o n s . P a r
c o n s é q u e n t , s i l ' o n a n a l y s e les é c h a n t i l l o n s de c o n c e n t r a t i o n s de m y c o t o x i n e s
i n c o n n u e s , il e s t u t i l e de p r o c é d e r d ' a b o r d à u n e o p é r a t i o n p r é l i m i n a i r e de
c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e p o u r d é t e r m i n e r la t e n e u r a p p r o x i m a t i v e e n
m y c o t o x i n e , a f i n q u ' o n p u i s s e p r é p a r e r u n e d i l u t i o n a p p r o p r i é e p o u r la
c h r o m a t o g r a p h i e q u a n t i t a t i v e e n c o u c h e m i n c e . P o u r le d o s a g e d e n s i m é t r i q u e ,
il f a u t p r o c é d e r à d e s d i l u t i o n s si l ' i n t e n s i t é des t a c h e s d ' é c h a n t i l l o n e t
c e l l e d e s t a c h e s d ' é t a l o n n e s o n t p a s d u m ê m e o r d r e de g r a n d e u r .

Les plaques doivent être développées dans l'obscurité ou en lumière


t a m i s é e c a r l ' e x p o s i t i o n des m y c o t o x i n e s sur des s u r f a c e s a d s o r b a n t e s a u x
r a y o n s u l t r a v i o l e t s p e u t e n t r a i n e r la d é c o m p o s i t i o n , s u r t o u t e n p r é s e n c e de
s o l v a n t s . De m ê m e , les p l a q u e s de c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e d o i v e n t ê t r e
recouvertes d'une plaque en verre propre après 1'évaporation du solvant et
s t o c k é e s d a n s l ' o b s c u r i t é e n a t t e n d a n t la v i s u a l i s a t i o n o u le d o s a g e . L e s
taches développées ne doivent être exposées à l'éclairage ultraviolet que
p e n d a n t la d u r é e m i n i m a l e n é c e s s a i r e à la v i s u a l i s a t i o n . A f i n d ' o b t e n i r d e s
c o n d i t i o n s de d é v e l o p p e m e n t a u s s i u n i f o r m e s que p o s s i b l e , il e s t c o n s e i l l é de
p l a c e r s i m u l t a n é m e n t d e u x p l a q u e s d a n s la m ê m e c u v e , les s u r f a c e s o ù s o n t
f i x é e s les s u b s t a n c e s é t a n t f a c e à f a c e .
- 74 -

b. Interprétation et calcul

La manière de déceler une mycotoxine dépend de ses propriétés physico-


chimiques. Les aflatoxines absorbent fortement l'éclairage ultraviolet et
émettent l'énergie de l'ultraviolet absorbé sous forme de fluorescence. Cette
heureuse caractéristique permet à la personne effectuant l'analyse de déceler
ces constituants. Pour les autres mycotoxines, il faut utiliser des réactifs
de visualisation, par exemple en pulvérisant un réactif sur la plaque ou en
exposant celle-ci à de la vapeur de réactif.

Après visualisation, il faut interpréter le chromatogramme afin de


déterminer si la mycotoxine recherchée est présente ou non dans l'échantillon.
La tache de mycotoxine provenant de l'extrait peut être localisée à l'aide des
étalons développés simultanément. La tache de toxine présumée doit coïncider
avec l'étalon de référence pour ce qui est de la valeur R^ et de la teinte
(couleur). Il est conseillé de procéder à une opération supplémentaire de
chromatographie si l'interprétation du chromatogramme est gênée par la
présence d'autres taches ayant les mêmes valeurs R^ que la tache de toxine
présumée, ou bien si l'on éprouve des doutes quant à l'identité d'une tache
de toxine "présumée". Pour cette chromatographie supplémentaire, on répète,
l'opération de chromatographie en couche mince, cette fois avec un étalon
interne surimposé sur la tache d'extrait avant développement de la plaque.
Après l'opération de chromatographie en couche mince, cet étalon surimposé et
la tache de toxine "présumée" provenant de l'échantillon doivent coïncider.

N.B.: Avec la chromatographie bidimensionnelle en couche mince, la position


effective de la tache de mycotoxine provenant de l'extrait d'échantillon après
développement suivant la seconde orientation peut accuser une valeur R,
quelque peu supérieure à celle de l'étalon correspondant dans la voie
latérale. Cela est généralement dû à la présence dans le gel de silice de
résidus des composants du premier solvant de développement (méthanol, eau),
ces résidus ne sont pas présents dans la voie latérale en raison de la ligne
limite du solvant. Il peut donc en résulter une légère divergence des
valeurs R,.

Le dosage peut être effectué par des moyens visuels ou densimétriques,


selon l'équipement du laboratoire. Pour l'estimation visuelle, on compare
l'intensité des taches de toxine provenant de l'échantillon avec celle des
étalons et l'on détermine quelles sont les taches d'étalon qui correspondent
à la tache d'échantillon. Au besoin, on peut procéder à une interpolation.
Pour calculer la concentration de mycotoxine dans l'échantillon, on applique
la formule suivante :

S x Y x V
MgAg = , où
X x W

S = /il de mycotoxine étalon égale à l'inconnue


Y = concentration de mycotoxine étalon en /ig/ml
V = /il de dilution finale de l'extrait d'échantillon
X = /il d'extrait d'échantillon donnant une intensité de tache égale à S
W = masse de l'échantillon, représentée par l'extrait final en g.
75 -

Pour le dosage densimétrique, on examine l'intensité des taches


d'échantillon et d'étalon conformément aux instructions du fabricant et l'on
compare les pics sur la sortie d'imprimante. Avec la chromatographie
bidimensionnelle en couche mince, on examine habituellement les taches
d'étalon développées selon la seconde orientation. La concentration de
mycotoxine dans l'échantillon est calculée d'après la formule suivante:

B x Y x S x V
Mg/kg = , où
Z x X x W

B = superficie moyenne du pic de mycotoxine provenant de l'échantillon


Y = concentration de mycotoxine étalon en /¿g/ml
S = ni de mycotoxine étalon égale à l'inconnue
V = /il de dilution finale de l'extrait d'échantillon
Z = superficie moyenne du pic de mycotoxine provenant de l'étalon
X = /j.1 d'extrait d'échantillon déposé en taches

W = masse de l'échantillon, représentée par l'extrait final en g.

Confirmation de 1 ' identité


a. Principes généraux

Malgré toutes les techniques d'épuration utilisées, il subsiste des


substances qui se comportent comme la mycotoxine recherchée par séparation
selon la méthode de chromatographie en couche mince. Pour réduire au minimum
le risque de résultats faussement positifs, il faut confirmer l'identité de
la mycotoxine dans les échantillons positifs. La méthode la plus fiable à
cette fin est la spectroscopie de masse à haute résolution. Toutefois, la
spectroscopie de masse à haute résolution utilisée en association avec la
chromatographie en couche mince est une opération d'assez longue durée et tous
les laboratoires ne disposent pas de ce type d'appareil de haute technicité.
Il faut donc accorder la préférence à des techniques chimiques simples. Ces
techniques n'offrent pas la même certitude absolue que la spectroscopie de
masse à haute résolution, mais elles évitent la plupart des résultats
faussement positifs.

Les épreuves de confirmation des mycotoxines reposent généralement sur


la dérivation de la mycotoxine considérée dans un produit de réaction doté
d'un comportement et/ou d'une couleur chromatographiques spécifiques. La
mycotoxine servant d'étalon et l'échantillon suspect sont tous deux soumis à
la même réaction de dérivation. Par conséquent, dans les échantillons
positifs, on devrait voir apparaître un dérivé de la mycotoxine identique à
celui de la mycotoxine servant d'étalon. Les réactions de confirmation peuvent
être effectuées dans des éprouvettes ou, de préférence, directement sur une
plaque de chromatographie en couche mince, ce qui permet de tirer profit des
avantages de cette technique. Comme exemples de cette dernière possibilité,
on peut citer les méthodes de confirmation de l'aflatoxine B, mises au point
à l'origine par Przybylski (1975) et par Verhülsdonk (1977), aujourd'hui
adoptées comme méthodes officielles, respectivement par l'AOAC et par les
Communautés européennes. Dans les deux méthodes, l'aflatoxine B, est dérivée
en milieu acide sur une plaque de chromatographie en couche mince pour obtenir
son hémiacétal, l'aflatoxine B2a, qui produit une fluorescence bleue à un R,
plus faible que l'aflatoxine B,.
- 76 -

D a n s la m é t h o d e ( s i m p l e ) de P r z y b y l s k i , o n o b t i e n t ce r é s u l t a t e n
s u r i m p o s a n t de l ' a c i d e t r i f l u o r o a c é t i q u e d i r e c t e m e n t s u r la t a c h e d ' e x t r a i t
a v a n t le d é v e l o p p e m e n t . A p r è s la r é a c t i o n , la p l a q u e e s t d é v e l o p p é e e t
e x a m i n é e s o u s é c l a i r a g e u l t r a v i o l e t p o u r d é t e r m i n e r la p r é s e n c e de la t a c h e
b l e u e d e f l u o r e s c e n c e de l ' a f l a t o x i n e B 2 a , q u i p e u t ê t r e i d e n t i f i é e à l ' a i d e
d ' u n é t a l o n d ' a f l a t o x i n e B, d é p o s é e n t a c h e s sur la m ê m e p l a q u e e t s o u m i s à
l a m ê m e o p é r a t i o n . C o m m e c o n f i r m a t i o n s u p p l é m e n t a i r e , o n p u l v é r i s e d u H 2 S 0 4 sur
u n e a u t r e p a r t i e de la p l a q u e o ù o n t été d é v e l o p p é e s d e s p a r t i e s a l i q u o t e s
n ' a y a n t p a s r é a g i de l ' e x t r a i t e t de l ' a f l a t o x i n e B, s e r v a n t d ' é t a l o n . L a
p u l v é r i s a t i o n d ' a c i d e H 2 S 0 4 m o d i f i e la f l u o r e s c e n c e de l ' a f l a t o x i n e , q u i v i r e
d u b l e u a u j a u n e , c e t t e é p r e u v e n e f a i t que c o n f i r m e r l ' a b s e n c e d ' a f l a t o x i n e ,
c ' e s t - à - d i r e que les taches qui ne virent pas au jaune ne sont certainement
p a s de l ' a f l a t o x i n e , m a i s de n o m b r e u s e s s u b s t a n c e s a u t r e s que l ' a f l a t o x i n e
p e u v e n t donner une tache jaune avec du H2S04.

D a n s le c a s d ' e x t r a i t s f o r t e m e n t " s o u i l l é s " , il p e u t s ' a v é r e r d i f f i c i l e


d e d i s t i n g u e r l ' h é m i a c é t a l de l ' a f l a t o x i n e B, ( c ' e s t - à - d i r e la B 2 a ) e n r a i s o n
d'une forte fluorescence de fond. La technique bi-dimensionnelle de
V e r h ü l s d o n k s e r a a l o r s la m é t h o d e de c h o i x , c o m p o r t a n t la succession
s é p a r a t i o n - r é a c t i o n - s é p a r a t i o n . O n p u l v é r i s e de l ' a c i d e c h l o r h y d r i q u e a p r è s
la p r e m i è r e s é p a r a t i o n e t la r é a c t i o n a l i e u . P u i s o n p r o c è d e à u n e d e u x i è m e
s é p a r a t i o n d a n s l a s e c o n d e d i m e n s i o n d a n s des c o n d i t i o n s r i g o u r e u s e m e n t
i d e n t i q u e s , a p r è s q u o i la t a c h e de f l u o r e s c e n c e b l e u e i s o l é e de l ' a f l a t o x i n e
B 2 a e s t v i s i b l e , p o u v a n t ê t r e i d e n t i f i é e à l ' a i d e de l ' é t a l o n d ' a f l a t o x i n e B,
d é p o s é e n t a c h e s s u r la m ê m e p l a q u e e t a y a n t s u b i la m ê m e o p é r a t i o n . D ' a u t r e s
c o n s t i t u a n t s (sans r é a c t i o n ) s o n t d i s p o s é s e n d i a g o n a l e s u i v a n t la b i s s e c t r i c e
d e la p l a q u e , la s é p a r a t i o n a y a n t é t é e f f e c t u é e s e l o n les d e u x o r i e n t a t i o n s
dans des conditions rigoureusement identiques.

N.B.: Ces deux méthodes sont tout aussi satisfaisantes l'une que l'autre pour
c o n f i r m e r l ' i d e n t i t é de l ' a f l a t o x i n e G,.

b. M é t h o d e de l ' A O A C p o u r l ' a f l a t o x i n e B, ( u n i d i m e n s i o n n e l l e )

Matériel et produits chimiques :

Plaques de chromatographie en couche mince préparées selon la


d e s c r i p t i o n q u i p r é c è d e o u u t i l i s a t i o n de p l a q u e s c o m p o r t a n t d é j à u n e c o u c h e
é p a i s s e de 0 , 2 5 m m de g e l de s i l i c e ( M e r c k , g e l D C - K i e s e l 60 ( D a r m s t a d t , R F A ) ;
M a c h e r y & N a g e l , MN-G-HR (Düren, RFA); ou équivalent).

Acide trifluoroacétique. Conserver au réfrigérateur dans un flacon à


bouchon étanche.
M i c r o s e r i n g u e de 10 /il o u c a p i l l a i r e s q u a n t i t a t i f s e n v e r r e .
C a p i l l a i r e s q u a l i t a t i f s e n v e r r e de 1 f i l .
P l a q u e e n v e r r e p r o p r e d ' e n v i r o n 10 x 20 c m .
Soufflerie d'air chaud.
S o l v a n t r é v é l a t e u r : m é l a n g e de c h l o r o f o r m e e t d ' a c é t o n e (85 + 1 5 ) .
Chambre de développement rectangulaire avec bord en verre et bouchon à
l'émeri ou équivalent.
L a m p e u l t r a v i o l e t à g r a n d e s o n d e s (360 n m ) (à u t i l i s e r a v e c des l u n e t t e s
a b s o r b a n t les ultraviolets) ou chambre ChromatoVue (Ultra-Violet
P r o d u c t s , I n c . ) o u é q u i v a l e n t . L ' i n t e n s i t é de l ' i r r a d i a t i o n doit
p e r m e t t r e de d i s t i n g u e r n e t t e m e n t sur u n e p l a q u e de c h r o m a t o g r a p h i e e n
c o u c h e m i n c e à 10 c m de la l a m p e u n e t a c h e de 1 n g d ' a f l a t o x i n e B,.
- 77 -

Mode opératoire

(Voir figure 36) . Diviser une plaque de chromatographie en couche mince


en deux parties égales en traçant dessus un trait épais. Recouvrir l'une des
parties avec la plaque en verre.

Sur la partie non couverte, déposer deux taches aliquotes de l'extrait


d'échantillon préparé pour la chromatographie en couche mince contenant de 0, 5
à 5 ng d'aflatoxine B,. Déposer deux aliquotes de l'aflatoxine B, servant
d'étalon (approximativement la même quantité que dans l'échantillon)
respectivement sur l'une de ces taches d'échantillon et en un autre endroit.

Chloroforme
-acétone
(85+15)

# Echantillon
O Etalon

C Echantillon + étalon
Figure 36

Surimposer 1 /J.1 d'acide trifluoroacétique sur chacune des trois taches


et laisser réagir pendant 5 minutes. Souffler ensuite de l'air chaud sur la
plaque pendant au moins 10 minutes (la température de l'air à la surface de
la plaque doit être d'environ 40° C) . Découvrir la deuxième partie de la
plaque et répéter l'opération décrite plus haut. Ne pas ajouter d'acide
trifluoroacétique.
- 78 -

Placer une quantité suffisante du solvant révélateur dans la cuve de


développement et introduire la plaque dans la cuve. Placer une auge ou trois
petits béchers contenant de l'eau devant la plaque. Ne pas équilibrer. Après
le développement, examiner la plaque sous éclairage ultraviolet grandes ondes.
L'aflatoxine B, n'ayant pas réagi apparaît près du haut de la plaque dans la
partie où il n'y a pas d'acide trifluoroacétique. Les dérivés à fluorescence
bleue (aflatoxine B2a) provenant de l'aflatoxine B, servant d'étalon et de
l'extrait où l'on a surimposé de l'étalon d'aflatoxine B, apparaissent avec
un fy d'environ 0,25 dans la partie où l'on a pulvérisé de l'acide
trifluoroacétique. La présence d'aflatoxine B2a dans le canal de l'extrait
d'échantillon ayant réagi est une preuve de l'identité de l'aflatoxine B,
dans l'extrait d'échantillon.

3. Méthodes de chromatographie en couche mince pour le dosage de


l'aflatoxine B, dans les produits d'alimentation humaine et animale

N.B.: Ces modes opératoires sont basés sur la méthode officielle des
Communautés européennes, Journal officiel des Communautés européennes L102,
9-18 (1976), texte modifié par P.L. Schuller et H.P. van Egmond.

Mode opératoire pour la chromatographie unidimensionnelle en couche


mince

a. But et champ d'application

Cette méthode permet de déterminer la teneur en aflatoxine B, des


produits simples d'alimentation animale suivants: tourteaux et farines
préparés à partir d'arachides, de coprah, de graines de lin, de soja, de
sésame, de babassou, de manioc et d'huile de germe de maïs, ainsi que de
céréales et de produits céréaliers, de maïs, de farine de pois, de fécule de
pomme de terre et d'amidon. Bien que ce ne soit pas spécifié dans le texte
officiel du mode opératoire prescrit par les Communautés européennes, cette
méthode convient aussi à l'analyse de divers produits d'alimentation humaine
pour y rechercher l'aflatoxine B,.

Le seuil de détection inférieur est d'environ 0,01 mg/kg (10 ppb).

Si le dosage est entravé par la présence de substances gênantes, il


faut répéter l'analyse en utilisant la chromatographie bidimensionnelle en
couche mince.

b. Principe

La prise d'essai est soumise à une extraction au chloroforme. L'extrait


est filtré et une partie aliquote est prélevée et purifiée sur gel de silice
par chromatographie sur colonne. L'éluat est évaporé et le résidu est
redissous dans un volume spécifique de chloroforme ou d'un mélange de benzène
et d'acétonitrile. Une partie aliquote de cette solution est soumise à une
opération de chromatographie en couche mince. Le dosage de l'aflatoxine B,
s'effectue par irradiation du chromatogramme aux ultraviolets, soit
visuellement, soit au fluorodensimètre, par comparaison avec des quantités
connues de l'aflatoxine B, servant d'étalon. L'identité de l'aflatoxine B,
extraite du produit d'alimentation animale est confirmée par la formation de
l'hémiacétal de l'aflatoxine B, sur la plaque de chromatographie en couche
mince.
- 79

c. Réactifs

(N.B.: Tous les réactifs doivent être de qualité "réactif analytique".)

Acétone
Chloroforme, stabilisé avec 0,5 à 1,0% d'éthanol à 96% (v/v)
n-Hexane
Méthanol
Ether éthylique anhydre, exempt de peroxydes
Mélange de benzène et d'acétonitrile: 98/2 (v/v)
Mélange de chloroforme et de méthanol: 97/3 (v/v)
Gel de silice pour chromatographie sur colonne; granulométrie:
0,05-0,20 mm
Coton hydrophile, préalablement dégraissé au chloroforme, ou laine de
verre
Sulfate de sodium anhydre granuleux
Gaz inerte, par exemple azote
Acide chlorhydrique (1 mol/L)
Solution aqueuse d'acide sulfurique à 50% (v/v)
Diatomite (Kieselguhr, Hyflosupercel), lavée à l'acide
Gel de silice G-HR ou équivalent pour plaques à enduire par l'opérateur
Solution étalon contenant 0,1 /¿g d'aflatoxine B, par ml dans du
chloroforme ou dans le mélange de benzène et d'acétonitrile préparé et
vérifié comme indiqué ci-après

Préparation de la solution étalon et dosage de la concentration:

Préparer une solution étalon d'aflatoxine B, dans du chloroforme ou


dans le mélange de benzène et d'acétonitrile avec une concentration de
8 à 10 /xg/ml. Enregistrer le spectre d'absorption entre 330 et 370 nm
à l'aide du spectrophotomètre.

Mesurer le pouvoir absorbant (A) à 363 nm dans le cas de la solution


au chloroforme et à 348 nm quand la solution est un mélange de benzène
et d'acétonitrile.

Calculer la concentration en microgrammes d'aflatoxine B, par ml de


solution à partir des formules ci-après:

312 x A x 1000 pour la solution au chloroforme;


20600

312 x A x 1000 pour la solution comportant un mélange de


19800 benzène et d'acétonitrile.
80 -

Diluer la solution d'étalon comme il convient à l'abri de la lumière


du jour pour obtenir une concentration d'aflatoxine B, de 0,1 /jg/ml.
Conservée au réfrigérateur à 4° C, cette solution reste stable pendant
deux semaines.

Vérification de la pureté chromatographique de la solution étalon:

Déposer sur une plaque 5 /j.1 de la solution étalon d'aflatoxine B,


contenant de 8 à 10 ¿¿g/ml. Développer le chromatogramme comme indiqué
à la page 82. Sous éclairage ultraviolet, le chromatogramme ne révélera
qu'une seule tache et aucune fluorescence ne sera perceptible dans la
zone de dépôt initiale.

Solution étalon pour épreuve qualitative contenant environ 0,1 /¿g


d'aflatoxine B, et B2 par ml dans du chlorofome ou dans" le mélange de
benzène et d'acétonitrile. ces concentrations sont données à titre
indicatif. On pourra les ajuster pour obtenir la même intensité de
fluorescence pour les deux aflatoxine.

Solvants révélateurs :

Mélange de chloroforme et d'acétone: 9/1 (v/v), cuve non saturée;


Mélange d'éther éthylique et de méthanol et d'eau: 96/3/1 (v/v/v), cuve
non saturée;
Mélange d'éther éthylique et de méthanol et d'eau: 94/4,5/1,5 (v/v/v),
cuve non saturée;
Mélange de chloroforme et de méthanol: 95/6 (v/v), cuve saturée;
Mélange de chloroforme et de méthanol: 97/3 (v/v), cuve saturée.
Acide trifluoroacétique (stocker au réfrigérateur dans un flacon à
fermeture hermétique);
Propanol-2.

Solvants révélateurs pour épreuve de confirmation:

Mélange de chloroforme et d'acétone et méthanol: 90/10/2 (v/v/v), cuve


non saturée;
Mélange de chloroforme et d'acétone et propanol-2: 85/12,5/2,5 (v/v/v),
cuve non saturée;

Solution aqueuse à 5% (v/v) d'hypochlorite de sodium (NaOCl).

d. Equipement

Broyeur-malaxeur
Agitateur, magnétique ou autre
Papiers filtres cannelés, Schleicher et Schüll N° 588 ou équivalent;
diamètre: 24 cm
Tube en verre pour chromatographic (diamètre interne: 22 mm; longueur:
300 mm) avec robinet en Teflon et réservoir de 250 ml
81 -

Evaporateur rotatif sous vide avec ballon de 500 ml


Fiole conique de 500 ml avec bouchon à l'émeri
Matériel de chromatographie en couche mince
Plaques en verre pour chromatographie en couche mince, 200 x 200 mm,
préparées comme suit (les quantités indiquées sont suffisantes pour
recouvrir 5 plaques): déposer 30 g de gel de silice G-HR dans une fiole
conique. Ajouter 60 ml d'eau, boucher et agiter pendant une minute.
Etaler la suspension sur les plaques de manière à obtenir une couche
uniforme de 0,25 mm d'épaisseur. Laisser sécher à l'air, puis stocker
dans un dessiccateur contenant du gel de silice. Au moment de
l'utilisation, activer les plaques en les plaçant pendant une heure dans
un four à 110° C.

Les plaques à antigène préfixé conviennent si elles donnent des


résultats analogues à ceux qu'on obtient avec les plaques préparées
selon la méthode indiquée ci-dessus.

Lampe ultraviolet grandes ondes (360 nm). L'intensité de l'irradiation


permettra de distinguer nettement une tache de 1,0 ng d'aflatoxine B,
sur une plaque de chromatographie en couche mince à 10 cm de la lampe.

ATTENTION - L'ECLAIRAGE ULTRAVIOLET EST DANGEREUX POUR LES YEUX. IL EST


IMPERATIF DE PORTER DES LUNETTES DE PROTECTION.

Tubes graduées de 10 ml avec bouchons en verre ou en polyéthylène


Spectrophotomètre ultraviolet
Fluorodensimètre (facultatif)
Capillaires de 1 ou 2 /il ou de préférence microseringue (0-50 \x 1)
Pulvérisateur pour chromatographie en couche mince (à faible volume
(5-20 ml)).

e. Mode opératoire

Préparation de l'échantillon:

Broyer l'échantillon de telle sorte qu'il traverse parfaitement un


tamis à mailles de 1 mm (conformément à la recommandation de l'ISO
R 565).

Extraction:

Placer dans une fiole conique 50 g d'échantillon broyé et homogénéisé.


Ajouter 25 g de diatomite, 25 ml d'eau et 250 ml de chloroforme. Boucher
la fiole, agiter ou remuer pendant 30 minutes en utilisant l'appareil
et filtrer à travers un papier filtre cannelé. Mettre au rebut les 10
premiers millilitres du filtrat, puis en recueillir au moins 50 ml.

Epuration de la colonne:

Introduire à l'extrémité inférieure du tube de chromatographie un


bouchon de coton hydrophile ou de laine de verre, remplir le tube aux
deux tiers avec du chloroforme et ajouter 5 g de sulfate de sodium.
- 82 -

Vérifier que la surface de la couche de sulfate de sodium soit bien


plane, puis ajouter 10 g de gel de silice en fractions réduites. Remuer
soigneusement après chaque addition pour éliminer les bulles d'air.
Laisser reposer 15 minutes, puis ajouter soigneusement 15 g de sulfate
de sodium. Ouvrir le robinet, laisser le liquide s'écouler jusqu'à ce
qu'il soit juste au-dessus de la surface de la couche de sulfate de
sodium. Fermer le robinet.

Mélanger 50 ml de l'extrait recueilli dans 100 ml de n-hexane et


transférer quantitativement le mélange dans la colonne. Ouvrir le
robinet, laisser le liquide s'écouler jusqu'à ce qu'il soit juste au-
dessus de la surface de la couche de sulfate de sodium. Fermer le
robinet. Mettre ce liquide au rebut. Ajouter ensuite 100 ml d'éther
éthylique et laisser de nouveau le liquide s'écouler jusqu'à ce qu'il
soit juste au-dessus de la surface de la couche de sulfate de sodium.
Pendant ces opérations, vérifier que le débit soit de 8 à 12 ml par
minute et que la colonne ne soit pas asséchée. Mettre au rebut le
liquide qui s'échappe. Eluer ensuite avec 150 ml du mélange de
chloroforme et de méthanol et recueillir la totalité de l'éluat dans
le ballon de 1'évaporateur rotatif.

Evaporer l'éluat jusqu'à ce qu'il soit presque totalement sec à une


température ne dépassant pas 50° C et de préférence sous un jet de gaz
inerte sous pression réduite avec 1'évaporateur rotatif. Transférer
quantitativement le résidu en utilisant le chloroforme ou le mélange de
benzène et d'acétonitrile dans un tube gradué de 10 ml. Concentrer la
solution sous un jet de gaz inerte, puis ajuster le volume à 2,0 ml avec
le chloroforme ou le mélange de benzène et d'acétonitrile.

N.B.: L'aflatoxine B, est une substance hautement cancérogène et il faut


donc la manipuler avec de grandes précautions. Ne pas transférer de
l'aflatoxine sèche pour la pesée ou à d'autres fins, à moins de disposer
de moyens (par exemple un caisson stérile) empêchant la diffusion de
l'aflatoxine aux alentours par suite d'une charge électrostatique sur
les particules. Rincer toute la verrerie exposée à l'aflatoxine
soigneusement au chloroforme, puis avec la solution d'eau de Javel;
laver ensuite à fond. Nettoyer l'aflatoxine répandue par accident avec
la solution d'eau de Javel. Pour plus de détails sur les méthodes de
décontamination, voir la publication du CIRC N° 37 "Décontamination au
laboratoire et destruction des aflatoxines B,, B2, G, et G2 dans les
déchets de laboratoire", publiée sous la direction de M. Castegnaro et
col., Lyon, 1980.

Chromatographie en couche mince:

Déposer en taches sur une plaque de chromatographie en couche mince,


à 2 cm du bord inférieur et à intervalles de 2 cm, les volumes indiqués
ci-après de la solution étalon et de l'extrait de la prise d'essai en
utilisant des pipettes capillaires ou la microseringue.

10, 15, 20, 30 et 40 ¿¿1 de la solution étalon d'aflatoxine B, ;


10 ni de l'extrait obtenu et, surimposés au même endroit, 20 ¡j.1 de
la solution étalon;
10 et 20 /il de l'extrait obtenu ci-dessus.
- 83 -

S é c h e r d a n s u n c o u r a n t d ' a i r o u de g a z i n e r t e à f a i b l e d é b i t . L e s t a c h e s
obtenues auront un diamètre d'environ 5 m m .

D é v e l o p p e r le c h r o m a t o g r a m m e d a n s l ' o b s c u r i t é a v e c l ' u n d e s s o l v a n t s
r é v é l a t e u r s . (On c h o i s i r a le s o l v a n t a u p r é a l a b l e e n d é p o s a n t 25 /¿I de
la s o l u t i o n é t a l o n q u a l i t a t i v e sur la p l a q u e e t e n v é r i f i a n t q u ' a p r è s
d é v e l o p p e m e n t les a f l a t o x i n e s B, e t B z à f l u o r e s c e n c e b l e u e s o n t
c o m p l è t e m e n t s é p a r é e s . ) L a i s s e r le s o l v a n t s ' é v a p o r e r d a n s l ' o b s c u r i t é ,
p u i s i r r a d i e r a u x u l t r a v i o l e t s e n p l a ç a n t la p l a q u e à 10 cm de la l a m p e .
L e s t a c h e s d ' a f l a t o x i n e B, d é g a g e n t u n e f l u o r e s c e n c e b l e u e .

Dosage :

Estimer visuellement ou doser au fluorodensimètre comme indiqué ci-


après.

Estimation visuelle :

E s t i m e r la q u a n t i t é d ' a f l a t o x i n e B, d a n s l ' e x t r a i t e n comparant


l ' i n t e n s i t é de f l u o r e s c e n c e des t a c h e s de l ' e x t r a i t a v e c c e l l e d e s
t a c h e s de s o l u t i o n é t a l o n . A u b e s o i n , p r o c é d e r p a r i n t e r p o l a t i o n . L a
f l u o r e s c e n c e o b t e n u e p a r s u r i m p o s i t i o n de l ' e x t r a i t sur la s o l u t i o n
é t a l o n s e r a p l u s i n t e n s e que c e l l e d e s 10 ¿¿1 d ' e x t r a i t e t s e r a p e r ç u e
c o m m e u n e s e u l e t a c h e v i s i b l e . Si l ' i n t e n s i t é de la f l u o r e s c e n c e d é g a g é e
p a r les 10 /il d ' e x t r a i t e s t s u p é r i e u r e à c e l l e d e s 4 0 /il de s o l u t i o n
é t a l o n , d i l u e r l ' e x t r a i t 10 o u 100 f o i s a v e c d u c h l o r o f o r m e o u a v e c le
m é l a n g e de b e n z è n e e t d ' a c é t o n i t r i l e a v a n t de r é p é t e r l ' o p é r a t i o n de
chromatographie en couche mince.

Mesure par fluorodensimétrie:

M e s u r e r a u f l u o r o d e n s i m è t r e l ' i n t e n s i t é de la f l u o r e s c e n c e d é g a g é e p a r
les t a c h e s d ' a f l a t o x i n e B, à u n e l o n g e u r d ' o n d e s d ' e x c i t a t i o n de 365 n m
e t à u n e l o n g u e u r d ' o n d e s d ' é m i s s i o n de 4 4 3 rim. D é t e r m i n e r la q u a n t i t é
d ' a f l a t o x i n e B, d a n s les t a c h e s d ' e x t r a i t e n c o m p a r a n t l ' i n t e n s i t é de
la f l u o r e s c e n c e d e s t a c h e s d ' e x t r a i t a v e c c e l l e d e s t a c h e s d ' a f l a t o x i n e
B, s e r v a n t d ' é t a l o n . S i l ' i n t e n s i t é de la f l u o r e s c e n c e d é g a g é e p a r les
20 /il d ' e x t r a i t e s t n e t t e m e n t s u p é r i e u r e à c e l l e d e s 4 0 /il de s o l u t i o n
é t a l o n , d i l u e r l ' e x t r a i t 10 o u 100 fois a v e c d u c h l o r o f o r m e o u a v e c le
m é l a n g e de b e n z è n e e t d ' a c é t o n i t r i l e a v a n t de r é p é t e r l ' o p é r a t i o n de
chromatographie en couche mince.

C o n f i r m a t i o n de l ' i d e n t i t é de l ' a f l a t o x i n e B, :

C o n f i r m e r l ' i d e n t i t é de l ' a f l a t o x i n e B, d a n s l ' e x t r a i t a u m o y e n de


l ' é p r e u v e de p r é s o m p t i o n à l ' a c i d e s u l f u r i q u e e t , s i c e t t e é p r e u v e
d o n n e u n r é s u l t a t p o s i t i f , a u m o y e n d e s é p r e u v e s de c o n f i r m a t i o n ci-
a p r è s e n u t i l i s a n t la c h r o m a t o g r a p h i e b i d i m e n s i o n n e l l e e n c o u c h e m i n c e .
S i l ' é p r e u v e de p r é s o m p t i o n à l ' a c i d e s u l f u r i q u e d o n n e u n r é s u l t a t
n é g a t i f , il n ' e s t p a s n é c e s s a i r e de p r o c é d e r à la c o n f i r m a t i o n e f f e c t i v e
p u i s q u e , d a n s ce c a s , il n ' y a p a s d ' a f l a t o x i n e B,.
- 84 -

Epreuve de présomption à l'acide sulfurique:

Pulvériser de l'acide sulfurique sur le chromatogramme. La fluorescence


des taches d'aflatoxine B, doit virer du bleu au jaune sous le
rayonnement ultraviolet.

Chromatographic bidimensionnelle comportant la formation de l'hémiacétal


de l'aflatoxine B, d'aflatoxine B?a) avec utilisation d'acide
chlorhydrique: (La préférence doit être accordée à cette méthode si l'on
dispose de plaques à antigène préfixé et d'un coffret de pulvérisation
à succion.)

Application des solutions; (Suivre le diagramme de la figure 37.)

Tracer deux lignes droites sur une plaque parallèlement aux deux côtés
contigus (à 6 cm de chaque bord) pour limiter la migration du solvant.
Déposer des taches des solutions ci-après sur la plaque à l'aide des
pipettes capillaires ou de la microseringue.

Orientation Iï >

Q o

O
H
ro
3
rt
B)
rr
H1
O
3

0 o 0

B
— O

CM

H 12 cm -fl-4 c m 1
2 cm 2 cm

A: extrait de la prise d'essai


B et C: étalon d'aflatoxine B.

Figure 37
85

a u p o i n t A : u n v o l u m e d ' e x t r a i t de la p r i s e d ' e s s a i , o b t e n u e n
" E p u r a t i o n de la c o l o n n e " , c o n t e n a n t e n v i r o n 2,5 n g d ' a f l a t o x i n e
B,;

a u x p o i n t s B e t C: 25 fil de la s o l u t i o n étalon;

S é c h e r d a n s u n c o u r a n t d ' a i r o u d e s gaz i n e r t e à faible débit. Les


taches auront un diamètre d'environ 5 mm.

D é v e l o p p e m e n t : ( S u i v r e le d i a g r a m m e de la f i g u r e 37.)

D é v e l o p p e r la p l a q u e s u i v a n t l ' o r i e n t a t i o n I d a n s l ' o b s c u r i t é e n
u t i l i s a n t le s o l v a n t r é v é l a t e u r c h l o r o f o r m e - a c é t o n e 9 / 1 ( v / v ) j u s q u ' à
ce q u ' i l a t t e i g n e la l i g n e l i m i t e .

R e t i r e r la p l a q u e de la c u v e e t la l a i s s e r s é c h e r d a n s l ' o b s c u r i t é à la
t e m p é r a t u r e a m b i a n t e p e n d a n t 5 m i n u t e s . P u l v é r i s e r e n s u i t e de l ' a c i d e
c h l o r h y d r i q u e sur u n e b a n d e de 2,5 cm de l a r g e e n c o u v r a n t les p o i n t s
A e t C (zone i n d i q u é e p a r les h a c h u r e s s u r la f i g u r e 3 7 ) j u s q u ' à ce q u e
c e t t e z o n e d e v i e n n e f o n c é e , e n p r o t é g e a n t le r e s t e de la p l a q u e a v e c u n e
f e u i l l e de v e r r e . L a i s s e r r é a g i r 10 m i n u t e s d a n s l ' o b s c u r i t é e t s é c h e r
d a n s u n c o u r a n t d ' a i r à la t e m p é r a t u r e a m b i a n t e .

D é v e l o p p e r e n s u i t e la p l a q u e s u i v a n t l ' o r i e n t a t i o n II d a n s l ' o b s c u r i t é
en u t i l i s a n t le s o l v a n t r é v é l a t e u r c h l o r o f o r m e - a c é t o n e 9 / 1 ( v / v ) j u s q u ' à
ce q u ' i l a t t e i g n e la l i g n e l i m i t e . R e t i r e r la p l a q u e de la c u v e e t
l a i s s e r s é c h e r à la t e m p é r a t u r e a m b i a n t e .

I n t e r p r é t a t i o n du chromatogramme:

E x a m i n e r le c h r o m a t o g r a m m e sous rayonnement ultraviolet et vérifier


les p o i n t s s u i v a n t s :

1) A p p a r i t i o n d ' u n e t a c h e f l u o r e s c e n t e b l e u e d ' a f l a t o x i n e B, é m a n a n t
de la s o l u t i o n é t a l o n a p p l i q u é e e n B ( m i g r a t i o n s u i v a n t l ' o r i e n t a t i o n
I).

2) A p p a r i t i o n d ' u n e t a c h e f l u o r e s c e n t e b l e u e d ' a f l a t o x i n e B, n ' a y a n t


p a s r é a g i (avec l ' a c i d e c h l o r h y d r i q u e ) e t d ' u n e t a c h e de f l u o r e s c e n c e
b l e u e , p l u s i n t e n s e , de l ' h é m i a c é t a l de l ' a f l a t o x i n e B, à u n e v a l e u r
R^ p l u s f a i b l e , les d e u x é m a n a n t de la s o l u t i o n é t a l o n a p p l i q u é e e n
C (migration suivant l'orientation II).

3) A p p a r i t i o n de t a c h e s c o r r e s p o n d a n t à c e l l e s d é c r i t e s e n (2) é m a n a n t
de l ' e x t r a i t de la p r i s e d ' e s s a i a p p l i q u é e n A . L a p o s i t i o n de c e s
t a c h e s e s t d é f i n i e p r e m i è r e m e n t p a r la d i s t a n c e de m i g r a t i o n de
l ' a f l a t o x i n e B, à p a r t i r d u p o i n t A s u i v a n t l ' o r i e n t a t i o n I
( i d e n t i q u e à la d i s t a n c e p a r c o u r u e p a r l ' é t a l o n a p p l i q u é e n B e t ,
d e u x i è m e m e n t , p a r la d i s t a n c e de m i g r a t i o n à p a r t i r de là e t s u i v a n t
l ' o r i e n t a t i o n II de l ' h é m i a c é t a l de l ' a f l a t o x i n e B, ( i d e n t i q u e à
c e l l e p a r c o u r u e p a r l ' é t a l o n a p p l i q u é e n C . L ' i n t e n s i t é de la
f l u o r e s c e n c e des t a c h e s d ' h é m i a c é t a l é m a n a n t de l ' e x t r a i t d o i t
c o r r e s p o n d r e à c e l l e de l ' é t a l o n a p p l i q u é e n C .
- 86 -

Chromatographie bidimensionnelle comportant la formation de l'hémiacétal


de l'aflatoxine B1 (1'aflatoxine B?a) avec utilisation d'acide
fluoroacétique:

Application des solutions: (Suivre le diagramme de la figure 38.)

Tracer deux lignes droites sur une plaque parallèlement aux deux côtés
contigus (6 cm de chaque bord) pour limiter la migration du solvant.
Déposer des taches des solutions ci-après sur la plaque à l'aide des
pipettes capillaires ou de la microseringue.

au point A, un volume de l'extrait de la prise d'essai obtenu en


"Epuration de la colonne" (page 81) contenant environ 2,5 ng
d'alfatoxine B, ;

aux points B et C, 20 /il de la solution étalon.

Sécher dans un courant d'air ou de gaz inerte à faible débit. Les taches
obtenues doivent avoir un diamètre d'environ 5 mm.

Développement : (Suivre le diagramme de la figure 38.)

Orientation II-

T
1
T c
1
±

I
- — o — O
o 1
rsi — 1 o
h
H.
m
3
PC
eu
A'" B'" rf
H-
O O O
A" s
£
O O o B"
A' - B '
O 0

1 1
A
1 B
o — 0 -
E
u 1 1
1 1
I- 12 cm il 1.1-4 cm
2 cm 2 cm

A: extrait de la prise d'essai


B et C: étalon d'aflatoxine B,

Figure 38
- 87 -

Développer la plaque suivant l'orientation I dans l ' o b s c u r i t é , en


u t i l i s a n t le solvant révélateur éther-méthanol-eau 94/4,5/1,5 (v/v/v)
jusqu'à ce qu'il atteigne la ligne limite. Retirer la plaque de la cuve
et la laisser sécher dans l'obscurité à la température ambiante p e n d a n t
15 m i n u t e s .

Développer ensuite la plaque suivant l'orientation II dans l ' o b s c u r i t é ,


en u t i l i s a n t le solvant révélateur chloroforme-acétone 9/1 (v/v) j u s q u ' à
ce qu'il atteigne la ligne limite. Retirer la plaque de la cuve et la
laisser sécher dans l'obscurité à la température a m b i a n t e .

Examiner le chromatogramme sous rayonnement u l t r a v i o l e t et m a r q u e r au


m o y e n d'un crayon à mine douce l'emplacement de la tache de solution
étalon au p o i n t B ' (voir figure 38) et de la tache présumée d'aflatoxine
B, (A') p r o v e n a n t de l'extrait. A u m o y e n d'un capillaire en v e r r e ,
déposer une tache de 1 à 2 ¿¿1 d'acide trifluoroacétique sur les taches
A ' et B ' . Sécher dans u n courant d'air à la température a m b i a n t e .

Développer de nouveau la plaque suivant l'orientation I (voir figure 38)


dans l'obscurité, en utilisant l'un des solvants révélateurs mentionnés
p r é c é d e m m e n t jusqu'à ce que ce dernier atteigne encore la ligne l i m i t e .
Retirer la plaque de la cuve et la laisser sécher dans l'obscurité à la
température ambiante pendant 15 m i n u t e s .

Interprétation du chromatogramme: (Suivre le diagramme de la figure 38.)

Examiner le chromatogramme sous rayonnement u l t r a v i o l e t et vérifier


les points suivants:

a) A p p a r i t i o n d'une faible tache fluorescente b l e u e , de dérivé


d'aflatoxine B, n o n identifié (position B ' ' ' ) , et d'une tache de
l'hémiacétal de l'aflatoxine B, développant une fluorescence b l e u e
plus intense (position B ' '), l'une et l'autre émanant de l'aflatoxine
B, servant d'étalon (position B').

b ) A p p a r i t i o n de taches fluorescentes bleues (positions A ' '' et A ' ' )


émanant de l'aflatoxine B, présumée dans l'extrait (position A ' ) ,
dont la v a l e u r R^ correspond à celles ayant pour origine l'aflatoxine
B, servant d'étalon (position B ' ) .

L'identité de l'aflatoxine B, dans l'extrait est confirmée quand la


v a l e u r R f de la tache d'hémiacétal de l'aflatoxine B, de l'extrait
correspond à celle de la tache de l'aflatoxine servant d'étalon
(positions A ' ' et B ' ' , r e s p e c t i v e m e n t ) .

f. Calcul des résultats

Estimation visuelle:

La formule suivante donne le contenu en /¿g d'aflatoxine B, par kg


d'échantillon (ppb):

X x S x V , où
Y x m
- 88 -

X et Y sont respectivement le volume en /il de la solution étalon


d'aflatoxine B, et le volume en /il de l'extrait développant une
fluorescence de même intensité;

S = concentration en /ig d'aflatoxine B, par ml de solution étalon;

V = volume final de l'extrait en /il, compte tenu de toute dilution


éventuellement nécessaire;

m = masse en grammes de la prise d'essai correspondant au volume


d'extrait soumis à une épuration sur colonne.

Mesure fluorodensimétrique:

La formule suivante donne le contenu en /ig d'aflatoxine B, par kg


d'échantillon:

S x V . où
Y x m

V = volume en /il d'extrait déposé sur la plaque (10 /il ou 20 /il);

S = masse en nanogrammes d'aflatoxine B, dans la tache d'extrait


(proportionnelle à la valeur de Y), déduite des mesures ;

V = volume final de l'extrait en /il, compte tenu de toute dilution


éventuellement nécessaire;

m = masse en grammes de la prise d'essai correspondant au volume


d'extrait soumis à une épuration sur colonne.

Chromatographic bidimensionnelle en couche mince (dépôt de taches pour


densimétrie)

But et champ d'application

Cette méthode permet de déterminer la teneur en aflatoxine B, des


produits d'alimentation humaine et des produits composés pour
alimentation animale, des produits d'alimentation animale simples
n'entrant pas dans le champ d'application de la méthode "Mode opératoire
pour la chromatographie unidimensionnelle en couche mince", page 78, et
des produits d'alimentation animale simples mentionnés dans le champ
d'application de la méthode, mais où la présence de substances gênantes
entrave le dosage de l'aflatoxine B,. Cette méthode n'est pas applicable
aux produits d'alimentation animale contenant de la pulpe d'agrumes. Le
seuil de détection est d'environ 0,01 mg/kg (10 ppb).

Principe

(N.B.: Comme pour la méthode à page 78.)

Réactifs

(N.B.: Tous les réactifs doivent être de qualité "réactif analytique".)

Acétone
- 89 -

Chloroforme, stabilisé avec de 0,5 à 1,0% d'éthanol a 96% (v/v)


n-Hexane
Méthanol
Ether éthylique anhydre exempt de peroxydes
Mélange de benzène et d'acétonitrile: 98/2 (v/v)
Mélange de chloroforme et de méthanol: 97/3 (v/v)
gel de silice pour chromatographie sur colonne; granulométrie: de 0,05
à 0,20 mm
Coton hydrophile préalablement dégraissé au chloroforme, ou laine de
verre
Sulfate de sodium anhydre granuleux
Gaz inerte, par exemple azote
Acide chlorhydrique (1 mol/L)
Diatomite (Kieselguhr, Hyflosupercel), lavée à l'acide
Gel de silice G-HR ou équivalent pour plaques à enduire par l'opérateur
Solvants révélateurs:
Mélange d'éther éthylique et de méthanol et d'eau: 94/4,5/1,5 (v/v/v),
cuve saturée;
Mélange de chloroforme et d'acétone: 9/1 (v/v), cuve non saturée;
Solution étalon contenant 0,1 /¿g d'aflatoxine B, par ml dans du
chloroforme ou dans le mélange de benzène et d'acétonitrile, préparée
et vérifiée comme indiqué ci-après;
Préparation de la solution étalon et détermination de la concentration:
procéder comme indiqué à la page 79;

Vérification de la pureté chromatographique de la solution étalon :

Procéder comme indiqué à la page 80.


Acide trifluoroacétique (conserver au réfrigérateur dans un flacon
parfaitement hermétique).
Propanol-2

Solvants révélateurs pour l'épreuve de confirmation:


Mélange de chloroforme et d'acétone et méthanol: 90/10/2 (v/v/v), cuve
non saturée;
Mélange de chloroforme et d'acétone et propanol-2: 85/12,5/2,5 (v/v/v),
cuve non saturée;

Hypochlorite de sodium (NaOCl), solution aqueuse à 5% (v/v).

d. Equipement

(N.B.: Comme pour la méthode indiqué à la page 80).


- 90 -

e. Mode opératoire

Préparation de l'échantillon d'épreuve: procéder comme indiqué à la


page 81.
Chromatographie bidimensionnelle en couche mince:
Application des solutions (suivre le diagramme de la figure 39).

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2 cm
A: extrait de la prise d'essai
B, C, D, E: étalon d'aflatoxine B,

Figure 39

Tracer deux lignes droites sur une plaque parallèlement aux deux côtés
contigus (à 5 et 6 cm de chaque bord, respectivement) pour limiter la
migration du solvant. Déposer des taches des solutions ci-après sur la
plaque à l'aide des pipettes capillaires ou de la microseringue:

au point A, 20 ¿il de l'extrait de la prise d'essai;


au point B, 20 /il de la solution étalon;
au point C, 10 /¿I de la solution étalon;
au point D, 20 /il de la solution étalon;
au point E, 40 /il de la solution étalon.

Sécher dans un courant d'air ou de gaz inerte à faible débit. Les taches
obtenues doivent avoir un diamètre d'environ 5 mm.
91

Développement:; (Suivre le diagramme de la figure 39).

Développer la plaque suivant l'orientation I dans l'obscurité en


utilisant le solvant révélateur jusqu'à ce qu'il atteigne la ligne
limite. Retirer la plaque de la cuve et la laisser sécher dans
l'obscurité à la température ambiante pendant 15 minutes.

Développer ensuite la plaque suivant l'orientation II dans l'obscurité


en utilisant le second solvant révélateur éther-méthanol-eau 94/4,5/1,5
(v/v/v) jusqu'à ce qu'il atteigne la ligne limite. Retirer la plaque de
la cuve et la laisser sécher dans l'obscurité à la température ambiante.

Interprétation du chromatogramme: (Suivre le diagramme de la figure 39.)

Irradier le chromatogramme à l'ultraviolet en plaçant la plaque à 10 cm


d'une lampe à ultraviolets. Repérer la position des taches fluorescentes
bleues B', C', D' et E' de l'aflatoxine B, provenant de la solution
étalon. Projeter deux lignes imaginaires traversant ces taches à angle
droit par rapport à l'orientation du développement. L'intersection P de
ces lignes est l'endroit où l'on peut s'attendre à trouver la tache
d'aflatoxine B., provenant de l'extrait de la prise d'essai appliquée en
A. Toutefois, il se peut que l'emplacement réel de la tache d'aflatoxine
B, soit un point A': à l'intersection de deux droites imaginaires
formant un angle d'environ 100° entre elles et traversant respectivement
les taches B' et C'. Doser la quantité d'aflatoxine B, dans l'extrait
de la prise d'essai, comme indiqué ci-après.

Chromatographie supplémentaire:

Tracer deux lignes droites sur une nouvelle plaque parallèlement aux
deux côtés contigus, comme indiqué sur le diagramme de la figure 39, et
appliquer au point A 20 /il de l'extrait de la prise d'essai et, en
surimposition, 20 de la solution étalon. Développer comme indiqué
précédemment. Irradier le chromatogramme à l'ultraviolet et vérifier:

que les taches d'aflatoxine B, de l'extrait et de la solution étalon


soient surimposées;

que la fluorescence de cette tache soit plus intense que celle de


la tache d'aflatoxine B, se trouvant en A' sur la première plaque.

Dosage :

Estimer visuellement ou doser par fluorodensimètre comme indiqué ci-


après .

Estimation visuelle :

Estimer la quantité d'aflatoxine B, dans l'extrait en comparant


l'intensité de la fluorescence de la tache d'extrait (A') avec celle des
taches C' , D' et E' de la solution étalon. Au besoin, procéder par
interpolation. Si la fluorescence émanant des 20 /¿I d'extrait est plus
intense que celle des 40 /J.1 de solution étalon, diluer l'extrait 10 ou
100 fois avec du chloroforme ou avec le mélange de benzène et
d'acétonitrile avant de répéter l'opération de chromatographie en couche
mince.
92 -

Mesure par fluorodensimétrie:

Mesurer au fluoroderisimètre l'intensité de la fluorescence dégagée par


les taches d'aflatoxine B, à une longueur d'ondes d'excitation de 365 nm
et à une longueur d'ondes d'émission de 443 nm. Déterminer la quantité
d'aflatoxine B, dans la tache d'extrait (A') en comparant l'intensité
de la fluorescence de la tache d'extrait avec celle des taches C , D'
et E' de la solution étalon. Si la fluorescence développée par les 20 ¿¿1
d'extrait est plus intense que celle des 40 ni de solution étalon,
diluer l'extrait 10 ou 100 fois avec du chloroforme ou avec le mélange
de benzène et d'acétonitrile avant de répéter l'opération de
chromatographie en couche mince.

Confirmation de l'identité de l'aflatoxine B, :

Par commodité, la préférence est accordée à la première méthode ci-


après, parce que la plaque utilisée pour le dosage convient directement
aux fins de confirmation. Si l'on ne dispose pas d'acide
trifluoroacétique, il faut appliquer la seconde méthode. Toutefois, il
est alors impératif de disposer de plaques à antigènes préfixé et d'un
coffret de pulvérisation avec succion.

Chromatographie bidimensionnelle comportant la formation de l'hémiacétal


de l'aflatoxine B, (l'aflatoxine B2a) avec utilisation d'acide
trifluoroacétique.

Examiner le chromatogramme sous rayonnement ultraviolet et marquer au


moyen d'un crayon à mine douce l'emplacement de la tache (B') (voir
figure 39) provenant de la solution étalon et appliquée au point B, et
de la tache (A') provenant de l'extrait de la prise d'essai et appliquée
au point A. A l'aide d'un capillaire en verre, déposer de 1 à 2 /il
d'acide trif luoroacétique sur les taches A' et B'. Sécher dans un
courant d'air à la température ambiante.

Développer de nouveau la plaque suivant l'orientation I (voir figure 39)


dans l'obscurité en utilisant un des solvants révélateurs jusqu'à ce que
ce dernier atteigne encore la ligne limite. Retirer la plaque de la cuve
et la laisser sécher dans l'obscurité à la température ambiante pendant
15 minutes.

Interprétation du chromatogramme: (Suivre le diagramme de la figure 39.)

Examiner le chromatogramme sous rayonnement ultraviolet et vérifier les


points suivants:

1) Apparition d'une faible tache fluorescente bleue de dérivé non


identifié d'aflatoxine B, (position B' ' ') et d'une tache fluorescente
bleue plus intense d'hémiacétal de l'aflatoxine B, (position B''),
les deux provenant de l'aflatoxine B, servant d'étalon (position B').

2) Apparition de taches fluorescentes bleues (positions A' ' ' et A' ' )
émanant de l'aflatoxine B, présumée dans l'extrait (position A') dont
la valeur fy correspond à celle de l'aflatoxine B, servant d'étalon
(position B'). L'identité de l'aflatoxine B, dans l'extrait est
confirmée quand la valeur R< de la tache d'hémiacétal de l'aflatoxine
B, provenant de l'extrait correspond à celle de la tache de l'étalon
(positions A'' et B'', respectivement).
- 93 -

Chromatographic bidimensionnelle comportant la formation de l'hémiacétal


de l'aflatoxine B, (aflatoxine B2a) avec utilisation d'acide
chlorhydrique: procéder comme indiqué à la page 82. Voir figure 37.

Calcul des résultats

Estimation visuelle:

La formule suivante donne le contenu en /¿g d'aflatoxine B, par kg


d'échantillon (ppb):

X x S x V . où
Y x m

X et Y représentent respectivement le volume en /il de la solution étalon


d'aflatoxine B, et de l'extrait développant une fluorescence de même
intensité ;

S = concentration en /¿g d'aflatoxine B, par ml de solution étalon;

V = volume final de l'extrait en /il, compte tenu de toute dilution


éventuellement nécessaire;

m = masse en grammes de la prise d'essai correspondant au volume


d'extrait soumis a une épuration sur colonne.

Mesure fluorodensimétrique:

La formule suivante donne le contenu en /ig d'aflatoxine B, par kg


d'échantillon:

S x V . où
Y x m

V = volume en /il de l'extrait déposé en taches sur la plaque (20 /il);

S = masse en nanogrammes d'aflatoxine B, dans la tache d'extrait


proportionnelle à la valeur de Y, déduite d'après les mesures;

V = volume final de l'extrait en /il, compte tenu de toute dilution


éventuellement nécessaire;

m = masse en grammes de la prise d'essai correspondant au volume


d'extrait soumis à une épuration sur colonne.

Chromatographie bidimensionnelle en couche mince (dépôt antidiagonal des


taches)

But et champ d'application

Cette méthode permet de déterminer (visuellement) la quantité


d'aflatoxine B, dans les produits d'alimentation humaine et dans les
produits d'alimentation animale simples ou composés, à l'exclusion de
ceux qui contiennent de la pulpe d'agrumes.
- 94 -

b. Principe

La prise d'essai est soumise à une extraction au chloroforme. L'extrait


est filtré et une partie aliquote est prélevée et épurée par
chromatographie sur colonne sur gel de silice. L'éluat est évaporé et
le résidu redissous dans un volume spécifique de chloroforme ou d'un
mélange de benzène et d'acétonitrile. On soumet une partie aliquote de
cette solution à une opération de chromatographie bidimensionnelle en
couche mince en utilisant la technique de l'application antidiagonale
des taches afin de faciliter la comparaison visuelle de la tache
d'échantillon et de la tache d'aflatoxine B, servant d'étalon. On
détermine visuellement la quantité d'aflatoxine B, sous rayonnement
ultraviolet du chromatogramme en comparant avec des quantités connues
de l'aflatoxine B, servant d'étalon. L'identité de l'aflatoxine B,
extraite du produit d'alimentation animale est confirmée par formation
de l'hémiacétal de l'aflatoxine b, sur la plaque de chromatographie en
couche mince.

c. Réactifs

(N.B.: Comme indiqué à la page 88) .

d. Equipement

(N.B.: Comme indiqué à la page 80).

e. Mode opératoire

Préparation de l'échantillon d'épreuve:


Procéder comme indiqué à la page 81.
Chromatographie bidimensionnelle en couche mince avec utilisation de la
technique d'application antidiagonale des taches.
Application des solutions (suivre le diagramme de la figure 40).

Tracer deux droites sur une plaque parallèlement aux deux côtés contigus
(à 3 cm de chaque bord) pour limiter la migration du solvant. Déposer
des taches des solutions ci-après sur la plaque à l'aide de pipettes
capillaires ou de la microseringue.

au point A, 20 /il de l'extrait de la prise d'essai;


au point B, 10 /il de la solution étalon;
au point C, 20 /il de la solution étalon;
au point D, 40 /il de la solution étalon;
au point E et F, 20 /il de la solution étalon.

Sécher dans un courant d'air ou de gaz inerte à faible débit. Les taches
obtenues doivent avoir un diamètre d'environ 5 mm.
95

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2 cm

A: extrait de la prise d'essai

B, C, D, E et F: aflatoxine B, servant d'étalon

F i g u r e 40

Développement : (Suivre le diagramme de la figure 40.)


Développer la plaque suivant l'orientation I dans l'obscurité en
utilisant le premier solvant révélateur éther-méthanol-eau 94/4,5/1,5
(v/v/v) jusqu'à ce qu'il atteigne la ligne limite. Retirer la plaque de
la cuve et la laisser sécher dans l'obscurité à la température ambiante
pendant 15 minutes.

Développer ensuite la plaque suivant l'orientation II dans l'obscurité


en utilisant le second solvant révélateur chloroforme-acétone 9/1 (v/v)
jusqu'à ce qu'il atteigne la ligne limite. Retirer la plaque de la cuve
et la laisser sécher dans l'obscurité à la température ambiante.

Interprétation du chromatogramme : (Suivre le diagramme de la figure 40.)

Irradier le chromatogramme aux rayons ultraviolets en plaçant la plaque


à 10 cm de la lampe à ultraviolets. Repérer la position des taches
fluorescentes bleues B', C', D', E' et F'. Projeter deux lignes
imaginaires passant respectivement à travers les taches E' et F' et
perpendiculairement à l'orientation du développement. L'intersection P
de ces lignes est l'endroit où l'on peut s'attendre à trouver la tache
- 96

d'aflatoxine B, provenant de l'extrait de la prise d'essai appliquée en


A. Toutefois, il se peut que l'emplacement effectif de la tache
d'aflatoxine B, soit un point A' à l'intersection d'une droite
imaginaire perpendiculaire à l'orientation du premier développement à
travers la tache E' à partir de la position de départ E et d'une autre
droite imaginaire passant par les positions B', C et D' des taches
d'étalon.

L'aflatoxine B, est présente dans la prise d'essai si l'on peut


visualiser quatre taches développant une fluorescence bleue sur une
ligne imaginaire passant par les taches d'aflatoxine B, ayant pour
origine la prise d'essai appliquée en A et l'étalon d'aflatoxine B,
appliqué en B, C et D. Doser la quantité d'aflatoxine B1 dans l'extrait
de la prise d'essai.

Chromatographie supplémentaire:

Tracer deux lignes droites sur une nouvelle plaque parallèlement aux
deux côtés contigus, comme indiqué sur la figure 40, et appliquer au
point A (voir figure 40) 20 /¿I de l'extrait de la prise d'essai obtenu
et, surimposés sur celui-ci, 20 ni de la solution étalon. Développer
comme précédemment. Irradier le chromatogramme à l'ultraviolet et
vérifier que:

les taches d'aflatoxine B, provenant de l'extrait et de la solution


étalon soient surimposées;

la fluorescence de cette tache soit plus intense que celle de la


tache d'aflatoxine B, en A' sur la première plaque.

Dosage :

Estimation visuelle:

Estimer la quantité d'aflatoxine B, dans l'extrait en comparant


l'intensité de la fluorescence développée par la tache d'extrait avec
celle des trois taches d'aflatoxine B, servant d'étalon situées en B',
C' et D' . Au besoin, procéder par interpolation. Si la fluorescence
développée par les 20 fil d'extrait est plus intense que celle des 40 /il
de solution étalon, diluer l'extrait 10 ou 100 fois avec du chloroforme
ou avec le mélange de benzène et d'acétonitrile avant de répéter
l'opération de chromatographie en couche mince.

Confirmation de l'identité de l'aflatoxine B, :

Confirmer l'identité de l'aflatoxine B, dans l'extrait en effectuant


l'épreuve de présomption à l'acide sulfurique et, si celle-ci donne un
résultat positif, procéder aux épreuves de confirmation par
chromatographie bidimensionnelle en couche mince. Si l'épreuve de
présomption à l'acide sulfurique donne un résultat négatif, il n'est pas
nécessaire de procéder à la confirmation effective puisque, en pareil
cas, il n'y a pas d'aflatoxine B,. La préférence doit être donnée à la
seconde méthode de confirmation si l'on dispose de plaques à antigène
préfixé et d'un coffret de pulvérisation à succion.
- 97 -

Epreuve de présomption à l'acide sulfurique:

Pulvériser de l'acide sulfurique sur le chromatogramme. La fluorescence


des taches d'aflatoxine B, doit virer du bleu au jaune sous rayonnement
ultraviolet.

Chromatographie bidimensionnelle comportant la formation de l'hémiacétal


de l'aflatoxine B, (1'aflatoxine B 2 a) avec utilisation d'acide
chlorhydrique.

Procéder comme indiqué à la page 84. Voir figure 37.

Chromatographie bidimensionnelle comportant la formation de l'hémiacétal


de l'aflatoxine B, (l'aflatoxine B 2 a) avec utilisation d'acide
trifluoroacétique.

Procéder comme indiqué à la page 86. Voir figure 38.

f. Calcul des résultats

Estimation visuelle:

La formule suivante donne le contenu en /¿g d'aflatoxine B, par kg


d'échantillon (ppb):

X x S x V . où
Y x m

X et Y représentent respectivement le volume en /i 1 de la solution étalon


d'aflatoxine B, et le volume en ¿¿1 de l'extrait développant une
fluorescence de même intensité;

S = concentration en /ig d'aflatoxine B, par ml de solution étalon;

V = volume final de l'extrait en /il, compte tenu de toute dilution


éventuellement nécessaire;

m «= masse en grammes de la prise d'essai correspondant au volume


d'extrait soumis a une épuration sur colonne.

Observations concernant les opérations de chromatographie en couche


mince

a. Délipidation

Les échantillons contenant plus de 5% de graisses seront délipidés au


pétrole léger (bp 40 à 60° C) avant la préparation initiale.

En pareil cas, les résultats d'analyse seront exprimés en fonction de


la masse de l'échantillon non dégraissé.

b. Répétabilité des résultats

L'écart entre les résultats de deux estimations parallèles effectuées


sur l'échantillon par le même opérateur ne doit pas dépasser:
- 98 -

25% p a r rapport au résultat le plus élevé pour la teneur en


a f l a t o x i n e B, depuis 10 /¿g/kg jusqu'à 20 /¿g/kg;

5 /¿g/kg pour les teneurs supérieures à 20 /¿g/kg et jusqu'à 50 /tg/kg;

10% p a r rapport à la valeur la plus élevée pour les teneurs


s u p é r i e u r e s à 50 /¿g/kg.

c. R e p r o d u c t i b i l i t é des résultats

La r e p r o d u c t i b i l i t é des r é s u l t a t s , c'est-à-dire la v a r i a t i o n entre les


r é s u l t a t s obtenus par au moins deux laboratoires avec le même
é c h a n t i l l o n , a été estimée comme suit:

± 50% de la v a l e u r m o y e n n e pour les valeurs moyennes d'aflatoxine B, se


s i t u a n t entre 10 et 20 /¿g/kg;

± 10% /¿g/kg de la v a l e u r moyenne pour les valeurs moyennes supérieures


à 20 /¿g/kg mais ne dépassant pas 50 /¿g/kg;

± 20% des v a l e u r s m o y e n n e s supérieures à 50 /ig/kg.

d. A p p l i c a t i o n de l'épreuve de confirmation à l'acide trifluoracétique

C h o i x des solvants révélateurs: (Voir le diagramme de la figure 38.)

Il est souhaitable d'avoir une valeur R^ d'aflatoxine B, de 0,5 au


m a x i m u m suivant l'orientation I pour disposer d'un espace suffisant pour
le troisième développement après la réaction à l'acide
t r i f l u o r o a c é t i q u e . La v a l e u r R, dépend du type de gel de silice u t i l i s é .
Si la v a l e u r Rf est supérieure à 0 , 5 , il est recommandé de réduire la
teneur du solvant révélateur en m é t h a n o l et e a u . De m ê m e , la v a l e u r R,
de l ' h é m i a c é t a l de l'aflatoxine B, varie selon le type de gel de silice
u t i l i s é . A f i n d'obtenir une distance de m i g r a t i o n o p t i m a l e , on peut
a j u s t e r la v a l e u r R, de l'hémiacétal de l'aflatoxine B, en m o d i f i a n t le
p o u r c e n t a g e de m é t h a n o l dans le solvant r é v é l a t e u r . Une distance de
m i g r a t i o n de l'hémiacétal de l'aflatoxine B, de 2 cm est jugée o p t i m a l e .

I n t e r p r é t a t i o n du chromatogramme: (Voir le diagramme de la figure 38.)

Q u a n d on analyse des échantillons faiblement c o n t a m i n é s , il est possible


q u ' o n ne puisse pas trouver le dérivé n o n identifié d'aflatoxine B,
(position A ' ' ' ) . De p l u s , ce dérivé n o n identifié d'aflatoxine B,
coïncide souvent avec des substances de fond dégageant de la
f l u o r e s c e n c e . T o u t e f o i s , l'hémiacétal de l'aflatoxine B, est n e t t e m e n t
d i s t i n c t et la confirmation repose essentiellement sur la p r é s e n c e de
cette tache.

4. T i t r a g e avec immunoadsorbant lié à u n e enzyme pour le dosage de


l ' a f l a t o x i n e B, dans les produits d'alimentation h u m a i n e et animale
R
M o d e o p é r a t o i r e basé sur la méthode A g r i - S c r e e n pour la détection de
l ' a f l a t o x i n e B,, N e o g e n C o r p o r a t i o n , Lansing MI 4 8 9 1 2 , Etats-Unis
d ' A m é r i q u e . Texte modifié par H . P . v a n Egmond.
- 99

Ce mode opératoire correspond à l'un des divers nécessaires d'épreuve


ELISA disponibles dans le commerce qui ont été mis au point pour le
dosage des aflatoxines dans les denrées agricoles. Le fait qu'il soit
inclus dans le présent manuel n'implique aucune approbation ni
recommandation de l'épreuve Agri-Screen par l'Organisation des Nations
Unies pour l'alimentation et l'agriculture à l'exclusion d'autres
méthodes d'épreuve ELISA qui pourraient également convenir pour le
dosage de l'aflatoxine B,.

But et champ d'application

Cette méthode permet le dosage semi-quantitatif de l'aflatoxine B, dans


les produits d'alimentation humaine et animale à des niveaux d'environ
20 pg/kg. Au moment de la rédaction du présent ouvrage (1987), on ne
connaissait pas encore l'éventail complet des produits auxquels cette
méthode est applicable. De même, les seuils de détection ne pouvaient
pas être précisés.

Principe

L'aflatoxine B, est conjuguée à une enzyme. Ce conjugué est utilisé


comme antigène connu (enzyme-conjugué). Des anticorps spécifiques de
l'aflatoxine B, sont fixés sur des cupules de microtitrage en matière
plastique. L'aflatoxine B, est extraite de l'échantillon à l'aide d'un
solvant. L'extrait est mélangé en parties égales avec l'aflatoxine B,
conjuguée à une enzyme et ce mélange est placé dans les cupules de
microtitrage enduits d'anticorps. L'aflatoxine B, contaminante provenant
de l'échantillon, si elle est présente, et l'aflatoxine B, conjuguée à
une enzyme sont en compétition pour se fixer sur les sites de liaison
de l'anticorps. L'aflatoxine B,, provenant de l'échantillon ou conjuguée
à une enzyme, qui est restée libre est évacuée par lavage. On ajoute
dans chaque cupule un support enzymatique solubilisé qui, s'il y a
présence d'une enzyme liée, est catalysé, virant d'une solution incolore
à une solution bleue. La couleur perd de son intensité à mesure
qu'augmente la quantité d'aflatoxine B, dans l'échantillon. Après
quelques minutes, on peut évaluer visuellement le changement de
coloration. En ajoutant le réactif fixant l'enzyme de couleur rouge, on
crée un spectre chromatique où une couleur se situant entre le mauve et
le rose ou le rouge indique des niveaux d'aflatoxine supérieurs à
20 ¿xg/kg, tandis qu'une couleur se situant entre le bleu et le bleu
foncé indique que la teneur de l'échantillon en aflatoxine est
inférieure à 20 ¿ug/kg.

Réactifs

Le nécessaire Agri-ScreenR contient tous les réactifs à l'exception du


méthanol.

Aflatoxine B, conjuguée à une enzyme. Conjugué enzymatique lyophilisé


spécifique de l'aflatoxine B, ou équivalent. Ne pas utiliser au-delà de
la date d'expiration.

Solution d'hydratation conjuguée à une enzyme. Eau distillée.


100 -

Support solide enduit d'anticorps. Barrettes de microtitrage à 12


cupules enduites d'anticorps ou équivalent. Ne pas utiliser au-delà de
la date d'expiration.

Support enzymatique contenant de la tétraméthylbenzidine dans un tampon


de citrate (pH 4,0). Boucher après utilisation et conserver au froid
(4° C).

Eau oxygénée. Contient 1,5 ml de H202 à 30% par litre dans un tampon de
citrate (pH 4,0). Boucher après utilisation et conserver au froid
(4° C).

Solution de fixation de la couleur. Contient 3,5 mg de HF, 10,5 g de


citrate de sodium, 6 ml de NaOH (NaOH = 1 mol/L) et 400 mg de Na4EDTA
par litre d'eau distillée. Boucher après utilisation et conserver au
froid.

Etalons d'aflatoxine B, dans une solution de méthanol (3,8).


Concentrations correspondant à 0, 5, 10, 20, 50 et 100 ¿¿g/kg
d'échantillon d'épreuve.

Solution de méthanol, méthanol de qualité réactif et eau: 55/45 (v/v).

Equipement

Le nécessaire Agri-ScreenR contient des cupules et des tubes de mélange.

Papier-filtre, Whatman N° 1 ou équivalent.

Pipettes. Pipetteur étalonné ou automatique à embouts à usage unique


capable de verser des quantités exactes de 0,1 à 1,0 ml Eppendorf ou
équivalent.

Eprouvettes à capsule vissée, contenance 50 ml.

Tubes de mélange. Verre ou matière plastique, 12 mm x 75 mm avec


couvercle.

Cupules de mélange. Barrette de microtitrage à 12 cupules ou équivalent.


Une cupule de mélange pour chaque étalon ou échantillon à soumettre à
1'épreuve.

Mélangeur Vortex. Capable d'agiter vigoureusement les tubes de mélange.


Mélangeur S/P (Scientific Products, Inc.) ou équivalent.

Mode opératoire

Préparation de l'échantillon d'épreuve:

Broyer l'échantillon de laboratoire de telle sorte qu'il traverse


parfaitement un tamis à mailles de 1 mm.

Extraction :

Peser 5 g d'échantillon d'épreuve et les placer dans une éprouvette à


capsule vissée. Ajouter 25 ml de solution de méthanol et agiter
vigoureusement pendant au moins une minute. Passer à travers un papier-
- 101 -

filtre dans une éprouvette de 50 ml ou équivalent. Tous les échantillons


à soumettre à l'épreuve doivent être préparés simultanément.

Préparation de la solution conjuguée à une enzyme :

Ajouter 2 ml de la solution d'hydratation conjuguée à une enzyme à


l'aflatoxine B, conjuguée à une enzyme. Bien mélanger afin de dissoudre
parfaitement. Ne pas agiter suffisamment pour produire de l'écume dans
le flacon. ATTENTION: La solution doit être à la température ambiante
avant utilisation et elle doit être utilisée dans les 30 minutes qui
suivent sa préparation.

Préparation de la solution de support enzymatique:

Transférer dans un tube de mélange 1 ml de support enzymatique et 1 ml


d'eau oxygénée. Boucher le tube et l'agiter vigoureusement. ATTENTION:
La solution doit être utilisée dans l'heure qui suit sa préparation.

Titrage immunoenzymatique:

N.B.: Il faut utiliser un embout de pipette distinct pour chacune des


étapes ci-après. Toujours verser dans les cupules au moyen de la pipette
dans le même ordre.

Mettre en place les cupules de mélange. Ne pas utiliser les cupules de


microtitrage où est fixé l'anticorps. Placer à la pipette dans chaque
cupule 0,1 ml de solution d'aflatoxine B, conjuguée à une enzyme.
Utiliser une cupule pour chaque échantillon à soumettre à l'essai et une
cupule pour chaque témoin. On peut utiliser avec chaque barrette jusqu'à
six cupules d'aflatoxine B, servant de témoin. Ajouter 0,1 ml
d'aflatoxine B, provenant de la solution étalon et du filtrat
d'échantillon dans les cupules distinctes et mélanger parfaitement en
réaspirant le liquide dans la pipette. Changer de pipette ou d'embout
pour chaque échantillon et témoin.

Mettre en place les cupules où est fixé l'anticorps. Transférer 0,1 ml


de la solution de chaque cupule de mélange à la cupule enduite
d'anticorps correspondante. Changer de pipette ou d'embout pour chaque
transfert. Laisser reposer à la température ambiante (22-25° C) pendant
10 minutes.

Agiter les cupules enduites d'anticorps pour en faire tomber la solution


dans un bac à déchets contenant une solution de décontamination (voir
Notes concernant la sécurité). Eviter que la solution de décontamination
ne pénètre dans les cupules. Laver les cupules dix fois en les
remplissant d'eau distillée, puis en les agitant pour évacuer la
solution de lavage. Après le lavage final, disposer les cupules à
l'envers sur un buvard et tapoter pour éliminer l'eau en excédent.

N.B.: Un seul embout de pipette doit être utilisé pour chacune des
étapes suivantes:

Ajouter immédiatement 0,1 ml de la solution servant de support


enzymatique dans chaque cupule où est fixé l'anticorps et laisser
reposer à la température ambiante pendant 5 minutes. Agiter doucement
la cupule plusieurs fois pendant le titrage en la maintenant sur la
paillasse et en tapotant le côté.
- 102 -

Ajouter 0,1 ml de solution de fixation de la couleur dans chaque cupule


d'anticorps et comparer la couleur qui se développe dans les cupules
témoins avec celle des cupules d'échantillon. Présenter les barrettes
sur un fond blanc pour effectuer la comparaison.

Interprétation des résultats

Comparer la couleur de chaque cupule d'échantillon avec les témoins dans


la même barrette. Noter la concentration de l'échantillon d'après
l'étalon dont il se rapproche le plus. L'étalon d'aflatoxine B, de
20 ¿¿g/kg est habituellement de couleur mauve. Si la couleur d'un
échantillon est plus bleue que celle de l'étalon d'aflatoxine B, de
20 /¿g/kg, cet échantillon contient moins de 20 /¿g/kg d'aflatoxine B,.
Si la couleur d'un échantillon est plus rose ou rouge que celle de
l'étalon de 20 /¿g/kg, cet échantillon contient plus de 20 /¿g/kg. Selon
l'opérateur, la couleur de l'étalon peut varier du mauve au lavande ou
bien l'étalon peut être légèrement rose, mais l'interprétation de
l'échantillon sera la même.

Notes concernant la sécurité

Laisser tremper tout le matériel de laboratoire, les embouts de pipettes


et les constituants du nécessaire d'épreuve dans une solution d'eau de
Javel à 10% avant de les mettre au rebut (l'eau de Javel contient
généralement 5,25% d'hypochlorite de sodium).
103 -

V. EXPOSES

1. Les mycotoxines: Introduction

Les mycotoxines sont de métabolites secondaires des champignons qui


peuvent développer des propriétés toxiques, cancérogènes, mutagènes,
tératogènes et oestrogènes. Le terme "mycotoxine" est tiré des mots grecs
mykes (champignon) et toksikon (poison) (1) . Les syndromes de toxicité
résultant de l'absorption de mycotoxines par l'homme ou les animaux sont
appelés "mycotoxicoses". Bien que certains champignons, tels que Claviceps
purpurea qui produit l'ergot, étaient connus depuis des siècles pour leur
toxicité prononcée et aiguë, c'est seulement après la découverte des
aflatoxines au Royaume-Uni en 1960 que la recherche a révélé qu'un grand
nombre d'autres espèces de champignons pouvaient former d'autres métabolites
secondaires toxiques tout aussi importants. Trois hypothèses ont été émises
quant à la fonction possible des métabolites secondaires (2) . Selon la
première, la formation de métabolites secondaires maintient la moisissure en
activité quand le support est épuisé; selon la deuxième, la formation de
métabolites empêche l'accumulation de composés anormaux, éventuellement
nocifs; selon la troisième hypothèse, le métabolisme secondaire a une utilité
sélective dans les systèmes écologiques: il se pourrait que les mycotoxines
soient produites comme mécanisme d'autodéfense contre d'autres organismes,
étant donné que certaines mycotoxines sont toxiques pour les animaux
supérieurs, les insectes et les micro - organismes. Il a été démontré que la
culture pure en laboratoire aboutit souvent à la disparition de l'activité qui
engendre la mycotoxine, ce qui pourrait s'expliquer par l'absence d'ennemis
naturels. Toutefois, selon toute probabilité ce phénomène est dû à la mutation
ou à la sélection de souches ne produisant que difficilement des toxines, cela
en raison du milieu de culture. En fait, il est douteux que la moisissure ait
besoin de produire des mycotoxines puisque des espèces aussi bien toxiques que
non toxiques pourraient être présentes dans la nature jusqu'à un certain
point.

Les mycotoxicoses sont connues de longue date. La première mycotoxicose


reconnue était probablement l'ergotisme, une maladie caractérisée par la
nécrose et la gangrène et mieux connue en Europe au Moyen-âge sous
l'appellation de "feu sacré"; elle était provoquée par l'absorption de
céréales contaminées par les sclérotes de Claviceps purpurea. Bien que les
mycotoxines fussent connues depuis longtemps, les mycotoxicoses ont été les
maladies délaissées jusqu'au début des années 1960 (3). Il y eut à cette
époque un brusque changement d'attitude par suite de la flambée de maladie X
du dindon en Grande-Bretagne. Plus de 100 000 dindons sont morts en quelques
mois. L'apparition de la maladie X du dindon a déclenché une campagne
pluridisciplinaire pour étudier la cause du problème. Ces efforts furent
couronnés de succès et l'origine de la maladie se révéla être un facteur
toxique présent dans la farine d'arachides brésilienne qui avait servi de
source de protéines pour l'alimentation des volailles atteintes. Le facteur
toxique semblait être produit par deux champignons, parasiticus et A.
flavus. d'où le nom d'aflatoxine qui lui fut donné, abréviation de
l'appellation du second champignon mentionné (4). L'étude plus poussée du
facteur toxique a révélé que la substance pouvait être séparée en quatre
taches distinctes par chromatographie (5) . Ces cinq composés ont reçu
l'appellation de aflatoxines B,, B2, G, et G2, selon la couleur de leur
104 -

fluorescence (B correspondant à "bleu", et G à "green", c'est-à-dire "vert"


en anglais) et leur mobilité chromatographique relative. On a constaté par la
suite que le groupe des aflatoxines comprend au moins 17 composés étroitement
apparentés, dont certains peuvent être présents dans des produits animaux par
suite du transfert de mycotoxines se trouvant dans les produits d'ali'mentation
ingérés par les bovins. Les aflatoxines sont très dangereuses pour l'homme et
les animaux, non seulement en raison de leur toxicité aiguë à doses élevées,
mais surtout à cause de leurs propriétés cangérogènes très prononcées. Les
enquêtes épidémiologiques ont révélé que l'incidence des tumeurs du foie était
plus élevée chez les sujets qui absorbent régulièrement des aliments
contaminés par les aflatoxines.

Au cours des deux décennies qui ont suivi la flambée de maladie X du


dindon, on a pu réunir une masse d'informations sur les aflatoxines et il est
apparu en outre qu'un grand nombre d'espèces de champignons pouvaient former
des mycotoxines. On connaît à l'heure actuelle plus de 200 mycotoxines
différentes avec des structures chimiques très diverses. La diapositive (6)
montre à titre d'exemple quelques-unes de ces structures. L'aflatoxine B, est
la mycotoxine la pus notoire, ayant une portion de difuranne caractéristique
et un anneau de lactone. On soupçonne que les deux parties de la molécule
jouent un rôle dans sa cancérogénicité. L'ochratoxine A est une autre
mycotoxine bien connue dont la structure moléculaire comporte une liaison
peptidique et un atome de chlore. Ce dernier semble assez particulier pour des
produits naturels. L'ochratoxine A provoque des lésions rénales. Il existe en
Europe plusieurs régions où l'on observe chez l'homme et les animaux la
néphropathie, maladie rénale qui peut être associée à l'absorption
d'ochratoxine A dans la nourriture. La patuline a une molécule relativement
petite et elle est dotée d'un anneau de lactone comme l'aflatoxine B, et
1 'ochratoxine A. La patuline a servi d'antibiotique dans le passé; de nos
jours, elle est considérée comme une mycotoxine qui peut être produite sur les
fruits et qui entraîne des hémorragies et un oedème chez les animaux
d'expérience. L'acide lysergique est un constituant des alcaloïdes qui
provoquaient l'ergotisme au Moyen-âge comme nous l'avons vu. La dernière
structure est celle d'une mycotoxine plus compliquée, la toxine T-2, qui
comporte un groupe époxy, caractéristique des trichothécènes, produites par
certaines souches de Fusarium. Dans les pays d'Afrique, les aflatoxines sont
probablement les mycotoxines les plus importantes.

L'homme peut être exposé aux mycotoxines non seulement par ingestion
d'aliments contaminés par la toxine, mais aussi par inhalation ou contact
cutané (7). On peut citer comme exemple d'exposition humaine par inhalation
l'observation faite par Van Nieuwenhuize qui a signalé le développement de
cancers dans divers organes chez des travailleurs qui avaient aspiré pendant
plusieurs années de petites poussières chargées d'aflatoxine dans une huilerie
où l'on broyait des arachides et d'autres oléagineux.

Cependant, la voie la plus importante est l'exposition par contamination


des aliments. Les matières premières des aliments et les produits alimentaires
peuvent être contaminés par des spores de conidies et par des fragments de
mycélium présents dans l'environnement. La contamination peut se développer
à différents stades de la production: pendant la croissance et le mûrissement
des plantes cultivées, pendant le traitement des produits semi-complets et
dans les produits de consommation. La présence d'espèces potentiellement
toxinogènes sur des produits alimentaires ne signifie pas toujours que ces
105 -

derniers contiennent des mycotoxines, parce que les conditions écologiques


favorables à la croissance des champignons ne sont pas nécessairement les
mêmes que pour la production des toxines, comme nous allons le voir sur l'une
des prochaines diapositives.

A l'inverse, la présence de mycotoxines ne signifie pas toujours que les


produits en question soient moisis. Le traitement thermique des produits
contaminés (par exemple le fait de griller les arachides ou la fabrication de
fourrage comprimé) permet de réduire de façon draconienne la teneur en
moisissures, alors que nombre de mycotoxines sont thermostables. De plus, les
mycotoxines peuvent être transférées des produits d'alimentation animale aux
produits alimentaires d'origine animale tels que la viande, le lait et les
oeufs. Ces produits animaux peuvent dès lors contenir des mycotoxines sans
être moisis. Les scientifiques se sont beaucoup penchés sur la contamination
des produits laitiers car on a découvert que l'aflatoxine B,, la plus notoire
des mycotoxines, était transformée par la vache laitière en son métabolite
hydroxylé M, (8), qui apparait dans le lait. Des expériences faites sur la
vache ont montré que de 1 à 4% de l'aflatoxine B, ingérée pouvaient être
récupérés dans le lait sous forme d'aflatoxine M,. On ignore si l'aflatoxine
M, a des propriétés cancérogènes. Quelques études de cancérogénicité portant
sur la truite arc-en-ciel et, plus récemment, sur le rat ont révélé que
l'aflatoxine M, est beaucoup moins cancérogène que l'aflatoxine B,. Toutefois,
aucune étude poussée sur la cancérogénicité de l'aflatoxine M, n'a été
publiée, probablement en raison de l'absence de substance suffisamment pure.
Vu sa forte toxicité et l'incertitude qui persiste quant à une éventuelle
cancérogénicité, la présence de ce composé est jugée indésirable dans les
produits alimentaires. Aussi plusieurs pays ont-ils promulgué une législation
visant à empêcher la contamination du lait et des produits laitiers par
l'aflatoxine M,.

Pour les pays en développement, la contamination directe des denrées


agricoles par les mycotoxines est plus importante que la contamination
indirecte par transfert.

Les moisissures ne se développent que dans des conditions favorables.


Les champignons ont besoin de divers nutriments pour se procurer l'énergie
nécessaire et pour former des macromolécules telles que les protéines et
l'ADN. Beaucoup de produits d'alimentation humaine et animale contiennent les
nutriments nécessaires et peuvent donc servir de support. Un grand nombre de
métabolites se forment lors de la décomposition des glucides, quelques-uns
pouvant s'accumuler dans certaines conditions, par exemple l'éthanol et les
acides organiques. Pendant la croissance, et surtout à la fin de celle-ci, on
observe la synthèse de certains métabolites qui ne sont manifestement pas
nécessaires à la moisissure pour sa croissance et son apport énergétique.
Certains de ces métabolites secondaires sont toxiques pour les micro-
organismes et on les appelle antibiotiques. D'autres sont (également) toxiques
pour les animaux supérieurs et on les appelle mycotoxines.

Outre la présence de nutriments, les facteurs les plus importants pour


la croissance et la production de mycotoxines sont la température (9) et
l'activité de l'eau. La température optimale (10) pour la croissance est de
25-30° C pour la plupart des Penicillia et de 30-40° C pour les Aspergilli.
températures qui régnent souvent dans les pays en développement. Les espèces
de Fusarium peuvent être considérées comme psychrophiles, parce que leur
température optimale est assez basse (8-15° C) et que ces espèces sont
présentes dans les régions à climat tempéré.
106 -

Le facteur appelé activité de l'eau (a^,) mesure l'eau libre qui, dans
les produits alimentaires, est disponible pour la croissance de la moisissure.
Ce terme est expliqué sur la diapositive (11). On utilise le terme d'humidité
relative pour l'atmosphère: l'humidité relative d'équilibre ou pression de
vapeur d'eau relative d'équilibre est en équilibre avec l'humidité de la
substance entreposée. L'activité de l'eau est définie sur la diapositive (12).
Il s'agit du quotient de la tension de vapeur d'eau du produit par la tension
de vapeur de l'eau pure à la même température et tension.

Plus l'eau se trouve sous une forme liée au support, moins il y a d'eau
disponible pour le champignon et plus l'activité a w est faible. Non seulement
la a^ influe sur la croissance des champignons mais, de plus, elle affecte la
production de mycotoxines. Quand la a,, est inférieure à une certaine valeur,
il n'y a pas production de mycotoxines. Cette valeur dépend de la mycotoxine
en cause, de la souche de champignon considérée, du support et de la
température.

La diapositive (13) montre l'éventail de a w pour la croissance


d'Aspergillus flavus et la production d'aflatoxine sur de la gélose de
saccharose d'extrait de malt à diverses températures. Le taux de croissance
fongique est représenté par les colonnes ouvertes, tandis- que la quantité
d'aflatoxine B, produits est représentée par les colonnes blanches. La a w pour
la production d'aflatoxine varie de 0,87 à 1,00 et la température de 12 à
37° C. Par ailleurs, la a w optimale pour la production de toxine, soit 0,99,
est supérieure à celle nécessaire pour la croissance, qui est de 0,95. Les
valeurs minimales de a w pour la croissance fongique et pour la production de
toxine peuvent différer selon le support et le Comité sur l'hygiène
alimentaire de la Commission du Codex Alimentarius a proposé comme norme une
a w de 0,70 pour les arachides afin d'éviter leur contamination par les
aflatoxines.

Un système assez complexe est normalement nécessaire pour mesurer la a w


d'un support. Cependant, Northolt a mis au point pour estimer la a w des
produits d'alimentation humaine une technique simple appelée épreuve de
liquéfaction des cristaux de sel. Cette épreuve repose sur le fait que les
cristaux de sel ont la propriété d'attirer la vapeur d'eau et de se liquéfier
si la pression de vapeur d'eau dans l'atmosphère dépasse celle de la solution
saturée de sel. On dépose de 40 à 80 g de l'échantillon, par exemple des
arachides, dans un flacon (14) qui est ensuite fermé et équilibré pendant au
moins deux heures. On ouvre ensuite brièvement le flacon (15) et l'on
pulvérise sur la surface interne du couvercle une couche très mince de
vaseline. Quelques dizaines de cristaux appropriés (en l'occurrence du
CuCl2.2H20) sont étalés sur la vaseline à l'aide d'une spatule. On ferme le
flacon et on l'équilibre pendant environ quatre heures. On observe ensuite les
cristaux pour voir s'ils sont liquéfiés ou non (16). Quand 50% au moins des
cristaux son liquéfiés, l'épreuve est considérée comme ayant donné un résultat
positif, ce qui signifie que la a w de l'échantillon est supérieure à la a w
spécifique du sel. Dans cet exemple, on a utilisé des cristaux de CUC12.2H20,
qui ont une a^, spécifique de 0,70. Cela signifie que la a w des arachides est
supérieure à 0,70 et, par conséquent, l'échantillon illustré sur la
diapositive n'est pas conforme à la norme Codex proposée pour les arachides.
L'épreuve de liquéfaction des cristaux de sel peut être facilement effectuée
sur le terrain et l'on obtient le résultat en quelques heures. L'épreuve de
liquéfaction des cristaux de sel est une épreuve physique indirecte de terrain
- 107

qui indique seulement que la présence d'une mycotoxine est possible. On peut
en obtenir la preuve directe en appliquant des méthodes d'analyse pour
déterminer la présence effective d'une ou plusieurs mycotoxines dans la denrée
à inspecter.

Deux approches sont possibles pour la détection et le dosage des


mycotoxines: les méthodes biologiques et les méthodes chimiques. Les méthodes
biologiques peuvent être utiles pour le dépistage de mycotoxines connues ou
inconnues. On peut indiquer à titre d'exemple qu'elles ont joué un rôle
important lors de la découverte des aflatoxines. Toutefois, le titrage
biologique manque généralement de spécificité et de reproductibilité et il
faut accorder la préférence aux titrages chimiques pour le dosage des
mycotoxines: les étapes fondamentales sont exposées sur la diapositive
suivante (17).

L'échantillonnage fait partie intégrante de l'analyse. Il a pour objet


d'obtenir un échantillon de laboratoire (prise d'essai) représentatif du lot
sur lequel il est prélevé. La décision d'accepter ou de rejeter un lot sera
fondée sur les résultats de l'analyse de l'échantillon. L'échantillonnage peut
poser un très grand problème, par exemple si la toxine n'est pas distribuée
de façon homogène dans le lot à inspecter. Des sacs d'arachides (18) peuvent
comprendre quelques arachides contenant de l'aflatoxine réparties de façon
inégale parmi celles qui sont saines. La diapositive suivante (19) illustre
les résultats de l'analyse de dix sous - échantillons prélevés sur un lot. On
a constaté que la concentration moyenne d'aflatoxine B, était de 36 /¿g/kg,
alors que les résultats variaient de 0 à 165 /¿g/kg. Cet exemple illustre
clairement les difficultés auxquelles on est confronté lorsqu'il s'agit
d'approuver ou de rejeter un lot sur la base des résultats de quelques
analyses. Les statisticiens ne sont pas encore parvenus à un accord sur la
méthode d'échantillonnage qu'il convient d'appliquer pour obtenir la meilleure
estimation possible de la teneur effective en toxine. Malgré ces problèmes,
des méthodes d'échantillonnage ont été élaborées pour certaines denrées
agricoles. On peut citer comme exemple la méthode d'échantillonnage pour les
produits d'alimentation animale qui est officiellement utilisée dans la
Communauté européenne (20).

L'analyse effective de la prise d'essai (habituellement de 20 à 100 g)


débute par l'isolement du constituant recherché. En général, les mycotoxines
sont extraites au moyen d'un solvant organique tel que le chloroforme, le
dichlorométhane, 1'acétonitrile, l'acétate d'éthyle, l'acétone ou le méthanol
(21) . Ces solvants peuvent être utilisés en association avec de faibles
quantités d'eau et d'acides. Les mycotoxines n'étant normalement présentes
qu'en très faibles quantités, une forte concentration de l'extrait est
nécessaire pour permettre le dépistage final. La présence fréquente de lipides
et d'autres constituants entrave toute concentration adéquate et la détection
finale. En pareil cas, il faut épurer les échantillons avant la concentration.
Plusieurs étapes d'épuration chromatographique sur colonne sont possibles avec
des substances telles que le gel de silice, l'oxyde d'aluminium, les
polyamides, le FlorisilR et le SephadexR (22). La substance la plus
fréquemment utilisée est le gel de silice. Le choix définitf du support dans
la colonne dépend des substances à éliminer (constituants de la matrice) et
du constituant recherché, qui est la mycotoxine à doser. Après addition de
l'extrait dans la colonne d'épuration, les impuretés sont habituellement
éliminées par lavage au moyen de solvants dans lesquels les toxines sont
108 -

insolubles ou moins solubles que les impuretés. On modifie ensuite la


composition du solvant de telle sorte que les toxines soient éluées d'une
manière sélective à partir de la colonne, puis l'éluat est recueilli, avec
certaines méthodes, on procède à une extraction liquide-liquide dans des
ampoules de décantation, par exemple du pentane avec du méthanol et de l'eau.
La plupart des toxines n'étant pas lipophiles, les graisses peuvent être
éliminées de la sorte sans la toxine.

Toutes ces techniques d'épuration sont en fait des méthodes de


séparation grâce auxquelles des groupes de substances ayant chacune un
comportement physicochimique différent sont séparés les uns des autres. Il
devient ainsi possible d'éliminer sans la toxine la majeure partie des autre
substances dans l'extrait. Les extraits qui ont été épurés sont généralement
concentrés par évaporation du solvant au moyen d'un évaporateur rotatif ou par
utilisation d'une étuve. Après la concentration on obtient un extrait final
qui est de nouveau soumis à l'étape du dosage. En dépit de l'épuration,
l'extrait final peut contenir d'autres substances extraites simultanément qui
risquent d'entraver le dosage de la mycotoxine. Il existe plusieurs moyens de
séparer la mycotoxine recherchée de ces autres constituants de la matrice. On
a le plus souvent recours aux méthodes chromatographiques, qui sont des
techniques de séparation physique (23). Pour les pays en développement, la
chromatographie unidimensionnelle et bidimensionnelle en couche mince doit
être considérée comme la technique chromatographique la plus importante pour
le dosage des mycotoxines et un exposé distinct (V.2) sera donc consacré à ces
techniques.

Les titrages immunologiques (24) sont des méthodes qui reposent sur des
principes tout à fait différents par rapport aux méthodes chromatographiques.
Les titrages immunologiques en sont encore à leur stade initial d'application
pour le dosage des mycotoxines. Néanmoins, le titrage sur immunoadsorbant lié
à une enzyme (ELISA), en particulier, gagne rapidement du terrain et c'est
pourquoi un exposé distinct (V.3) sera consacré aux techniques ELISA.

Diapositive (1) Explication du terme "mycotoxine"


(2) Fonctions possibles des mycotoxines
(3) Mycotoxicoses: maladies délaissées
(4) La toxine de flavos: l'aflatoxine
(5) Taches d'aflatoxine sur une plaque de chromatographie en
couche mince
(6) Structure de quelques mycotoxines importantes
(7) Voies d'exposition aux mycotoxines
(8) Structure chimique des aflatoxines B, et M,
(9) Facteurs principaux pour la croissance fongique et la
production de toxine
(10) Températures optimales pour la croissance de Pénicillium.
Aspergillus et Fusarium
(11) Différents paramètres en rapport avec la vapeur d'eau
(12) Définition de la aw
(13) Eventail de a w et de températures pour la croissance de A.
flavus et la production d'aflatoxine
(14) Epreuve de liquéfaction des cristaux de sel: étape 1
(15) Epreuve de liquéfaction des cristaux de sel: étape 2
(16) Epreuve de liquéfaction des cristaux de sel: étape 3
(17) Etapes fondamentales des méthodes d'analyse
109

(18) Stockage de sacs d'arachides au Nigéria


(19) Distribution non homogène d'aflatoxine dans les arachides
d'un lot
(20) Méthode d'échantillonnage pour les produits d'alimentation
animale selon la directive de la Communauté européenne
(21) Solvants utilisés pour l'extraction des mycotoxines
(22) Substances d'épuration pour la chromatographie sur colonne
(23) Méthodes de séparation chromatographiques
(24) Méthodes de séparation immunochimiques

2. Techniques de chromatographie en couche mince

"La chromatographie met en oeuvre le principe séculaire: diviser pour


régner. Les substances sont soumises à division, ce qui permet à l'homme de
régner sur les éléments. Il faut régner pour le plus grand bien de l'humanité,
bien qu'elle ait été découverte il y a 75 ans, la chromatographie ne cesse de
se développer et elle demeure à jamais jeune et féconde".

Ces paroles du Dr. Chmutov, Président du Conseil scientifique de


l'Académie des Sciences de l'URSS, s'adressaient à la fin des années 1970 aux
titulaires de la médaille d'or "Tswett" à l'occasion du 75e anniversaire de
la découverte de la chromatographie par Tswett. A n'en pas douter, cette
médaille commémorative est la plus haute distinction qui puisse être accordée
pour des réalisations remarquables dans le domaine du développement de la
chromatographie. Tswett était un botaniste russe qui réussit à séparer les
carotènes et plusieurs xanthophylles présents dans les extraits organiques de
feuilles vertes en faisant passer la solution organique par une colonne
d'adsorbant solide tel que le carbonate de calcium. Plusieurs pigments
végétaux devinrent ainsi visibles, d'où le nom de "chromatographie" donné au
procédé, calqué sur les mots grecs khroma et graphein qui signifient "couleur"
et "écrire". Dans sa thèse de doctorat (1), Tswett décrivait le procédé d'une
manière plus détaillée. Il reconnaissait dans ce procédé un phénomène
d'adsorption. Les pigments le moins fortement adsorbés étaient lavés
rapidement à travers la colonne, tandis que les pigments fortement adsorbés
étaient immobilisés par leur adsorption si bien que leur vitesse de migration
à travers la colonne était considérablement réduite.

Outre la "chromatographie d'adsorption", où la séparation repose sur les


différentes affinités d'adsorption des constituants de l'échantillon vers la
surface d'un solide actif, on peut recenser les types suivants de
chromatographie (2): la chromatographie de partage, la chromatographie sur
échangeurs d'ions, le tamisage moléculaire (chromatographie d'exclusion), la
chromatographie d'ions appariés et la chromatographie d'affinité. Parmi
celles-ci, seules la chromatographie d'adsorption et la chromatographie de
partage revêtent de l'importance pour l'analyse visant à déceler les
mycotoxines. Comme les autres mécanismes de séparation ne présentent qu'une
importance mineure, nous n'y reviendrons pas ici. Très rares sont les exemples
de chromatographie d'adsorption pure (par exemple pour les travaux portant sur
les médicaments à base de charbon) et de chromatographie de partage pure (par
exemple la chromatographie sur papier). La plupart du temps, le phénomène sur
lequel repose la séparation est une association de chromatographie
d'adsorption et de chromatographie de partage. Ce type de chromatographie peut
être subdivisé comme suit (3):
110 -

a. La chromatographie en phase liquide à pesanteur (dont la


chromatographic sur colonne de Tswett fut la première application);

b. La chromatographie liquide sous haute pression (technique récente où


l'on utilise des pressions d'admission élevées et des micro-
supports) ;

c. La chromatographie en couche mince, dont les caractéristiques et


l'application possible pour le dosage des mycotoxines seront
examinées ci-après.

La chromatographie en couche mince est elle aussi une technique de


séparation assez "récente". Bien que les principes de la chromatographie en
couche mince aient été décrits avant la Deuxième Guerre mondiale par Izmailow
(1938) , cette technique a été surtout appliquée dans les années 1960 lorsque
E. Stahl a "redécouvert" la chromatographie en couche mince. Son plus grand
mérite a été de normaliser les adsorbants disponibles à l'époque. On peut
définir la chromatographie en couche mince (4) comme étant "la séparation de
faibles quantités de mélanges en différentes zones sur une couche mince
d'adsorbant". La couche mince (phase fixe) est fixée sur une plaque, par
exemple du verre ou du métal, principalement par étalement d'une suspension
d'adsorbant à laquelle a été ajouté un liant. Après avoir séché et conditionné
cette plaque de couche mince, on y applique un faible volume d'extrait de
l'échantillon à séparer et la plaque est ensuite placée, généralement dans une
position verticale, dans un coffret de séparation (souvent appelé la cuve)
partiellement rempli de la phase mobile, appelée solvant révélateur. Ce
solvant révélateur traverse la couche mince sous l'effet des forces
capillaires. Selon leurs caractéristiques physicochimiques, les constituants
de l'extrait se déplacent plus ou moins par rapport à la phase mobile et les
fractions séparées apparaissent sous forme de taches derrière le front de la
phase mobile sur la couche. Si la séparation est effectuée suivant une seule
orientation, on dit de la chromatographie en couche mince qu'elle est
unidimensionnelle (5). Si cette séparation n'est pas satisfaisante, on peut
procéder à un second développement suivant une orientation perpendiculaire à
la première en utilisant un autre type de solvant révélateur (6). On dit dans
ce cas que la chromatographie en couche mince est bidimensionnelle.

Le déplacement des substances séparées peut être exprimé par leur débit,
habituellement représenté par le symbole R^, lequel peut être défini comme
étant (7):
Distance de migration du composé
Distance de migration du solvant

le rapport entre la distance de migration du composé et la distance de


migration du solvant.

Le Rf est toujours inférieur à l'unité et, par convention, il est


habituellement indiqué avec deux décimales. Pour un ensemble solvant/adsorbant
donné, le R^ est caractéristique et reproductible pour chaque composé. Les
paramètres que sont l'adsorbant (phase fixe), le solvant (phase mobile) et le
composé qui doit être chromatographié constituent les trois éléments
fondamentaux d'une système chromatographique. Les variations de la phase fixe
et/ou de la phase mobile entraînent une modification du R, des solutions et
offrent donc la possibilité de séparer le produit dissous considéré (c'est-
à-dire la mycotoxine qu'il faut titrer) des autres constituants, ce qui rend
possibles la détection et le dosage.
- Ill

On peut utiliser tout un éventail d'adsorbants pour la chromatographie


en couche mince. Pour la détection des mycotoxines, on utilise le plus souvent
des plaques de chromatographie en couche mince à gel de silice car ce type
d'adsorbant est celui qui offre généralement la meilleure possibilité de
séparer la toxine recherchée des autres constituants de la matrice. On peut
préparer au laboratoire les plaques de chromatographie en couche mince à gel
de silice en utilisant le matériel approprié (8) . On peut aussi se les
procurer auprès de diverses entreprises commerciales sous forme de plaques où
les antigènes sont préfixés. Les caractéristiques des plaques à antigène
préfixé et des plaques enduites par l'opérateur peuvent différer d'une marque
à l'autre, voire d'un lot à l'autre, d'où un comportement différent lors de
la séparation, comme on le voit sur la diapositive (9) où un mélange
d'af latoxines B,, B2, G! et G2 a été séparé sur trois types de plaques
différents.

Les plaques préenduites et les plaques à enduire présentent différents


avantages. Les plaques enduites par l'opérateur (10) permettent à ce dernier
de choisir librement l'adsorbant et les additifs (par exemple du sulfate de
calcium pour fixer le gel de silice à la plaque de verre, du EDTA comme
chélateur, des agents de régulation du pH comme l'acide oxalique). On peut
faire varier l'épaisseur de la couche mince sur les plaques enduites par
l'opérateur en ajustant la sortie de l'étaleur. Enfin, les plaques enduites
par l'opérateur sont moins coûteuses que les plaques à antigène préfixé. En
revanche, les plaques à antigène préfixé (11) possèdent généralement une
couche plus uniforme et plus rigide et permettent un certain choix pour le
support, par exemple du verre, de la matière plastique ou de l'aluminium.
Elles sont prêtes à l'emploi et peuvent être stockées d'une manière très
simple dans leur conditionnement d'origine, même si on laisse les boites
ouvertes pendant une durée prolongée. Par contre, les plaques enduites par
l'opérateur nécessitent un séchage et une mise en activité à environ 110° C,
après quoi elles doivent être conservées dans un dessiccateur jusqu'au moment
de l'emploi. Pour assurer un stockage satisfaisant (12), il existe des
supports de séchage spéciaux conçus de manière à pouvoir être disposés dans
un dessiccateur, les plaques pouvant être introduites horizontalement sans
endommager la couche mince. On peut stocker les plaques après leur
développement dans des boites simples en bois qui les protègent de la lumière,
des influences atmosphériques et de tout dégât mécanique.

La chromatographie en couche mince peut être utilisée non seulement pour


séparer les substances et les identifier d'après leur R^, mais aussi pour
doser la substance à analyser qui est présente dans le mélange.

L'exactitude des résultats obtenus avec la chromatographie quantitative


en couche mince dépend dans une large mesure de la précision avec laquelle la
substance peut être appliquée sur les plaques. Pour l'analyse des mycotoxines
par chromatographie en couche mince, la substance qui est appliquée sur la
plaque a généralement un volume de l'ordre de 5 à 25 /il. Selon le degré
d'exactitude (pour mesurer l'erreur systématique) et de précision (pour
mesurer l'erreur accidentelle) souhaité (13), on utilise différents types
d'étaleurs (14). Pour la vérification, on se contentera de pipettes
capillaires qualitatives à usage unique. Pour les travaux quantitatifs, on
utilise des pipettes capillaires quantitatives à usage unique ou des seringues
de précision, qui sont plus exactes et plus précises. Qui plus est, ces
dernières permettent l'application par intermittence de volumes plus
- 112 -

importantes sous atmosphère inerte, étant utilisées en association avec un


verseur à répétition intégré dans un dispositif pour déposer les taches (15) .
On peut confectionner ce dispositif soi-même ou l'obtenir dans le commerce.

Le solvant pour déposer les taches, qui doit être le même pour l'extrait
et pour l'étalon, doit permettre (16) une solubilité satisfaisante de la
toxine à rechercher, et doit être volatil et donner des taches réduites et
uniformes. Ces conditions revêtent une grande importance pour obtenir des
résultats reproductibles.

Les plaques de chromatographie en couche mince existent en différents


formats (17). On peut résoudre la plupart des problèmes de séparation en
utilisant une plaque carrée de 20 x 20 cm; toutefois, l'utilisation de plaques
de 10 x 10 cm donnera souvent de bons résultats et même les plaques de
7 x 7 cm découpées par l'opérateur sont utiles, surtout pour un dépistage
rapide. En outre, les plaques de dimensions plus réduites offrent la
possibilité de les développer non seulement dans des coffrets spécialement
conçus à cet effet, mais aussi dans de simples béchers ou par séries de dix
à la fois sur sun support dit multiplaques, ce qui réduit considérablement la
durée totale requise pour une série d'opérations de chromatographie en couche
mince.

Le système de solvant utilisé doit évidemment permettre une séparation


satisfaisante des constituants du mélange à titrer. Il se compose généralement
d'au moins deux solvants de polarité différente, parce que l'emploi d'un
mélange donne habituellement une meilleure séparation que l'utilisation d'un
solvant unique. Pour être certain d'obtenir des résultats reproductibles, il
convient d'employer des solvants de qualité analytique. En règle générale,
pour la chromatographie en couche mince sur plaques à gel de silice, une
augmentation de la polarité du solvant révélateur aboutit à un accroissement
du Rf. On estime que le R, optimal des composés intéressants se situe entre
0,25 et 0,75. On peut influer sur la séparation entre les différents
constituants du mélange à titrer en modifiant le rapport des divers solvants
du système ou en ajoutant ou supprimant tel ou tel solvant.

D'autres facteurs peuvent aussi revêtir de l'importance, par exemple le


modèle et la taille su coffret de séparation utilisé et le degré de saturation
de ce coffret par les vapeurs de solvant. La saturation d'une cuve par la
vapeur de solvant aboutit à des valeurs de R^ plus faibles et souvent plus
cohérentes, parce que l'ampleur de la migration des substances dépend du débit
du solvant révélateur. Dans les cuves saturées de vapeur, ce débit du solvant
est beaucoup plus faible et beaucoup plus égal sur toute la plaque. Sur le
plan pratique, cela a pour avantage que la durée des opérations est abrégée.
La manière la plus simple de saturer une cuve consiste à la doubler
intérieurement d'une manière totale avec du papier-filtre et à remplir la cuve
de solvant révélateur, afin de saturer le papier de solvant.

Le dépôt des taches d'échantillon et d'étalon est normalement effectué


selon un schéma prescrit dans le cadre de la méthode d'analyse. Ce schéma de
dépôt des taches peut être applicable à la chromatographie unidimensionnelle
en couche mince ou, dans le cas d'un extrait "souillé", à la chromatographie
bidimensionnelle en couche mince.
113 -

On peut citer comme exemple (18) d'un schéma de dépôt des taches pour
chromatographic unidimensionnelle en couche mince celui de la méthode dite de
la Contamination Branch (CB) , qui peut être appliquée pour le dosage de
l'aflatoxine B, dans les arachides, les produits à base d'arachides et le
maïs. On dépose en taches de petites quantités d'extrait de l'échantillon et
de l'aflatoxine B, servant d'étalon sur une plaque de 20 x 20 cm, suivant une
ligne imaginaire située à 4 cm du bord inférieur de la plaque de
chromatographie en couche mince. Sur l'une des taches d'échantillon, on dépose
5 ni de l'étalon d'aflatoxine B, comme étalon interne. On dépose aussi une
tache de 5 ni d'un mélange qualitatif d'étalon d'aflatoxine pour indiquer si
la résolution est adéquate. Il subsiste sur la plaque de chromatographie en
couche mince assez d'espace pour déposer des taches d'autres extraits
d'échantillons permettant d'estimer la teneur en aflatoxine B, d'après la même
série d'étalons. Après évaporation du solvant utilisé pour le dépôt des
taches, on place la plaque dans une cuve de développement contenant un mélange
de chloroforme et d'acétone (9+1) et la plaque est développée jusqu'à ce que
le solvant atteigne la ligne limite (tracée à 16 cm du bord inférieur de la
plaque), la durée de cette opération étant d'environ 40 minutes. Après
séchage, on observe la plaque sous éclairage ultraviolet dans les grandes
longueurs d'ondes afin de permettre la visualisation et le dosage des taches
d'aflatoxine (19). Sur le côté gauche de la plaque est visible le résultat de
la séparation d'un extrait d'arachides crues contaminées par de l'aflatoxine
B, obtenue selon la méthode CB. La séparation du mélange d'étalon d'aflatoxine
permet de conclure que la qualité de séparation de la plaque était suffisante.
A l'aide des étalons d'aflatoxine B,, on peut localiser la tache d'aflatoxine
B, dans l'extrait et en estimer la quantité afin de pouvoir calculer la
concentration initiale de l'échantillon. Il est beaucoup plus difficile de
localiser et de doser l'aflatoxine B, présente dans le beurre de cacahuètes.
Ce produit ayant été grillé, il s'est formé de nombreux constituants qui
peuvent gêner considérablement l'interprétation et le chiffrage du résultat
obtenu avec la chromatographie en couche mince. Afin d'améliorer la séparation
dans ce cas, et ainsi d'abaisser le seuil de détection, il faut recourir à la
chromatographie bidimensionnelle en couche mince.

Le schéma de dépôt des taches pour les étalons et pour l'échantillon


doit être adapté à la méthode de dosage, c'est-à-dire par densimétrie ou par
estimation visuelle. Si l'on utilise un densimètre, on applique le schéma de
dépôt des taches densimétrique. Pour 1'estimation visuelle, on accorde souvent
la préférence au schéma antidiagonal.

Avec le schéma de dépôt des taches densimétriques (20), on dépose une


partie aliquote de l'échantillon (extrait de beurre de cacahuètes) en A et des
quantités connues de l'aflatoxine B, servant d'étalon en B. La plaque est
ensuite développée suivant la première orientation et, après séchage, on la
fait pivoter de 90° et on la développe suivant la seconde orientation. La
détection et le dosage sont effectués sous éclairage ultraviolet (21) avec
l'aide des étalons d'aflatoxine B, développés simultanément; la tache
d'aflatoxine B, de l'échantillon, nettement séparée, peut être repérée. Un
densimètre ou un intégrateur de chromatographie en couche mince permet de
comparer l'intensité de la fluorescence des taches d'aflatoxine B, de
l'échantillon et de l'étalon et l'on peut ainsi calculer la concentration
d'aflatoxine B, dans l'échantillon initial.
- 114 -

Si l'on ne dispose pas d'un densimètre, il faut donner la préférence au


schéma de dépôt des taches antidiagonal (22) . On dépose une partie aliquote
de l'échantillon (beurre de cacahuètes) en A et différentes quantités de
l'aflatoxine servant d'étalon au point B. La plaque est développée suivant
deux dimensions et la détection et le dosage sont de nouveau effectués sous
éclairage ultraviolet (23). A l'aide de la rangée d'étalons d'aflatoxine B,
soumis à un développement bidimensionnel, on peut repérer l'aflatoxine B, de
l'extrait et en estimer la concentration en comparant l'intensité de sa
fluorescence avec celle des différents étalons d'aflatoxine B,. Etant donné
que toutes les taches d'aflatoxine B, sont alignées et assez proches l'une de
l'autre, une telle estimation est plus aisée que la comparaison visuelle avec
les taches d'étalon développées sur les côtés, comme c'est le cas avec le
schéma de dépôt des taches densimétrique.

Ce sont la qualité de l'extrait final et le seuil de détection souhaité


(24) qui détermineront s'il y a lieu de choisir la chromatographie en couche
mince unidimensionnelle ou la chromatographie en couche mince
bidimensionnelle. La variante unidimensionnelle a pour avantage la rapidité,
la simplicité et l'économie, mais la résolution obtenue est généralement assez
limitée et une épuration poussée peut se révéler nécessaire. En revanche, la
chromatographie bidimensionnelle en couche mince nécessite beaucoup plus de
temps et d'équipement et elle est moins facile à appliquer, mais la résolution
est très nettement meilleure sans qu'il soit nécessaire de procéder à une
épuration plus poussée. Il faut examiner les avantages et les inconvénients
des deux variantes de la chromatographie en couche mince au regard des
exigences de tel ou tel problème d'analyse.

Ce sont les propriétés physicochimiques de la mycotoxine en cause qui


déterminent le mode de détection. Les aflatoxines absorbent fortement les
rayons ultraviolets et émettent l'énergie de ces derniers sous forme de
fluorescence. Fort heureusement, cette caractéristique permet à l'opérateur
de déceler ces constituants, comme le montre le chromatogramme en couche mince
d'arachides et de beurre de cacahuètes. Malheureusement, une méthode aussi
simple ne permet pas de déceler toutes les mycotoxines. Beaucoup d'entre elles
ne deviennent pas fluorescentes sous éclairage ultraviolet; certaines révèlent
l'absorption des rayons ultraviolets ou de la lumière visible, alors que
d'autres ne le font pas (25). Dans ce dernier cas, on peut parfois les rendre
visibles par dérivation, par exemple en pulvérisant un réactif sur une plaque
ou en exposant la plaque à de la vapeur de réactif.

On peut citer comme exemple d'une technique de pulvérisation celle qui


est couramment utilisée pour la visualisation de la stérigmatocystine, une
toxine parfois présente dans les céréales et dans le fromage. On peut voir
deux plaques de chromatographie en couche mince (26) avec des taches de
stérigmatocystine développées de concentration croissante. Sur la plaque de
chromatographie en couche mince située à droite, on a pulvérisé une solution
de A1C13 dans l'éthanol. Les deux plaques ont été exposées aux rayons
ultraviolets, mais seules les taches sur la plaque comportant la solution de
A I C I 3 sont visibles sous forme de fluorescence jaune. L'emploi de ce réactif
de pulvérisation améliore 100 fois le seuil de détection.

Malgré toutes les techniques d'épuration utilisées, il subsiste des


substances qui se comportent de la même façon que la mycotoxine dont
l'estimation est effectuée par séparation au moyen de la chromatographie en
115 -

couche mince. Afin de réduire au minimum l'éventualité de résultats faussement


positifs, il faut confirmer l'identité de la mycotoxine dans les échantillons
positifs. La méthode la plus fiable à cette fin est la spectroscopie de masse
à haute résolution. Cependant, la spectroscopie de masse en association avec
la chromatographie en couche mince est une opération d'assez longue durée et
tous les laboratoires ne sont pas équipés de ce type d'appareillage de haute
technicité. Par conséquent, il faut recourir à des techniques chimiques
simples. Ces techniques n'offrent pas la même certitude absolue que la
spectroscopie de masse, mais elles excluent la presque totalité des résultats
faussement positifs. Il est parfois possible d'effectuer ces épreuves de
confirmation directement sur des plaques de chromatographie en couche mince,
en tirant ainsi parti des avantages de cette méthode.

On peut citer comme exemple d'une telle épreuve pour la confirmation de


la présence d'aflatoxine B, dans des extraits de produits d'alimentation
humaine et animale l'épreuve de séparation-réaction-séparation à l'acide
chlorhydrique mise au point par Verhülsdonk. Cette épreuve peut même
s'appliquer à des extraits très "souillés" tels que les produits
d'alimentation pour lapins. Des tâches de l'échantillon et de l'étalon sont
déposées sur une plaque de chromatographie en couche mince (27) de la même
façon que pour la chromatographie bidimensionnelle. La séparation est d'abord
effectuée suivant une orientation, après quoi on pulvérise de l'acide
chlorhydrique sur la zone hachurée. Ensuite, la séparation est effectuée
suivant la seconde orientation, exactement dans les mêmes conditions. La
réaction de l'acide chlorhydrique à l'aflatoxine B,, qui a déjà été séparée
lors de la première opération, aboutit à la formation d'un hémiacétal de
l'aflatoxine B,, qui a un R, spécifique plus faible que celui de l'aflatoxine
B,. Le fait est confirmé après chomatographie suivant la seconde orientation.
Les autres constituants doivent être situés suivant une diagonale divisant la
plaque en deux parties puisque la séparation a été effectuée suivant les deux
orientations dans des conditions rigoureusement identiques. La diapositive
(28) illustre le résultat d'une telle épreuve de confirmation dans le cas d'un
produit d'alimentation pour lapins.

Les facteurs d'importance dans la chromatographie en couche mince


peuvent se résumer en dix points fondamentaux (29). L'analyste doit tout
d'abord définir son problème: quelle est la toxine qui l'intéresse, quelle est
la matrice en cause, quel doit être le seuil de détection? Une fois le
problème défini, il faut choisir sur la liste des adsorbants susceptibles
d'être utilisés. Pour les mycotoxines, l'adsorbant de choix sera normalement
le Si02. Le format de la plaque dépendra des exigences de l'analyste en
matière de séparation, de précision et de rapidité de la méthode. Le choix du
solvant révélateur sera dicté par les caractéristiques physicochimiques de la
toxine recherchée. Normalement, une séparation satisfaisante devrait être
réalisée quand le R, de la solution se situe entre 0,25 et 0,75. L'échantillon
et l'étalon peuvent être appliqués sur la plaque au moyen de pipettes
capillaires ou de seringues. Les premières sont à usage unique; les secondes
sont plus précises, mais elles doivent être nettoyées parfaitement pour éviter
toute contamination croisée. Les taches doivent être aussi petites que
possible et de dimensions égales. La normalisation des conditions de
développement est une condition préalable indispensable pour obtenir des
résultats reproductibles. La visualisation des taches de toxines dépend de
leurs caractéristiques physicochimiques. Certaines toxines absorbent la
lumière visible ou les rayons ultraviolets, d'autres développent une
- 116 -

fluorescence après irradiation aux ultraviolets, une pulvérisation ou


vaporisation de réactifs étant parfois nécessaire. L'identification se fait
à l'aide d'étalons développés simultanément et l'estimation peut être
effectuée visuellement ou par densimétrie. Si un échantillon est jugé positif,
il faut procéder à une épreuve pour en confirmer l'identité, de préférence en
effectuant une réaction dont le produit aura des caractéristiques spécifiques
sur le plan de la chromatographie en couche mince.

Il convient enfin d'adresser un avertissement à ceux qui ont recours au


densimètre pour mesurer l'intensité des taches sur les plaques de
chromatographie en couche mince. Bien que de tels intégrateurs de
chromatographie en couche mince offrent des possibilités attrayantes et des
avantages non négligeables, facilitent l'opération et conduisent à une
estimation plus précise, il ne faut pas perdre de vue que la moindre erreur
de manipulation avec un tel appareil ou la moindre petite défectuosité dans
ce dernier peuvent aboutir à des chiffres qui n'auront aucune validité.
Quoique pratiques, les densimètres ne sont pas indispensables. Il est de bonne
pratique dans les laboratoires de commencer toujours l'évaluation d'une plaque
par une estimation visuelle. La formule suivante a été utilisée dans d'autres
contextes, mais elle est tout aussi valable dans le cas présent (30): "Mieux
vaut être approximativement exact que se tromper avec précision!".

Diapositive (1) Reproduction de la première page de la thèse de Tswett


(2) Les mécanismes en chromatographie
(3) La subdivision de la chromatographie d'adsorption
(4) Définition de la chromatographie en couche mince
(5) Illustration de la séparation unidimensionnelle des
colorants
(6) Illustration de la séparation bidimensionnelle des colorants
(7) Définition de la valeur R
(8) Matériel nécessaire pour préparer soi-même des plaques de
chromatographie en couche mince
(9) Séparation d'un mélange d'étalon d'aflatoxine sur plusieurs
types de plaques de chromatographie en couche mince à Si02
(10) Avantages des plaques enduites par l'opérateur
(11) Avantages des plaques où l'antigène est préfixé
(12) Support de plaque pour chromatographie en couche mince et
coffret de stockage des plaques de chromatographie en couche
mince
(13) Description de l'exactitude et de la précision
(14) Divers types d'applicateurs de taches pour chromatographie
en couche mince
(15) Illustration d'un dispositif de répartition des taches
fabriqué par l'opérateur
(16) Exigences pour les solvants utilisés pour déposer les taches
(17) Illustration des formats de plaques habituels avec leurs
coffrets de développement respectifs
(18) Schéma de répartition des taches avec la méthode CB
(19) Séparation des extraits d'arachides crues et de beurre de
cacahuètes selon la méthode CB
(20) Répartition des taches pour la chromatographie
bidimensionnelle en couche mince (dosage densimétrique)
- 117 -

(21) S é p a r a t i o n d ' u n e x t r a i t de b e u r r e de c a c a h u è t e s s o u m i s à la
chromatographic bidimensionnelle en couche mince avec
utilisation du schéma de répartition des taches
densimétrique
(22) Schéma de répartition des taches antidiagonal pour
chromatographie bidimensionnelle en couche mince
(23) S é p a r a t i o n d ' u n e x t r a i t de b e u r r e de c a c a h u è t e s s o u m i s à la
chromatographie bidimensionnelle en couche mince avec
u t i l i s a t i o n d u s c h é m a de r é p a r t i t i o n d e s t a c h e s a n t i d i a g o n a l
(24) A v a n t a g e s e t i n c o n v é n i e n t s de la c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e
mince unidimensionnelle et bidimensionnelle
(25) Auxiliaires de visualisation pour la détection des
mycotoxines par chromatographie en couche mince
(26) I l l u s t r a t i o n de t a c h e s de s t é r i g m a t o c y s t i n e v i s u a l i s é e s e t
non visualisées avec réactif au A1C13
(27) S c h é m a de l ' é p r e u v e de c o n f i r m a t i o n à l ' a c i d e c h l o r h y d r i q u e
(28) I l l u s t r a t i o n d u r é s u l t a t de l ' é p r e u v e de c o n f i r m a t i o n à
l'acide chlorhydrique appliquée à un produit d'alimentation
p o u r l a p i n s c o n t a m i n é p a r de l ' a f l a t o x i n e B,
(29) L e s d i x é t a p e s f o n d a m e n t a l e s de la c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e
mince
(30) " M i e u x v a u t ê t r e a p p r o x i m a t i v e m e n t e x a c t que se t r o m p e r a v e c
précision!"

3. Techniques ELISA

D é j à d a n s l ' A n t i q u i t é l ' h o m m e é t a i t f a s c i n é p a r la p r o t e c t i o n q u ' i l


p o u v a i t o b t e n i r c o n t r e t e l l e ou t e l l e m a l a d i e a p r è s a v o i r s u b i c e l l e - c i . Ce
n ' e s t q u e v e r s 1 9 0 0 q u ' o n a d é c o u v e r t que des f a c t e u r s de p r o t e c t i o n
a p p a r a i s s a i e n t d a n s le s a n g e n r é p o n s e à l ' i n v a s i o n p a r d e s m i c r o - o r g a n i s m e s
o u p a r c e r t a i n e s s u b s t a n c e s . L e s e n v a h i s s e u r s c a p a b l e s de d é c l e n c h e r u n e
r é a c t i o n s p é c i f i q u e c o n t r e e u x - m ê m e s é t a i e n t a p p e l é s " a n t i g è n e s " , les f a c t e u r s
de p r o t e c t i o n p r o d u i t s é t a n t a p p e l é s " a n t i c o r p s " ( 1 ) . P a r la s u i t e , il e s t
a p p a r u c l a i r e m e n t q u e les a n t i c o r p s s o n t des p r o t é i n e s p r o d u i t e s in v i v o (les
i m m u n o g l o b u l i n e s ) q u i se f i x e n t d ' u n e m a n i è r e s é l e c t i v e a u x a n t i g è n e s
c o r r e s p o n d a n t s . O n a d é c o u v e r t que c e s r é a c t i o n s i m m u n o l o g i q u e s a v a i e n t u n
f o n d e m e n t c h i m i q u e e t q u ' e l l e s p o u v a i e n t a v o i r l i e u n o n s e u l e m e n t in v i v o ,
m a i s a u s s i in v i t r o .

C e s c o n s t a t a t i o n s o n t p e r m i s de m e t t r e a u p o i n t d e s m é t h o d e s d ' a n a l y s e
immunochimiques dites "titrages immunologiques". Ces titrages exploitent leurs
p r o p r i é t é s de r e c o n n a i s s a n c e m o l é c u l a i r e d e s a n t i c o r p s , t o u t c o m m e u n e s e r r u r e
c o r r e s p o n d à u n e clé ( 2 ) . L a clé q u ' i l f a u t m e s u r e r e s t l ' a n t i g è n e .

A v a n t d ' a p p l i q u e r les m é t h o d e s i m m u n o c h i m i q u e s à la d é t e c t i o n e t a u
dosage d'un constituant (l'antigène), il f a u t p r é p a r e r les réactifs
b i o l o g i q u e s q u i i n t e r v i e n n e n t d a n s c e s m é t h o d e s (les a n t i c o r p s ) c h e z d e s
a n i m a u x s u p é r i e u r s e n l e u r i n o c u l a n t l ' a n t i g è n e , tous les a n t i g è n e s n ' o n t p a s
la c a p a c i t é d ' i n d u i r e la f o r m a t i o n d ' a n t i c o r p s c h e z les a n i m a u x d ' e x p é r i e n c e .
L ' i m m u n o g é n i c i t é d é p e n d d a n s u n c e r t a i n e m e s u r e de la t a i l l e de l ' a n t i g è n e .
L e s p e t i t e s m o l é c u l e s c o m m e les m y c o t o x i n e s ne s o n t p a s i m m u n o g è n e s ; o n les
appelle des haptènes (3), Une fois le haptène fixé à un grand porteur,
s ' a g i s s a n t g é n é r a l e m e n t d ' u n e p r o t é i n e , il d e v i e n t i m m u n o g è n e . P o u r la
p r o d u c t i o n d ' a n t i c o r p s o n u t i l i s e d e s l a p i n s , des s o u r i s , des c o b a y e s , des
118 -

chèvres, des moutons, des poules et des chevaux; l'injection peut être
intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée ou intrapéritonéale. Le sérum
recueilli après l'injection est appelé immunsérum ou antisérum; il contient
un groupe de protéines sériques également appelés immunoglobulines.

Au départ, les techniques immunoanalytiques reposaient sur l'interaction


des antigènes et des anticorps en solution, aboutissant à la précipitation du
complexe antigène-anticorps. Cette précipitation permet de déterminer la
concentration d'antigène ou d'anticorps. Ces méthodes de précipitation
conviennent pour mesurer les concentrations d'antigène de l'ordre du ^g-mg/ml.
Cependant, quand la substance à analyser est présente dans des concentrations
plus faibles, comme c'est souvent le cas avec les mycotoxines, d'autres
méthodes plus sensibles sont nécessaires pour mesurer la formation du
complexe. En pareil cas, l'antigène ou l'anticorps est marqué aux fins du
dosage. En règle générale, il s'agit de ces méthodes-là lorsqu'on emploie les
termes de "méthodes immunochimiques" ou "titrages immunologiques" .

Les titrages immunologiques modernes tirent parti de deux phénomènes


importants: la spécificité potentielle des anticorps de réagir vis-à-vis d'un
antigène donné et la possibilité, par marquage avec des indicateurs,
d'amplifier considérablement l'aptitude à déceler le complexe antigène-
anticorps. Ces indicateurs (4) peuvent être, entre autres, des enzymes, des
radio-isotopes ou des marqueurs fluorescents ou luminescents. Après leur
introduction, à la fin des années 1950, les titrages immunologiques sont
devenus des outils d'analyse importants en biochimie clinique. Le démarrage
fut beaucoup plus lent pour l'analyse des produits alimentaires, le premier
titrage immunologique de mycotoxines ayant été décrit en 1976. Ce retard
s'explique en partie par le fait que les mycotoxines sont des haptènes , ce qui
signifie qu'elles ne sont pas immunogènes et qu'elles doivent être conjuguées
avec une protéine porteuse avant que l'immunisation puisse se produire pour
obtenir un immunsérum. Ces conjugaisons peuvent être complexes parce que la
molécule de la plupart des mycotoxines ne comporte pas un groupe réactif
susceptible de réaliser la fixation à la protéine porteuse. Cette absence de
réactif adéquat empêcha tout développement rapide jusqu'aux années 1980,
époque où l'on mit au point plusieurs méthodes pour la préparation de
conjugués de mycotoxines et, plus particulièrement, de conjugués
d'aflatoxines. Il n'y a pas lieu ici d'exposer en détail la conjugaison des
haptènes et la production d'anticorps dirigés contre les mycotoxines. Il
importe davantage de savoir qu'on dispose depuis peu d'immunsérums dirigés
contre certaines des mycotoxines et de mycotoxines marquées par un indicateur,
quoique le plus souvent dans le cadre d'un nécessaire d'épreuve. La plupart
de ces substances ont été mises au point pour le dosage des aflatoxines.

Jusqu'à présent (1987) dans le domaine de la recherche sur les


mycotoxines l'emploi des titrages immunologiques s'est limité au titrage
radio-immunologique et au titrage immunoenzymatique. Dans ces deux méthodes
de titrage, la liaison réversible entre antigène et anticorps joue un rôle
déterminant, comme c'est le cas pour toutes les méthodes immunochimiques. On
peut mesurer la formation du complexe antigène-anticorps en mettant en
compétition un antigène marqué par un isotope radioactif ou une enzyme.
L'application du titrage radio-immunologique présente quelques inconvénients,
par exemple une durée d'activité limitée des radio-isotopes, des problèmes
d'élimination des déchets radioactifs ou d'obtention des autorisations
nécessaires, et la nécessité de disposer d'un coûteux compteur à
- 119

scintillation. Ce sont probablement ces inconvénients qui expliquent pourquoi


il n'existe que très peu de titrages radio -immunologiques pour les
mycotoxines. Cette technique convient beaucoup moins bien aux pays en
développement que le titrage immunoenzymatique, lequel est applicable presque
partout. Par conséquent, nous ne reviendrons plus ici sur le titrage radio-
immunologique, la préférence étant accordée au titrage immunoenzymatique.

Avec le titrage immunoenzymatique, on peut mesurer indirectement la


formation du complexe antigène-anticorps en mettant en compétition un antigène
marqué par une enzyme et l'antigène à doser. La quantité d'enzyme reflète
l'importance du complexe antigène-anticorps. Elle peut être mesurée au moyen
d'un support chromogène. A l'heure actuelle, la plupart des titrages
immunoenzymatiques utilisés pour le dosage des mycotoxines sont du type
titrage avec immunoadsorbant lié à une enzyme (ELISA). Avec la méthode ELISA,
on immobilise sur un support solide soit l'anticorps, soit l'antigène
conjugué. Souvent des plaques ou barrettes de microtitrage (5) servent de
support solide. Elles sont transparentes et fabriquées en polystyrène ou en
chlorure de polyvinyle. Les plaques comportent 96 cupules et les barrettes 8
ou 12. Ces plaques et barrettes de microtitrage présentent plusieurs avantages
par rapport à des tubes distincts (6). Elles sont plus faciles à manipuler,
le lavage et la lecture sont plus aisés, et elles conviennent à des grandes
séries d'analyses. L'anticorps ou l'antigène conjugué à une protéine peuvent
être fixés d'une manière assez uniforme et reproductible sur les cupules des
plaques ou barrettes de microtitrage. On peut réaliser cette fixation
simplement en laissant une solution aqueuse tamponnée 'avec l'anticorps ou
l'antigène conjugué dans les cupules pendant une durée variant de quelques
heures à une journée, après fixation, la solution est évacuée des cupules et
la plaque est lavée plusieurs fois à l'eau. Après séchage, les plaques
enduites peuvent être conservées plusieurs mois. Des plaques et barrettes
enduites chez le fabricant sont habituellement fournies avec les nécessaires
ELISA disponibles dans le commerce.

L'application de la méthode ELISA pour la détection des mycotoxines


comporte plusieurs variantes (7) : le titrage avec mise en compétition, le
titrage avec saturation séquentielle, qui est une variante du précédent, le
titrage par immunocapture, appelé aussi titrage immunométrique.

Pour le titrage avec mise en compétition (8), on fixe sur une plaque de
microtitrage une quantité connue d'anticorps dirigé contre la mycotoxine
recherchée. Après lavage, on ajoute la solution d'épreuve contenant une
quantité inconnue de la mycotoxine avec une quantité connue de mycotoxine
marquée par une enzyme. La mycotoxine marquée et la mycotoxine libre sont en
compétition pour se fixer sur les sites actifs de l'anticorps enduit sur la
plaque. Après incubation on lave de nouveau la plaque et l'enzyme capturée est
dosée par addition d'un support chromogène. On peut mesurer visuellement ou,
avec plus de précision, au moyen d'un lecteur ELISA la couleur obtenue ou
l'intensité de cette couleur. Dans les deux cas, on peut doser la quantité de
mycotoxine dans la solution d'épreuve en utilisant une série d'étalons de
concentration variable auxquels a été appliquée la même méthode. Souvent, les
solutions d'épreuve sont appliquées avec différentes dilutions si l'on n'a
aucune idée de l'ampleur de la concentration de mycotoxine dans la prise
d'essai. Plus la concentration du produit de la réaction enzymatique est
faible, plus la quantité d'enzyme fixée est faible et plus la concentration
de mycotoxine dans la prise d'essai est élevée. La diapositive suivante (9)
- 120

montre les résultats d'une épreuve où l'on mesure l'intensité de la coloration


et d'une épreuve où l'on détermine la couleur elle-même. Cette dernière
épreuve est utilisée avec la méthode Agriscreen, qui comporte un nécessaire
vendu dans le commerce pour le dosage de l'aflatoxine B, dans les produits
d'alimentation humaine et animale.

Le titrage avec saturation séquentielle (10) est une variante du titrage


avec mise en compétition. On fixe sur une plaque de microtitrage une quantité
connue de l'anticorps dirigé contre la mycotoxine recherchée. Après lavage,
on ajoute la solution d'épreuve contenant une quantité inconnue de la
mycotoxine. La mycotoxine à doser réagit avec une partie des anticorps fixés
sur la plaque. Ensuite, on procède au titrage des anticorps non liés au moyen
d'une mycotoxine marquée par une enzyme. Les opérations qui suivent sont les
mêmes que pour le titrage avec mise en compétition et le dosage est effectué
de la même façon.

Avec le titrage par immunocapture (11) on fixe sur la plaque de


microtitrage la mycotoxine, et non pas l'anticorps comme cela se fait pour le
titrage avec mise en compétition et le titrage avec saturation séquentielle.
Pour que la fixation soit possible, il faut que la mycotoxine ait d'abord été
conjuguée avec une protéine. On ajoute dans les cupules de la plaque de
microtitrage enduites de mycotoxine la solution d'épreuve contenant une
quantité inconnue de mycotoxine et une quantité fixe d'anticorps. L'anticorps
qui n'a pas réagi avec la mycotoxine de la solution d'épreuve est capturé par
la surface interne des cupules enduite de mycotoxine. Cet anticorps capturé
est habituellement une immunoglobuline de lapin. Après incubation et lavage,
on laisse incuber la plaque avec un second anticorps (anti-lapin) dirigé
contre l'anticorps de lapin et marqué par une enzyme. On obtient ainsi une
sorte de cascade: l'anticorps marqué par une enzyme a réagi à l'anticorps
anti-mycotoxine, lequel à son tour s'est fixé à la mycotoxine enduite sur la
cupule. On procède au dosage de l'enzyme capturée en ajoutant un support
chromogène. Plus la concentration du produit de la réaction enzymatique est
faible, plus la concentration de mycotoxine dans la prise d'essai est élevée.
De même que pour le titrage avec mise en compétition et le titrage avec
saturation séquentielle, on utilise une courbe type pour doser la mycotoxine
dans la solution d'épreuve. Le titrage ELISA par immunocapture ne nécessite
pas une mycotoxine marquée par une enzyme, et des anticorps anti-lapin liés
à une enzyme sont disponibles dans le commerce, ce qui représente un avantage.
Toutefois, un conjugué mycotoxine-protéine est nécessaire pour pouvoir
réaliser la fixation aux cupules de la plaque de microtitrage.

Outre les nécessaires ELISA, qui comportent des plaques ou barrettes de


microtitrage, on peut utiliser d'autres supports solides pour fixer
l'anticorps. Il convient de citer comme progrès récent l'épreuve "Quick Card",
un nécessaire vendu dans le commerce qui fait appel à des cartes en matière
plastique de la taille d'une carte de crédit (12). Pour l'épreuve Quick Card,
une quantité connue d'anticorps anti-aflatoxine est fixée sur chacune des deux
parties de la carte. Cette fixation se fait en fait à l'usine, la carte étant
ainsi prête à l'emploi. On ajoute une goutte de solution étalon exempte
d'aflatoxine sur la partie gauche et une goutte de solution d'épreuve sur la
partie droite. Ensuite, on ajoute de l'aflatoxine marquée par une enzyme sur
les deux parties de la carte, puis la solution servant de support. Avec des
quantités croissantes d'aflatoxine, la couleur d'un côté apparaîtra plus
claire. Réciproquement, s'il n'y a pas d'aflatoxine, une tache d'un gris-
- 121 -

bleu intense se développera de ce côté (13). La solution étalon exempte


d'aflatoxine donnera une tache d'un gris-bleu foncé. L'épreuve "Quick Card"
est conçue pour déceler des quantités d'aflatoxines B,, B2, G, et M, d'environ
5 ou 10 jig/kg, ce qui est pratique du point de vue de la plupart des
tolérances officielles actuellement en vigueur pour les aflatoxines dans les
produits d'alimentation humaine. Cette épreuve donne des résultats rapides et
ne nécessite aucun équipement ni aucune expérience technique.

En règle générale, les méthodes d'extraction et d'épuration nécessaires


pour procéder au titrage immunoenzymatique sont plus simples que pour la
chromatographie. L'extraction se produit habituellement avec un solvant
aqueux, par exemple un mélange méthanol-eau, mais des solvants organiques
comme le chloroforme sont souvent plus efficaces. Parfois, on procède à une
simple étape de délipidation à l'hexane et une épuration de la colonne n'est
habituellement pas nécessaire. A la différence de nombre des extraits préparés
pour les méthodes chromatographiques, les extraits finals utilisés pour le
titrage immunoenzymatique sont des solutions aqueuses tamponnées parce qu'un
milieu aqueux est nécessaire pour que puisse se former le complexe antigène-
anticorps .

La simplicité des méthodes ELISA et le grand nombre d'échantillons


pouvant être traités en une journée, d'où un coût relativement bas par
analyse, ont rendu ces techniques très précieuses pour une vérification rapide
sur le terrain. Toutefois, il semble que les résultats soient beaucoup plus
variables avec la méthode ELISA qu'avec la chromatographie en couche mince,
encore qu'on ne dispose pas, jusqu'à présent, de données suffisantes issues
d'études concertées et comparatives pour pouvoir estimer parfaitement les
avantages des méthodes ELISA. Un autre problème potentiel est la spécificité
et la sélectivité des méthodes ELISA. Beaucoup de mycotoxines ont une
structure chimique étroitement apparentée. Par conséquent, il existe la
possibilité que des réactions croisées puissent se produire entre des
anticorps dirigés contre une certaine mycotoxine et d'autres toxines du même
groupe également présentes. Il semble que cela ait lieu avec certains des
nécessaires vendus dans le commerce pour le dosage des aflatoxines,
l'anticorps accusant une certaine réactivité croisée avec d'autres
aflatoxines. Cela signifie qu'un résultat positif ne fournit pas d'information
sélective quant à la concentration des différentes aflatoxines, à la
différence de la chromatographie en couche mince qui permet de distinguer
entre les aflatoxines B,, B2, G, et G2 présentes à l'état naturel.

Aux fins de la lutte contre les mycotoxines en Afrique, il semble qu'une


démarche utile et efficace consisterait à associer la méthode ELISA et la
chromatographie en couche mince de manière à utiliser la première pour une
vérification rapide et la seconde pour le dosage analytique des échantillons
positifs.

Diapositive (1) Explication des antigènes et anticorps


(2) Principe clé-serrure pour la réaction antigène-anticorps
(3) Définition du haptène
(4) Marqueurs utilisés pour les titrages immunologiques
(5) Instruments utilisés avec la méthode ELISA
(6) Avantages des plaques de microtitrage par rapport à des
tubes séparés
122 -

(7) Variantes de la méthode ELISA pour la recherche des


mycotoxines
(8) Principe de la méthode ELISA avec mise en compétition
(9) Résultats de la méthode ELISA avec mise en compétition
(10) Principe de la méthode ELISA avec saturation séquentielle
(11) Principe de la méthode ELISA avec titrage par immunocapture
(12) Illustration de l'épreuve "Quick Card"
(13) Résultats de l'épreuve "Quick Card"

4. Caractéristiques des méthodes

La chimie analytique est une science à orientation pratique dans


laquelle des opérations de mesure permettent de rassembler des informations
sur la composition qualitative ou quantitative de diverses substances. Une
méthode analytique est l'adaptation d'une technique en vue d'un certain but
de mensuration. Les méthodes d'analyse ont des caractéristiques scientifiques
et pratiques. Les caractéristiques scientifiques les plus importantes qui
déterminent la fiabilité des données d'analyse sont la précision,
l'exactitude, le seuil de détection, la sensibilité et la spécificité. Les
caractéristiques pratiques sont l'applicabilité, le coût de l'opération, la
durée requise, l'équipement nécessaire et le niveau de formation voulu, ces
caractéristiques déterminent l'utilité de la méthode. Ce sont les buts visés
par l'analyste qui déterminent s'il doit accorder plus d'attention à la
fiabilité d'une méthode ou à son utilité. Aux fins de la recherche et de la
conformité avec la réglementation, il est peut-être important de connaître le
mieux possible la valeur réelle, les aspects pratiques ne venant qu'au second
plan. On peut aussi concevoir des situations où l'élégance scientifique doit
être sacrifiée au profit des avantages pratiques, par exemple quand des
épreuves rapides "tout ou rien" sont nécessaires sur le terrain pour permettre
de décider rapidement si l'on peut accepter un lot ou s'il faut le rejeter.

Il ressort clairement de la littérature que les caractéristiques de la


méthode scientifique suscitent bien des malentendus et des usages incorrects.
C'est pourquoi il convient de bien définir ces termes.

La sensibilité est la pente de la courbe d'étalonnage analytique, en


d'autres termes le changement de signal analytique par unité de concentration
modifiée. C'est la valeur m que nous devons connaître pour doser la substance
analysée en fonction d'un certain signal analytique. La sensibilité vis-à-
vis de la substance analysée dans l'extrait de l'échantillon final peut ne pas
être nécessairement égale à la sensibilité vis-à-vis de la substance analysée
telle qu'elle est présente dans une solution étalon simple. Des effets
imputables à la matrice peuvent donner lieu à un étalonnage incorrect de
l'étape de la méthode d'analyse correspondant au dosage et, partant, à des
estimations de la substance analysée qui seront soit trop élevées, soit trop
faibles. En chimie analytique, on confond très souvent le terme de
"sensibilité" avec celui de "seuil de détection", lequel a une autre
signification comme nous le verrons pus loin.

La spécificité est une caractéristique qui provoque probablement moins


de confusion: on entend par spécificité l'aptitude d'une méthode à déceler ou
à mesurer la substance recherchée par rapport à d'autres substances analogues
ou à des composés gênants. On dit d'une méthode d'analyse qu'elle est
"pleinement spécifique" quand elle donne un signal analytique uniquement pour
123

un composé donné mais demeure "inerte" pour tous les autres composés qui
peuvent aussi être présents dans l'échantillon. Ainsi, avec une méthode
pleinement spécifique, la probabilité de réactions faussement positives est
nulle. Souvent les techniques chromatographiques classiques visant à séparer
les aflatoxines des autres constituants de la matrice ne sont pas pleinement
spécifiques et il faut procéder à des épreuves supplémentaires pour confirmer
la présence d'aflatoxine dans l'échantillon. La méthode la plus fiable à cet
effet est la spectrométrie de masse à haute résolution, mais bien des
laboratoires dans des pays en développement ne seront pas dotés de ce type
d'appareil perfectionné et devront donc appliquer des techniques plus simples.
Parmi les diverses possibilités qui s'offrent pour accroître la spécificité
d'une méthode, la dérivation à effectuer directement sur la plaque de
chromatographie en couche mince ou en aval de la colonne dans le cas de la
chromatographie liquide sous haute pression est l'une des plus utiles.

Outre ces caractéristiques fonctionnelles, il existe quelques


caractéristiques statistiques telles que la précision et le seuil de
détection. ainsi qu'une caractéristique opérationnelle, 1'exactitude. On
confond souvent précision et exactitude, alors que ces deux termes ont en fait
chacun une signification très particulière. La précision concerne la
dispersion inévitable des résultats obtenus lorsqu'on répète une méthode
d'analyse soit dans un même laboratoire, soit dans des laboratoires
différents, alors que l'exactitude est fonction de l'écart systématique par
rapport à la valeur réelle. Ces significations peuvent être illustrées à
l'aide de la diapositive suivante: Un tireur doit tirer un certain nombre de
coups de feu avec un vieux fusil en essayant d'atteindre la cible. On voit en
haut à gauche le premier résultat de son essai. Le tir a tendance à être trop
bas, ce qui indique une erreur systématique et, par conséquent, un manque
d'exactitude. En outre, on constate une dispersion non négligeable et nous
pouvons donc en conclure que le tir manque de précision. Nous décidons de
donner au tireur un autre fusil et de répéter l'exercice. Nous constatons de
nouveau la même dispersion, ce qui traduit, une fois de plus, un manque de
précision, mais nous ne voyons aucun signe d'erreur systématique, de sorte
qu'avec le nouveau fusil le tireur a obtenu des résultats exacts. La partie
suivante de l'illustration indique le résultat obtenu par un autre tireur
utilisant le même nouveau fusil et nous constatons que la dispersion est
faible, si bien que la précision est bonne, et que l'exactitude est
satisfaisante elle aussi. Enfin, le bon tireur tire avec l'ancien fusil: les
points d'impact sont groupés, de sorte que la précision est bonne; toutefois,
on constante clairement une erreur systématique, donc l'exactitude n'est pas
bonne. En fait, la raison, en 1'occurence, était une torsion du canon du fusil
ancien.

La précision d'une méthode est habituellement exprimée par l'écart-


type de cette méthode ou par l'écart-type relatif, dit coefficient de
variation. La précision peut être imputée à un erreur de méthode à l'intérieur
du laboratoire, laquelle est exprimée par r indiquant la répétabilité, ou bien
elle peut être imputée à un erreur entre laboratoires, laquelle est exprimée
par R indiquant la reproductibilité. La répétabilité r peut être définie comme
étant la valeur au-dessous de laquelle on peut s'attendre à ce que la
différence absolue entre deux résultats d'épreuve obtenus avec la même méthode
sur une substance identique dans les mêmes conditions se situe dans les
limites d'une probabilité spécifiée. En l'absence d'autres indications, la
probabilité est de 95%. Mathématiquement, la répétabilité r = 2,83 s, où
- 124 -

s = l'écart-type des résultats de l'épreuve. De façon analogue, la


reproductibilité R peut être définie comme étant la valeur au-dessous de
laquelle on peut s'attendre à ce que la différence absolue entre deux
résultats d'épreuve obtenus avec la même méthode sur une substance identique,
mais dans des conditions différentes (opérateurs, appareils et laboratoires
différents et/ou durées différentes), se situe dans les limites d'une
probabilité spécifiée. Là encore, en l'absence d'autres indications, la
probabilité est de 95%. Mathématiquement, la reproductibilité R = 2,83 s, où
s = l'écart-type des résultats de l'épreuve.

La répétabilité et la reproductibilité des méthodes d'analyse sont des


caractéristiques importantes qui permettent de vérifier si la technique
expérimentale d'un laboratoire est conforme à la normale, ou de comparer les
résultats d'épreuves obtenus à l'intérieur d'un laboratoire donnée ou par
différents laboratoires. Elles indiquent si les différences observées entre
les résultats d'épreuves sont importantes ou bien si elles s'inscrivent
simplement dans le cadre des fluctuations normales.

Il faut s'informer de la précision d'une méthode en soumettant celle-


ci à des épreuves lors d'une étude interlaboratoires. Pour ce qui est des
titrages classiques d'aflatoxine, on peut obtenir une idée assez exacte de la
précision de ces méthodes. Horwitz a constaté que les titrages d'aflatoxine
accusent des caractéristiques de reproductibilité conformes au tableau
général, à savoir que la précision interlaboratoires semble être fonction de
la concentration, étant indépendante de la nature de la substance analysée ou
de la technique de mesure utilisée. En général, cette précision peut être
représentée par l'équation suivante: C.V. (%) = 2<1"0,5l09 c), où c est la
concentration exprimée en puissances de 10. Dans la pratique, cela signifie
qu'avec un niveau d'environ 10 /¿g/kg un C.V. interlaboratoires est supérieur
à 30% et qu'avec un niveau de 0,1 /¿g/kg ce C.V. interlaboratoires a dépassé
65%.

En outre, Horwitz a observé que le rapport répétabilité/reproductibilité


se situe le plus souvent entre 0,5 et 0,7. Un rapport de moins de 0,5 indique
qu'il s'agit d'une méthode très personnelle; les analystes peuvent très bien
vérifier leur propre travail, mais ils ne peuvent pas vérifier celui de
collègues dans d'autres laboratoires, ce qui signifie que les instructions
doivent être revues ou qu'il faut vérifier les normes de référence appliquées.
Un rapport de plus de 0,7 peut indiquer que les répétitions d'opérations
faites par un analyste individuel sont de si mauvaise qualité qu'elles
éliminent la composante interlaboratoires.

La caractéristique suivante qui mérite qu'on lui accorde une certaine


attention est le seuil de détection d'une méthode. Là encore, il s'agit d'une
caractéristique qui n'est pas définie de la même façon par tous les analystes.
Selon la définition de l'UICPA, on entend par seuil de détection d'une méthode
le niveau de concentration le plus faible qui puisse être déterminé comme
étant statistiquement différent d'un dosage à blanc. L'UICPA précise que le
seuil de détection c L correspond à la mesure xB la plus faible qui puisse être
effectuée avec un degré raisonnable de certitude pour une méthode d'analyse
donnée. Mathématiquement xL = x B + ksB où xB est une estimation de la valeur
moyenne des résultats à blanc et où sB est l'écart-type des résultats à blanc,
k est un facteur numérique choisi en fonction de la limite de confiance
souhaitée. L'UICPA a choisi k = 3, ce qui signifie dans la pratique qu'il
125 -

existe une certitude de 90% qu'un signal mesuré à xL provient du composé


recherché; nous appelons seuil de détection la concentration correspondante
cL. La diapositive suivante indique la relation entre le seuil de détection
et la sensibilité m: plus la sensibilité est élevée et plus le seuil de
détection est bas. Il ne faut pas perdre de vue qu'à proximité du seuil de
détection tous les dosages d'une substance sont assez imprécis. Aussi la
American Chemical Society a-t-elle fixé comme autre critère une distance
correspondant à 10 fois l'écart-type du dosage à blanc par rapport à xB. Les
échantillons qui sont mesurés comme ayant un signal x, où x correspond à plus
de 10 fois l'écart-type du dosage à blanc, sont considérés comme étant dans
la zone de dosage, ce qui signifie que les concentrations sont suffisamment
élevées pour permettre un dosage raisonnable. On appelle zone de détection la
fourchette se situant entre trois fois et 10 fois l'écart-type du dosage à
blanc.

Malheureusement, les données signalées dans la littérature pour le seuil


de détection et de dosage semblent avoir été établies d'une manière très
subjective, ne correspondant que rarement à cette approche. Certains auteurs
font correspondre le seuil de détection qu'ils signalent à la quantité la plus
faible d'aflatoxine tout juste visible sur une plaque de chromatographie en
couche mince; d'autres font correspondre leur seuil de détection uniquement
à des étalons ou à des matrices qui ne produisent aucun "bruit de fond"
important. On peut citer comme autres complications les différences
d'intensité des divers types de lampes à ultraviolet et les différences de
sensibilité des divers types de détecteurs utilisés pour la chromatographie
liquide sous haute pression.

La dernière caractéristique à examiner est 1'exactitude. Cet écart


systématique est habituellement exprimé en pourcentages de récupération. Avec
les titrages d'aflatoxine classiques, des taux de récupération de 70 à 80%
sont courants. Le grand problème en matière de récupération est que les
données sont tirées d'épreuves où l'on utilise des échantillons enrichis. Nous
devons présumer que la fraction récupérée d'aflatoxine présente naturellement
dans l'échantillon est égale à celle d'aflatoxine ajoutée. En fait, nous
ignorons si toute l'aflatoxine naturellement présente se prête ou non à une
extraction au moyen de nos solvants initiaux. Ces problèmes peuvent être
surmontés en partie par l'emploi de substances de référence homologuées dans
lesquelles les alfatoxines sont présentes d'une manière naturelle. Cela permet
au moins de calculer l'exactitude de la méthode étudiée à l'aide d'une "valeur
réelle" ayant fait l'objet d'une homologation. Toutefois, ces substances de
référence homologuées pour le dosage des aflatoxines en sont encore au stade
du développement, sauf celles pour le lait en poudre ayant une teneur
homologuée en aflatoxine M,, qui sont disponibles depuis 1986 par
l'intermédiaire du Bureau de référence de la Communauté européenne.

La nécessité de substances de référence pour les mycotoxines s'impose


d'elle-même lorsqu'on considère les résultats des études interlaboratoires
portant sur les mycotoxines. Les programmes de vérification d'échantillons
organisés pour les mycotoxines par le Centre international de recherche sur
le cancer ont montré qu'une grande variabilité des résultats doit être
considérée comme la norme plutôt que l'exception et cela n'est guère
réconfortant pour ceux qui doivent payer pour les dosages ou tabler sur ceux-
ci pour des décisions importantes. Dans le cadre du programme du CIRC, des
échantillons de produits agricoles sont envoyés à de nombreux pays
- 126 -

participants en vue de rechercher par analyse les aflatoxines B,, B2, G, et Gz,
ainsi que des échantillons de lait en poudre pour la détection de l'aflatoxine
M,. Après avoir envoyé les résultats de leur analyse, les participants
reçoivent un rapport succinct décrivant les résultats des analyses
préliminaires effectuées sur des échantillons par trois laboratoires choisis
pour leur maîtrise des titrages d'aflatoxine. A un stade ultérieur, un rapport
complet contenant tous les résultats anonymes est distribué. Ces rapports
permettent aux laboratoires participants de juger de la qualité de leurs
propres résultats. La participation à ce programme de vérification
d'échantillons du CIRC est gratuite et elle est fortement recommandée parce
que le personnel qui travaille dans le domaine du dosage des mycotoxines ne
peut qu'admettre la justesse de ce qu'il a été convenu d'appeler la Loi de
Murphy, à savoir:

Rien n'est aussi facile qu'il apparaît.


Tout nécessite plus de temps que prévu
et si quelque chose doit aller mal cela se produira
au pire moment possible.
- 127

VI. PROGRAMME D'ETUDES PROPOSE POUR UN STAGE DE FORMATION


DE TROIS SEMAINES

Ce projet est assez approximatif, étant fondé sur l'expérience acquise


précédemment (voir II.5); il peut être adapté à la situation locale, aux
préférences du directeur de stage et aux derniers perfectionnements de la
méthodologie concernant les mycotoxines. Au besoin, la durée du stage pourrait
être quelque peu réduite par une diminution du nombre des exercices à
répétition.

Jour 1 - Les participants et le directeur de stage se présentent.


Explication du but poursuivi et planifiction approximative des
activités.
Cours magistral V.l: Les mycotoxines: introduction.

Travaux pratiques :

Préparation et manipulation des solutions étalons d'aflatoxine.


Chromatographie en couche mince des étalons d'aflatoxine ,
inspection aux rayons ultraviolets.
Devoirs individuels A-C (voir annexe II).

Jour 2 - Cours magistral V.2: Techniques de chromatographie en couche mince.

Travaux pratiques:

Préparation des plaques de chromatographie en couche mince.


Préparation des solvants révélateurs pour la chromatographie en
couche mince.
Chromatographie en couche mince des aflatoxines B,, B2, G, et G2
préfixées sur plaque ou fixées sur les plaques par l'opérateur.
Identification, valeurs Rf, intensité des taches.
Epreuve de confirmation au H2S04.
Devoirs individuels D-F (voir annexe II).

Jour 3 Travaux pratiques:

Chromatographie en couche mince unidimensionnelle et


bidimensionnelle des extraits (préparatifs effectués par le
directeur de stage).
Interprétation visuelle des plaques développées.
Surimposition des taches étalons sur les taches d'extrait aux fins
de confirmation.
Estimation de la teneur en aflatoxine B, sur la plaque de
chromatographie en couche mince.
Epreuve de confirmation au H2S04.

Jour 4 Travaux pratiques:

Chromatographie en couche mince unidimensionnelle et


bidimensionnelle d'extraits de produits agricoles (extraits
préparés par le directeur de stage).
Interprétation visuelle des plaques développées.
128

Estimation des quantités d'aflatoxines B,, B2, G, et G2 sur les


plaques de chromatographie en couche mince.
Calcul de la teneur des échantillons initiaux en aflatoxines B,,
Bz, G, et G2.
Transfert quantitatif des extraits de fiole à flacon.
Nettoyage de la verrerie contaminée.
Préparation des papiers filtres pliés.

Jour 5 Non programmé, laissé libre pour répétition de l'enseignement


théorique ou des exercices des jours 1 à 4, ou pour rattraper un
retard imprévu.

Jour 6 Travaux pratiques:

Démonstration des diverses étapes de la méthode des Communautés


européennes.
Application de la méthode complète des Communautés européennes
(chromatographie en couche mince unidimensionnelle et
bidimensionnelle) à un échantillon fourni par le directeur de
stage.
Estimation de la teneur de l'échantillon initial en aflatoxine B,.
Devoir individuel G (voir annexe II).

Jour 7 Travaux pratiques :

Application de la méthode complète des Communautés européennes


(chromatographie en couche mince unidimensionnelle et
bidimensionnelle) à des échantillons fournis par le directeur de
stage.
Estimation de la teneur des échantillons initiaux en aflatoxines
B,, B2, Gj Gt G2.

Jour 8 Travaux pratiques:

Application de la méthode complète des Communautés européennes


(chromatographie en couche mince unidimensionnelle et
bidimensionnelle) à des échantillons fournis par le directeur de
stage.
Estimation de la teneur en aflatoxines B,, B2, G, et G2.
Application des épreuves de confirmation au H2S04 et au HC1.

Jour 9 Même programme que pour le jour 8, mais avec des échantillons
choisis par les participants (produits locaux, problèmes
spécifiques).

Jour 10 Non programmé, laissé libre pour répétition de l'enseignement


théorique ou des exercices des jours 6 à 9, ou pour rattraper un
retard imprévu.
129

Jour 11 - Cours magistral V.3: Les techniques ELISA.

Travaux pratiques :

Démonstration de la méthode ELISA disponible dans le commerce pour


le dosage de l'aflatoxine B,.
Application de la méthode ELISA à des séries d'étalons
d'aflatoxine B,.
Application de la méthode ELISA à des échantillons de produits
agricoles.

Jour 12 - Cours magistral V.4: Caractéristiques.

Travaux pratiques:

Application de l'épreuve de liquéfaction des cristaux de sel.


Comparaison de la chromatographie en couche mince et de la méthode
ELISA appliquées à un même échantillon.

Jour 13 Travaux pratiques:

Détermination de l'exactitude et de la précision de la


chromatographie en couche mince et des méthodes ELISA par analyse
d'échantillons à répétition.

Jour 14 - Non programmé, laissé libre au gré de chacun pour répétition de


l'enseignement théorique ou des exercices des jours 11 à 13, ou
pour rattraper un retard imprévu.

Distribution des questionnaires d'évaluation (annexe I, E).

Jour 15 - Entrevues individuelles entre les participants et le directeur de


stage.
Discussion des questionnaires d'évaluation.
Cérémonie de clôture.
130

ANNEXE I

FORMES DE QUESTIONNAIRE A-E

A. Questionnaire concernant le participant

Nom:

Sexe: masculin/féminin

Date de naissance:

Niveau d'instruction:

Expérience du titrage des aflatoxines B,, B2, G,, G2:


Oui, pendant années/Non.

Expérience du titrage de l'aflatoxine M, :


Oui, pendant années/Non.

Fonctions actuelles:

Questions intéressant particulièrement le participant en ce qui concerne


la méthodologie applicable aux mycotoxines.
131 -

B. Questionnaire concernant les installations

Adresse de l'Institut:

Distance du centre ville:

L'Institut est-il accessible par les transports publics?

Quels sont les jours ouvrables officiels chaque semaine et quelle est
la durée officielle du travail quotidien?

Y a-t-il des jours fériés pendant la période proposée pour le stage de


formation?

Existe-t-il, pour les cours magistraux, une petite salle de conférence


où il sera possible de faire l'obscurité?

Peut-on disposer d'un projecteur de diapositives de taille normale, d'un


écran de projection blanc et d'un tableau noir?

L'espace de laboratoire est-il suffisant pour assurer la formation


simultanée de six participants?

Un ou plusieurs techniciens sont-ils disponibles pour fournir une


assistance technique pendant le stage?

Combien y a-t-il de hottes pour les activités du stage?

Comment la décontamination de la verrerie (pour la débarrasser des


aflatoxines) est-elle normalement assurée dans le laboratoire?

Comment les déchets de solvants organiques sont-ils éliminés dans le


laboratoire?
132

C. Questionnaire concernant les réactifs

Veuillez indiquer si les réactifs ci-après sont disponibles dans le


laboratoire où aura lieu le stage de formation. Tous les réactifs
doivent être de qualité "réactif analytique".

Acétone?

Chloroforme, stabilisé avec 0,5 à 1,0% d'éthanol à 96%?

n-Hexane?

Méthanol?

Ether éthylique anhydre, exempt de peroxydes?

Acétate d'éthyle?

Toluène?

Acétonitrile?

Gel de silice pour chromatographic sur colonne, granulométrie 0,05-


0,20 mm?

Sulfate de sodium anhydre granuleux?

Gaz inerte, par exemple azote?

Solution d'hypochlorite de sodium (NaOCl)?

Papiers filtres cannelés, Schleicher et Schull, N° 588 ou équivalent de


24 cm de diamètre?

Chlorure de sodium?

Sulfate laurique de sodium?

Acide citrique?

Acide phosphorique?

Acide sulfurique?

Acide trifluoroacétique?

Acide acétique?

Acide formique?

Acide chlorhydrique?
- 133 -

D. Questionnaire concernant l'équipement

Veuillez indiquer si le laboratoire où aura lieu le stage de formation


dispose des articles ci-après.

Chambre d'examen pour chromatographie en couche mince, avec enregistreur


ou intégrateur? Dans l'affirmative, de quel type?

Balance micro - analytique pour peser avec exactitude au mg près?

Balance analytique pour peser avec exactitude au g près?

Balance de précision à grande vitesse pour peser des échantillons à


environ 50-100 g près?

Agitateur pour fioles coniques de 300 à 500 ml de contenance?

Evaporateur rotatif sous vide disponible avec ballons?

Spectrophotomètre à ultraviolets avec cuves en quartz? Dans


l'affirmative, de quel type?

Lampe ultraviolets à grandes ondes à utiliser en chambre noire? Dans


l'affirmative, de quel type et de quelle intensité? (Une tache de 1,0 ng
d'aflatoxine B, sur une plaque de chromatographie en couche mince est-
elle nettement visible à 10 cm de la lampe?)

Broyeur?

Agitateur magnétique?

Microseringues? Dans l'affirmative, quelles sont les tailles (volumes)


disponibles et combien y a-t-il de microseringues de chaque taille?

Appareil de pulvérisation pour chromatographie en couche mince (faible


volume, 5-20 ml)?

Etaleur pour chromatographie en couche mince avec fente de sortie de


0,25 mm ou adaptable, y compris plaques de verre, plateau d'alignement
et support de stockage?

Four, ajustable de 70 à 110 degrés C?

Dessicateur avec pour dessiccatif du gel de silice actif?

Eprouvettes à capsule vissée, contenance 50 ml. Dans l'affirmative, de


combien d'éprouvettes disposera-t-on?

Colonnes de verre (diamètre interne 22 mm, longueur 300 mm), de


préférence avec robinet en téflon et réservoir de 250 ml? Dans
l'affirmative, de combien de colonnes disposera-t-on?

Verrerie normale de laboratoire, par exemple béchers, fioles coniques,


pipettes, verres gradués, etc., de différentes tailles?
134

Cuves pour chromatographie en couche mince avec couvercle? Dans


l'affirmative, combien de cuves et de quelles tailles?

Appareil pour concentration d'échantillons au laboratoire (bloc de


chauffage, pouvant contenir plusieurs flacons dont le contenu pourra
être évaporé sous azote)?

Pompe pour chromatographie liquide sous haute pression, colonnes de gel


de silice pour chromatographie liquide sous haute pression et colonnes
C18 de phase inverse, détecteur de fluorescence relié à
1'enregistreur/intégrateur?

Malaxeur Vortex?

Pipetteurs automatiques avec embouts à usage unique? Dans l'affirmative,


de quel type?

Lecteur pour titrage immunoenzymatique? Dans l'affirmative, de quel


type?
135 -

E. Questionnaire final concernant le participant

Veuillez donner votre opinion pour chacune des questions suivantes:

1. La taille du groupe pour ce stage était:


trop grande / parfaite / trop faible.

2. Les contacts individuels avec les participants et le directeur de stage


étaient :
excellents / normaux / médiocres.

3. La durée du stage était:


trop longue / parfaite / trop courte.

4. La qualité des installations du laboratoire était:


très bonne / suffisante / médiocre.

5. L'équilibre entre enseignement théorique et travaux pratiques était:


optimal / non optimal: trop d'enseignement théorique / trop de travaux
pratiques.

6. Les qualités pédagogiques du directeur de stage étaient:


excellentes / suffisantes / médiocres.

7. Les devoirs individuels étaient:


trop compliqués / corrects / trop simples.

8. La programmation du stage était:


trop stricte / parfaite / trop souple.

9. La pertinence globale du stage par rapport à vos propres travaux était:


élevée / suffisante / faible.

10. Vous pouvez formuler ci-dessous des remarques et suggestions


supplémentaires qui pourraient aider à améliorer la qualité des futurs
stages de formation de même type:
- 136

ANNEXE II

EXERCICES DE CALCUL

(CES QUESTIONS ONT POUR SEUL BUT DE VOUS FAMILIARISER


AVEC LES NOTIONS QUI REVIENNENT SOUVENT DANS LES CALCULS
EFFECTUES POUR L'ANALYSE DES MYCOTOXINES)

EXERCICE A
UN MICROGRAMME (/¿g) EST EGAL A NANOGRAMMES (ng)
UN MILLIGRAMME (mg) EST EGAL A NANOGRAMMES (ng)
UN GRAMME (g) EST EGAL A KILOGRAMMES (kg)
UN GRAMME (g) EST EGAL A MICROGRAMMES (/¿g)
UN NANOGRAMME (ng) EST EGAL A MICROGRAMMES (/ig)

EXERCICE B
UN MILLIGRAMME (mg) PAR KILOGRAMME (kg) EST EGAL A MICROGRAMMES PAR GRAMME
UN MICROGRAMME (ng) PAR GRAMME (g) EST EGAL A MICROGRAMMES PAR KILOGRAMME
UN NANOGRAMME (ng) PAR GRAMME (g) EST EGAL A MICROGRAMMES PAR KILOGRAMME
UN NANOGRAMME (ng) PAR MICROGRAMME (/ig) EST EGAL A MICROGRAMMES PAR GRAMME

EXERCICE C
UN MILLILITRE (ml) EST EGAL A MICROLITRES (p1)
UN LITRE (1) EST EGAL A MILLILITRES (ml)
UN MICROLITRE (/il) EST EGAL A MILLILITRES (ml)
UN LITRE (1) EST EGAL A MICROLITRES (/il)

EXERCICE D
LA DENSITE RELATIVE DE L'EAU EST DE 1,0
UN MILLILITRE (ml) D'EAU PESE MILLIGRAMMES (mg)
UN MICROLITRE (/il) D'EAU PESE MILLIGRAMMES (mg)
UN MILLILITRE (ml) D'EAU PESE MICROGRAMMES (/ig)
UN MILLILITRE (ml) D'EAU PESE GRAMMES (g)
137

EXERCICE E
LA DENSITE RELATIVE DU CHLOROFORME EST DE 1,49

UN MILLILITRE (ml) DE CHLOROFORME PESE GRAMMES (g)


UN MILLILITRE (ml) DE CHLOROFORME PESE MILLIGRAMMES (mg)
UN GRAMME (g) DE CHLOROFORME EST EGAL A MILLILITRES (ml)
UN GRAMME (g) DE CHLOROFORME EST EGAL A MILLILITRES (¿t1)

EXERCICE F
SUPPOSONS QUE NOUS DISPOSONS D'UNE SOLUTION ETALON D'AFLATOXINE B, DE ng/ml
DANS DU CHLOROFORME;
SI NOUS DISPOSONS SUR UNE PLAQUE DE CHROMATOGRAPHIE EN COUCHE MINCE DES TACHES
DE CET ETALON DE RESPECTIVEMENT 5, 10 et 15 fil, COMBIEN DE NANOGRAMMES
D'AFLATOXINE B, ONT ETE DEPOSES SUR LA PLAQUE RESPECTIVEMENT DANS CHAQUE
TACHE?

EXERCICE G
SUPPOSONS QUE VOUS AVEZ PROCEDE A L'EXTRACTION DE 50 g D'ARACHIDES ET QUE
L'EXTRAIT A ETE DE NOUVEAU ANALYSE SELON LA PROCEDURE DES COMMUNAUTES
EUROPEENNES. VOTRE VOLUME FINAL EST DE 2 ml ; VOUS PRELEVEZ SUR CE VOLUME FINAL
Ml QUE VOUS DEPOSEZ EN TACHE SUR LA PLAQUE DE CHROMATOGRAPHIE EN COUCHE
MINCE.
LA TACHE D'AFLATOXINE B, PROVENANT DE VOTRE EXTRAIT ET DEPOSEE SUR LA PLAQUE
DEVELOPPE UNE FLUORESCENCE DE MEME INTENSITE QUE ng D'AFLATOXINE B,.
COMBIEN Y A-T-IL D'AFLATOXINE B, DANS LE VOLUME FINAL DE VOTRE EXTRAIT
D'ECHANTILLON (en ng)?
QUELLE EST LA TENEUR DE VOTRE ECHANTILLON EN AFLATOXINE B, (/ig/kg)?
- 138 -

ANNEXE III

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líSÉpIliP

ISBN 92-5-202947-8 ISSN 1014-2908

M-82 T0322F/1/11.92/1000
ETUDE FAO: ALIMENTATION ET NUTRITION 14/io
ISSN 10142
-90*

manuels
sur le contrôle de la qualité
des •produits alimentaires

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ORGANISATION DES NATIONS UNIES POUR


L'ALIMENTATION ET L'AGRICULTURE ROME
ÉTUDE FAO: ALIMENTATION ET NUTRITION 14/io

manuels
sur le contrôle de la qualité
des produits alimentaires
10. cours de formation
sur l'analyse des mycotoxines

ORGANISATION DES NATIONS UNIES POUR L'ALIMENTATION ET L'AGRICULTURE


Rome, 1992
Les appellations employées dans cette publication et la présentation
des données qui y figurent n'impliquent de la part de l'Organisation
des Nations Unies pour l'alimentation et l'agriculture aucune prise de
position quantaustatutjuridique des pays, territoires, villes ou zones,
ou de leurs autorités, ni quant au tracé de leurs frontières ou limites.

M-82
ISBN 92-5-202947-8

Tous droits réservés. Aucune partie de cette publication ne peut être reproduite,
mise en mémoire dans un système de recherche bibliographique ni transmise sous
quelque forme ou par quelque procédé que ce soit: électronique, mécanique, par
photocopie ou autre, sans autorisation préalable. Adresser une demande motivée
au Directeur de la Division des publications, Organisation des Nations Unies pour
l'alimentation et l'agriculture, Vlale delle Terme dl Caracalla, 00100 Rome, Italie, en
indiquant les passages ou illustrations en cause.

© FAO 1992
AVANT-PROPOS

Dans la plupart des pays en développement, l'économie repose sur


l'agriculture et l'on compte beaucoup sur les cultures d'exportation comme
source de devises étrangères pour financer les activités productives et autres
services essentiels.

La plupart de ces cultures sont des céréales et des oléagineux qui sont
extrêmement vulnérables aux champignons et à la production de mycotoxines. Non
seulement les mycotoxines sont dangereuses pour la santé du consommateur, mais
de plus elles altèrent la qualité des produits alimentaires, entrainant
d'énormes pertes économiques pour ces pays.

Le présent Manuel a été préparé pour le compte de l'Organisation des


Nations Unies pour l'alimentation et l'agriculture en vue d'offrir un module
de formation aux gouvernements des pays en développement qui cherchent à
améliorer leurs programmes de prévention et de surveillance des mycotoxines.
Il est destiné à la formation aux niveaux national et régional.

La FAO tient à remercier M. H.P. van Egmond, du Laboratoire d'analyse


des résidus, Institut national de la Santé publique et de la protection de
l'environnement, à Bilthoven (Pays-Bas), qui était chargé de préparer le
texte. Une partie de la section III reproduit, avec l'autorisation des
éditeurs, l'article "Determination of mycotoxins" de H. P. van Egmond, qui
figurait dans "Developments in Food Analysis Techniques III", R.D. King
(Directeur de la publication), Applied Science Publishers Ltd. , Barking,
Essex, Angleterre (1984), 99-144.

J.W. Dickens (North Carolina State University, Raleigh, Caroline du


Nord, Etats-Unis d'Amérique) et E. Mulders (CIVO-TNO, Zeist, Pays-Bas) ont
communiqué respectivement les figures 9-13 et la figure 26.

La FAO remercie aussi de leur contribution au présent Manuel Karen Kool,


qui a dactylographié le texte, ainsi que le Service de mise en page et le
Service de photographie de l'Institut national de la Santé publique et de
l'Hygiène de l'environnement.

Cette publication est à la disposition des particuliers et des


organisations. On y trouvera à la fin une liste des publications et documents
sur les mycotoxines. Toutes suggestions pour d'éventuelles éditions
ultérieures de cette publication doivent être envoyées à l'adresse suivante:

Le Chef du
Service de la qualité des aliments et des normes alimentaires
Division des Politiques alimentaires et de la nutrition
Organisation des Nations Unies pour l'alimentation et l'agriculture
00100 Rome, Italie
iv -

NOTE SPECIALE

Les méthodes et procédures d'analyse décrites dans le présent Manuel


sont conçues pour être appliquées par un personnel dûment formé travaillant
dans un laboratoire équipé de façon adéquate. Comme c'est le cas pour de
nombreuses procédures de laboratoire, les méthodes citées impliquent
fréquemment l'emploi de substances dangereuses.

Pour que ces méthodes soient exécutées correctement et en toute


sécurité, il est indispensable que le personnel de laboratoire observe les
normes de sécurité applicables à la manutention des substances dangereuses.

Bien que les informations figurant dans le Manuel aient été préparées
avec le plus grand soin, la FAO décline expressément toute responsabilité à
l'égard des usagers de ces procédures pour les dommages de quelque sorte que
ce soit pouvant résulter de leur application.

L'inclusion de méthodes dans le présent Manuel n'implique nullement


qu'elles soient officielles; il s'agit simplement de méthodes que l'usage à
révélé comme étant applicables dans un laboratoire de type moyen.
- V -

TABLE DES MATIERES

Pages

I. BUT ET CHAMP D'APPLICATION 1

II. ASPECTS ORGANISATIONNELS DES COURS DE FORMATION 2

1. Généralités 2
2. Equipement du laboratoire 2
3. Réactifs et matériel de base 2
4. Niveau d'instruction des participants 2
5. Enseignements tirés des cours antérieurs 3

III. LES MYCOTOXINES: LEUR IMPORTANCE ET LEUR ANALYSE 5

1. Introduction 5
2. Croissance des champignons et production des toxines 7
3. Présence et toxicité des mycotoxines 11
4. Limites et réglementations 13
5. Echantillonnage 20
6. Techniques d'analyse 25
Titrages biologiques 25
Titrages chimiques 27
Extraction 27
Epuration 28
Dernières opérations de séparation,
de détection et de dosage 29
Méthodes chromatographiques 29
a. Chromatographie sur colonne ouverte 30
b. Chromatographie en couche mince 31
c. Chromatographie liquide sous haute pression 39
d. Chromatographie en phase gazeuse 44
Méthodes immunochimiques 44
a. Titrage immunoenzymatique 45
b. Titrage radio-immunologique 50
Conclusion 52
7. Caractéristiques 54
Sensibilité 54
Spécificité 55
Précision 56
Seuil de détection 58
Exactitude 60
8. Assurance de la qualité 61

IV. METHODES DE LABORATOIRE 64

1. Epreuve de liquéfaction des cristaux de sel pour


déterminer l'activité de l'eau (aw) dans les denrées
agricoles 64

But et champ d'application 64


Définition 64
- vi -

Principe 64
Réactifs 64
Equipement 65
Mode opératoire 65
Expression des résultats 65
Examen critique 65

2. Techniques de laboratoire pour la chromatographic en


couche mince 67

Préparation des plaques en couche mince 67


a. Matériel et produit chimiques 67
b. Mode opératoire 67
Préparation des étalons 68
a. Equipement 68
b. Vérification de la pureté 68
c. Préparation des étalons pour chromatographie en
couche mince 70
d. Détermination de la concentration d'aflatoxine 71
e. Détermination de la pureté chromatographique 72
f. Préparation et stockage des solutions étalons 72
g. Préparation de l'étalon de référence pour résolution 73
Chromatographie en couche mince 73
a. Dépôt des taches et développement 73
b. Interprétation et calcul 74
Confirmation de l'identité 75
a. Principes généraux 75
b. Méthode de l'AOAC pour l'aflatoxine B,
(unidimensionnelle) 76
Mode opératoire 77

3. Méthodes de chromatographie en couche mince pour le


dosage de l'aflatoxine B, dans les produits
d'alimentation humaine et animale 78

Mode opératoire pour la chromatographie


unidimensionnelle en couche mince 78
a. But et champ d'application 78
b. Principe 78
c. Réactifs 79
d. Equipement 80
e. Mode opératoire 81
f. Calcul des résultats 87
Chromatographie bidimensionnelle en couche mince
(dépôt de taches pour densimétrie) 88
a. But et champ d'application 88
b. Principe 88
c. Réactifs 88
d. Equipement 89
e. Mode opératoire 90
f. Calcul des résultats 93
- vi i -

Chromatographie bidimensionnelle en couche mince


(dépôt antidiagonal des taches) 93
a. But et champ d'application 93
b. Principe 94
c. Réactifs 94
d. Equipement 94
e. Mode opératoire 94
f. Calcul des résultats 97
Observations concernant les opérations de
chromatographie en couche mince 97
a. Délipidation 97
b. Répétabilité des résultats 97
c. Reproductibilité des résultats 98
d. Application de l'épreuve de confirmation à l'acide
trifluoracétique 98

4. Titrage avec immunoadsorbant lié à une enzyme pour


le dosage de l'aflatoxine B, dans les produits
d'alimentation humaine et animale 98

But et champ d'application 99


Principe 99
Réactifs 99
Equipement 100
Mode opératoire . 100
Interprétation des résultats 102
Notes concernant la sécurité 102

V. EXPOSES 103

1. Les mycotoxines: Introduction 103


2. Techniques de chromatographie en couche mince 109
3. Techniques ELISA 117
4. Caractéristiques des méthodes 122

VI. PROGRAMME D'ETUDES PROPOSE POUR UN STAGE DE FORMATION DE


TROIS SEMAINES 127

ANNEXES

I. FORMES DE QUESTIONNAIRE 130-135


II. EXERCICES DE CALCUL 136-137
III. BIBLIOGRAPHIE 138-143
1

I. BUT ET CHAMP D'APPLICATION

Depuis plusieurs années, le Service de la qualité des aliments et des


normes alimentaires de la FAO aide les pays en développement à renforcer les
moyens dont ils disposent pour empêcher et combattre la contamination des
aliments par les mycotoxines, en particulier les aflatoxines. Plusieurs
conférences et cours de formation internationaux ont eu lieu pendant cette
période. Les cours étaient organisés suivant les besoins, avec la
participation de consultants et de conférenciers invités qui y apportaient
leur propre documentation. Toutefois, il a été jugé qu'une approche plus
uniforme serait souhaitable, tout en conservant un certain degré de souplesse
et de spécificité par pays. On a donc entrepris de préparer un programme
d'enseignement de base pour un module de formation qui correspondrait aux
besoins de ces pays.

Le présent Manuel est conçu pour des cours d'une durée d'environ trois
semaines et il est destiné à former des analystes des pays en développement.
L'accent a été mis sur l'analyse des aflatoxines dans les produits
d'alimentation humaine et animale.
- 2 -

II. ASPECTS ORGANISATIONNELS DES COURS DE FORMATION

1. Généralités

Pour qu'un cours de formation sur les mycotoxines se déroule dans des
conditions de travail satisfaisantes, il faut veiller à un certain nombre
d'aspects organisationnels. Il est indispensable pour le directeur du cours
de se faire une idée précise des installations au lieu proposé et qu'il soit
avisé du budget disponible pour l'achat de fournitures supplémentaires dès le
stade initial. Si les délais impartis et les ressources le permettent, il est
préférable que le directeur du cours se rende sur place peu •après son
recrutement, éventuellement six mois avant la date prévue pour le cours, afin
d'estimer si les installations conviennent, de prendre note de tous problèmes
éventuels, de suggérer des adaptations, de prendre contact avec les autorités
locales et de commander les fournitures supplémentaires nécessaires. Au lieu
de se rendre sur place en personne, ou en plus, il peut utiliser des
questionnaires pour se faire une idée de la situation à l'endroit proposé pour
le cours de formation (voir annexe I B).

2. Equipement du laboratoire

Un cours de formation sur l'analyse des mycotoxines nécessite une salle


de classe simple où seront donnés les exposés théoriques et un laboratoire
pour les expériences. Le laboratoire doit posséder l'équipement ci-après:

- une alimentation régulière en eau et en électricité;


- au moins une hotte;
- la possibilité d'occulter la lumière du jour;
- un dispositif de climatisation dans les régions à climat chaud et
humide ;
- un espace de travail suffisant pour chaque participant;
- des moyens d'élimination des déchets.

Un questionnaire conforme au modèle B (voir annexe I) peut se révéler utile


pour estimer si les installations du laboratoire sont adéquates.

3. Réactifs et matériel de base

Bien que ces documents de formation mettent l'accent sur les méthodes
d'analyse des aflatoxines, qui sont relativement faciles à appliquer, il est
impossible de procéder au titrage des aflatoxines sans un minimum de réactifs
et de matériel. Un questionnaire conforme au modèle C (voir annexe I) pourra
se révéler utile pour déterminer si les fournitures essentielles sont
disponibles. La section IV contient des listes détaillées de réactifs et de
matériel pour certaines procédures de laboratoire.

4. Niveau d'instruction des participants

Il est difficile, surtout pour des étrangers, d'évaluer les diplômes


officiels qui sont décernés dans divers pays en développement, mais en général
un diplôme de fin d'études secondaires devrait être exigé pour participer à
des cours de formation sur les mycotoxines. Il n'est pas indispensable de
posséder déjà une expérience du titrage des mycotoxines. Toutefois, pour bien
- 3 -

profiter d'un stage de formation de trois semaines, il est bon d'avoir une
certaine expérience de la chimie analytique, et de préférence de l'analyse des
oligo-éléments. Un questionnaire conforme au modèle A (annexe I) pourrait se
révéler utile pour obtenir quelques informations sur les participants.

5. Enseignements tirés des cours antérieurs

Divers cours de formation sur les aflatoxines ont été organisés dans des
pays africains et autres entre 1982 et 1988. Les points ci-après reflétant les
enseignements pratiques tirés des cours antérieurs méritent d'être signalés,
car ils pourront guider la programmation de futurs cours de formation sur les
mycotoxines dans les pays en développement.

a. Il faut au minimum deux semaines pour que des analystes sans


expérience se familiarisent avec le dosage des aflatoxines dans les produits
d'alimentation humaine et animale par chromatographie en couche mince. Une
durée de trois semaines sera préférable si l'on désire aussi enseigner et
mettre en pratique d'autres techniques telles que le titrage avec immuno-
adsorbant lié à une enzyme.

b. Un groupe de six stagiaires par enseignant est considéré comme


étant un maximum pour garantir toute l'attention individuelle nécessaire. Pour
des raisons d'efficacité, il faudrait que soit présent un assistant local au
laboratoire où se déroule le cours. S'il s'agit d'un cours de portée
nationale, il est souhaitable qu'il regroupe des participants de différentes
institutions. Cela pourrait stimuler à l'avenir la coopération entre ces
institutions qui peuvent avoir des tâches, des responsabilités et des
installations différentes.

c. Les produits chimiques et le matériel simple non disponibles sur


place mais qui sont indispensables pour le cours de formation doivent être
achetés en Europe ou ailleurs et expédiés dans le pays en développement par
fret aérien car on a constaté que ce moyen de transport était sûr et qu'il
était le plus facile à contrôler. (Par exemple, les prix des produits
chimiques qui auraient été achetés à Nairobi en 1984 étaient supérieurs de
40% aux prix des mêmes produits chimiques achetés en Europe, fret aérien
inclus). Quand c'est possible, l'expédition doit être faite deux mois avant
la date du début du cours pour prévoir le temps nécessaire aux formalités sur
place, lesquelles peuvent être d'assez longue durée. Arrivés à destination,
les lots expédiés doivent être stockés en lieu sûr et il ne faut rien ouvrir
avant l'arrivée du directeur du cours.

d. Le directeur du cours doit arriver sur place trois à cinq jours


ouvrables avant la date d'ouverture du cours de formation, ce qui lui laissera
un temps minimum pour s'acclimater et s'occuper des inévitables affaires
administratives et questions d'organisation.

e. On constate fréquemment que certains stagiaires sont incapables


de faire des calculs arithmétiques simples. En pareil cas, il est très utile
qu'ils fassent quelques devoirs: l'annexe II contient quelques exemples
d'exercices.

f. La chimie analytique, et singulièrement l'analyse des oligo-


éléments, exige le plus grand soin et beaucoup d'ordre dans le laboratoire
- 4 -

ainsi qu'une solide faculté d'autocritique. Il faudra probablement un certain


effort pour obtenir des stagiaires qu'ils se conforment à ces exigences, même
s'ils manifestent un vif intérêt et se montrent disposés à tirer pleinement
parti du cours.

g. A l'issue d'un cours de formation il faut procéder à une


évaluation en tenant compte des observations des participants. Pour obtenir
ces informations, on peut utiliser un questionnaire simple comme le modèle E
dans 1'annexe I.
- 5 -

III. LES MYCOTOXINES: LEUR IMPORTANCE ET LEUR ANALYSE

1. Introduction

Les mycotoxines peuvent être définies comme étant des métabolites de


champignons qui engendrent des mutations pathologiques chez l'homme et les
animaux. Le mot "mycotoxine" est tiré des mots grecs "mykes" (champignon) et
"toksikon" (poison). Les mycotoxicoses peuvent être définies comme étant les
syndromes de toxicité résultant de l'absorption de mycotoxines par l'homme et
les animaux, généralement par ingestion.

Les maladies causées par les mycotoxines sont connues de longue date.
La première mycotoxicose reconnue était probablement l'ergotisme, une maladie
caractérisée par la nécrose et la gangrène et mieux connue au moyen-âge en
Europe sous le nom de "feu sacré"; elle était provoquée par l'absorption de
céréales contaminées par les sclérotes de Claviceps purpurea.

Une autre mycotoxicose reconnue comme ayant gravement atteint les


populations humaines est l'aleucie toxique alimentaire (ATA). Chez l'homme,
les symptômes revêtent de multiples aspects, dont la leucopénie, des lésions
nécrotiques de la cavité buccale, de l'oesophage et de l'estomac, la
septicémie, la diathèse hémorragique et l'épuisement de la moelle osseuse.
La maladie était provoquée par l'ingestion de céréales moisies stockées
pendant l'hiver et elle a frappé de nombreuses régions de la Russie, en
particulier pendant la Deuxième Guerre mondiale. Les champignons qui sont à
l'origine de ces accidents appartiennent aux genres Fusarium et Cladosporium.

Au Japon, la toxicité associée au riz moisi de couleur jaune a posé un


problème, surtout au lendemain de la Deuxième Guerre mondiale quand le riz
devait être importé de divers pays. L'ingestion de "riz jaune" par l'homme
provoquait des vomissements, des convulsions et une paralysie ascendante. La
mort pouvait survenir dans les un à trois jours suivant l'apparition des
premiers signes de la maladie. Les champignons produisant la toxine dans le
riz jaune font partie du genre Pénicillium.

Malgré les exemples susmentionnés de maladies provoquées par des


mycotoxines chez l'homme, les mycotoxicoses sont restées les "maladies
négligées" jusqu'au début des années 1960, quand cette attitude fut modifiée
de façon draconienne par la flambée de maladie X du dindon en Grande-
Bretagne. En l'espace de quelques mois, plus de 100 000 dindons sont morts,
surtout dans l'East Anglia et dans le sud de l'Angleterre. En outre, on a
signalé la mort de milliers de canetons et de jeunes faisans (Asplin, 1961).
L'apparition de la maladie X du dindon a entraîné une enquête
pluridisciplinaire pour déterminer la cause du problème. Ces recherches ont
été couronnées de succès et l'origine de la maladie a été imputée à un facteur
toxique présent dans de la farine d'arachides brésilienne qui était utilisée
comme source de protéines pour l'alimentation des volailles atteintes. Le
facteur toxique semblait être produit par deux champignons, Aspergillus
parasiticus et Aspergillus f lavus. d'où le nom d'"aflatoxine" qui lui futt
donné, étant une contraction du nom du second champignon mentionné. L'étude
plus poussée du facteur toxique a révélé que la substance en cause pouvait
être séparée en quatre taches distinctes par chromatographie. Ces quatre
éléments ont tous reçu le nom d'"aflatoxine" afin d'en identifier l'origine
- 6 -

générique. La distinction entre les quatre substances a été effectuée en


fonction de leur fluorescence avec des indices indiquant leur mobilité
chromatographique relative. Par la suite, il est apparu clairement que le
groupe des aflatoxines comprend au moins 17 composés étroitement apparentés.

Les deux décennies qui ont suivi la flambée de maladie X du dindon ont
donné naissance à une abondance d'informations sur les aflatoxines et beaucoup
d'autres mycotoxines ont également été isolées et caractérisées. On connaît
aujourd'hui plus de 200 mycotoxines différentes accusant une grande diversité
de structures chimiques. La figure 1 contient des exemples de quelques-unes
de ces structures.

CO OCH3
CH3

0C0CM3
OCOCH3

Atlatoxine B, Toxine T-2

^O' "O' OCH3

Sterigmatocystine Ochratoxine A

Figure 1. Structure chimique de quelques mycotoxines.

Les nombreuses mycotoxines différentes ont produit divers effets


biologiques chez les animaux de laboratoire: effets toxiques aigus, effets
mutagènes, cancérogènes, tératogènes, hallucinogènes, émétiques et
oestrogènes.

L'homme et les animaux peuvent être exposés aux mycotoxines par


l'ingestion de produits alimentaires contaminés par les toxines, par
inhalation ou par contact cutané.

La présence de mycotoxines dans les produits d'alimentation humaine


peut être le résultat:
- 7 -

a. De la contamination directe par des champignons de cultures sur


pied, de matières premières, de produits manufacturés ou de produits finis.
Comme exemple de contamination en plein champ, on peut citer la présence
d'aflatoxines dans les arachides, culture importante dans de nombreux pays en
développement. Comme exemple de contamination d'un produit semi-manufacturé,
on peut citer la présence de stérigmatocystine dans le fromage.

b. De la contamination de produits animaux provoquée par la


contamination du fourrage consommé par l'animal. On peut citer comme exemple
la contamination du lait et des produits laitiers par l'aflatoxine M,, qui est
le métabolite hydroxylé de l'aflatoxine B, et qui est formée dans l'organisme
de la vache laitière après qu'elle ait ingéré du fourrage contaminé par
l'aflatoxine B, (Allcroft, 1963). Ces faits ont conduit de nombreux pays à
promulguer une législation pour contrôler la contamination par les mycotoxines
des produits d'alimentation humaine ou animale (voir section III.4). Les pays
en développement qui exportent dans le monde industrialisé de grandes
quantités de produits d'alimentation animale ou de constituants de ces
produits doivent reconnaître qu'il importe de contrôler la teneur en
aflatoxines non seulement des produits d'alimentation humaine, mais aussi des
produits d'affouragement.

Des méthodes efficaces d'analyse sont nécessaires pour les enquêtes, la


surveillance et les programmes de contrôle. Le degré de simplicité de la
méthode influera sur le volume de données produit et sur l'applicabilité des
mesures de contrôle qui seront prises par la suite. L'existence de méthodes
d'analyse joue un rôle capital dans les enquêtes et les programmes de
recherche. Néanmoins, pour s'attaquer efficacement au problème des
mycotoxines, il faut une approche pluridisciplinaire où la mycologie, la
toxicologie et la chimie jouent chacune un rôle de grande importance.
Cependant, dans les sections qui suivent, les aspects mycologiques et
toxicologiques ne sont pas traités de façon très détaillée, l'accent étant mis
sur l'analyse pour rechercher les mycotoxines, en particulier les aflatoxines,
groupe de mycotoxines extrêmement cancérogènes qui ont fait l'objet d'études
très poussées.

2. Croissance des champignons et production des toxines

Les moisissures toxinogènes peuvent envahir les produits agricoles


pendant la croissance des végétaux ou la moisson, ou plus tard. La
contamination est due aux spores ou aux fragments de conidies ou de mycélium
présents dans l'environnement. La présence de grands nombres de spores ou de
fragments de conidies et de mycélium dans des produits qui ne sont pas
visiblement moisis peut être le signe d'une contamination générale de
l'environnement, d'une part, ou du traitement de matières premières moisies,
d'autre part. Pendant le traitement, il se peut que les champignons soient
inactivés et, dans ce cas, ils ne sont plus viables. La croissance des
champignons n'a lieu que dans des conditions favorables. Les champignons ont
besoin de divers nutriments pour leurs besoins énergétiques et pour fabriquer
des macro-molécules telles que les protéines et l'ADN. Puisque les champignons
ne peuvent pas synthétiser les glucides, le substrat doit contenir ces
composés, encore que les champignons puissent se développer dans un substrat
riche en protéines en utilisant les acides aminés comme source de carbone. Les
composés azotés organiques peuvent être assimilés par tous les champignons,
alors que les composés minéraux ne peuvent être assimilés que par un nombre
- 8 -

restreint d'espèces. Certaines vitamines doivent être présentes dans le


substrat, d'autres pouvant être synthétisées selon les espèces. Presque tous
les produits alimentaires contiennent les nutriments susmentionnés et peuvent
donc servir de substrat.

Un grand nombre de métabolites se forment pendant la décomposition des


glucides. Ils comprennent ceux qui sont toxiques pour l'homme et les animaux
(les mycotoxines) et ceux qui sont toxiques pour les micro-organismes (les
antibiotiques). Les champignons qui produisent notoirement des mycotoxines
sont au nombre d'environ 150. Le tableau 1 donne quelques exemples de
certaines moisissures bien connues et de leurs mycotoxines (voir aussi la
figure 1 pour la structure chimique des mycotoxines mentionnées).

Tableau 1

Moisissures toxigènes et leurs toxines

Espèces de champignons Toxines

Aspergillus flavus Aflatoxines


Aspergillus versicolor Sterigmatocystine
Pénicillium verrucosum Ochratoxines
Fusarium roseum Zéaralénone
Fusarium tricinctum Trichothécènes

Outre la présence de nutriments, les facteurs les plus importants pour


la croissance et pour la production de mycotoxines sont l'oxygène, la
température et l'activité de l'eau. La plupart des champignons ont besoin
d'oxygène, encore que quelques-uns puissent se développer en anaérobiose en
utilisant un processus de fermentation où se forment de l'éthanol et des
acides organiques. Les températures minimale, optimale et maximale pour la
croissance peuvent différer considérablement d'une espèce à l'autre. Certaines
peuvent se développer à des températures inférieures à 0° C, tandis que
d'autres exigent un minimum de 10° C. La plupart des Penicillia ont un
éventail de températures minimales plus bas que les Aspergilli. La température
optimale est de 25-30° C pour la plupart des Penicillia et de 30-40° C pour
la plupart des Aspergilli et ces gammes de températures seront souvent
rencontrées dans les pays tropicaux. Pour les diverses espèces de Fusarium.
la température optimale oscille entre 8 et 15° C, de sorte qu'on les trouve
dans les zones à climat tempéré.

L'activité de l'eau (aw) a remplacé l'hygrométrie comme expression la


plus utile de l'eau disponible pour la croissance des micro-organismes (Scott,
1957). La figure 2 illustre les diverses notions (Northolt, 1984). La notion
d'humidité relative s'applique à l'atmosphère. L'humidité relative d'équilibre
ou la pression de vapeur d'eau relative d'équilibre concerne l'atmosphère dans
un lieu clos où la pression de vapeur d'eau est en équilibre avec l'humidité
des substances entreposées. La a w équivaut au quotient de la pression de
vapeur d'eau autour du produit alimentaire quand elle est en équilibre avec
l'humidité du produit alimentaire, et la pression de vapeur de l'eau libre à
- 9 -

la même température. Chez les champignons, la a w minimale est généralement


beaucoup plus basse que chez les bactéries. C'est ce qui explique pourquoi
beaucoup de produits qui ne sont pas avariés par les bactéries peuvent l'être
par les champignons. On peut empêcher la croissance des champignons en séchant
les produits agricoles pour y ramener la a w à un niveau inférieur à 0,65 et
la maintenir au-dessous de ce seuil. La figure 3 récapitule les conditions de
a w et de température propice à la croissance de certaines espèces de
champignons et à la production de mycotoxines (Northolt, 1982). Il convient
de noter que l'éventail de a w et de températures indiqué englobe les valeurs
les plus basses et les plus élevées obtenues avec les diverses souches et les
divers substrats. L'aflatoxine B, peut être produite à des conditions de a w
et de température proches de celles qui sont le minimum pour la croissance.
La patuline et 1'orchratoxine A (voir figure 1) sont produites avec un
éventail de a w et de températures plus faible que pour la croissance.
Toutefois, il semble que la patuline ne soit produite que sur des substrats
à a w élevée.

Humidité relative 60%

Hygrométrie d'équilibre 88%

Activité de l'eau 0,88

Figure 2. Différents paramètres relatifs à la vapeur d'eau


(d'après Northolt, 1984).

Le Comité de l'hygiène alimentaire de la Commission du Codex


Alimentarius a proposé comme norme une aw de 0,70 pour les arachides, en vue
d'empêcher la contamination par les aflatoxines. Cette norme d'une a w de 0,70
est également utile pour assurer le stockage en toute sécurité d'autres
produits agricoles. Toutefois, l'introduction de normes pour la a w est gênée
soit par la complexité et le prix des instruments de détermination du point
de rosée, soit par la nécessité d'étalonner souvent ces instruments. Aussi
Northolt (1982) a-t-il mis au point pour vérifier l'activité de l'eau dans les
produits alimentaires une méthode simple qui peut être appliquée sur le
terrain, à savoir l'épreuve dite de liquéfaction des cristaux de sel. Cette
méthode repose sur la propriété qu'ont les cristaux de sel d'attirer la vapeur
d'eau et de la liquéfier si la pression de vapeur d'eau dans l'atmosphère
environnante dépasse la pression de vapeur d'eau d'une solution saturée du sel
utilisé. Cette deuxième pression de vapeur d'eau est spécifique des divers
types de sel et on l'exprime le plus souvent sous forme de vapeur d'eau
relative d'équilibre ou de a w du sel. On procède à l'épreuve simplement en
10 -

plaçant dans un bocal un mélange de cristaux secs et d'échantillons du produit


alimentaire. Si la aw de l'échantillon de produit alimentaire est plus élevée
que celle du sel, les cristaux vont se liquéfier au bout de quelques heures,
phénomène aisément visible à l'oeil nu. Pour vérifier la aw des arachides, on
utilise des cristaux de CUC12.H20 qui se liquéfient à une aw d'environ 0,70
(voir aussi la section IV.1 pour le mode opératoire). Quand 50% au moins des
cristaux sont liquéfiés, l'épreuve est considérée comme ayant donné un
résultat positif.

Croissance Production de mycotoxines

3 Qw

1. A. flavus AFLATOXINEB,
2. A. parasiticus

0.80
0 10 20 30 0 10 2 0 30
Température fC)

Croissance Production de mycotoxines


Qw

1. A. clavatus
2. P. expansum PATULINE
3. P. patulum

10 20 30 0 10 20 30
Température (-C)

Croissance Production de mycotoxines


V:y ' V \ Qw
P
1. A. ochraceus mmMi
2. P. cyclopium OCHRATOXINE A
3. P. viridicatum
Ww0 a
10 20 30 0 10 20 30
Température ("C)

Figure 3. Conditions d'activité de l'eau (a„) et de température


propices (hachures) à la croissance de différentes espèces de
champignons et à la production de différentes mycotoxines
(d'après Northolt, 1981).

L'épreuve de liquéfaction des cristaux de sel est une épreuve physique


indirecte applicable sur le terrain qui indique seulement l'éventualité de la
présence d'une ou plusieurs mycotoxines. Outre ce type d'épreuve, il existe
de nombreuses méthodes d'analyse pour déceler et déterminer la présence
effective d'une ou plusieurs mycotoxines dans le produit à inspecter. Ces
méthodes sont décrites dans la section III.6.
- 11 -

3. Présence et toxicité des mycotoxines

La contamination des produits d'alimentation humaine et animale par les


mycotoxines dépend en grande partie des conditions écologiques qui sont
propices à la croissance des moisissures et à la production des toxines. Les
données sur l'incidence et l'ampleur de la contamination sont limitées par de
nombreux facteurs, parmi lesquels les ressources disponibles pour mener les
enquêtes, l'existence de moyens de laboratoire pour procéder aux analyses, les
méthodes d'échantillonnage appliquées, la fiabilité et la sensibilité des
méthodes d'analyse utilisées, et la compétence des analystes. Néanmoins, de
nombreuses publications ont été consacrées à la présence de diverses
mycotoxines dans les produits d'alimentation humaine et animale depuis la
découverte des aflatoxines au début des années 1960. Il est probable qu'aucune
substance comestible ne peut être considérée comme étant absolument à l'abri
d'une éventuelle contamination par des mycotoxines, celles-ci pouvant être
produites en plein champ ou pendant la récolte, le traitement, le stockage ou
le transport d'un produit donné. Il serait impossible et injustifié de passer
en revue ici toutes les données concernant la présence des mycotoxines.
Certaines de ces données sont récapitulées dans "Critères d'hygiène de
l'environnement, document N° 11: Mycotoxines" (OMS, 1980). La plupart des
données concernent les redoutables aflatoxines, qui se développent plus
particulièrement dans les arachides et les produits à base d'arachides, le
maïs et d'autres céréales comme le riz, le blé, le sorgho et le millet en
quantités variant du /¿g/kg au mg/kg. Dans beaucoup de pays, le seuil de
tolérance pour les aflatoxines dans les produits d'alimentation humaine se
situe entre 5 et 25 /¿g/kg, mais il est souvent plus élevé pour les produits
d'alimentation animale (voir section III.4).

Les effets aigus et chroniques de l'exposition aux aflatoxines ont été


bien étudiés et l'on trouvera des informations précises dans certains ouvrages
détaillés (Heathcote, 1978) (Stoloff, 1977). L'aflatoxine B, est la plus
toxique, suivie des aflatoxines G,, B2 et G2 par ordre d'activité décroissante.
Pour ces mycotoxines, la valeur de la DL50 chez des canetons d'un jour était
respectivement de 0,36, 0,78, 1,70 et 3,45 mg par kilogramme de poids corporel
(Carnaghan, 1963). La vulnérabilité des animaux aux aflatoxines varie d'une
espèce à l'autre, les lapins, les canetons, les porcs, les truites et les rats
étant modérément sensibles, tandis que les souris, les hamsters et les
poussins sont relativement résistants. Les aflatoxicoses aiguës produisent une
hémorragie générale et une stéatose hépatique avec issue fatale.

Encore plus alarmante que les faits concernant les effets aigus des
aflatoxines fut la découverte que l'aflatoxine B, est un hépatocancérogène
très puissant chez le rat (Butler, 1968), et chez toutes les autres espèces
d'animaux de laboratoire soumises aux épreuves (Wogan, 1973). Le tableau 2
récapitule les données concernant la tumorigénicité hépatique de l'aflatoxine
B, chez diverses souches de rats.

Le cancer primitif du foie est l'un des cancers les plus répandus chez
l'homme dans les pays en développement. Les études épidémiologiques menées
dans les années 1970 confirment du point de vue statistique une association
entre l'incidence des carcinomes hépatocellulaires et la consommation
d'aliments contaminés par les aflatoxines. On a estimé pour ces études qu'il
était justifié de comparer l'exposition actuelle aux aflatoxines avec les taux
actuels de cancer, puisque les observations se limitaient à des populations
12 -

rurales stables dont le régime alimentaire et les habitudes en matière de


stockage et de cuisine n'avaient pas changé dans un passé récent (Dil, 1986).
On pense aujourd'hui qu'il existe un effet synergique entre l'aflatoxine et
l'infection due au virus de l'hépatite B provoquant un cancer primitif du
foie. Cette théorie de l'étiologie plurifactorielle gagne rapidement du
terrain par suite des résultats de récentes études de génétique moléculaire
portant sur les mécanismes de l'hépatocancérogenèse (Hsieh, 1986). Il semble
de plus en plus démontré que chez l'homme l'aflatoxine agissant isolément
exerce un effet hépatocancérogène très limité (Van Rensburg, 1986).

Tableau 2

Données sur le cancer du foie provenant d'études sur des rats


recevant de l'aflatoxine B, (AFB) (d'après Hsieh, 1986)

Etude N° Souche AFB dans Incidence du Référence


de rats la ration cancer du foie
(MgAg)

I Fischer 0 0/18 (0) Wogan (1974)


1 2/22 (0,09)
5 1/22 (0,05)
15 4/21 (0,19)
50 20/25 (0,80)
100 28/28 (1,0).

II Fischer 0 0/16 (0) Nixon (1974)


20 5/13 (0,38)

III Wistar 0 0/17 (0)


20 0/20 (0)
100 7/17 (0,41)

IV Porton 0 0/46 (0) Butler (1968)


100 17/26 (0,47)
500 25/25 (1,0)

V use 0 0/9 (0) Alfin-Slater


1 0/16 (0) (1969)
10 0/10 (0)

Les effets aigus et chroniques de quelques autres mycotoxines


importantes (voir figure 1) ont aussi été étudiés et signalés. Il a été
démontré que 1'ochratoxine A est une néphrotoxine puissante chez toutes les
espèces animales soumises aux épreuves, y compris des oiseaux, des poissons
et des mammifères (Krogh, 1977). L'hypothèse a été émise qu'il y aurait une
association entre 1'ochratoxine A et la néphropathie endémique balkanique,
maladie du rein observée dans certains pays des Balkans (Krogh, 1974). Par
ailleurs, des rapports sur la cancérogénicité de 1 'ochratoxine chez la souris
ont été publiés (Bendele, 1985). La patuline est un indicateur de méthodes de
fabrication défectueuses (utilisation de matières premières moisies) plutôt
qu'une menace sérieuse pour la santé humaine et animale, ainsi que l'ont
- 13 -

révélé de récentes études sur la toxicité subaiguë et semi-chronique (Speyers,


1987, 1988). Néanmoins, huit pays ont imposé officiellement un seuil de
tolérance pour la patuline (van Egmond, 1987). La stérigmatocystine est une
substance cancérogène qui se développe occasionnellement dans les céréales et
dans la croûte des fromages à pâte dure. La structure chimique de cette toxine
est apparentée à celle des aflatoxines. Parmi les trichothécènes, la toxine
T-2 et le déoxynivalénol sont celles qui ont attiré le plus d'attention. Ces
composés accusent un large éventail d'effets toxiques chez les animaux
d'expérience, dont le refus de s'alimenter, les vomissements, la diarrhée et
des hémorragies graves. D'autre part, ces composés sont extrêmement
tératogènes et ils perturbent le système immunitaire.

Pour les pays en développement, les aflatoxines sont les mycotoxines les
plus importantes du point de vue de leur présence dans l'environnement, de
leur toxicité et de l'économie nationale. Etant donné les conditions
climatiques favorables à la croissance des champignons et à la production de
toxines dans les aliments et leurs ingrédients, et compte tenu des méthodes
peu satisfaisantes utilisées pour la manutention des produits alimentaires,
il est probable qu'une partie de la population de ces pays soit exposée à un
certain degré d'intoxication par les aflatoxines. Il est beaucoup plus
difficile que dans les pays développés de réduire le risque d'exposition aux
aflatoxines. Pour l'heure, tout au moins, il est presque impossible pour
certains des habitants des pays en développement d'éviter tous les produits
alimentaires contaminés par les aflatoxines.

Outre les dangers que font peser sur la santé les mycotoxines en général
et les aflatoxines en particulier, il faut mentionner l'impact négatif sur
l'économie de ces pays. Dans la plupart d'entre eux, les technologies
applicables pendant et après la récolte et qui empêcheraient la croissance des
moisissures et la production des mycotoxines sont parfois insuffisantes, ou
bien tout simplement inexistantes. Pour de tels pays qui exportent des
produits alimentaires ou autres vers des pays qui ont des programmes efficaces
de contrôle de la contamination et qui mettent en pratique un système de
contrôle de la qualité des denrées alimentaires, les conséquences économiques
peuvent être catastrophiques. D'autre part, la présence de mycotoxines dans
les produits d'alimentation animale peut avoir un effet défavorable sur la
productivité animale. En prenant pour hypothèse une réduction de poids de 3%
chez les poulets de chair en raison d'une faible contamination par les
mycotoxines, Hesseltine (1986) a estimé le montant annuel des pertes à plus
de 140 millions de dollars des Etats-Unis. Ces aspects et d'autres concernant
la réglementation applicable en matière de mycotoxines sont examinés dans la
section 4.

4. Limites et réglementations

Les risques que comporte pour l'homme ou les animaux l'ingestion de


produits agricoles contaminés par des mycotoxines ont conduit de nombreux pays
à instaurer des mesures pour contrôler la contamination des produits
d'alimentation humaine et animale.

Les divers facteurs ci-après interviennent dans la détermination des


limites et des réglementations applicables aux mycotoxines:
- 14 -

a. Données d'enquête: Les données sur la présence des mycotoxines


indiquent les produits sur lesquels doit porter la législation. De plus, ces
données permettront d'estimer les effets des mesures de contrôle sur les
disponibilités de produits d'alimentation humaine, y compris les produits
d'origine animale, et de produits d'alimentation animale. Toutefois, dans les
pays en développement où les disponibilités alimentaires sont déjà
restreintes, l'imposition de mesures légales draconiennes pourrait conduire
à des pénuries alimentaires et à une hausse des prix.

b. Données toxicologiques: En l'absence d'informations


toxicologiques, il n'est pas possible de déterminer avec exactitude si la
substance en question est ou non dangereuse. Les mesures sont prises
logiquement en fonction d'effets toxicologiques spécifiques, sauf quand le
sujet d'inquiétude est le cancer comme c'est le cas pour les aflatoxines.
Selon les hypothèses actuelles, il n'y a pas de seuil pour les aflatoxines en-
deçà duquel certains effets ne pourraient pas se manifester, si bien que
n'importe quelle dose peu élevée rendra probable un effet quelconque, ne
serait-ce que dans une faible mesure. Une tolérance nulle semblerait dès lors
appropriée, mais le problème réside dans le fait que les aflatoxines sont des
contaminants naturels qui ne peuvent pas être totalement éliminés sans
interdire tout simplement le produit d'alimentation humaine ou animale
sensible. C'est ce qui rend particulièrement difficiles les jugements en
matière de réglementation.

c. Méthodes d'analyse: Pour que l'inspection des produits soit


possible, il faut disposer de méthodes d'analyse précises. S'il n'existe pas
de méthodes d'analyse fiables, il n'est pas possible de respecter les
tolérances fixées. D'autre part, il ne faut pas perdre de vue qu'en fait une
tolérance ne peut pas être inférieure à la limite effective de dépistage de
la méthode d'analyse appliquée.

d. Distribution des mycotoxines: La distribution des mycotoxines


dans les produits peut poser des problèmes très difficiles en ce qui concerne
la fixation des critères régissant la réglementation. Si une telle
distribution n'est pas homogène, comme c'est le cas pour les aflatoxines dans
les arachides, il y a de fortes chances pour que la concentration de
mycotoxines dans le lot à inspecter soit estimée de façon erronée en raison
des difficultés que soulève un échantillonnage représentatif. Il faut tenir
compte du risque à la fois pour le consommateur et pour le producteur quand
on fixe des critères pour l'échantillonnage et l'analyse des arachides (voir
section 5).

e. Législation: Enfin, il faut prendre en considération la


réglementation en vigueur chez les autres partenaires commerciaux et, si
possible, l'harmoniser avec la législation à l'étude. En dépit de leur
nécessité, les réglementations constituent une entrave pour le commerce
international puisqu'elles créent:

- des difficultés pour les pays exportateurs qui recherchent des marchés
pour leurs produits;

- des difficultés pour les pays importateurs qui veulent


s'approvisionner en produits essentiels comme les céréales et les
produits d'alimentation animale.
- 15 -

Il est clair qu'il n'existe aucune formule simple pour peser ces
facteurs. Toute décision est surtout question de bon sens. Le personnel des
services de santé publique est confronté à un problème complexe: les
mycotoxines, et singulièrement les aflatoxines, doivent être exclues des
produits d'alimentation humaine dans toute la mesure possible, mais puisque
les substances sont présentes dans les aliments sous forme de contaminants
naturels, on ne peut pas empêcher totalement l'homme d'y être exposé. Il
s'ensuit donc qu'il faut tolérer l'exposition de la population à un certain
degré d'aflatoxines. L'adoption de réglementations pour le contrôle des
aflatoxines est un processus en continuelle évolution dans certains pays. La
plupart des pays n'ont pas rendu publiques les informations qui ont servi de
base aux décisions concernant la fixation de tolérances. Il faut citer comme
exception les Etats-Unis d'Amérique où tous les problèmes et toutes les
difficultés ont été exposés dans des publications, de sorte que la raison
d'être des décisions prises est connue (Stoloff, 1980).

En 1981, les efforts tentés pour obtenir un aperçu de la législation sur


les mycotoxines dans le monde entier ont abouti à une publication de Schuller
(1983) sur la question. Cette synthèse contient des renseignements sur la
législation relative aux mycotoxines dans 46 pays. Depuis 1981, la
réglementation en matière de mycotoxines a été modifiée, complétée ou créée
dans divers pays. Aussi a-t-il été préparé pour la Deuxième Conférence
internationale mixte FAO/OMS/PNUE sur les mycotoxines un document actualisé
qui reflète la situation telle qu'elle se présentait en mai 1987 (van Egmond,
Bangkok, 1987) . Ce document à jour contient des informations sur la
réglementation en vigueur ou sur des propositions détaillées de réglementation
en matière de mycotoxines dans 56 pays. Le fait que de nombreux pays n'qient
pas promulgué une législation spécifique sur la question ne signifie pas
nécessairement qu'ils ne soient pas conscients du problème, ni que le problème
ne se pose pas chez eux. Beaucoup de pays se contentent d'une législation de
caractère général comme la suivante: "Le produit doit être exempt de micro-
organismes capables de se développer dans des conditions d'entreposage
normales et il ne doit contenir aucune substance provenant de micro-
organismes en quantités susceptibles de constituer un danger pour la santé".

Les documents de travail de la FAO Myc 87/9.1 et Myc 87/9.2 contiennent


des précisions pour le monde entier sur les tolérances, les bases juridiques,
les autorités compétentes, le degré de perfectionnement des méthodes
d'échantillonnage et d'analyse, et l'élimination des denrées contenant des
quantités inadmissibles de mycotoxines. Ces renseignements portent sur les
aflatoxines dans les produits d'alimentation humaine, l'aflatoxine M, dans les
produits laitiers, les aflatoxines dans les produits d'alimentation animale
et d'autres mycotoxines dans les produits d'alimentation humaine ou animale.
Certains renseignements sur les diverses tolérances sont récapitulés sous la
forme d'une distribution de fréquence dans les figures 4 à 8. Pour ces
figures, les restrictions et simplifications suivantes ont été opérées afin
de rendre possibles les comparaisons.

Dans les cas où les pays ont fixé des tolérances différentes pour les
aflatoxines selon les produits, on a retenu la tolérance applicable aux
produits d'alimentation humaine "principaux" (s'agissant souvent de produits
à base d'arachides), ce choix ayant pu avoir occasionnellement un caractère
subjectif. Pour les pays qui avaient indiqué une tolérance nulle pour la somme
des aflatoxines Bi, B2, G, et G2, on a considéré automatiquement que la
tolérance était nulle pour l'aflatoxine B,, si ce n'était pas spécifié
séparément.
16

Nombre de pays

U• N =30

12

10 •

10 15 20 25 30 35 40 ¿5 50
Tolérance (ng/kg)

F i g u r e 4 . D i s t r i b u t i o n de f r é q u e n c e des q u a n t i t é s t o l é r é e s
(en v i g u e u r ou p r o p o s é e s ) d ' a f l a t o x i n e B, d a n s les p r o d u i t s
d'alimentation humaine dans divers pays.

Nombre de pays

14

12
N = 35
10

10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tolérance (ng/kg)

F i g u r e 5 . D i s t r i b u t i o n de f r é q u e n c e d e s q u a n t i t é s t o l é r é e s
(en v i g u e u r o u p r o p o s é e s ) de la s o m m e d e s a f l a t o x i n e s
B ^ B j + G ^ G g d a n s les p r o d u i t s d ' a l i m e n t a t i o n h u m a i n e
dans divers pays.
- 17 -

Dans les cas où les pays ont fixé des tolérances différentes pour les
aflatoxines selon les produits, on a retenu la tolérance applicable aux
produits d'alimentation humaine "principaux" (s'agissant souvent de produits
à base d'arachides), ce choix ayant pu avoir occasionnellement un caractère
subjectif. Les tolérances applicables à la somme de l'aflatoxine B, et des
autres aflatoxines ont été considérées comme correspondant aux tolérances
applicables à la somme des aflatoxines B,, B2, G, et G2.

Nombre de pays
I
N =13

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 06 0.7 0.8 0.9 1.0

Tolérance (ng/kg)

Figure 6. Distribution de fréquence des quantités tolérées


(en vigueur ou proposées) d'aflatoxine M, dans le lait dans
divers pays.

Seules ont été incluses les tolérances pour l'aflatoxine M, dans le lait
de consommation (pas pour des produits spécifiés contenant du lait tels que
les préparations pour nourrissons).
- 18 -

Nombre de pays

12
N = 18
10

10 20 25 30 35 Í.0 ¿5 50
Tolérance (wj/kg)

Figure 7. Distribution de fréquence des quantités tolérées


(en vigueur ou proposées) d'aflatoxine B, dans les produits
d'alimentation animale (pour bovins laitiers) dans divers pays.

Seules ont été incluses les tolérances pour l'aflatoxine B, dans les
produits d'alimentation animale pour bovins laitiers (ou pour les produits
d'alimentation animale en général, si aucune précision n'a été fournie).

Nombre de pays

12
N=6

10

10 15 20 25 30 35 ¿0 ¿5 50

Tolérance (ng/kg)

Figure 8. Distribution de fréquence des quantités tolérées


(en vigueur ou proposées) d'aflatoxines B ^ B J + G J + G J dans
les produits d'alimentation animale (pour bovins laitiers)
dans divers pays.

Voir les observations pour la figure 4.


- 19

On peut constater d'après la figure 4 que le seuil de tolérance de


5 /¿g/kg pour l'aflatoxine B, est celui qui est le plus souvent appliqué par
les auteurs de la réglementation régissant les aflatoxines dans les produits
d'alimentation humaine. Dans les pays qui appliquent des limites pour la somme
des aflatoxines, on ne constate pas une telle uniformité dans les valeurs de
tolérance (figure 5). Il n'est pas absolument certain qu'une tolérance pour
la somme des aflatoxines, qui nécessite plus de travaux d'analyse que pour la
seule aflatoxine B,, contribue de façon appréciable à mieux protéger la santé
publique qu'une tolérance applicable uniquement à l'aflatoxine B,.
L'aflatoxine B, est la plus importante des aflatoxines, considérée du double
point de vue de la toxicologie et de la présence dans l'environnement. Il est
peu probable que des produits contiennent les aflatoxines B2, G, et G2 et non
l'aflatoxine B,, tandis que la concentration de la somme des aflatoxines B2,
G, et G2 est généralement inférieure à la concentration de la seule aflatoxine
B, (van Egmond, données inédites).

La distribution de fréquence de la figure 6 montre que, pour


l'aflatoxine M, dans le lait, il se produit deux pics principaux de tolérance,
à 0,05 et 0,5 /¿g/kg. En fait, il est étonnant de constater ces très grandes
différences en ce qui concerne la tolérance à l'égard de l'aflatoxine M, entre
certains pays d'Europe occidentale (0,05 /¿g/kg) et certains pays américains,
l'URSS et la Tchécoslovaquie (0,5 /¿g/kg). La tendance des pays d'Europe
occidentale à fixer à 0,05 /¿g/kg le seuil de tolérance pour l'aflatoxine M,
dans le lait a abouti à une réglementation plus stricte de la Communauté
européenne pour les produits d'alimentation animale, la tolérance pour
l'aflatoxine B, dans les produits complémentaires pour bovins laitiers ayant
été fixée en 1984 à 10 /¿g/kg (voir le pic maximal de 10 /¿g/kg dans la
figure 7). Un autre fait récent dans la législation communautaire est
l'introduction d'une tolérance de 200 /¿g/kg pour l'aflatoxine B, dans les
ingrédients de produits d'alimentation animale, mesure qui a force de loi
depuis la fin de 1988. Il se peut que l'évolution de la réglementation
internationale sur les mycotoxines suscite des problèmes croissants pour les
pays en développement qui seront contraints de fixer à l'exportation des
limites correspondant aux exigences de la clientèle.

Les aflatoxines constituent le groupe principal de mycotoxines pour


lesquelles il existe une réglementation. Toutefois, 15 pays avaient proposé
ou appliqué effectivement des tolérances pour d'autres mycotoxines en 1987.
Il s'agissait de la patuline, de 1'ochratoxine A, du déoxynivalénol, de la
toxine T-2 et de la zéaralénone (voir figure 1), ainsi que des mycotoxines
moins connues que sont la chétomine, la stachiobotriotoxine et la phomopsine.
Cependant, ces réglementations ne seront pas évoquées davantage dans le
présent document. Les lecteurs que cela intéresse pourront se reporter aux
documents de travail présentés par la FAO à la Deuxième Conférence
internationale mixte FAO/OMS/PNUE sur les mycotoxines, qui s'est tenue à
Bangkok en 1987.

Il ressort des figures 4 à 8 que la législation en matière d'aflatoxines


accuse des différences très nettes selon les pays dans le monde. On a parfois
l'impression que les auteurs de la réglementation ont eu le souci de faire
preuve d'originalité dans leur travail, sans accorder beaucoup d'attention à
la législation existant dans d'autres pays. Il serait hautement souhaitable
d'harmoniser la réglementation applicable aux aflatoxines. Cet effort
d'harmonisation doit s'appuyer sur une connaissance des motifs des décisions
- 20 -

qui ont conduit à l'application de la réglementation actuellement en vigueur


dans les divers pays du monde. La réglementation promulguée et celle qui est
en cours d'élaboration doivent être le résultat d'une coopération rationnelle
entre les parties intéressées, c'est-à-dire l'industrie, les consommateurs,
le secteur scientifique et les milieux officiels. C'est seulement dans ces
conditions que l'on pourra parvenir à une législation réaliste.

5. Echantillonnage

L'échantillonnage fait partie intégrante des procédés d'analyse.


L'échantillonnage a pour objet d'obtenir un échantillon de laboratoire (prise
d'essai) représentatif du lot sur lequel il a été prélevé. Normalement, la
décision d'accepter ou de rejeter un lot repose sur les preuves issues de
l'analyse de l'échantillon. Quand les mycotoxines sont réparties d'une manière
homogène dans tout le lot à inspecter, l'échantillonnage est facilité. La
distribution est homogène dans le cas de l'aflatoxine M, contenue dans le lait
et les produits laitiers, en raison de la liquidité originelle de ces
produits. Cette situation est exceptionnelle. Malheureusement, la plupart des
mycotoxines ont une distribution hétérogène et il se peut qu'elles ne se
présentent que dans une fraction des éléments constituant le lot à inspecter.
On peut citer comme exemple la distribution très inégale de l'aflatoxine B,
dans un lot d'arachides (Cucullu, 1966) et dans certaines autres denrées se
présentant en particules comme les céréales. Comme le problème le plus grave
est celui de la distribution de l'aflatoxine B, dans les arachides, celle-
ci a fait l'objet d'études assez poussées et c'est sur cet exemple qu'on se
fondera dans tout le reste de la présente section pour mettre en évidence les
difficultés de l'échantillonnage et la démarche qu'il faudra suivre pour
parvenir à des procédés d'échantillonnage pratiques en dépit des problèmes qui
se posent.

L'erreur totale d'un processus analytique comprend trois termes:


l'erreur d'échantillonnage, l'erreur de sous-échantillonnage (on entend par
sous-échantillonnage que l'échantillon originel est broyé, après quoi cette
fraction broyée fait l'objet d'un échantillonnage) et l'erreur d'analyse
proprement dite. En se basant sur de nombreuses analyses, Whitaker (1977) a
pu calculer la part de chaque erreur dans l'erreur totale lors de
l'échantillonnage et de l'analyse d'un lot d'arachides contaminé par
l'aflatoxine B,. Comme on le voit dans la figure 9, le facteur d'erreur
principal est l'erreur d'échantillonnage, tandis que l'erreur de sous-
échantillonnage et l'erreur d'analyse proprement dite (intra-laboratoire) ne
varient que fort peu quelles que soient les concentrations. (N.B.: l'erreur
d'analyse inter-laboratoires dépend beaucoup plus de la concentration.)

Il est possible de tracer une courbe indiquant la relation entre la


probabilité d'acceptation d'un lot et la concentration d'aflatoxine dans ce
lot, eu égard à une tolérance donnée. La figure 10 donne l'exemple d'une telle
courbe du mode opératoire (Whitaker, 1977). On peut voir d'après la figure 10
que le degré de probabilité d'acceptation d'un lot avoisine l'unité quand la
concentration d'aflatoxine est presque nulle, et qu'à mesure que la
concentration s'accroit la probabilité d'acceptation se rapproche du zéro. Il
ressort en outre de la figure 10 qu'il y a deux risques, le risque pour le
producteur et le risque pour le consommateur. Pour le producteur, il y a le
risque que le lot soit rejeté à tort du fait que la quantité d'aflatoxine
mesurée dans la prise d'essai est supérieure à la tolérance, bien que la
21 -

concentration moyenne dans le lot soit en-deçà du seuil fixé. Le consommateur,


quant à lui, court le risque qu'un lot soit accepté à tort parce que la
quantité d'aflatoxine mesurée dans la prise d'essai est inférieure à la
tolérance, bien que la concentration moyenne dans le lot dépasse celle-ci. En
augmentant la taille de l'échantillon, on réduira le risque aussi bien pour
le consommateur que pour le producteur (figure 11) (Dickens, 1978).

100

80
c Echantillonnage (21,8 kg)
o
•S 6 0
CO
>

CD
"O
c
2 40
o
it
ai
O
o Sous-échantillonnage (1100 g)
20
Analyse (18,3 g avec répétition)

0 20 40 60 80
Concentration d'aflatoxine ((ig/kg)

Figure 9. Part relative de l'erreur d'échantillonnage, de


l'erreur de sous-échantillonnage et de l'erreur d'analyse
proprement dite dans l'erreur totale (d'après Whitaker, 1977)
(communiqué par l'UICPA).

Tolérance

Concentration d'aflatoxine (|ig/kg)

Zone représentant le risque pour le producteur

Zone représentant le risque pour le consommateur

Figure 10. Probabilité d'acceptation d'un lot au regard de la


concentration d'aflatoxine (courbe du mode opératoire)
(d'après Whitaker, 1977) (communiqué par l'UICPA).
- 22 -

Tolérance

Taille de l'échantillon
3.2 kg
9.1 kg
3 4 kg

10 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 100
Concentration d'aflatoxine (p.g/kg) j g / k g )

Figure 11. Effet de la taille de l'échantillon sur la courbe


du mode opératoire (d'après Dickens, 1978) (communiqué par
l'Institut für Toxikologie, Zürich).

On obtient la courbe idéale pour le mode opératoire quand le lot tout


entier est broyé et analysé (figure 12) (Dickens, 1978). Cette situation
théoriquement idéale a manifestement des conséquences très peu pratiques: il
ne resterait plus rient à vendre ou à acheter, tout au moins sous sa forme
initiale. Le choix de la taille de l'échantillon dépend des risques qui
peuvent être acceptés et du coût qu'on est disposé à assumer. Une autre
possibilité d'influer sur le risque pour le producteur et le risque pour le
consommateur consiste à modifier le seuil de décision (il s'agit d'un seuil
de toxine critique qui a pour conséquence que, si le résultat de l'analyse de
la prise d'essai dépasse le seuil de décision, le lot sera rejeté).

En abaissant le seuil de décision, on réduit le risque pour le


consommateur mais, par contre, le risque s'accroît pour le producteur
(figure 13) (Dickens, 1978). Pour limiter ces risques, on a mis au point des
plans d'échantillonnage comportant deux (ou plus) seuils de décision, un seuil
d'acceptation et un seuil de rejet. En pareil cas, un lot est accepté si le
résultat de l'analyse de la prise d'essai est en-deçà du seuil d'acceptation
et il est rejeté si le résultat est au-dessus du seuil de rejet, une nouvelle
analyse étant effectuée quand le résultat se situe entre les deux seuils.
- 23 -

1.00 r

0.90 Tolérance
o
0.80
3
T3 0 . 7 0
c
O
ra0 . 6 0
Q. Faible
O 0.50
ra
b 0.40
S
S 0.30
ra
-O
o 0.20
CL
0.10

10 20 30 40 50 60 70 80
Concentration d'aflatoxine (p.g/kg)

Figure 12. Courbe idéale du mode opératoire: le lot tout entier


est broyé et analysé (d'après Dickens, 1978) (communiqué par
l'Institut für Toxikologie, Zürich).

Tolérance

c
13
T3
C
O Seuil de décision
ra
o. 50 jug/kg
25 / j g / k g
ra 10 > j g / k g
-<D
-O
ra
-O
O

10 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 70 8 0 9 0 100
Concentration d'aflatoxine (ng/kg)

Figure 13. Effet du seuil de décision sur la courbe du mode


opératoire (d'après Dickens, 1978) (communiqué par
l'Institut für Toxikologie, Zürich).
- 24 -

On peut citer comme exemple d'un tel plan d'échantillonnage celui du PAC
(Peanut Administrative Committee - Commission administrative sur les
arachides) qui est appliqué aux Etats-Unis d'Amérique pour l'échantillonnage
des lots importants d'arachides avant qu'ils soient expédiés à l'usine de
traitement (Dickens, 1977). Ce procédé d'échantillonnage comporte des
opérations multiples d'échantillonnage et de titrage effectuées sur des unités
représentatives de 22 kg du lot avec application d'une tolérance de 25 pg/kg
pour la somme des aflatoxines B,, B2, G, et G2.

Bien que l'opération soit parfois coûteuse, il est hors de doute qu'il
faut prélever de très grands échantillons d'arachides pesant plusieurs
kilogrammes pour ramener à un niveau minimal le risque d'une décision erronée
tant pour le consommateur que pour le producteur. Avec ces échantillons de
grande taille, il est nécessaire de procéder à un sous-échantillonnage pour
rendre possible une analyse adéquate. Vu l'éventualité d'une hétérogénéité,
il faut broyer et homogénéiser la totalité de l'échantillon. On a mis au point
à cet effet des instruments spéciaux et des techniques spéciales tels que la
meule de sous-échantillonnage de Dickens -Satterwhite (Dickens, 1969) et
l'appareil vertical de coupe et malaxage de Hobart (Francis, 1979). Ensuite,
ou bien on analyse la totalité du sous-échantillon, ou bien on réduit de
nouveau la taille du sous-échantillon jusqu'à ce qu'on obtienne une prise
d'essai dont la taille se situe généralement entre 20 et 100 g. Il semble
qu'on ait fixé la taille à 50 g pour parvenir à un compromis entre l'économie
de solvant et l'obtention d'un échantillon représentatif. Dans le programme
d'essai de la PAC pour les arachides, on procède à l'extraction de la totalité
du sous-échantillon (1 100 g) au moyen d'un mélange de 1 650 ml de méthanol,
1 350 ml d'eau, 1 000 ml d'hexane et 22 g de chlorure de sodium. Outre qu'ils
soient coûteux, les solvants sont une importante source d'énergie et ils est
difficile de s'en débarrasser après usage sans polluer l'environnement. Aussi
Whitaker (1980) a-t-il proposé une méthode qui consiste à extraire les
aflatoxines au moyen d'un solvant à partir d'un échantillon de 130 g d'une
boue qu'on obtient en mélangeant 1 100 g de graines d'arachides broyées,
1 500 ml d'eau et 22 g de chlorure de sodium dans un malaxeur Waring. Il
semble que la variance parmi les analyses avec cette méthode ne différait pas
sensiblement de la variance constatée entre les analyses effectuées selon le
procédé officiel de la PAC.

Outre les Etats-Unis d'Amérique où l'on applique le plan


d'échantillonnage de la PAC, plusieurs autres pays ont indiqué en 1987 qu'ils
avaient proposé ou approuvé des plans d'échantillonnage pour la lutte contre
les mycotoxines (uniquement pour les aflatoxines) (van Egmond, 1987). Les pays
africains ayant des plans d'échantillonnage pour les produits d'alimentation
humaine sont le Kenya, le Malawi et le Nigéria. Les pays africains ayant des
plans d'échantillonnage pour les produits d'alimentation animale sont la Côte
d'Ivoire, le Nigéria et le Sénégal.

On peut supposer que la conception de ces plans d'échantillonnage


s'inspire des informations concernant les facteurs essentiels suivants: un
seuil critique (contrôle, tolérance, directive, etc. pour les aflatoxines);
une définition d'un lot satisfaisant (acceptable) ou non satisfaisant (à
rejeter); un énoncé des risques acceptables ou souhaités pour le consommateur
et pour le producteur. En l'absence de telles informations, le choix d'un plan
d'échantillonnage quelconque serait arbitraire.
- 25 -

6. Techniques d'analyse

Des procédures biologiques et techniques ont été établies pour la


détection et le dosage des mycotoxines. Les méthodes biologiques peuvent se
révéler utiles pour la recherche des mycotoxines connues ou inconnues. On peut
citer à titre d'exemple qu'elles ont joué un rôle important pendant la période
de découverte initiale des aflatoxines (Carnaghan, 1963). Cependant, si l'on
connaît la mycotoxine ou les mycotoxines qu'il faut rechercher, il est
préférable de recourir aux techniques d'épreuve chimique, si c'est possible,
parce qu'elles sont généralement beaucoup plus spécifiques, plus rapides et
plus reproductibles et qu'elles possèdent un seuil de détection plus bas.
Ainsi, les titrages chimiques jouent un rôle de grande importance dans le
dosage des mycotoxines. Par conséquent, les épreuves biologiques ne seront
passées en revue que brièvement, tandis que les dosages chimiques seront
décrits d'une façon plus détaillée.

Titrages biologiques

D'une manière générale, les systèmes de titrage biologique s'appliquent


à cinq catégories d'organismes: les micro-organismes, les animaux aquatiques,
les animaux terrestres, les systèmes de culture d'organes et de tissus et les
végétaux. Watson (1982) donne un aperçu de l'utilité de ces organismes pour
la détection des mycotoxines.

Il semble que les micro - organismes soient assez insensibles aux


mycotoxines. Burmeister (1966) a enquêté sur plus de 300 espèces de micro-
organismes pour déterminer leur sensibilité aux aflatoxines et il n'a trouvé
qu'une souche de Bacillus brevis et deux de Bacillus megaterium qui soient
sensibles aux aflatoxines. Toutefois, une méthode de titrage fondée sur
l'action antibactérienne observée (Clements, 1968) avait un seuil de détection
absolu élevé (1 ¿¿g) et n'était pas suffisamment reproductible lors d'études
concertées pour justifier des recherches plus poussées. D'autres mycotoxines
peuvent entraver la croissance des micro-organismes d'une manière telle que
des méthodes de titrage utiles peuvent être mises au point.

Quelques animaux aquatiques comme la crevette d'eau saumâtre (Artemia


salina) et certaines espèces de poissons (truite, Brachydano rerio. gambusie)
sont utilisés dans des systèmes de titrage biologique pour déceler les
mycotoxines (Brown, 1968). D'une manière générale, les larves des poissons ou
des crevettes d'eau saumâtre sont exposées à diverses concentrations de
toxines dissoutes dans l'eau d'aquarium et, après un certain temps, on estime
le pourcentage d'animaux tués pour chaque dilution (Waart, 1972). L'épreuve
à laquelle sont soumises les crevettes d'eau saumâtre est l'un des titrages
les plus simples, mais elle est relativement insensible aux mycotoxines,
hormis quelques trichothécènes, la stérigmatocystine et les aflatoxines. L'un
des problèmes que soulève l'épreuve avec les crevettes d'eau saumâtre est
peut-être le fait que beaucoup de mycotoxines ne sont que légèrement
hydrosolubles. L'épreuve dure environ une journée et aucune compétence
technique particulière n'est requise.

Parmi les animaux terrestres, il semble que les plus sensibles aux
mycotoxines soient les canetons et les embryons de poulet. Lors de l'épreuve
biologique initialement mise au point à l'occasion de la flambée de maladie X
du dindon (Carnaghan, 1963), on a utilisé des canetons nouvellement éclos
- 26 -

comme animaux d'expérience pour déterminer la présence d'aflatoxine isolée


dans des aliments douteux, la réaction mesurée spécifique étant 1'hyperplasie
des canaux biliaires. La dose minimale de 0,4 /¿g/jour pendant 5 jours
constitue l'apport minimal nécessaire à l'induction d'une lésion décelable des
canaux biliaires. Dans l'épreuve sur embryon de poulet, on applique à la
seringue une petite quantité d'extrait sur la membrane de l'oeuf. Après une
incubation de 3 à 4 semaines, on dénombre les survivants. Il semble que
l'épreuve sur embryon de poulet soit l'un des systèmes de titrage biologique
les plus sensibles pour les mycotoxines. En outre, elle est reproductible et
particulièrement utile pour le dosage de l'aflatoxine B,, puisqu'on observe
des lésions typiques dans l'embryon avec des niveaux subaigus d'aflatoxine B,,
moins de 0,1 /¿g/oeuf. L'épreuve sur embryon de poulet a fait l'objet d'études
concertées avec succès (Verret, 1973) et l'Association of Official Analytical
Chemists l'a adoptée comme méthode finale officielle (AOAC, 1984). En raison
de la longue période d'incubation, l'épreuve sur embryon de poulet est l'un
des titrages biologiques les plus lents, ce qui en constitue l'inconvénient
majeur. Pour le dépistage des trichothécènes, groupe de mycotoxines provoquant
des dermatites, l'épreuve cutanée sur l'animal expérimental s'est révélée
utile (Chung, 1974) . Des extraits de produits douteux et de cultures sont
appliqués sur la peau rasée d'un lapin ou d'un rat qui est ensuite inspectée
pendant quelques jours. Les réactions comme l'érythème, l'oedème et la nécrose
indiquent la présence de trichothécènes dans l'extrait. Cette méthode est
fiable et son seuil de détection absolu est d'environ 0,01 /¿g par épreuve.

L'emploi de cultures cellulaires pour déceler les mycotoxines a pour


avantage que de faibles concentrations peuvent provoquer une réaction
perceptible. Des cultures de cellules hépatiques, rénales et musculaires
peuvent servir de matériel d'épreuve. On procède à ce titrage in vitro en
ajoutant des extraits de denrées douteuses ou de cultures fongiques au milieu
de culture. La culture se poursuit pendant plusieurs jours et l'on relève
périodiquement le degré de cytotoxicité ainsi que les effets cytopoïétiques
et les transformations morphologiques (Umeda, 1977). L'exposition de cellules
hépatiques de rat à des concentrations de 0,1 /¿g d'aflatoxine B, par
millilitre de milieu de culture entraine des lésions marquées (Umeda, 1971).
La méthode avec culture cellulaire a pour limitation le fait que beaucoup des
milieux utilisés pour la culture des champignons semblent être toxiques et ne
peuvent donc pas servir de moyen de contrôle.

La dernière catégorie à mentionner est celle des végétaux. Les titrages


de phytotoxicité reposent sur l'aptitude de certaines mycotoxines à freiner
la croissance et la germination des semences de végétaux supérieurs. Schoental
(1965) a découvert que des suspensions d'aflatoxines dans l'eau à une
concentration de 25 /¿g/ml ajoutées à un milieu gélosé contentant des graines
de cresson provoquaient l'arrêt total de la germination, tandis qu'on relevait
une carence en chlorophylle dans la plantule ("albinisme") à des
concentrations de 1 à 2,5 ¿¿g/ml. Burmeister (1970) a signalé que 0,5 /¿g de
toxine T-2 ralentissait de 50% la germination de graines de pois quand celles-
ci étaient trempées pendant toute une nuit dans la solution.

Les titrages biologiques peuvent être utiles quand il n'est pas possible
de procéder à un titrage chimique. Les titrages biologiques se sont révélés
surtout utiles pour le dépistage des mycotoxines. Cependant, leur emploi pour
la surveillance des produits d'alimentation humaine et animale est de peu
d'importance car ces méthodes manquent généralement de spécificité, de
reproductibilité et de rapidité.
27

Titrages chimiques

Les limitations des techniques de titrage biologique pour déceler et


doser les mycotoxines ont conduit les chimistes à mettre au point des méthodes
d'analyse plus sélectives et plus fiables. En règle générale, toutes les
méthodes d'analyse chimique utilisées pour la détection et le dosage des
mycotoxines comportent les étapes fondamentales indiquées sur la figure 14.
Les problèmes d'échantillonnage ont déjà été exposés. Les prises d'essai
homogénéisées qui sont prélevées pour analyse ont habituellement un poids qui
se situe entre 20 et 100 g, cette fourchette étant le résultat d'un compromis
entre les exigences d'homogénéité et les besoins pratiques.

Echantillonnage

1
Extraction

1
Epuration de l'extrait

\
Concentration

\
Séparation des composants de l'extrait

J
Détection et dosage

I
Confirmation de l'identité

Figure 14. Procédure d'analyse pour le dosage des mycotoxines.

Extraction

La première étape de l'analyse chimique comporte l'extraction de la


prise d'essai pour séparer les composantes intéressantes de l'ensemble des
constituants de la matrice et pour obtenir le matériel sous une forme
utilisable. En règle générale, les mycotoxines sont extraites avec des
solvants organiques comme le chloroforme, le dichlorométhane, 1'acétonitrile,
l'acétate d'éthyle, l'acétone et le méthanol. Le contact entre le solvant et
le substrat solide s'effectue soit pendant une brève période (1 à 3 minutes)
dans un malaxeur à grande vitesse, soit pendant une durée plus longue (30
minutes) par agitation dans une fiole. Les liquides peuvent être épuisés dans
- 28 -

une ampoule à décantation ou absorbés sur un milieu hydrophile qui est placé
au préalable dans une colonne, après quoi l'extraction est effectuée par
élution au solvant. On peut citer comme exemple de cette dernière technique
d'extraction la procédure employée pour doser l'aflatoxine M, dans le lait,
où l'on utilise une colonne de Celite préparée en laboratoire (Schuller,
1973).

Le choix du solvant est dicté par les propriétés chimiques de la toxine


à extraire autant que par les propriétés du support. On constate souvent que
les mélanges de solvants ou les solvants ajoutés à de faibles quantités d'eau
et d'acides sont les plus efficaces. Bien que beaucoup de mycotoxines ne
soient que faiblement hydrosolubles, les solvants aqueux peuvent pénétrer dans
les tissus hydrophiles, conduisant à une extraction extrêmement efficace par
les solvants non aqueux. Deux des méthodes d'analyse les mieux connues et les
plus employées pour le dépistage des aflatoxines, la méthode CB (méthode dite
de la Contamination Branch) (Eppley, 1966) et la méthode des Communautés
européennes (Commission des Communautés européennes, 1976), emploient un
mélange de chloroforme et d'eau pour l'extraction des aflatoxines.

Epuration

Les mycotoxines n'étant normalement présentes qu'en quantités très


faibles, une forte concentration de l'extrait est nécessaire pour pouvoir les
déceler. La présence fréquente de lipides et d'autres substances qui risquent
de gêner la détection finale rend nécessaire l'épuration de l'extrait avant
la concentration, s'agissant d'épuration en colonne, de techniques
d'extraction liquide-liquide et/ou de précipitation simultanée des impuretés.
Plusieurs étapes d'épuration chromatographique en colonne sont possibles avec
des substances telles que le gel de silice, le gel de silice modifié, l'oxyde
d'aluminium, le polyamide FlorisilR et SephadexR. C'est le gel de silice qui
est le plus fréquemment utilisé. Les colonnes peuvent être garnies dans le
laboratoire. Toutefois, il existe désormais dans le commerce des colonnes déjà
prêtes; l'emploi de ces colonnes est indiqué dans un assez grand nombre de
méthodes d'analyse pour mycotoxines ayant récemment fait l'objet de
publications. Les avantages de ces colonnes déjà garnies, par exemple
SEP-pakR, BakerR, sont évidents. Les différences de préparation des colonnes
d'un analyste à l'autre sont évitées et l'on économise le temps nécessaire
pour préparer les colonnes. Cependant, des variations entre lots de colonnes
déjà garnies ont été signalées (Scott, 1984) et il existe effectivement la
possibilité d'introduire aisément de légères variations dans la composition
de la colonne (par exemple un ajustement de la teneur en eau ou de la taille
de la colonne). L'extrait de l'échantillon est habituellement ajouté à la
colonne dans un solvant approprié, après quoi la colonne est lavée au moyen
d'un ou plusieurs solvants dans lesquels les toxines sont insolubles ou moins
solubles que les impuretés. La composition des solvants est ensuite modifiée
de telle façon que les toxines soient éluées sélectivement de la colonne.
L'éluat est recueilli et concentré.

La technique d'extraction liquide - liquide peut aussi être pratiquée dans


des ampoules à décantation, par exemple le pentane contre un mélange méthanol-
eau. La plupart des mycotoxines n'étant pas lipophiles, la délipidation peut
être effectuée de cette manière sans perte de toxine. Dans certaines méthodes
d'analyse, on utilise des réactifs de précipitation. On peut citer comme
exemples l'acétate de plomb' et le gel basique ferrique frais pour précipiter
- 29 -

les p i g m e n t s de g o s s y p o l d a n s des e x t r a i t s de g r a i n e s de c o t o n ( P o n s , 1 9 6 5 )
( W i s e m a n , 1 9 6 7 ) , le c a r b o n a t e de c u i v r e p o u r é l i m i n e r la c h l o r o p h y l l e
( V e l a s c o , 1 9 7 0 ) e t le n i t r a t e d ' a r g e n t p o u r e x t r a i r e la t h é o b r o m i n e d u c a c a o
(Scott, 1969).

L e s t e c h n i q u e s d ' é p u r a t i o n s u s m e n t i o n n é e s s o n t e n f a i t des p r o c é d u r e s
de s é p a r a t i o n p e r m e t t a n t de s é p a r e r l ' u n de l ' a u t r e d e s g r o u p e s de s u b s t a n c e s
p o s s é d a n t c e r t a i n e s p r o p r i é t é s p h y s i c o c h i m i q u e s . Il e s t p o s s i b l e de c e t t e
m a n i è r e d ' é l i m i n e r la m a j e u r e p a r t i e d e s s u b s t a n c e s e x t r a i t e s s i m u l t a n é m e n t .
Le c h o i x de la t e c h n i q u e d ' é p u r a t i o n p o u r r a d é p e n d r e de la m é t h o d e e m p l o y é e
p o u r la d é t e c t i o n e t le d o s a g e , d u s e u i l de d é t e c t i o n r e q u i s , de la r a p i d i t é
de l ' a n a l y s e e t d u d e g r é de r é c u p é r a t i o n .

Les extraits qui ont été épurés sont généralement concentrés par
évaporation du solvant dans un évaporateur rotatif sous pression réduite, ou
à l ' é t u v e , t a n d i s q u e l ' e x t r a i t e s t m a i n t e n u s o u s u n c o u r a n t d ' a z o t e . Le
r é s i d u e s t r e d i s s o u s d a n s u n p e t i t v o l u m e de s o l v a n t , p u i s transféré
quantitativement dans une petite fiole et amené à un v o l u m e spécifié. Selon
la t o x i n e e t l ' é t a p e u l t i m e de s é p a r a t i o n e t de d é t e c t i o n p r é v u e , il p e u t
s ' a v é r e r n é c e s s a i r e de p r o c é d e r à la d é r i v a t i o n de la m y c o t o x i n e à l a q u e l l e
o n s ' i n t é r e s s e a f i n de p o u v o i r la m e s u r e r o u e n o p t i m i s e r le c o m p o r t e m e n t
chromatographique.

D e r n i è r e s o p é r a t i o n s de s é p a r a t i o n , de d é t e c t i o n et de d o s a g e

M a l g r é l ' e x t r a c t i o n e t l ' é p u r a t i o n , il se p e u t q u e l ' e x t r a i t f i n a l


c o n t i e n n e de g r a n d e s q u a n t i t é s d ' a u t r e s s u b s t a n c e s e x t r a i t e s s i m u l t a n é m e n t e t
q u i p o u r r a i e n t g ê n e r le d o s a g e d e s m y c o t o x i n e s . Il e x i s t e plusieurs
p o s s i b i l i t é s p o u r s é p a r e r les m y c o t o x i n e s de la m a t r i c e a f i n de p e r m e t t r e u n
dosage qualitatif et quantitatif. Les méthodes chromatographiques, qui
r e p o s e n t s u r des p r i n c i p e s de s é p a r a t i o n p h y s i q u e , s o n t c e l l e s q u i s o n t le
plus souvent appliquées. Elles sont utilisées en association avec u n dosage
v i s u e l ou a u x i n s t r u m e n t s d e s m y c o t o x i n e s r e c h e r c h é e s . C e p e n d a n t , les m é t h o d e s
i m m u n o c h i m i q u e s , q u i r e p o s e n t s u r des p r i n c i p e s c o m p l e x e s de s é l e c t i o n e t de
l i a i s o n b i o c h i m i q u e , g a g n e n t r a p i d e m e n t d u t e r r a i n d a n s la r e c h e r c h e s u r les
mycotoxines.

Méthodes chromatographiques

L e s p r o c é d é s c h r o m a t o g r a p h i q u e s i m p l i q u e n t u n p a r t a g e b a s é s u r la
s o l u b i l i t é d i f f é r e n t i e l l e d ' u n e s u b s t a n c e v i s - à - v i s d ' u n e p h a s e f i x e (le
s u p p o r t c h r o m a t o g r a p h i q u e ) e t d ' u n e p h a s e m o b i l e ( l i q u i d e o u g a z e u s e ) , les
s u b s t a n c e s à s é p a r e r p a s s a n t à t r a v e r s le s u p p o r t c h r o m a t o g r a p h i q u e . L a p h a s e
f i x e r e t a r d e p l u s o u m o i n s le p a s s a g e des s u b s t a n c e s s e l o n l e u r s p r o p r i é t é s
p h y s i c o c h i m i q u e s , de s o r t e q u e la s é p a r a t i o n d e s c o n s t i t u a n t s p e u t ê t r e
r é a l i s é e . P o u r le t i t r a g e des m y c o t o x i n e s , o n p e u t d i s t i n g u e r les t y p e s de
chromatographie suivants:

- chromatographie sur colonne ouverte;


- chromatographie en couche mince ;
- c h r o m a t o g r a p h i e l i q u i d e sous h a u t e p r e s s i o n ;
- chromatographie gaz-liquide.
30

a. Chromatographic sur colonne ouverte

Il a déjà été fait état de la chromatographie sur colonne ouverte comme


technique souvent utilisée dans les procédés d'épuration. On peut recourir à
une conception spéciale - la minicolonne en verre ayant un diamètre interne
d'environ 5 mm - pour la détection de quelques mycotoxines dans certains
produits. Dans la méthode d'épreuve recommandée par Romer (1975), la
minicolonne est garnie de couches successives d'adsorbants tels que l'alumine,
le gel de silice et le FlorisilR avec un dessiccateur au sulfate de calcium
à chaque extrémité, le tout maintenu en place avec de la laine de verre
(figure 15). Un extrait au chloroforme appliqué à l'extrémité supérieure de
la colonne est entraîné par gravité. Puis on applique une chromatographie
descendante avec un mélange de chloroforme et d'acétone, fixant les
aflatoxines sous forme de bande serrée à la partie supérieure de la couche de
FlorisilR où elles peuvent être décelées par la couleur bleue de leur
fluorescence sous un éclairage ultraviolet (figure 16) . En comparant une
colonne d'échantillon avec une colonne contenant une quantité connue
d'aflatoxine, il est possible de juger si l'échantillon contient plus
d'aflatoxine ou moins que l'étalon. contrairement aux techniques de
chromatographie en couche mince, la méthode de Romer sur minicolonne (1975)
ne distingue pas entre les différentes aflatoxines. La méthode de Romer (1975)
a fait l'objet d'une étude concertée réussie (Romer, 1976) et elle a été
adoptée par l'AOAC comme méthode officielle d'action initiale pour la
détection des aflatoxines dans les amandes, le maïs blanc et jaune, les
farines d'arachides et de graines de coton, les arachides, le beurre
d'arachides, les pistaches et les aliments composés pour animaux (AOAC, 1984).
Outre les aflatoxines, des procédés analogues sur minicolonne ont été mis au
point pour quelques autres mycotoxines qui deviennent fluorescentes quand
elles sont exposées à un rayonnement ultraviolet, par exemple 1'ochratoxine
A (voir figure 1) dans tout un éventail de produits (Holaday, 1976) et la
zéaralénone (voir figure 1) dans le maïs, le blé et le sorgho (Holaday, 1980).
Les seuils de détection atteints varient d'environ 5 à 15 /¿g/kg pour la
zéaralénone.

Les méthodes sur minicolonne sont des méthodes "tout ou rien" qui ne
prennent que peu de temps et ne nécessitent aucun matériel complexe. Aussi
sont-elles utiles pour les épreuves de dépistage à effectuer sur le terrain
par des spécialistes scientifiques et des techniciens dans les pays en
développement. En conséquence, l'Organisation de coopération et de
développement économiques (OCDE) a décrit quelques méthodes sur minicolonne
pour les aflatoxines dans un manuel sur le dépistage rapide des mycotoxines
(OCDE, 1982). En dépit de quelques avantages, les méthodes sur minicolonne ont
certaines limitations: l'interprétation de l'image sur la colonne exige une
certaine expérience et elle peut se révéler particulièrement difficile quand
sont appliqués sur la colonne des extraits "souillés" contenant des composés
fluorescents autres que la toxine recherchée. En pareil cas, on risque
d'obtenir des résultats faussement positifs. Les méthodes sur minicolonne sont
au mieux semi- quantitatives et en général leur seuil de détection est plus
élevé et la sensibilité, le pouvoir de résolution et la sélectivité sont
inférieurs à ce qu'on obtient avec la chromatographie en couche mince et la
chromatographie liquide sous haute pression. On peut s'attendre à ce que le
titrage immuno-enzymatique remplace les méthodes sur minicolonne pour le
dépistage rapide.
31

Laine de verre

Sulfate de calcium
Alumine

Gel de silice

FlorisilR

Sulfate de calcium

Laine de verre —

Figure 15. Garniture d'une minicolonne Figure 16. Adsorption de l'afla-


selon Romer (1975) . toxine B, sur la couche de FlorisilR
d'une minicolonne.

b. Chromatographic en couche mince

Dans la chromatographie en couche mince, la phase fixe se compose d'une


couche mince de particules adsorbantes étalées sur une plaque et la phase
mobile passe au travers de cette couche par capillarité. Au cours des
premières années de recherche sur les mycotoxines, la chromatographie en
couche mince est devenue une technique très courante et très appréciée pour
séparer les constituants d'un extrait et elle a aujourd'hui encore de
nombreuses applications. A l'origine, les séparations étaient opérées en une
seule dimension avec utilisation d'un solvant unique. Par la suite, la
recherche sur les mycotoxines a fait appel à la chromatographie en couche
mince bidimensionnelle (Kiermeier, 1970). C'est une technique de séparation
puissante comportant un second développement à angle droit par rapport au
premier avec utilisation d'un solvant différent. On obtient ainsi une bien
meilleure séparation qu'avec la chromatographie en couche mince
unidimensionnelle et on y a recours en particulier dans les cas où il faut
déceler des niveaux très faibles, par exemple l'aflatoxine M, dans le lait,
ou encore si les extraits contiennent de nombreuses substances gênantes, par
exemple les produits d'alimentation animale et les arachides grillées
(cacahuètes).
- 32

Pour la chromatographie en couche mince, on peut utiliser tout un


éventail d'adsorbants. Pour la recherche des mycotoxines, on utilise le plus
souvent des plaques de chromatographie en couche mince au gel de silice car
ce type d'adsorbant offre généralement la meilleure possibilité de séparer la
toxine recherchée des autres constituants de la matrice. On peut utiliser des
plaques préenduites ou sur lesquelles on effectue soi-même l'étalement. Les
plaques qui doivent être enduites par l'opérateur permettent de choisir
librement les adsorbants et les additifs. Du sulfate de calcium peut être
ajouté pour fixer le gel de silice à la plaque de verre. Stubblefield (1979b)
a utilisé l'EDTA comme chélateur des contaminants dans le gel de silice pour
éviter que des taches de citrinine ne soient disposées en rangées. D'un autre
côté, les plaques préenduites sont prêtes à l'emploi; elles possèdent
généralement une couche plus uniforme et rigide et laissent quand même un
certain choix pour le support, par exemple du verre, du plastique ou de
l'aluminium. Les caractéristiques des plaques à antigène préfixé, tout comme
celles des plaques enduites par l'opérateur, peuvent différer d'une marque à
l'autre et parfois même d'un lot à l'autre, d'où un comportement différent en
matière de séparation comme on le voit sur la figure 17 où un mélange
d'aflatoxines B,, B2, G, et G2 a été séparé sur trois types différents de
plaques, après quoi celles-ci sont examinées sous rayonnement ultraviolet.
(Ces quatre principales aflatoxines ont été désignées d'après la couleur de
leur fluorescence (bleue, c'est-à-dire B pour "blue" en anglais, ou verte,
c'est-à-dire G pour "green" en anglais) et leur mobilité relative sur la
plaque de chromatographie en couche mince (valeur R,) .

Figure 17. Séparation d'un mélange d'étalons d'aflatoxine


sur plusieurs types de plaques de chromatographie en couche
mince au Si02.
- 33

Les plaques de chromatographie en couche mince peuvent avoir différents


formats. On peut résoudre la plupart des problèmes de séparation en utilisant
une plaque de 20 x 20 cm; toutefois, on pourra aussi obtenir souvent des
résultats satisfaisants avec des plaques de 10 x 10 cm ou même en découpant
soi-même des plaques de 7 x 7 cm. L'emploi de plaques de taille plus
restreinte fait gagner beaucoup de temps, surtout pour les opérations de
séparation bidimensionnelle. Comme exemples de méthodes d'analyse où la
séparation bidimensionnelle est effectuée sur de petites plaques de
chromatographie en couche mince, on peut citer la méthode multi-mycotoxines
de Patterson (1979) , les méthodes de van Egmond (1980) pour le dosage de la
stérigmatocystine dans le fromage, la méthode de Stubblefield (1981) pour le
dosage des aflatoxines dans les tissus animaux et la méthode de Paulsch (1982)
pour le dosage de 1'ochratoxine A dans les rognons de porc. De plus, l'emploi
de plaques de taille plus restreinte offre la possibilité de les développer
non seulement dans des dispositifs spécialement conçus à cet effet, mais aussi
dans de simples béchers, ce qui est très intéressant pour les laboratoires ne
possédant que peu de verrerie. Elles peuvent aussi être utilisées par séries
de 10 simultanément sur un support multiplaques (figure 18) , ce qui réduit
notablement la durée totale requise pour une série d'opérations de
chromatographie en couche mince.

iSséW

Figure 18. Support en acier inoxydable pour la chromatographie


parallèle de 10 plaques de chromatographie en couche mince
de 6,7 x 6,7 cm.
34

Pour le dosage des mycotoxines en général par chromatographie en couche


mince, on dispose sur la plaque de 5 à 15/il d'extrait. Selon le degré
d'exactitude et de précision voulu, on utilise différents types d'étaleurs.
Pour le criblage, on utilise les pipettes capillaires qualitatives à usage
unique ou seringues de précision, qui permettent d'opérer avec plus
d'exactitude et de précision. Qui plus est, les seringues permettent
d'appliquer des volumes plus importants par intermittence sous atmosphère
inerte en les utilisant avec un distributeur à répétition incorporé dans le
dispositif servant à déposer les taches. Le dépôt des taches d'échantillon et
d'étalon est normalement effectué selon un certain schéma prescrit dans le
cadre de l'opération d'analyse dans son ensemble. Différents schémas de
répartition des taches sont applicables pour la chromatographie en couche
mince unidimensionnelle ou bien, dans le cas des extraits "souillés", la
chromatographie en couche mince bidimensionnelle. Dans la chromatographie en
couche mince bidimensionnelle, l'extrait d'échantillon est déposé à un angle
de la plaque et deux opérations de développement sont effectuées
successivement parallèlement aux deux côtés de la plaque avec deux solvants
différents. Les deux solvants doivent être compatibles et indépendants, c'est-
à-dire qu'il ne doit y avoir que peu de corrélation entre les schémas de
rétention des deux systèmes, faute de quoi les taches ont tendance à
s'agglomérer le long de la bissectrice de la plaque.

On peut citer comme exemple de l'utilisation de la chromatographie en


couche mince bidimensionnelle la procédure suivie en conformité avec la
méthode officielle des Communautés européennes pour le dosage de
l'aflatoxine B, dans les produits d'alimentation animale (Commission des
Communautés européennes, 1976) (figure 19): on dépose en taches une aliquote
d'extrait en A et des quantités connues de l'étalon d'aflatoxine B, en B. La
plaque est ensuite développée selon la première orientation avec un mélange
d'éther éthylique, de méthanol et d'eau (94+4,5+1,5) et, après séchage, on
fait décrire à la plaque un angle de 90° et on la développe selon la seconde
orientation avec un mélange de chloroforme et d'acétone (9+1). La détection
et le dosage sont effectués sous exposition à un rayonnement ultraviolet dans
la région des grandes longueurs d'ondes (365 nm). La figure 20 illustre le
résultat d'une séparation par chromatographie en couche mince bidimensionnelle
d'un extrait de beurre d'arachides contaminé par de l'aflatoxine B,. Avec
l'aide des étalons d'aflatoxine B, développés simultanément, il est possible
de localiser la tache d'aflatoxine B, bien séparée provenant de l'échantillon.
Un densimètre permet de comparer l'intensité de la fluorescence de la tache
d'aflatoxine B, provenant de l'échantillon et de la tache provenant de
l'étalon et l'on peut ainsi calculer la concentration d'aflatoxine B, dans
l'échantillon initial.

Si l'on ne dispose pas d'un densimètre, ce qui sera souvent le cas dans
les pays en développement, on peut recourir au schéma de taches disposées
perpendiculairement à la diagonale tel que l'avait mis au point à l'origine
Beljaars (1973) pour le dosage de l'aflatoxine B, dans les arachides
(figure 21): on dispose en taches une aliquote d'un extrait de l'échantillon
en A et différentes quantités de l'étalon d'aflatoxine B, en B. La plaque est
soumise à un développement bidimensionnel et la détection et le dosage sont
de nouveau effectués sous rayonnement ultraviolet (figure 22). Avec l'aide de
la rangée d'étalons d'aflatoxine B, soumis à un développement bidimensionnel,
il est possible de localiser l'aflatoxine B, provenant de l'extrait et
d'estimer sa concentration en comparant l'intensité de sa fluorescence avec
- 35 -

celle des différents étalons d'aflatoxine B,. Etant donné que toutes les
taches d'aflatoxine B, sont alignées et assez proches l'une de l'autre, une
telle estimation est plus facile qu'une comparaison visuelle avec des taches
d'étalon développées dans les bandes latérales, comme c'est le cas pour le
schéma de taches densimétrique. Toutefois, cette technique n'est applicable
que si les taches d'étalon apparaissent dans une partie "libre" de la plaque
après le développement bidimensionnel.

Orientation 1
>•

B

• m

A B B

A
• • •

A : extrait de l'échantillon . . . • • .
B: étalon d'aflatoxine 0 5 cm

Figure 19. Disposition des taches Figure 20. Séparation d'un extrait
pour la chromatographie en couche de beurre d'arachides soumis à la
mince bidimensionnelle (dosage chromatographie en couche mince
densimétrique). bidimensionnelle avec utilisation
d'un schéma de répartition des
taches densimétrique.

Des méthodes de chromatographie en couche mince bidimensionnelle ont


également été mises au point pour le dosage d'autres mycotoxines telles que
la zéaralénone (Jemmali, 1977), la stérigmatocystine (van Egmond, 1980) et
1'ochratoxine A (Paulsch, 1982) (figure 1), ainsi que pour une méthode
multimycotoxines (Patterson, 1979).
- 36 -

Les aflatoxines ayant h e u r e u s e m e n t pour caractéristique d'émettre sous


f o r m e de f l u o r e s c e n c e l ' é n e r g i e d u r a y o n n e m e n t u l t r a v i o l e t à g r a n d e s l o n g u e u r s
d'ondes qu'elles ont absorbé, l'opérateur effectuant l'analyse peut déceler
c e s c o m p o s é s à de f a i b l e s n i v e a u x . M a l h e u r e u s e m e n t , t o u t e s les m y c o t o x i n e s n e
peuvent pas être décelées par une méthode aussi simple. Beaucoup de
m y c o t o x i n e s ne deviennent pas fluorescents sous rayonnement ultraviolet;
c e r t a i n e s a b s o r b e n t les r a y o n n e m e n t s u l t r a v i o l e t s o u la l u m i è r e v i s i b l e ,
t a n d i s q u e d ' a u t r e s n e le f o n t p a s . D a n s ce d e r n i e r c a s , o n p e u t p a r f o i s
r e n d r e l a m y c o t o x i n e v i s i b l e e n p u l v é r i s a n t u n r é a c t i f s u r la p l a q u e o u e n
e x p o s a n t c e l l e - c i à d e s v a p e u r s de r é a c t i f . O n p e u t c i t e r c o m m e e x e m p l e de
c e t t e p r o d u c t i o n d ' u n d é r i v é la t e c h n i q u e de p u l v é r i s a t i o n u t i l i s é e p o u r
r e n d r e v i s i b l e la s t é r i g m a t o c y s t i n e , u n e t o x i n e p a r f o i s p r é s e n t e d a n s les
c é r é a l e s ( S c o t t ) e t d a n s le f r o m a g e ( N o r t h o l t , 1 9 8 0 ) . S t a c k ( 1 9 7 1 ) a d é c o u v e r t
q u e la p u l v é r i s a t i o n d ' u n e s o l u t i o n de A 1 C 1 3 c o n d u i t à u n c o m p l e x e A l a v e c les
g r o u p e m e n t s c é t o e t h y d r o x y l e de la m o l é c u l e de s t é r i g m a t o c y s t i n e ( f i g u r e 1 ) ,
ce q u i a c c e n t u e e n v i r o n c e n t f o i s l ' i n t e n s i t é de la f l u o r e s c e n c e . D ' a u t r e
p a r t , la c o u l e u r de la f l u o r e s c e n c e v i r e d u r o u g e b r i q u e a u j a u n e . U n e a u t r e
a p p l i c a t i o n d u r é a c t i f A 1 C 1 3 e s t i n c l u s e d a n s la p r o c é d u r e de d o s a g e d u
d é o x y n i v a l é n o l ( D O N ) ( f i g u r e 1 ) , o ù l ' o n u t i l i s e d e s p l a q u e s a u g e l de s i l i c e
i m p r é g n é e s d e A 1 C 1 3 ( T r u c k s e s s , 1 9 8 4 ) . U n e f o i s c h a u f f é e la p l a q u e de
c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e d é v e l o p p é e , le D O N a p p a r a î t s o u s é c l a i r a g e
u l t r a v i o l e t à g r a n d e l o n g u e u r d ' o n d e s s o u s la f o r m e d ' u n e t a c h e de
fluorescence bleue.

M a l g r é t o u t e s les t e c h n i q u e s d ' é p u r a t i o n a u x q u e l l e s o n a r e c o u r s , il
subsiste des substances qui se comportent pendant la séparation
c h r o m a t o g r a p h i q u e e n c o u c h e m i n c e de la m ê m e f a ç o n q u e la m y c o t o x i n e q u ' o n
c h e r c h e à d o s e r . P o u r r é d u i r e a u m i n i m u m le r i s q u e de r é s u l t a t s f a u s s e m e n t
p o s i t i f s , il f a u t c o n f i r m e r l ' i d e n t i t é de la m y c o t o x i n e d a n s les é c h a n t i l l o n s
p o s i t i f s , surtout quand l'opérateur n'a pas une grande expérience du titrage
d e s m y c o t o x i n e s . L a m é t h o d e la p l u s f i a b l e à c e t t e f i n e s t la s p e c t r o m é t r i e
de m a s s e à h a u t e r é s o l u t i o n . T o u t e f o i s , la s p e c t r o m é t r i e de m a s s e à h a u t e
r é s o l u t i o n a s s o c i é e à la c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e e s t u n e p r o c é d u r e
a s s e z l o n g u e e t la p l u p a r t d e s l a b o r a t o i r e s d a n s les p a y s e n d é v e l o p p e m e n t n e
s e r o n t p a s d o t é s de ce t y p e d ' é q u i p e m e n t c o m p l e x e . Il l e u r f a u d r a d o n c
a p p l i q u e r d e s t e c h n i q u e s p l u s s i m p l e s . S a n s d o u t e les m o y e n s les p l u s s i m p l e s
de c o n f i r m e r la p r é s e n c e de m y c o t o x i n e s s o n t - i l s l ' u t i l i s a t i o n de s y s t è m e s de
solvants supplémentaires ou l'application d'une chromatographie
s u p p l é m e n t a i r e , l ' o p é r a t i o n de c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e é t a n t a l o r s
r é p é t é e a v e c u n é t a l o n i n t e r n e q u i e s t s u r i m p o s é s u r la t a c h e d ' e x t r a i t a v a n t
le développement de la p l a q u e . A p r è s achèvement de l'opération de
c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e , c e t é t a l o n s u r i m p o s é e t la t a c h e " p r é s u m é e "
de t o x i n e p r o v e n a n t de l ' é c h a n t i l l o n d o i v e n t c o ï n c i d e r . U n e a u t r e p o s s i b i l i t é
c o n s i s t e à p u l v é r i s e r u n r é a c t i f s u r la p l a q u e de c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e
m i n c e d é v e l o p p é e , de s o r t e q u e la c o u l e u r (de f l u o r e s c e n c e ) de la t a c h e de
m y c o t o x i n e c h a n g e . C o m m e e x e m p l e de c e t t e d e r n i è r e p o s s i b i l i t é , o n p e u t c i t e r
l ' é p r e u v e de p u l v é r i s a t i o n a v e c u n e s o l u t i o n d i l u é e d ' a c i d e s u l f u r i q u e ( S m i t h ,
1 9 6 2 ) q u i e n t r a î n e u n c h a n g e m e n t de c o u l e u r de la f l u o r e s c e n c e , les t a c h e s
d ' a f l a t o x i n e v i r a n t d u b l e u a u j a u n e . B i e n q u e les é p r e u v e s d é c r i t e s p l u s
h a u t , s i e l l e s d o n n a i e n t u n r é s u l t a t n é g a t i f , e x c l u r a i e n t la p r é s e n c e de la
m y c o t o x i n e r e c h e r c h é e , c e l l e - c i n e s e r a i t t o u t e f o i s p a s c o n f i r m é e e n c a s de
résultat positif.
37

Orientation 1

• CD

B

B

•B
A
• B

A: extrait de l'échantillon
B: étalon d'aflatoxine O 5 cm

Figure 21. Disposition des taches Figure 22. Séparation d'un extrait
selon un schéma antidiagonal pour la de beurre d'arachides soumis à la
chromatographic en couche mince chromatographie en couche mince
bidimensionnelle (dosage visuel). bidimensionnelle avec utilisation
du schéma de répartition des taches
antidiagonal.

L'identification positive peut être obtenue par formation de dérivés


spécifiques possédant des propriétés chromatographiques modifiées. L'étalon
de mycotoxine et l'échantillon suspect sont tous deux soumis à la même
réaction de dérivation. En conséquence, dans les échantillons positifs on
devrait observer l'apparition d'un dérivé de la mycotoxine identique au dérivé
provenant de l'étalon. Les réactions de confirmation peuvent être effectuées
dans des éprouvettes ou, de préférence, directement sur une plaque de
chromatographie en couche mince, exploitant ainsi le pouvoir de séparation de
la chromatographie en couche mince. Comme exemple de cette dernière technique,
on peut citer la procédure de confirmation adoptée pour la méthode
officiellement préconisée par les Communautés européennes pour le dosage de
l'aflatoxine dans les produits d'alimentation animale et publiée à l'origine
par Verhülsdonk (1977). Cette méthode comporte une procédure dite de
séparation-réaction-séparation (figure 23). On pulvérise de l'acide
chlorhydrique après la première opération de séparation et la réaction a lieu.
On procède ensuite à une deuxième séparation selon la seconde orientation dans
des conditions identiques, après quoi la tache isolée à fluorescence bleue de
l'aflatoxine BZa, un "adduct aqueux" de l'aflatoxine B,, est visible et peut
être identifiée à l'aide d'un étalon d'aflatoxine B, déposé en taches sur la
- 38 -

même plaque et ayant subi la même procédure. D'autres constituants (non soumis
à réaction) sont disposés en diagonale, formant une bissectrice sur la plaque,
du fait que la séparation a été effectuée selon les deux orientations dans des
conditions rigoureusement identiques. La figure 24 illustre le résultat d'une
telle épreuve de confirmation appliquée à un produit d'alimentation animale
contaminé par les aflatoxines B, et G,.

Séparation Réaction Séparation


r
B

A B
• •

A: dépôt des taches de l'échantillon ^ o Produit de réaction spécifique


B: dépôt des taches de l'étalon Zone à pulvériser

Figure 23. Représentation schématique


de l'épreuve de confirmation bidimen-
sionnelle de Verhülsdonk (1977).
t

Figure 24. Résultat de l'épreuve de


confirmation de Verhülsdonk (1977
appliqué à un produit d'alimentation
pour lapins.

Les techniques décrites pour confirmer la présence d'aflatoxine B, sont


également applicables à l'aflatoxine G,, mais non aux aflatoxines B2 et G2 dont
l'anneau furannique terminal est saturé. Une épreuve de confirmation in situ
a aussi été mise au point pour l'aflatoxine M, par Trucksess (1976). Une
réaction est effectuée entre l'acide trifluoroacétique et l'aflatoxine M, sur
la tache d'origine d'une plaque de chromatographie en couche mince avant
développement de la plaque.
39 -

Les méthodes de dérivation in situ sur plaques suivies de la


chromatographie en couche mince des produits de réaction pour déterminer
l'identité des mycotoxines autres que les aflatoxines sont assez rares. Van
Egmond (1980) a décrit une épreuve de confirmation de l'identité de la
stérigmatocystine (voir figure 1) dans un extrait de fromage. Pour cette
épreuve, qui repose sur les principes de la procédure de séparation-réaction-
séparation (voir figure 23), un mélange d'acide trifluoroacétique et de
benzène est pulvérisé sur une plaque de chromatographie en couche mince et,
après la réaction et une seconde opération de développement, le produit de
réaction est rendu visible au moyen d'une pulvérisation de A1C13 (Stack,
1971) . Paulsch (1982) a mis au point une épreuve de confirmation pour
1'ochratoxine A (voir figure 1) dans les rognons de porc en s'inspirant des
découvertes de Kleinau (1981). Les taches d'ochratoxine A séparées après
chromatographie en couche mince bidimensionnelle sont estérifiées sur la
plaque de chromatographie en couche mince au moyen d'un mélange de méthanol
et d'acide sulfurique, après quoi la plaque est développée pour la troisième
fois. L'ester méthylique de 1 'ochratoxine A est visible sous rayonnement
ultraviolet dans les grandes longueurs d'ondes sous forme d'une tache
fluorescente ayant une valeur R, supérieure à celle de 1'ochratoxine A. Comme
1'ochratoxine A, l'ester méthylique change de couleur de fluorescence, virant
du vert au bleu quand on fait passer le pH de la plaque de l'acide à l'alcalin
en l'exposant à-la vapeur d'ammoniac; ce phénomène peut alors être considéré
comme une confirmation d'identité supplémentaire.

Depuis quelques années, la chromatographie en couche mince en tant que


technique utilisable pour séparer les mycotoxines des autres composantes de
la matrice a cédé le pas à la chromatographie liquide sous haute pression et,
dans une moindre mesure, à la chromatographie gaz-liquide (en particulier
pour le dosage des trichothécènes). Un nouveau recul sera probablement
enregistré dans un proche avenir en faveur des titrages immunologiques,
surtout le titrage avec immunoadsorbant lié à une enzyme. Néanmoins, la
chromatographie en couche mince est une technique fiable, relativement simple
et encore souvent utilisée pour le dosage des mycotoxines, surtout dans son
application bidimensionnelle qui offre une bonne résolution et, par
conséquent, des seuils de détection bas. La chromatographie en couche mince
a pour avantages particuliers la possibilité d'effectuer des opérations de
dérivation in situ pour confirmer la présence des mycotoxines, l'aptitude à
garder des plaques en réserve pour interprétation ultérieure et le fait que
l'opérateur a un certain "contact" avec le résultat de la séparation, puisque
l'oeil humain lui-même peut agir comme détecteur. La chromatographie en couche
mince est particulièrement recommandée aux personnes qui n'ont que peu
d'expérience de l'analyse des produits d'alimentation humaine et animale pour
le dosage des mycotoxines et qui ne peuvent pas se permettre d'acheter un
appareillage de haute technicité.

c. Chromatographie liquide sous haute pression

Dans la chromatographie liquide sous haute pression, des particules


d'adsorbant sont fortement comprimées dans un tube (colonne) et la phase
mobile est pompée à travers la colonne sous haute pression. La chromatographie
liquide sous haute pression a commencé à pouvoir être utilisée pour l'analyse
des produits d'alimentation humaine au début des années 1970 et le premier
document décrivant son application pour la recherche sur les mycotoxines date
probablement de 1973 (Seiber, 1973). Après des débuts quelque peu hésitants,
cette technique a revêtu une importance croissante pour le dosage des
- 40 -

mycotoxines, surtout à partir de l'époque où l'on a pu disposer de plusieurs


types de supports et de détecteurs de fluorescence. L'introduction d'auto-
échantillonneurs et de systèmes de recherche des données informatisées a fait
de la chromatographic liquide sous haute pression en principe un outil très
utile pour les analyses de grande envergure.

Lors des premières applications pour le titrage des aflatoxines, on a


utilisé des colonnes de Si02 associées à des phases mobiles contenant du
chloroforme ou du dichlorométhane, le dépistage étant effectué au moyen de
détecteurs ultraviolets (A = 254 nm ou 365 nm) (Seiber, 1973) (Pons, 1976)
(Kmieciak, 1976). Cependant, la détection aux ultraviolets n'est pas très
sélective alors que les seuils de détection obtenus pour les aflatoxines sont
relativement élevés (de l'ordre d'environ 1 à 2 ng pour chaque aflatoxine
(Pons, 1976) ou, exprimés comme seuils de détection limites, environ 50 /ig
d'aflatoxine B, par kilogramme d'arachides (Kmieciak, 1976)). Aussi a-t-on
dans une large mesure renoncé à employer les détecteurs aux ultraviolets pour
le titrage des aflatoxines dès qu'on a pu disposer des détecteurs de
fluorescence plus sélectifs. Au départ, le pouvoir de détection des détecteurs
de fluorescence était également limité parce que les aflatoxines B, et B2 ne
développent pas une forte fluorescence dans les solvants de phase normale et
que les aflatoxines B, et G, n'ont pas une fluorescence marquée dans les
solvants de phase inverse. Par conséquent, les seuils de détection pour ces
aflatoxines ne pouvaient en aucune façon concurrencer ceux qu'on obtenait avec
la chromatographie en couche mince. Des efforts ont été entrepris pour
améliorer l'intensité de la fluorescence des aflatoxines et ils ont abouti
aux quatre principales techniques suivantes:

1) Dans les méthodes d'épreuve de Takahashi (1977) et de Haghighi


(1981), la solution échantillon et la solution témoin sont traitées à l'acide
(acide trifluoroacétique) pour que les aflatoxines B, et G, soient transformées
en leurs hémiacétals respectifs B2a et G2a. Les hémiacétals deviennent
fluorescents aussi fortement que les aflatoxines B2 et G2 dans des solvants de
phase inverse. Cette technique a pour inconvénient qu'elle nécessite une étape
supplémentaire pour la transformation chimique. En outre, on peut se demander
si la transformation a toujours lieu sur le plan quantitatif.

2) Panalaks (1977) et Zimmerli (1977) ont introduit l'emploi de


supports au gel de silice pour la détection fluorimétrique des aflatoxines
dans des solvants de phase normale. A l'état adsorbé, les aflatoxines B, et
B2 développent une fluorescence beaucoup plus intense qu'en solution. Les
seuils de détection ainsi atteints sont du même ordre de grandeur que ceux
qu'on obtient avec la chromatographie en couche mince avec détection de
fluorescence. La durée de vie de la cellule contenant le support peut varier
selon le nombre et l'état des échantillons qui sont injectés. Dans la
pratique, la cellule est contaminée du fait que des dépôts provenant
d'extraits souillés s'accumulent sur le gel de silice à la longue, ce qui
nécessite des changements fréquents. Cet inconvénient restreint l'emploi de
cette technique, surtout quand le détecteur n'a pas de cellule aisément
accessible. Panalaks (1977) a indiqué qu'on pouvait utilement régénérer la
cellule en y pompant un solvant plus polaire, parce qu'ainsi la transparence
du gel de silice était modifiée.

3) Manabe (1978) a introduit une nouvelle phase mobile qui empêchait


l'extinction habituelle des aflatoxines B, et B2. Avec un solvant composé d'un
mélange de toluène, d'acétate d'éthyle, d'acide formique et de méthanol, la
41 -

quantité décelable minimale d'aflatoxine B, serait d'environ 0,3 ng, alors que
l'application de la méthode de Manabe aux produits d'alimentation humaine et
animale a révélé que des quantités des quatre afltoxines B,, B2, G, et G2 de
10 à 20 /¿g/kg étaient encore décelables. Par rapport aux autres techniques
utilisées pour accentuer la fluorescence des aflatoxines B, et B2, les seuils
de détection indiqués par Manabe (1978) ne sont pas très impressionnants;
toutefois, cette technique est la plus facile à appliquer. Elle a pour
inconvénient la décomposition possible des aflatoxines B, et G, sur la colonne
par suite de la présence d'acide dans la phase mobile. Il faut veiller à ne
pas employer de trop grandes quantités d'acide et vérifier avec des témoins
s'il se produit une décomposition dans les conditions de séparation optimales.

4) Davis (1979) a signalé le traitement des aflatoxines B, et G, à


l'iode pour produire des dérivés dotés d'une fluorescence plus intense. Davis
a appliqué cette découverte à la chromatographie liquide sous haute pression
de phase inverse (1980) et cette application a été encore affinée par Thorpe
(1982) qui a décrit la dérivation en aval de la colonne pour la détection des
aflatoxines par chromatographie liquide sous haute pression de phase inverse.
L'addition d'iode accroit d'environ 50 fois la fluorescence des aflatoxines
B, et G, sans modifier la fluorescence des aflatoxines B2 et G2. Cette méthode
a pour avantage que le dérivé se forme à partir d'un pic d'aflatoxine déjà
séparée, ce qui signifie que les conditions de réaction pour l'échantillon et
pour le témoin sont les mêmes, l'apparition de produits de réaction multiples
n'étant pas importante tant que la réaction est renouvelable. Comme autres
avantages il convient de mentionner qu'il est seulement nécessaire de dériver
la fraction de l'échantillon à injecter dans le dispositif de chromatographie
liquide et qu'il est possible de pratiquer des injections consécutives dans
l'appareil avec ou sans addition de réactif en aval, ce qui confirme la
présence ou l'absence des aflatoxines B, et G,. Cette méthode s'est révélée
satisfaisante pour l'analyse d'échantillons de maïs et de beurre de cacahuètes
(contaminés à des niveaux variant de 0,5 à 2,0 /¿g/kg) et, par ailleurs, on a
mis au point des méthodes qui permettent de doser les aflatoxines dans des
aliments composés pour animaux contenant des agrumes à raison d'environ
1 /¿g/kg (Tuinstra, 1983) (van Egmond, 1987b). La pulpe d'agrumes est un
ingrédient très apprécié en Europe pour les produits d'alimentation animale
et elle perturbe notoirement nombre d'opérations de chromatographie en couche
mince et de chromatographie liquide sous haute pression. Aussi la méthode de
van Egmond (1987b) est-elle actuellement envisagée pour une étude concertée
de la Communauté européenne en vue de son adoption comme méthode officielle
de la Communauté. La figure 25 montre un chromatogramme obtenu par
chromatographie liquide sous haute pression de phase inverse, à parti d'un
extrait de produit d'alimentation animale contenant de la pulpe d'agrumes
préparé selon cette méthode.

Les méthodes de chromatographie liquide sous haute pression sont


désormais applicables aussi à l'analyse du lait et des produits laitiers pour
la détection de l'aflatoxine M! (voir figure 1). La plupart de ces méthodes
font appel à la chromatographie liquide sous haute pression de phase inverse,
ce qui n'entraine aucun problème du point de vue de la détection. L'aflatoxine
M, produit une fluorescence beaucoup plus intense dans les solvants de phase
inverse que l'aflatoxine B,, de sorte qu'aucune disposition particulière en
matière de dérivation ne s'impose. Les seuils de détection sont comparables
à ceux qu'on obtient avec la chromatographie en couche mince
(bidimensionnelle) et certaines de ces méthodes sont déjà largement utilisées
dans les programmes de surveillance. La figure 26 montre à titre d'exemple une
- 42

excellente séparation par chromatographic liquide sous haute pression d'un


extrait de lait en poudre préparé selon la méthode de Stubblefield (1979a).
Outre les aflatoxines, des méthodes de séparation par chromatographie liquide
sous haute pression ont également été mises au point pour d'autres
mycotoxines. La plupart de ces méthodes font appel à la détection aux
ultraviolets; toutefois, pour diverses mycotoxines (à savoir 1'ochratoxine A,
la zéaralénone, quelques alcaloïdes de l'ergot et quelques toxines
d'Alternaría). les détecteurs de fluorescence se sont révélés utiles. Il n'y
a pas lieu de passer en revue ici toutes les méthodes existantes qui ont fait
l'objet de publications; les personnes que la question intéresse pourront se
reporter à une étude complète de Scott (1981) contenant de nombreuses
précisions techniques.

La chromatographie liquide sous haute pression a remplacé en partie la


chromatographie en couche mince pour l'analyse des produits d'alimentation
humaine en vue de la détection des mycotoxines. Les raisons sont évidentes.
La séparation ne prend que quelques minutes, les méthodes de chromatographie
liquide sous haute pression fournissent généralement des données chiffrées
satisfaisantes et le matériel employé dans ces systèmes peut être automatisé
très facilement, ce qui rend cette technique attrayante pour les laboratoires
procédant à des épreuves systématiques et pour les laboratoires de contrôle
de la qualité.

La chromatographie liquide sous haute pression comporte aussi des


limitations. Bien que le pouvoir de résolution soit bien meilleur qu'avec la
chromatographie en couche mince unidimensionnelle, l'utilisation de la méthode
bidimensionnelle n'est guère possible avec la chromatographie liquide sous
haute pression. Or, c'est précisément cette dernière technique qui s'est
révélée être un puissant instrument de séparation lorsqu'elle est appliquée
avec la chromatographie en couche mince, surtout quand des seuils de détection
bas sont nécessaires pour des extraits d'échantillons "souillés". Le coût du
matériel pour la chromatographie en couche mince (hormis les densimètres) est
relativement peu élevé par rapport à celui des instruments très onéreux
nécessaires pour la chromatographie liquide sous haute pression. La vaste
expérience requise pour profiter au maximum d'un système de chromatographie
liquide sous haute pression constitue un autre obstacle, alors qu'on peut
apprendre assez facilement à utiliser la chromatographie en couche mince. Les
quelques études dont les résultats ont été publiés et qui comparent la
chromatographie liquide sous haute pression à la chromatographie en couche
mince pour le dosage des aflatoxines dans les arachides (Crosby, 1978) et dans
le maïs et les arachides (De Vries, 1982) ont indiqué que les deux techniques
fournissent des résultats qui concordent d'une manière assez satisfaisante.
Dans les pays en développement, il ne faut pas renoncer à la légère à la
simplicité et au bas prix de la chromatographie en couche mince en faveur de
la chromatographie liquide sous haute pression qui parait plus séduisante. Il
faut garder présent à l'esprit que les systèmes de haute technicité comportent
des points faibles s'il est difficile d'obtenir des fournitures, des pièces
de rechange et des services, comme cela peut être le cas dans beaucoup de pays
en développement, si bien que le choix ne doit pas se porter en premier lieu
sur la chromatographie liquide sous haute pression lorsqu'on se prépare dans
ces pays à mettre en place un système de surveillance et de contrôle des
mycotoxines dans les denrées agricoles. Il faut veiller à ne pas choisir au
hasard une technique complexe par simple amour de la haute technicité!
- 43 -

O 5 10 15 20

>. min.
Figure 25. Chromatogramme (chromatographie liquide sous haute pression de
phase inverse) C18 d'un extrait de produit d'alimentation animale contenant de
la pulpe d'agrumes et contaminé par les aflatoxines B,, B2 , G, et G2 à raison
d'environ 12, 3, 8 et 1 pg/kg respectivement, préparé selon van Egmond
(1987) .

Pic M

0 5 10
Durée de rétention (min.)

Figure 26. Chromatogramme (chromatographie liquide sous haute pression de


phase inverse) C18 d'un extrait de lait en poudre contenant environ 0,4 ¡ug
d'aflatoxine M,/kg, préparé selon Stubblefield (1979) (reproduit avec
l'aimable autorisation du Dr Mulders, Pays-Bas).
- 44 -

d. Chromatographie en phase gazeuse

Dans la chromatographie en phase gazeuse, la phase mobile est un gaz


porteur, acheminé à travers une colonne contenant un adsorbant solide ou une
phase fixe liquide. La chromatographie en phase gazeuse n'a connu qu'un emploi
limité pour l'analyse des mycotoxines car la plupart de celles-ci ne sont pas
volatiles et doivent donc être dérivées avant de pouvoir faire l'objet d'une
chromatographie en phase gazeuse. De plus, le fait que beaucoup des
mycotoxines sont aisément décelées et dosées à de faibles concentrations avec
les techniques de chromatographie en couche mince et de chromatographie
liquide sous haute pression, ainsi qu'il a été exposé dans les paragraphes qui
précèdent, n'a guère stimulé le développement des titrages par chromatographie
en phase gazeuse.

Bien que quelques méthodes de chromatographie en phase gazeuse aient été


mises au point dans les années 1970 pour la détection et le dosage de la
patuline (voir figure 1) dans le jus de pomme (Pohland, 1970), de l'acide
pénicillique dans le maïs et dans le riz (Pero, 1972) et de la zéaralénone
dans le maïs (Mirocha, 1974), le seul avantage appréciable par rapport à la
chromatographie en couche mince et à la chromatographie liquide sous haute
pression est la possibilité d'utiliser des spectromètres de masse comme
détecteurs hautement sélectifs et sensibles. Toutefois, la situation est tout
autre pour un groupe important de mycotoxines, les trichothécènes, dont font
partie la toxine T-2 et le déoxynivalénol (voir figure 1). L'emploi de la
chromatographie en couche mince et de la chromatographie liquide sous haute
pression est difficile pour le dosage chimique des trichothécènes parce que
ces composés ne produisent aucune fluorescence, pas plus qu'ils n'absorbent
de façon appréciable les rayons ultraviolets. Bien qu'on ait mis au point des
méthodes de chromatographie en couche mince utilisant des réactifs de
visualisation, les seuils de détection obtenus sont relativement élevés par
rapport à la chromatographie en phase gazeuse. Celle-ci permet de déceler et
de doser la plupart des trichothécènes les plus courants. Les trichothécènes
peuvent être soumis à une chromatographie en phase gazeuse par le biais de
leurs dérivés triméthylsilvyl- (TMS) ou heptafluorobutyryl- (HBF), tandis que
pour la détection il faut s'en remettre à des détecteurs à ionisation de
flamme et à des détecteurs de capture d'électrons. Etant donné que les
trichothécènes ne revêtent qu'une importance mineure dans les pays en
développement, nous n'insisterons pas davantage ici sur les techniques de
chromatographie en phase gazeuse utilisables pour leur dosage. Nous
n'examinerons pas non plus la possibilité d'employer la chromatographie en
phase gazeuse en association avec des spectromètres de masse pour le titrage
quantitatif des mycotoxines dans les denrées agricoles. L'utilisation pratique
de ces systèmes complexes est limitée aux laboratoires qui disposent des
moyens financiers leur permettant d'acheter ces instruments très onéreux
commandés par ordinateur.

Méthodes immunochimiques

Par rapport à la chromatographie, les méthodes immunochimiques reposent


sur des principes tout à fait différents. Elles mettent en jeu une liaison
réversible entre des antigènes (la substance à analyser, par exemple une
mycotoxine) et des anticorps sélectifs, ce qui aboutit à un complexe
spécifique antigène-anticorps. On peut produire des anticorps en immunisant
des animaux d'expérience au moyen d'un immunogène. On peut alors obtenir à
partir de leur sang un immunsérum. Parfois 1'immunogène est identique à
45 -

l'antigène, par exemple pour les protéines ou les polypeptides d'un poids
moléculaire supérieur à 5000 Dalton. En règle générale, les mycotoxines ont
un poids moléculaire trop faible pour produire directement des anticorps quand
elles sont administrées à des animaux. Ces substances qu'on appelle des
haptènes doivent être conjuguées par covalence avec des protéines avant que
l'immunisation puisse se produire. Les anticorps (immunsérums) sont un groupe
de protéines sériques aussi appelées immunoglobulines. La plupart des
immunoglobulines appartiennent à la classe IgG. Du fait qu'il existe pour ces
immunoglobulines des sites de réaction non seulement pour les anticorps mais
aussi pour les déterminants antigéniques, elles peuvent elles-mêmes servir
d'antigènes quand elles sont injectées dans un organisme animal étranger.
Cette possibilité est exploitée dans certains types de titrages immunologiques
(par exemple le titrage avec immunoadsorbant lié à une enzyme opérant par
immuno cap ture, dont il est question plus loin). Il n'entre pas dans les
limites du présent chapitre d'exposer en détail la conjugaison des haptènes
et la production d'anticorps dirigés contre les mycotoxines. Plus important
est de savoir que des immunsérums dirigés contre certaines des mycotoxines
(des aflatoxines en particulier) ont été produits (Chu, 1983). Certains de ces
immunsérums sont aujourd'hui disponibles dans le commerce, quoique le plus
souvent uniquement dans des nécessaires d'épreuve.

Les techniques immunoanalytiques classiques reposent sur l'interaction


(en solution) des antigènes originels et d'anticorps spécifiques, aboutissant
à la précipitation du complexe antigénique. Cette précipitation est fonction
de la concentration d'antigène ou d'anticorps et permet de mesurer des
concentrations antigéniques (en solution) de l'ordre du /i g-mg/ml. Quand
l'antigène est présent en faibles concentrations, comme c'est habituellement
le cas pour les mycotoxines, il faut mettre en compétition l'antigène marqué
avec l'antigène à doser pour mesurer indirectement la formation du complexe.
Le marqueur peut être une enzyme, un radio-isotope ou quelque autre substance
susceptible d'être décelée et mesurée. Pour le dosage des mycotoxines,
l'utilisation des titrages immunologiques a été limitée à ce jour (1987) au
titrage immunoenzymatique et au titrage radio-immunologique.

a. Titrage immunoenzymatique

Dans le titrage immunoenzymatique, la liaison réversible entre antigène


et anticorps joue un rôle primordial, comme c'est le cas pour toutes les
méthodes immunochimiques. On peut mesurer indirectement la formation du
complexe antigène - anticorps en mettant en compétition l'antigène marqué par
une enzyme et l'antigène à doser. La quantité d'enzyme reflète l'importance
du complexe antigène-anticorps. Elle peut être mesurée au moyen d'un support
chromogène. A l'heure actuelle, la plupart des titrages immunoenzymatiques
utilisés pour le dosage des mycotoxines sont du type titrage avec
immunoadsorbant lié à une enzyme (ELISA). Dans la méthode ELISA, l'anticorps
ou l'antigène (conjugué) est immobilisé sur un support solide. On utilise
souvent comme support solide des microplaques ou des barrettes de
microtitrage. Il s'agit de plaques transparentes en polystyrène ou en chlorure
de polyvinyle comportant 96 petites cupules (dans le cas des barrettes: de 8
à 12 cupules) (voir figure 27) . Les plaques et barrettes de microtitrage
présentent plusieurs avantages par rapport aux tubes séparés. Elles sont plus
faciles à manipuler, elles peuvent être lavées et lues plus aisément et elles
conviennent pour de grandes séries d'analyses. On peut fixer d'une manière
assez uniforme et reproductible un anticorps ou un antigène conjugué à une
protéine sur les cupules des plaques ou barrettes de microtitrage. On obtient
- 46 -

••n — ^

> R ^ ^

Figure 27. Plaque et barrette de microtitrage pour


titrage avec immunoadsorbant lié à une enzyme.

KOE + KO
K K t OE :
Produit coloré
K O E + SLJ PP ort

Anticorps spécifique AE
K (fixé à la paroi)
O Antigène
Antigène marqué
par une enzyme (antigène)

Figure 28. Principe du titrage avec immunoadsorbant lié à


une enzyme avec mise en compétition.
- 47

cette fixation en déposant une solution contenant l'anticorps ou l'antigène


conjugué dans les cupules pendant une durée variant de quelques heures à une
journée. La solution est évacuée des cupules creuses après la fixation et la
phase solide est lavée à plusieurs reprises. Les plaques sèches ainsi enduites
peuvent être conservées. Généralement, les nécessaires d'épreuve ELISA vendus
dans le commerce contiennent des plaques et barrettes où l'anticorps ou
l'antigène a déjà été fixé en usine.

Au moment de la rédaction du présent ouvrage (1987) , des descriptions


de méthodes ELISA pour mycotoxines avaient été publiées non seulement pour
1 ' aflatoxine B, (Biermann, 1980a, 1980b), (Pestka, 1981), (Neogen Corporation,
1986), mais aussi pour l'aflatoxine M, (Harder, 1979), (Frémy, 1984),
(Jackman, 1985), (Màrtlbauer, 1985), 1'ochratoxine A (Morgan, 1982), (Lee,
1984), (Morgan, 1986), la stérigmatocystine (Kang, 1984) et la toxine T-2
(Pestka, 1981). L'application de la méthode ELISA pour la détection des
mycotoxines comporte plusieurs variantes: le titrage avec mise en compétition,
le titrage par saturation séquentielle, variante du précédent, et le titrage
par immunocapture (appelé aussi titrage immunométrique). Les principes
régissant ces méthodes sont décrits ci-après d'une manière concise:

Titrage avec mise en compétition (voir figure 28)

On fixe sur une plaque de microtitrage une quantité connue d'anticorps


dirigé contre la mycotoxine recherchée (l'antigène). Après lavage, on ajoute
la solution d'épreuve contenant une quantité inconnue de la mycotoxine,
conjointement avec une quantité connue de mycotoxine marquée par une enzyme.
La mycotoxine marquée et la mycotoxine libre sont en compétition pour se fixer
sur les sites actifs de l'anticorps. Après incubation, on lave de nouveau la
plaque et l'on procède au dosage de l'enzyme capturée en ajoutant un support
chromogène. L'intensité de la couleur qui en résulte peut être mesurée de
façon photométrique, par exemple au moyen d'un lecteur ELISA dans lequel on
peut disposer la plaque de microtitrage. On peut aussi mesurer la couleur ou
l'intensité de couleur de façon visuelle. Plus la concentration du produit de
la réaction enzymatique est faible, plus est faible la quantité d'enzyme liée
et plus est élevée la concentration de mycotoxine dans la prise d'essai.
Normalement, le dosage de la mycotoxine dans la prise d'essai s'effectue au
moyen d'une courbe type. On peut citer comme exemple du titrage avec mise en
compétition la méthode AgriscreenR de la Neogen Corporation (1986) , un
nécessaire vendu dans le commerce pour déceler l'aflatoxine B, dans les
produits d'alimentation humaine et animale (voir aussi section IV.d). Ce
nécessaire d'épreuve comporte des barrettes de microtitrage où l'anticorps est
préfixé en usine.

Titrage de saturation (voir figure 29)

Le titrage de saturation séquentielle est une variante du titrage avec


mise en compétition. On fixe sur une plaque de microtitrage une quantité
connue d'anticorps dirigé contre la mycotoxine recherchée. Après lavage, on
ajoute la solution d'épreuve contenant une quantité inconnue de la mycotoxine.
La mycotoxine à doser réagit avec une partie de l'anticorps fixé. Ensuite, les
anticorps restés libres sont titrés au moyen de la mycotoxine marquée par une
enzyme. La méthode se poursuit ensuite de la même façon que le titrage avec
mise en compétition. On peut citer comme exemple de ce titrage la méthode de
Biermann (1980a,b) pour le dosage de l'aflatoxine B, dans les produits
d'alimentation humaine.
- 48 -

K + 0 KO+ OE KO
K K KOE
+ support
Produit coloré
AE'

K Anticorps spécifique
O (fixé à la paroi)
Antigène (antigène)
O E Antigène marqué
par une enzyme

Figure 29. Principe du titrage avec immunoadsorbant lié


à une enzyme avec titrage de saturation.

Titrage par immunocapture (voir figure 30)

Pour le titrage par immunocapture, on fixe sur la plaque de microtitrage


la mycotoxine et non l'anticorps comme c'est le cas pour le titrage avec mise
en compétition et le titrge de saturation. (Pour que la fixation de la
mycotoxine soit possible, il faut d'abord la conjuguer à une protéine). On
ajoute aux cupules de la plaque de microtitrage où est fixée la mycotoxine la
solution d'épreuve contenant une quantité inconnue de mycotoxine et une
quantité fixe d'anticorps. L'anticorps qui n'a pas réagi avec la mycotoxine
de la solution d'épreuve se fixe sur la surface interne des cupules enduite
de mycotoxine. Cet anticorps capturé est habituellement une immunoglobuline
de lapin. Après incubation et lavage, la plaque est incubée avec un second
anticorps (anti-lapin) marqué par une enzyme. On obtient ainsi une sorte de
cascade: l'anticorps marqué par une enzyme a réagi à l'anticorps
antimycotoxine qui, à son tour, s'est lié à la mycotoxine fixée sur la paroi
de la cupule. Le dosage de l'enzyme capturée est effectué par addition d'un
support chromogène. Plus la concentration du produit de la réaction
enzymatique est faible, plus la concentration de mycotoxine dans la prise
d'essai est élevée. Là encore, on se sert d'une courbe type pour doser la
quantité de mycotoxine dans la solution d'épreuve. L'épreuve ELISA par
immunocapture ne nécessite pas une mycooxine marquée par une enzyme;
toutefois, un conjugé mycotoxine-protéine est nécessaire pour permettre la
fixation aux cupules de la plaque de microtitrage. On trouve dans le commerce
un anticorps anti-lapin marqué par une enzyme. On peut citer comme exemple du
titrage par immunocapture la méthode utilisée par Morgan (1982) pour le dosage
de 1'ochratoxine A (voir figure 1) dans l'orge.
- 49 -

IO + > + ) E ^ l<C>»E
+ support
O Antigène Produit coloré
l O Antigène fixé à la paroi AE
)>-° Anticorps spécifique
Anticorps anti-immunoglobuline
marqué par une enzyme (antigène)

Figure 30. Principe du titrage ELISA par immunocapture.

Outre les nécessaires ELISA disponibles dans le commerce, il existe


désormais un nécessaire de titrage immunoenzymatique pour les aflatoxines, où
l'on utilise des "Quick-CardsR" au lieu de plaques ou de barrettes de
microtitrage (International Diagnostics, 1987). Dans cette méthode "Quick-
Card11", on fixe une quantité connue d'anticorps anti-aflatoxine sur chacune
des deux parties d'une carte en plastique de la taille d'une carte de crédit.
On ajoute une goutte de solution témoin exempte d'aflatoxine à la partie
gauche et une goutte de la solution d'épreuve à la partie droite. On ajoute
de l'aflatoxine marquée par une enzyme aux deux parties de la carte, puis une
solution de support, a mesure que les quantités d'aflatoxine augmentent, la
couleur apparaîtra plus claire. A l'inverse, s'il n'y a pas d'aflatoxine, on
verra se développer une tache de teinte gris-bleu. La solution témoin exempte
d'aflatoxine produira une tache gris-bleu foncé. L'épreuve "Quick-CardR" est
conçue pour déceler des quantités d'aflatoxines B,, B2, G, et M, d'environ 5
ou 10 ^g/kg. Cette méthode donne des résultats rapides et son exécution ne
requiert aucun matériel ni aucune expérience technique. Le coût par analyse
est peu élevé. La méthode n'a pas encore été validée (en 1987) par une étude
concertée. Il est prévu que seront bientôt disponibles aussi dans le commerce
des nécessaires d'épreuve comportant des cartes pour la détection de la
zéaralénone, du déoxynivalénol et de la toxine T-2 (voir figure 1).

En général, les méthodes d'extraction et d'épuration appliquées au


titrage immunoenzymatique pour les mycotoxines sont plus simples que celles
dont on a besoin pour appliquer les techniques chromatographiques. On utilise
souvent un mélange méthanol-eau comme solvant d'extraction pour le titrage
immunoenzymatique de 1'aflatoxine, encore que les extractions au méthanol
soient moins efficaces que le chloroforme pour les aflatoxines (Trinder,
1985). On applique quelquefois une simple étape de délipidation à l'hexane,
mais l'épuration sur colonne n'est généralement pas nécessaire. A la
50 -

différence de nombre des extraits préparés pour les méthodes


chromatographiques, les extraits finals utilisés dans le titrage
i m m u n o e n z y m a t i q u e sont des solutions aqueuses (tamponnées).

A l ' é p o q u e de la rédaction du présent ouvrage (1987), aucune p u b l i c a t i o n


n ' a v a i t e n c o r e r e n d u compte de méthodes ELISA pour les m y c o t o x i n e s validées
p a r des études c o n c e r t é e s . C e p e n d a n t , les résultats (provisoires) de la
p r e m i è r e é t u d e concertée A O A C - U I C P A portant sur une m é t h o d e ELISA (méthode
A g r i s c r e e n p o u r le dosage de l'aflatoxine B, dans certains produits
d ' a l i m e n t a t i o n h u m a i n e et animale) semblent prometteurs (Park, 1 9 8 7 ) .

E n r a i s o n de la simplicité de la méthode ELISA et du grand nombre


d ' é c h a n t i l l o n s qu'elle p e r m e t de traiter en une j o u r n é e , d'où un coût
r e l a t i v e m e n t bas par a n a l y s e , cette technique revêt une importance c r o i s s a n t e .
Les seuils de détection des méthodes ELISA pour les aflatoxines sont
s u f f i s a m m e n t b a s pour p e r m e t t r e le dosage aux niveaux de tolérance (van
E g m o n d , 1987) fixés pour ces s u b s t a n c e s . En r e v a n c h e , avec les méthodes ELISA
o n n o t e u n e plus grande v a r i a t i o n des résultats d'épreuves qu'avec les
m é t h o d e s c h r o m a t o g r a p h i q u e s classiques de sorte qu'une v i g i l a n c e permanente
s ' i m p o s e . B e a u c o u p de m y c o t o x i n e s ont des structures chimiques étroitement
a p p a r e n t é e s et elles sont donc groupées e n s e m b l e , par exemple les a f l a t o x i n e s ,
les o c h r a t o x i n e s et les t r i c h o t h é c è n e s . De ce f a i t , il existe en p r i n c i p e une
p o s s i b i l i t é de réactions croisées entre les anticorps dirigés contre une
c e r t a i n e m y c o t o x i n e et d'autres toxines du même groupe é g a l e m e n t p r é s e n t e s .
Il semble dans la p r a t i q u e que cela se produise lors de certains titrages
d ' a f l a t o x i n e o ù l'anticorps dirigé contre l'aflatoxine B, accuse une certaine
r é a c t i v i t é c r o i s é e avec d'autres a f l a t o x i n e s . Par c o n s é q u e n t , u n résultat
d ' a n a l y s e p o s i t i f ne fournit aucune information sélective quant à la
c o n c e n t r a t i o n des différentes a f l a t o x i n e s . Il y a là une différence avec la
c h r o m a t o g r a p h i e e n couche mince et la chromatographie liquide sous h a u t e
p r e s s i o n , l e s q u e l l e s p e r m e t t e n t de distinguer entre les aflatoxines B,, B 2 , G,
et G 2 p r é s e n t e s à l'état n a t u r e l . On peut s'attendre à ce que les méthodes
E L I S A d e v i e n n e n t très utiles pour le dosage rapide des mycotoxines m a i s , pour
l ' h e u r e , les m é t h o d e s et systèmes ELISA devront encore être soumis à des
é p r e u v e s de v a l i d a t i o n très poussées avant que leurs mérites p u i s s e n t être
pleinement évalués.

b . Titrage radio-immunologique

A v e c le titrage r a d i o - i m m u n o l o g i q u e , on p e u t mesurer la formation du


c o m p l e x e a n t i g è n e - a n t i c o r p s en m e t t a n t un antigène marqué par u n isotope
r a d i o a c t i f en c o m p é t i t i o n avec l'antigène à d o s e r . Le m é c a n i s m e du titrage
r a d i o - i m m u n o l o g i q u e est esquissé sur la figure 3 1 .

La p r i s e d ' e s s a i , c o n t e n a n t une quantité connue d'antigène marqué


(indiqué comme é t a n t actif) et une quantité inconnue d'antigène libre (la
m y c o t o x i n e r e c h e r c h é e ) , est mise en contact avec une quantité fixe
d ' a n t i c r o p s . L ' a n t i g è n e m a r q u é et l'antigène l i b r e , c'est-à-dire n o n m a r q u é ,
s o n t en c o m p é t i t i o n pour se fixer sur les sites actifs de l ' a n t i c o r p s . A u b o u t
d ' u n c e r t a i n t e m p s , l'équilibre est réalisé et il subsistera u n p e u d'antigène
l i b r e , le reste é t a n t lié à l'anticorps. Le taux relatif de liaison de
l ' a n t i g è n e m a r q u é et de l'antigène libre avec l'anticorps dépend du taux
r e l a t i f de c o n c e n t r a t i o n de l'antigène marqué et de l'antigène l i b r e . Plus est
f a i b l e la r a d i o a c t i v i t é du complexe a n t i g è n e - a n t i c o r p s . Après séparation du
- 51 -

complexe antigène-anticorps et de la fraction libre, on mesure la


radioactivité du complexe dans un compteur à scintillation. Cette
radioactivité est fonction de la quantité d'antigène libre (la mycotoxine
recherchée) dans la prise d'essai. Normalement, on évalue au moyen d'une
courbe type la quantité de mycotoxine dans un échantillon inconnu.

100% actif
• • • • • • + I I I
100% actif
I I I SWT
50% actif
f 91 50% actif
•oo««o + II I
ottoo* irâr
33% actif
oootot II I 9f 9
ottooo + 33% actif
•ooo«o "5751r
17% actif
O•OOOO
•ooooo 999
ootooo , 17% actif
oooo«o T II 1
ooo*oo
ooooo*
Complexe Anticorps Antigène contenant
antigène-anticorps la prise d'essai

# Antigène marqué
O Antigène libre

Figure 31. Mécanisme du titrage radio-immunologique.

Il n'existe que peu de publications consacrées à l'emploi du titrage


radio-immunologique pour la détection des mycotoxines, à savoir une méthode
pour le dosage de l'aflatoxine B, (Langone, 1976) et une méthode pour le
dosage de la toxine T-2 (Lee, 1981). Cela s'explique probablement par le fait
que l'application du titrage radio-immunologique oblige les laboratoires à
opérer avec de faibles concentrations de substances radioactives.
L'application du titrage immunologique présente donc quelques inconvénients
tels que la durée d'activité réduite des isotopes radioactifs, les problèmes
liés à l'élimination des déchets radioactifs ou à la délivrance des
autorisations requises, et la nécessité de disposer d'un coûteux compteur à
scintillation. La méthode ELISA, au contraire, peut être appliquée presque
partout. Cet avantage, joint au fait que le seuil de détection est plus bas
avec la méthode ELISA (Chu, 1984), a stimulé le développement des épreuves
- 52 -

ELISA pour les mycotoxines au détriment du titrage radio-immunologique dans


les années 1980. Aussi ne sera-t-il plus question des techniques de titrage
radio-immunologique dans la présente section.

Conclusion

L'état actuel de la méthodologie pour le dosage des mycotoxines dans les


produits d'alimentation humaine et animale peut se résumer ainsi:

1. Les méthodes de titrage biologique peuvent être utiles pour découvrir


les sources de mycotoxines connues et inconnues, toutefois, leur
emploi pour déceler la présence de mycotoxines dans les produits
d'alimentation humaine et animale ne revêt qu'une importance mineure.

2. Les titrages chimiques sont d'une grande importance pour le dosage


des mycotoxines. Les techniques le plus employées sont celles qui
comportent une étape chromatographique pour séparer la mycotoxine
recherchée des autres constituants de la matrice.

3. Les méthodes de chromatographie sur minicolonne sont utiles comme


épreuves de vérification des denrées agricoles quand il est
nécessaire de décider rapidement s'il faut accepter ou rejeter un
lot. Elles ont été mises au point principalement pour les
aflatoxines.

4. Bien qu'étant l'une des plus anciennes méthodes employées pour les
mycotoxines, la chromatographie en couche mince est une technique de
séparation fiable, aisément réalisable et relativement simple,
offrant un large chanmp d'application. C'est la technique de choix
pour les pays en développement. Son application bidimensionnelle
offre une résolution particulièrement bonne, d'où un seuil de
détection assez bas.

5. La chromatographie liquide sous haute pression peut remplacer


avantageusement la chromatographie en couche mince. Cette technique
plus onéreuse offre la possibilité d'automatiser les dernières étapes
de séparation et de dosage. Cependant, si l'obtention des services,
des pièces de rechange et des fournitures requis pose un problème,
ce qui peut être le cas dans beaucoup de pays en développement, il
faut accorder la préférence à la chromatographie en couche mince.

6. L'utilisation de la chromatographie en phase gazeuse est surtout


limitée à l'analyse des denrées agricoles pour déceler les
trichothécènes. Etant donné que ceux-ci ne revêtent qu'une importance
mineure dans les pays en développement et que la chromatographie en
phase gazeuse peut poser les mêmes problèmes que la chromatographie
liquide sous haute pression, cette méthode présente peu d'intérêt.

7. Le titrage avec immunoadsorbant lié à une enzyme (ELISA) est une


technique prometteuse qui peut être appliquée presque partout, bien
que la méthode ELISA soit encore récente, on peut s'attendre à ce
qu'elle joue un rôle important dans la détection des mycotoxines.
- 53 -

8. Le titrage radio - immu.nologique ne sera probablement pas une technique


importante pour le dosage des mycotoxines en raison des inconvénients
que présente le travail avec des substances radioactives.

Le tableau 3 contient une comparaison de quelques-unes des


caractéristiques des diverses catégories de méthodes qui ont été passées en
revue. Il ne faut pas perdre de vue que la classification de ces catégories
est une question assez subjective: influencée par l'expérience personnelle,
les opinions et les préférences de chacun, elle est donc sujette à
controverse.

Tableau 3

Comparaison de quelques caractéristiques de diverses catégories de


méthodes pour le dosage des mycotoxines dans les produits alimentaires

Catégorie Champ Fiabilité Seuil de Coût du Possibilité


d'appli- détection matériel d'automa-
cation tisation

Titrage
biologique Limité Faible Elevé Faible Non

Minicolonne Limité Modérée Modéré Faible Non

Chromatographie
en couche
mince Large Elevée Faible Faible Non

Chromatographie
liquide sous Partiel-
haute pression Large Elevée Faible Elevé lement

Chromatographie
en phase Partiel-
gazeuse Limité Elevée Faible Elevé lement

Titrage radio-
immunologique Limité * Faible Elevé Oui

ELISA Limité * Faible Bas Oui

* Inconnue actuellement.
- 54 -

7. Caractéristiques

Les méthodes d'analyse présentent des caractéristiques scientifiques et


pratiques. Les caractéristiques scientifiques déterminent la fiabilité des
données d'analyse et les caractéristiques pratiques déterminent l'utilité de
la méthode. C'est le but que s'est fixé l'analyste qui déterminera lequel de
ces aspects mérite qu'on lui accorde le plus d'attention. Aux fins de la
recherche et pour les activités visant à détrminer la conformité avec la
réglementation, il peut être important de déterminer le mieux possible la
valeur exacte, les aspects pratiques ne présentant dès lors qu'un intérêt
secondaire. On peut aussi concevoir une situation où il faut sacrifier
l'élégance scientifique au côté pratique, par exemple quand des épreuves
rapides "tout ou rien" sont requises sur le terrain pour permettre de vite
décider s'il convient d'accepter ou de rejeter un lot. Les caractéristiques
scientifiques des méthodes d'analyse sont la précision, l'exactitude, le seuil
de détection, la sensibilité et la spécificité; parmi les caractéristiques
pratiques figurent l'applicabilité, le coût d'exécution, la durée et le
matériel requis et le niveau de formation nécessaire. Les propriétés des
méthodes d'analyse sont parfois appelées "caractéristiques" ou "avantages
respectifs". Il ressort clairement de la littérature que les caractéristiques
scientifiques d'une méthode sont souvent l'objet de nombreux malentendus et
d'interprétations inexactes. Aussi ne semble-t-il pas inutile de définir ces
termes.

Sensibilité

Une analyse quantitative n'est possible que si l'on détermine la


relation entre la mesure x et la concentration c de la substance à doser
(c'est-à-dire le constituant recherché, par exemple 1'aflatoxine). Cette
relation est établie par une série de mesures d'étalonnage qui produisent la
fonction d'étalonnage x = f(c); la représentation graphique est appelée courbe
d'étalonnage analytique (figure 32). A chaque point de cette courbe, la
sensibilité peut être définie comme étant m = dx/dc, c'est-à-dire la pente de
la courbe d'étalonnage (Kaiser, 1972); en d'autres termes, c'est le changement
de signal analytique par rapport à la concentration par unité. C'est la valeur
que nous devons connaitre pour doser la substance analysée en fonction d'un
certain signal analytique. Les spécialistes de l'analyse chimique supposent
souvent à l'avance que la sensibilité à l'égard de la substance à analyser
dans l'extrait final de l'échantillon équivaut à la sensibilité de la
substance telle qu'elle est présente dans une solution type simple. Or, cette
hypothèse n'est pas toujours fondée et il faut au moins la vérifier. Des
effets dus à la matrice peuvent donner lieu à un étalonnage incorrect de
l'étape de dosage de la méthode d'analyse et, partant, à des estimations trop
élevées ou trop faibles de la substance à analyser.

L'unité où la sensiblité est mesurée c'est le quotient des unités pour


la mesure x et pour la concentration c. Il faut bien noter que la sensibilité
n'est pas une concentration, pas plus qu'elle n'indique la plus faible
différence entre des concentrations qui puisse être distinguée selon une
méthode déterminée. C'est là une question statistique sur laquelle nous
reviendrons dans le paragraphe intitulé "Précision".
55 -

Cu —-c

Figure 32. Courbe d'étalonnage analytique du signal x


par rapport à la concentration C.

Il ne faut pas confondre la sensibilité avec le "seuil de détection".


La relation entre sensibilité et seuil de détection sera examinée dans le
paragraphe intitulé "Seuil de détection".

Spécificité

Une méthode d'analyse est dite "pleinement spécifique" quand elle


fournit un signal analytique uniquement pour un constituant particulier, mais
est "inerte" pour tous les autres constituants qui peuvent aussi être présents
dans l'échantillon (Kaiser, 1972). Une méthode pleinement spécifique a une
probabilité nulle de réactions faussement positives. Souvent, les méthodes
d'analyse classiques pour mycotoxines faisant appel à la chromatographie en
couche mince et à la chromatographie liquide sous haute pression comme
techniques pour séparer les mycotoxines des autres constituants de la matrice
présents dans l'extrait final ne sont pas pleinement spécifiques puisque
d'autres substances se comportant de la même façon que ces mycotoxines peuvent
être présentes, même si l'on a recours à la chromatographie bidimensionnelle
en couche mince, technique de séparation puissante (voir III.6). Pour réduire
au minimum le risque de résultats faussement positifs, il faut confirmer
l'identité de la mycotoxine dans les échantillons positifs. Les méthodes
d'analyse chromatographique ont atteint un degré de spécificité satisfaisant
grâce à l'incorporation de plusieurs épreuves de confirmation faciles à
exécuter, par exemple la formation de dérivés in situ sur les plaques de
chromatographie en couche mince ou la dérivation en aval de la colonne dans
- 56 -

les systèmes de chromatographic liquide sous haute pression. Les titrages


immurtologiques pour le dosage des mycotoxines comme la méthode ELISA peuvent
être tout à fait spécifiques, surtout depuis qu'on utilise les anticorps
monoclonaux.

Précision

La précision est fonction de la variabilité. Elle concerne la dispersion


inévitable des résultats obtenus par appliction répétée d'une méthode
d'analyse soit dans le même laboratoire, soit dans des laboratoires
différents. On décrit couramment la précision en fonction de l'écart-type ou
de l'écart-type relatif (= écart-type/moyenne = coefficient de variation (CV))
d'une série de résultats successifs. Si les mesures sont normales, les deux
tiers environ d'entre elles seront en-deçà d'un écart-type de part et d'autre
de la moyenne et environ 95% d'entre elles seront en-deçà de deux écarts-
types de part et d'autre de la moyenne. La précision peut être en rapport avec
le degré d'erreur d'une méthode dans un laboratoire donné, c'est-à-dire la
répétabilité, ou avec le degré d'erreur d'une méthode entre laboratoires,
c'est-à-dire la reproductibilité (Organisation internationale de
normalisation, 1981). La répétabilité (r) peut être définie comme étant la
valeur en-deçà de laquelle on peut s'attendre à ce que se situe avec un degré
de probabilité spécifié la différence absolue entre deux résultats d'épreuve
unique obtenus par application de la même méthode à des substances identiques
dans les mêmes conditions (même opérateur, mêmes instruments, même laboratoire
et intervalles de brève durée). En l'absence de toute autre indication, la
probabilité est de 95%. Mathématiquement, la répétabilité r = 2,83 s, où s -
écart-type des résultats d'épreuve. On peut définir la reproductibilité (R)
comme étant la valeur de-deçà de laquelle on peut s'attendre à ce que se situe
avec un degré de probabilité spécifié la différence absolue entre deux
résultats d'épreuve unique obtenus par application de la même méthode à des
substances identiques mais dans des conditions différentes (opérateurs
différents, instruments différents, laboratoires différents et/ou durées
différentes). En l'absence de toute autre indication, la probabilité est de
95%. Mathématiquement, la reproductibilité R = 2,83 s, où s = écart-type des
résultats d'épreuve. La répétabilité et la reproductibilité d'une méthode
peuvent être appliquées de diverses manières. Elles peuvent servir:

à vérifier si la technique expérimentale d'un laboratoire est bien


conforme aux normes ;
à comparer avec une spécification les épreuves effectuées sur un
échantillon provenant d'un lot;
à comparer les résultats d'épreuves obtenus par différents
laboratoires.

Il faut obtenir des informations sur la précision d'une méthode


(détermination de la répétabilité et de la reproductibilité) en l'essayant
dans le cadre d'une étude concertée interlaboratoires (expérience de
précision) conçue selon des directives reconnues (ISO, AOAC). Dans le cas des
titrages de 1'aflatoxine, de nombreuses études concertées ont été consacrées
à des méthodes faisant appel à la chromatographie en couche mince, de sorte
qu'on a pu obtenir un assez bon aperçu de la précision de ces méthodes.
Jusqu'à présent (1987), seules quelques études concertées ont été consacrées
aux méthodes utilisant la chromatographie liquide sous haute pression pour le
dosage des aflatoxines et il n'existe qu'une seule étude sur l'emploi de la
- 57

méthode ELISA pour l'aflatoxine B,. Très intéressants sont les résultats d'une
étude rétrospective d'Horwitz (1980, 1981) qui a étudié les données en matière
de précision tirées d'environ 200 études concertées menées sous les auspices
de l'AOAC, dont plusieurs portant sur les aflatoxines. Il a pu en tirer deux
conclusions remarquables qui sont également applicables au titrage des
afltoxines (chromatographie en couche mince): 1) la précision
interlaboratoires (reproductibilité) semble être fonction de la concentration
(figure 33) et semble être indépendante de la nature de la substance à
analyser ou de la technique de mesure adoptée.

Conc. (en ng/kg)

Figure 33. Coefficient de variation interlaboratoires


en fonction de la concentration.

En règle générale, cette précision peut être représentée par l'équation


suivante: CV (%) = 2(1"°-slogc) où c est la concentration exprimée en puissances
de 10 (par exemple 1 ppm = 10"6) . 2) le rapport répétabilité/reproductibilité
se situe prncipalement entre 0,5 et 0,7. Un rapport inférieur à 0,5 dénote une
méthode très personnelle; les analystes peuvent très bien vérifier leur propre
travail, mais ils ne peuvent pas vérifier celui de leurs homologues d'autres
laboratoires. Cet état de choses donne à penser qu'il faut revoir les
instructions ou que les étalons diffèrent peut-être d'un laboratoire à
l'autre. Un rapport supérieur à 0,7 peut être l'indication que les répétitions
effectuées par un analyste individuel sont tellement médiocres qu'elles
éliminent l'élément interlaboratoires.
58 -

Ces conclusions ont une grande importance sur le plan pratique. Elles
signifient qu'à un niveau d'environ 10 ng/kg, niveau de contamination "normal"
pour l'aflatoxine B,, on peut s'attendre à un CV d'environ 20% dans un
laboratoire donné et à un CV interlaboratoires d'environ 32%. En outre, à un
niveau de 0,1 /¿g/kg, niveau de contamination "normal" pour l'aflatoxine M,,
on peut s'attendre à un CV dans un laboratoire donné d'environ 40% et à un
CV interlaboratoires d'environ 64%.

Seuil de détection

On entend par seuil de détection d'une méthode le niveau de


concentration le plus bas qui puisse être déterminé comme étant
statistiquement différent d'un dosage à blanc. Bien que cette définition
paraisse assez nette, l'expression de ces valeurs a soulevé des problèmes non
négligeables en raison des diverses interprétations du terme "statistiquement
différent".

L'UICPA précise que le seuil de détection, exprimé sous forme de


concentration CL, correspond à la plus petite mesure X L qu'une méthode
d'analyse donnée permette d'effectuer avec un degré de certitude raisonnable
(voir figure 34) (Kaiser, 1972; Long 1983).

*B X,

C, c,

Figure 34. Courbe de distribution normale pour une


variable x mesurée.
59

Mathématiquement x L = x B + 3sB (1), où x"B et s B sont respectivement une


estimation de la valeur moyenne des résultats à blanc et une estimation de
l'écart-type des résultats à blanc. En fin de compte, la concentration
significative la plus faible C L nous intéresse davantage que la mesure X L . Si
X L est connue, C L peut être déterminée directement par le biais de la courbe
d'étalonnage en chaque point de laquelle la sensbilité m est définie comme
étant m = dx/dc (2) (voir Sensibilité). En substituant l'équation (2) à
l'équation (1), la relation entre sensibilité et seuil de détection apparait
clairement :

m — dx/dc —• de = dx/m

C L - C0 - (XL - x B )/m

CL = 3s B /m

Au voisinage du seuil de détection, tous les dosages quantitatifs d'une


substance sont assez imprécis. Il est raisonnable de fixer un critère minimal
pour les dosages quantitatifs à quelque distance du seuil de détection. Il
n'existe pas encore de définition de ce seuil de dosage, mais le Sous-Comité
de l'ACS sur la chimie analytique environnementale a proposé de fixer le seuil
de dosage à 10sB de x B (ACS, 1980). Dès lors, les échantillons qui sont
mesurés comme ayant un signal x > à 10sB sont considérés comme étant dans les
limites de la zone de dosage, tandis que les échantillons où 3sB < x < 10sB
sont considérés comme étant dans la zone de détection (figure 35).

10SB
3Sb _ ,
i
\ i
\ i
\ i
\ i
\ i
\i
\i

Substance à analyser non décelée , Zone de détection i Zone de dosage

Figure 35. Zones de mesure de la substance à analyser.


- 60 -

Quand on applique des techniques de chromatographie en couche mince avec


une simple estimation visuelle, comme ce sera souvent le cas dans la plupart
des pays en développement, il n'est pas possible de déterminer le seuil de
détection selon cette méthode. En pareil cas, certains auteurs font
correspondre leur seuil de détection signalé à la quantité de mycotoxine la
plus faible qui soit visible sur une plaque de chromatographie en couche
mince, ce qui signifie le seuil à partir duquel, dans 50% des cas, la
mycotoxine (ne) sera (pas) observée. D'autres établissent leur seuil de
détection uniquement avec des étalons ou avec des "matrices faciles" qui ne
provoquent aucune gêne sérieuse dans l'étape de détection, alors que le seuil
de détection peut dépendre dans une large mesure de la matrice à l'étude.
Parmi d'autres complications figurent les différences d'intensité entre les
divers types de lampes à ultraviolets et (dans le cas des techniques avec
instruments) les différences de sensibilité des divers détecteurs utilisés
avec la chromatographie liquide sous haute pression. A cause de tout cela, il
est souvent difficile de procéder à une comparaison objective des seuils de
détection signalés avec diverses méthodes, de sorte que les données
communiquées ne fournissent que des indictions grossières.

Exactitude

L'exactitude (ou erreur systématique) est fonction de l'écart


systématique par rapport à la valeur réelle. Plus la partie systématique de
l'erreur expérimentale est faible, plus l'exactitude de la méthode est grande.
L'exactitude d'une méthode est habituellement exprimée en pourcentage de
récupération. Théoriquement, la récupération d'une méthode peut ne jamais être
supérieure à 100% puisqu'une partie de la substance à analyser est toujours
perdue au cours de l'analyse, si bien que l'erreur systématique est orientée
de façon négative. Dans la pratique, des récupérations de 70 à 80% sont
courantes avec l'analyse des mycotoxines; toutefois, la récupération dépasse
parfois 100%, probablement par suite d'interférences persistantes.

Pour déterminer l'exactitude, il faut procéder à un grand nombre


d'analyses afin d'atténuer la partie aléatoire de l'erreur expérimentale. Les
données relatives à l'exactitude des méthodes d'analyse doivent être tirées
d'études concertées grâce au calcul de la récupération moyenne de quantités
connues de substance ajoutée ayant subi tous les stades du processus. Le point
faible de cette épreuve est qu'elle n'est applicable que si l'on ajoute des
composés "purs". Dans le cas des mycotoxines, qui sont des composés présents
à l'état naturel, nous devons supposer que la fraction récupérée de la
mycotoxine présente à l'origine dans l'échantillon équivaut à celle de la
mycotoxine ajoutée. En fait, nous ignorons si la totalité de la mycotoxine
naturelle se prête à une extraction au moyen de nos solvants initiaux. Le
problème serait surmonté en partie si l'on pouvait disposer de substances de
référence homologuées dans lesquelles les mycotoxines seraient présentes "à
l'état naturel" (voir Assurance de la qualité). En tout état de cause,
l'exactitude de la méthode peut être calculée alors à l'aide d'une "valeur
vraie" convenue par homologation. Là encore, l'application pratique est plus
difficile parce que de telles substances de référence homologuées pour le
dosage des mycotoxines n'en sont encore qu'au stade de la mise au point.
- 61 -

8. Assurance de la qualité

Beaucoup de laboratoires effectuent un grand nombre de dosages


d'aflatoxines et d'autres mycotoxines et se flattent de leur expérience et de
leur fiabilité. Nous pouvons dès lors nous demander pourquoi des laboratoires
trouvent si souvent des valeurs tellement différentes, même avec des
échantillons qui ont fait l'objet d'une homogénéisation particulière en vue
d'études concertées. De plus, ceux qui doivent faire face aux dépenses
qu'entraînent ces déterminations souvent très coûteuses peuvent se demander
à quels résultats ils doivent se fier. Les programmes de vérification
d'échantillons organisés pour les mycotoxines par le Centre international de
recherche sur le cancer ont montré qu'une grande variabilité des résultats
doit être considérée comme la norme plutôt que l'exception (Friesen, 1982),
et cela n'est guère réconfortant pour ceux qui doivent payer pour les dosages
ou tabler sur ceux-ci pour des décisions importantes. Toutefois, cet état de
choses ne doit pas être jugé inévitable.

Il a été prouvé qu'en général les analystes sont responsables de la


moitié ou des deux tiers de la variabilité totale d'un système de
détermination analytique. L'homme n'est ni impartial ni objectif; par
conséquent, tout laboratoire opérant dans le domaine de l'analyse des oligo-
éléments doit élaborer un programme d'assurance de la qualité. Un programme
d'assurance de la qualité doit comprendre divers éléments, dont les suivants:

a. Un personnel qualifié; des méthodes consignées par écrit et validées;


un laboratoire bien construit, équipé et entretenu.

b. L'utilisation de verrerie, de solvants et d'autres matériaux


d'épreuve de haute qualité.

c. Vérification fréquente de l'exactitude des déterminations chimiques.

L'existence des deux premiers éléments pourra dépendre du lieu où


l'étude sera effectuée. Il faut prévoir de sérieux problèmes en certains
endroits dans des pays en développement où du matériel supplémentaire et un
appui scientifique seront peut-être nécessaires avant qu'un programme de
surveillance puisse être mis en route. La troisième condition indiquée sera
sans doute difficile à réaliser et à démontrer. Toutefois, il existe plusieurs
mécanismes possibles pour vérifier l'exactitude (Wagstaffe, 1987). Ils sont
récapitulés dans le tableau 4.

Pour que la fiabilité des résultats d'épreuve puisse être vérifiée selon
au moins deux méthodes indépendantes, il faut que celles-ci aient été
utilisées avec succès dans d'autres situations analogues comportant des
analyses (mêmes concentrations, mêmes interférences). On entend par
"indépendantes" des déterminations reposant sur différentes propriétés
physico-chimiques de la substance analysée, par exemple la chromatographie en
couche mince par opposition à la méthode ELISA. Il est très peu probable que
deux méthodes indépendantes puissent accuser une erreur systématique du même
ordre de grandeur et dans le même sens. Par conséquent, quand les résultats
de différentes analyses concordent, il est à peu près certain qu'ils sont
exacts. Les comparaisons faites dans un même laboratoire selon des méthodes
indépendantes sont un précieux élément dans un programme d'assurance de la
qualité.
62 -

Tableau 4

Quelques méthodes pour vérifier/améliorer l'exactitude des


déterminations chimiques (d'après Wagstaffe, 1987)

Méthode Observations

Vérification croisée des résul- Rarement possible dans la plupart


tats à l'intérieur du laboratoire des laboratoires; l'indépendance
par un analyste indépendant totale est difficile à réaliser
appliquant une méthode
parfaitement indépendante

Participation à un programme Pas toujours disponible quand


extérieur d'assurance de la c ' est nécessaire : la valeur "vraie"
qualité n'est pas toujours connue des
organisateurs

Utilisation d'une substance de Commode et économique; peut être


référence homologuée pour appliquée quand c'est nécessaire;
vérifier/améliorer l'exactitude l'éventail des substances de
de la méthode référence homologuées qui sont
disponibles est limité

Le Centre international de recherche sur le cancer (CIRC) applique un


programme permanent extérieur d'assurance de la qualité (Friesen, 1982).
Chaque année, des échantillons de denrées agricoles à analyser pour doser les
aflatoxines B,, B2, G, et G2 et de produits laitiers à analyser pour doser
l'aflatoxine M, sont envoyés à quelques dizaines de pays, dont plusieurs pays
en développement. La participation à ce programme de vérification
d'échantillons de mycotoxines du CIRC est gratuite et vivement recommandée
pour tout laboratoire procédant à des dosages de mycotoxines.

Le Bureau communautaire de référence (BCR) des Communautés européennes


entreprend actuellement un programme sur les mycotoxines qui a pour objectif
d'améliorer l'exactitude et, partant, la comparabilité des dosages de
mycotoxines. Ce programme comporte à cet effet la mise au point de substances
de référence homologuées. Le tableau 5 récapitule les mycotoxines et les
matrices choisies au départ pour le programme sur les mycotoxines (Wagstaffe,
1987) . Du lait en poudre dont la teneur en afaltoxine M, est certifiée est
disponible depuis peu.

Le BCR peut fournir de petites quantités de ces substances de référence


homologuées. D'autres substances de référence pour les mycotoxines, par
exemple de la farine d'arachides contenant de l'aflatoxine B1, sont en cours
de mise au point.
- 63

Tous les éléments de programmes destinés à assurer la précision et


l'exactitude imposent un surcroit de travail et de dépenses au laboratoire.
On a estimé que la durée néessaire pour les appliquer correspondait à environ
30% de la durée totale disponible pour l'analyse. Néanmoins, l'assurance de
la qualité est indispensable pour garantir la qualité et l'intégrité des
données d'analyse.

Tableau 5

Récapitulation des projets du BCR concernant les substances


de référence pour mycotoxines (d'après Wagstaffe, 1987)

Matrice : Lait en poudre Farine d'arachides et produits


d'alimentation animale blé

Mycotoxine: Aflatoxine M, Aflatoxine B,, Déoxynivalénol


certifiée 10-40 /xg/kg 400 Mg/kg
0,05; 0,31 et
0,76 Mg/kg

Préparation: Séchage par Produits présents Contamination


pulvérisation "à l'état naturelle et
de lait naturel" provoquée par
provenant de des champignons
bovins ayant
absorbé de
1'aflatoxine B,

Note: La zéaralénone et 1'ochratoxine A feront l'objet d'une


troisième phase.
- 64 -

IV. METHODES DE LABORATOIRE

1. Epreuve de liquéfaction des cristaux de sel pour déterminer l'activité


de l'eau (aw) dans les denrées agricoles

(D'après la méthode de Northolt et col. J. Food Prot. 45, 537-540,


1982); Manuel sur la détection rapide des mycotoxines 3-7, OCDE, Paris,
1982) .

But et champ d'application

Description d'une méthode pour mesurer l'activité de l'eau (aw) dans les
produits d'alimentation humaine. Cette épreuve convient pour vérifier la a w
de diverses denrées agricoles, laquelle doit être conforme aux normes fixées
en la matière pour empêcher la croissance des champignons et la production de
mycotoxines.

Définition

L'activité de l'eau (aw) est définie comme étant la pression de vapeur


d'eau relative d'équilibre d'un substrat.

pression de vapeur d'eau du substrat


a» =
pression de vapeur d'eau de l'eau libre
(à la même température)

Principe

Les cristaux de sel attirent la vapeur d'eau et se liquéfient quand ils


sont placés dans un bocal contenant un produit dont la a w est supérieure à la
a w spécifique du sel, équivalente à la a w de la solution saline saturée. On
peut déterminer la a w des échantillons en utilisant des sels ayant une a w
spécifique appropriée.

Réactifs

Vaseline

Sels pulvérisés, maille 105-210 ^m, le choix des sels étant fonction
d'étalons représentant les échantillons à soumettre aux épreuves.

CuCl2. 2H20 (a« * = 0,684)


NaCl (aw = 0,756)
NH4C1 (aw = 0,790)
(NH4)2S04 (aw - 0,807)
KC1 (aw - 0,856)
K2Cr 0 4 (aw = 0,870)
BaCl2. 2H20 (aw = 0,910)
(NH4)H2P04 (aw = 0,939)
K 2 SO 4 (aw = 0,982)

* Valeur de la a w de solutions salines saturées mesurée à une température de


18° C avec un instrument de mesure du point de rosée qu'on a étalonné en
utilisant le rapport généralement admis entre le point de rosée et la pression
de vapeur d'eau (CRC Manuel de chimie et de physique).
65

Equipement

Bocal étanche d'environ 500 ml à couvercle transparent

Spatule en acier inoxydable.

Mode opératoire

Placer 40-80 g de l'échantillon dans le bocal.

Fermer le bocal et équilibrer pendant au moins deux heures. Pour


l'épreuve comportant un sel dont la a^ est > à 0,91, l'équilibrage doit être
effectué dans une étuve avec une température égale à la température ambiante
ou inférieure à celle-ci de quelques degrés centigrades. L'épreuve comportant
un sel dont la a w est < à 0,91 peut être effectuée dans une pièce où la
température varie peu.

Ouvrir le bocal brièvement et étaler une très mince couche en vaseline


sur la surface interne de couvercle.

A l'aide de la spatule, étaler sur la vaseline quelques dizaines des


cristaux appropriés.

Fermer le bocal et équilibrer pendant 3 à 24 heures (selon le sel


utilisé, voir tableau 6).

Observer les cristaux pour voir s'ils sont liquéfiés ou non. Quand 50%
ou davantage des cristaux sont liquéfiés, le résultat de l'épreuve est jugé
positif.

Expression des résultats

Dans le cas d'une épreuve positive, 50% ou plus des cristaux du sel x
sont liquéfiés au bout de 3 à 24 heures selon le type de sel, le type de
produit et la température (voir tableau 6). La a w de l'échantillon peut être
exprimée ainsi:

a^ (échantillon) > a w (sel x) + 0 , 0 2

Examen critique

L'épreuve de liquéfaction des cristaux de sel est très simple;


néanmoins, quelques précautions s'imposent. L'épreuve comportant des sels
ayant une a w spécifique élevée (> 0,91) doit être effectuée dans une étuve
pour éviter que de brusques changements de température ne produisent des
résultats erronés. L'épreuve comportant des sels ayant une a w se situant entre
0,75 et 0,87 peut être effectuée dans une pièce où la température varie peu.
Quand on utilise des cristaux de CuCl2.2H20, l'épreuve n'est guère perturbée
par de brusques changements de température, de sorte qu'on peut l'utiliser
comme méthode sur le terrain pour vérifier une a w pouvant induire une
croissance de moisissures. C'est le cas, par exemple, pour les arachides, pour
lesquelles le Comité de l'hygiène alimentaire de la Commission du Codex
Alimentarius a proposé comme norme une a w de 0,70 pour éviter la contamination
par les aflatoxines.
- 66 -

Pour éviter des résultats inexacts, il faut empêcher le fond ou le


couvercle du bocal d'être exposé directement à la lumière solaire ou à un
rayonnement thermique. L'échantillon doit peser de 40 à 80 g parce que des
échantillons plus réduits pourraient avoir une a^ plus faible par suite de la
perte de vapeur d'eau pendant le remplissage et la réouverture du bocal. Des
résultats faussement positifs peuvent se produire avec des échantillons plus
importants quand la température diminue rapidement, par suite d'une
sursaturation de vapeur d'eau.

L'épreuve a une sensibilité de 0,04 a^ avec lecture de la a w au bout de


2 à 7 heures et de 0,02 a w avec lecture au bout de 3-24 heures, selon le type
de sel, le type de produit et la température.

Il convient de noter que cette épreuve indique la a w au moment de


l'échantillonnage uniquement et non pas telle qu'elle était précédemment. Par
conséquent, on ne saurait exclure que le produit ait été contaminé par des
mycotoxines auparavant.

Tableau 6

Durée de liquéfaction des cristaux de différents sels


déterminée avec différents produits à 18° C

Substance a w (substance) Sel a w (substance Durée de


d'épreuve d'épreuve) d'épreuve)-aw liquéfaction1
(sel) (heure)

Arachides non
décortiquées 0,702 CuCl2.2H20 0,018

Solution de
glycérol 0,776 NaCl 0,020 4

Pâtisserie 0,814 NH4C1 0,024 7

Pâtisserie 0,838 (NH4)2S04 0,031 3

Solution de
glycérol 0,876 KC1 0,020

Solution de
glycérol 0,890 K2Cr04 0,020 12

Pâtisserie 0,928 BaCl2.2H20 0,018 6

Saucisse
fermentée 0,960 (NH4)H2P04 0,021 4

Eau 1,000 K2S04 0,018 7 - 242

Durée nécessaire pour liquéfier 50% des cristaux.


La liquéfaction se produit quand la lecture se fait après une durée
se situant entre 7 et 24 heures.
- 67 -

2. Techniques de laboratoire pour la chromatographic en couche mince

Préparation des plaques en couche mince

a. Matériel et produit chimiques

Gel de silice pour chromatographie en couche mince


Fiole conique à bouchon de verre de 300 ml
Plateau d'alignement d'environ 112 x 22 cm
Etaleur de chromatographie en couche mince avec une fente de sortie de
0,25 mm ou ajustable
Cinq plaques de verre de 20 x 20 cm, épaisseur 4 mm
Deux plaques de verre de 5 x 20 cm, épaisseur 4 mm
Support pour plaques de chromatographie en couche mince
Four à 110° C
Dessiccateur avec pour dessiccatif du gel de silice actif.

b. Mode opératoire

Nettoyer soigneusement les plaques de verre avec un détergent ou une


solution de soude concentrée, rincer à l'eau distillée et laisser sécher. Les
plaques doivent être exemptes de graisse.

Disposer les plaques parallèlement l'une à l'autre et


perpendiculairement au fond du plateau d'alignement; disposer les petites
plaques aux extrémités gauche et droite de la rangée comme plaque de départ
et plaque d'arrivée.

Peser 30 g de gel de silice et le déposer dans une fiole conique,


ajouter la quantité d'eau recommandée par le fabricant, agiter vigoureusement
pendant une minute et verser dans l'étaleur avec la fente de sortie en
position fermée.

Placer l'étaleur sur la plaque de départ, basculer le levier de 180


degrés et enduire immédiatement les cinq plaques de verre avec une épaisseur
de 0,25 mm de suspension de gel de silice en l'espace de 5 à 6 secondes.
Laisser reposer les plaques jusqu'à ce que le gel ait pris (environ 10
minutes).

Dès l'étalement terminé, nettoyer l'étaleur immédiatement sous un jet


d'eau puissant. Dévisser l'extrémité du tube et retirer celui-ci. Nettoyer
l'appareil à fond avec un écouvillon en veillant à ne pas rayer le rebord de
la fente de sortie.

Disposer les plaques enduites sur un support, laisser reposer de


préférence pendant toute la nuit à la température ambiante, puis mettre le
support au four pendant une heure.

Vérifier que les couches minces soient bien lisses et étalées de façon
égale sur les plaques. conserver au dessiccateur jusqu'au moment de
1'utilisation.
- 68 -

Préparation des étalons

Plusieurs entreprises commerciales et institutions scientifiques peuvent


fournir des étalons de mycotoxines. On peut se les procurer sous diverses
formes, par exemple en pellicule sèche, cristaux, solutions types qualitatives
et quantitatives. Dans la présente section, la description de la préparation
des étalons pour la chromatographie en couche mince se limite aux AFLATOXINES.
Toutefois, pour l'essentiel, les principes et techniques sont les mêmes pour
la préparation d'étalons d'autres mycotoxines.

a. Equipement

Microbalance analytique, sensibilité de 0,001 mg

Spectrophotomètre, capable de déterminations se situant entre 200 et


400 nm, avec cellules de quartz de 1 cm.

Etalonner le spectrophotomètre comme suit:

Préparer trois solutions de K g C r ^ dans du H2S04

(1) K2Cr207, 0,25 mmol/L dans H2S04, 9 mmol/L (dissoudre 78 mg de K2Cr207


dans 1,0 L de H2S04, 9 mmol/L d'eau).
(2) K2Cr207, 0,125 mmol/L dans H2S04, 9 mmol/L (diluer 25 ml de (1) pour
50 ml avec du H2S04, 9 mmol/L d'eau).
(3) K2Cr207, 0,0625 mmol/L dans H2S04, 9 mmol/L (diluer 25 ml de (2)
pour 50 ml avec du H2S04, 9 mmol/L d'eau).

Déterminer le pouvoir absorbant (A) des solutions (1), (2) et (3) à


l'absorption maximale proche de 350 nm, avec H2S04, 9 mmol/L comme solvant
témoin. Calculer le coefficient d'absorption molaire (S) à chaque
concentration :
A
S = , où
c x 1

c = concentration en mmol/L
1 = trajet en mètres.

Si la variation des trois valeurs est supérieure à l'exactitude garantie


du barème A, vérifier soit la technique, soit l'instrument. Etablir la moyenne
des trois valeurs S pour obtenir S. Déterminer le facteur de correction (FC)
pour l'instrument et les cellules en fonction de l'équation: FC = 316 où
316 = la valeur de S pour des solution de K2Cr207 (S en m2/mol) . £

Si le FC est < à 0,95 ou > à 1,05, vérifier soit l'instrument, soit la


technique pour déterminer et éliminer la cause (utiliser la même série de
cellules pour l'étalonnage et pour la détermination de la pureté des étalons
de mycotoxine) .

b. Vérification de la pureté

Les aflatoxines à utiliser comme étalons primaires doivent répondre aux


critères de pureté suivants:
- 69 -

1) pureté chromatographique comme indiqué plus bas;


2) coefficients d'absorption molaire correspondant aux limites de confiance
données au tableau 7;
3) rapports des pics d'absorption correspondant aux limites de confiance
données au tableau 8.

Peser environ 1 mg de l'étalon d'aflatoxine au moyen d'une microbalance


analytique, puis transférer quantitativement à une fiole volumétrique de
100 ml. Dissoudre et diluer avec du méthanol. Calculer la concentration (c)
de la solution en jug/ml. Mesurer le pouvoir absorbant (A) de la solution avec
1'absorption maximale (voir tableau 7). Calculer les coefficients d'absorption
molaire :
A x PM
S = , où
c x 1

PM = poids moléculaire de l'aflatoxine considérée (voir tableau 9)


c = concentration en mmol/L
1 = trajet en mètres.

Calculer les rapports du pouvoir absorbant pour chaque aflatoxine aux


longueurs d'ondes données au tableau 8.

Tableau 7

Coefficients d'absorption molaire (S) des aflatoxines dans le méthanol


et limites de confiance à 95% prévues pour une détermination
unique du coefficient d'absorption molaire

Aflatoxine S ( m2/mo 1 ) Limites de confiance


dans MeOH à 95% (±)

B, 223 2210 160


265 1240 80
360 2180 110

222 1860 100


265 1210 60
362 2400 50

G, 216 2740 250


242 960 30
265 960 120
362 1770 70

214 2530 230


244 1050 30
265 900 110
362 1930 80
70 -

Tableau 8

Rapports des principaux pics de spectres d'absorption ultraviolets


des aflatoxines dans le méthanol et limites de confiance à 95%
prévues pour des spectres uniques

Principaus pics Paramètres Aflatoxines


comparés (nm)
B1 B2 G, G2

223/265 Rapport 1,77 1,54


Limites de confiance ±0,04 ±0,05
à 95%

214/265 Rapport 2,86 2,83


Limites de confiance ±0,15 ±0,13
à 95%

242/265 Rapport 1,00 1,20


Limites de confiance ±0,02 ±0,07
à 95%

362/265 Rapport 1,76 1,98 1,84 2,09


Limites de confiance ±0,04 ±0,08 ±0,06 ±0,18
à 95%

Tableau 9

Poids moléculaire (PM) de quelques aflatoxines

Aflatoxine PM

B, 312
B2 314
G, 328
G2 330
M, 328

c. Préparation des étalons pour chromatographie en couche mince

Préparation des solutions-mères :

Etalons d'aflatoxine livrés sous forme de pellicules sèches ou de


cristaux :
- 71

Ajouter dans le récipient d'aflatoxine sèche du chloroforme ou du


benzène-acétonitrile (98 + 2) calculé pour obtenir une concentration de 8 à
10 /¿g/ml. Pour l'aflatoxine M,, utiliser du chloroforme ou du benzène-
acétonitrile (90 + 10). Se guider sur l'indication portée sur l'étiquette pour
le poids d'aflatoxine. Agiter la solution vigoureusement pendant une minute
dans un agitateur Vortex et transférer sans rincer dans une fiole à bouchon
de verre de taille appropriée.

N.B.: Ne pas sécher l'aflatoxine pour la peser ou à d'autres fins à moins de


disposer des moyens nécessaires pour éviter la diffusion des aflatoxines aux
alentours par suite de la charge électrostatique sur les particules.

Etalons d'aflatoxine reçus sous forme de solution:

Transférer la solution dans une fiole appropriée à bouchon de verre. Au


besoin, diluer pour obtenir une concentration de 8 à 10 /¿g/ml.

d. Détermination de la concentration d'aflatoxine

Enregistrer un spectre ultraviolet de la solution d'aflatoxine obtenue


ci-dessus de 330 à 370 nm au regard du solvant utilisé pour la solution dans
la cellule de référence. Déterminer la concentration de la solution
d'aflatoxine en mesurant le pouvoir absorbant (A) à la longueur d'ondes
d'absorption maximale proche de 350 nm et en utilisant l'équation suivante:

(A x PM x FC)
/¿g d'aflatoxine/ml = , où
1 x S

FC = facteur de correction obtenu en étalonnant le spectrophotomètre


1 = trajet en mètres.

Le PM est lu sur le tableau 9 et les valeurs 2 (m2/mmol) sont les suivantes:

Aflatoxine S-(benzène - S(chloroforme)


acétonitrile

B, 1980 2100
B2 2090
G, 1710
G2 1820
M, 1882 1995

Remettre la solution d'aflatoxine dans la fiole d'origine à bouchon de


verre (l'exposition normale aux rayons ultraviolets pendant la détermination
du pouvoir absorbant n'entraîne aucune photosynthèse observable).
72 -

e. Détermination de la pureté chromatographique

Sur une plaque de chromatographie en couche mince, déposer des taches


de 5¿il de solution étalon sur une ligne imaginaire à environ 2 cm de la
surface du solvant révélateur. Développer la plaque dans l'un des solvants
indiqués au tableau 10. Renouveler l'opération avec une seconde plaque,
développée dans un système de solvant différent indiqué au tableau 10. Sous
rayons ultraviolets, les chromatogrammes n'indiqueront que les taches des
étalons d'aflatoxine individuels, aucune autre fluorescence n'étant
perceptible.

Tableau 10

Solvants révélateurs pour la chromatographie en couche mince


des aflatoxines
B7¡ B^i G, et G2 = ordre du R^ des aflatoxines à partir du sommet:

Chloroforme-acétone (90 + 10), cuve non saturée


Ether éthylique-méthanol-eau (96 + 3 + 1), cuve non saturée
Ether éthylique-méthanol-eau (94 + 4,5 + 1,5), cuve saturée
Chloroforme-méthanol (94 + 6), cuve saturée
Chloroforme-éthanol (97 + 3), cuve saturée
Benzène-méthanol-acide acétique (90 + 5 + 5), cuve non saturée
Dichlorométhane-trichloroéthène-n-alcool d'amyle-acide formique
( 8 0 + 1 5 + 4 + 1 ) , cuve non saturée (l'ordre du R^ devient B,, G,, B2, G2)
Chloroforme-trichloroéthène-n-acide amylalcoolique-acide formique
(80 + 1 5 + 4 + 1 ) , cuve saturée
Chloroforme-acétone-eau (88 + 12 + 1,5), cuve non saturée
Chloroforme-acétone-isopropanol-eau (88 + 12 + 1,5 + 1), cuve non saturée
Chloroforme-isopropanol (99 + 1), cuve non saturée
Toluène-acétate d'éthyle-acide formique ( 6 + 3 + 1 ) , cuve non saturée

Ether éthylique-méthanol-eau (95 + 4 + 1), cuve non saturée


Ether éthylique-hexane-méthanol-eau (85 + 1 0 + 4 + 1 ) , cuve non saturée
Chloroforme-acétone-méthanol (90 + 10 + 2), cuve non saturée
Chloroforme-acétone-isopropanol (87 + 1 0 + 3 ) , cuve non saturée

f. Préparation et stockage des solutions étalons

Diluer une fraction de la solution-mère à l'abri de la lumière avec le


solvant déjà utilisé pour la solution-mère, afin d'obtenir une solution étalon
de la même concentration que celle prescrite dans la méthode d'analyse en
cause (habituellement 0,1 ou 0,5 /¿g d'aflatoxine/ml). Après avoir retiré des
aliquotes pour dilution ou dépôt de taches, on pèse la fiole contenant la
solution-mère à un mg près et l'on enregistre le poids pour référence
ultérieure avant de mettre en réserve la solution-mère.

Envelopper la fiole dans une feuille d'aluminium bien serrée et la


stocker à moins de 4° C, mais non à 0° C pour les solutions au chloroforme,
quand la solution doit être utilisée après stockage, peser de nouveau la fiole
et noter tout changement. Pour éviter l'incorporation de la condensation de
l'eau, porter la solution-mère et la solution étalon à la température ambiante
avant utilisation. Ne pas retirer la feuille d'aluminium de la fiole avant que
73 -

le c o n t e n u s o i t à la t e m p é r a t u r e a m b i a n t e . L a s o l u t i o n - m è r e p e u t ê t r e
c o n s e r v é e 4 m o i s si e l l e e s t s t o c k é e d a n s u n r é f r i g é r a t e u r à l ' a b r i de la
l u m i è r e . L a s o l u t i o n é t a l o n p e u t ê t r e c o n s e r v é e a u m o i n s 14 j o u r s si e l l e e s t
s t o c k é e de la m ê m e f a ç o n .

g. P r é p a r a t i o n de l ' é t a l o n de r é f é r e n c e p o u r résolution

P r é p a r e r l ' é t a l o n de r é f é r e n c e p o u r r é s o l u t i o n e n m é l a n g e a n t les
s o l u t i o n s d ' a f l a t o x i n e s B,, B 2 , G, e t G 2 a f i n d ' o b t e n i r d e s c o n c e n t r a t i o n s de
1 , 0 , 4 , 1 e t 0 , 4 yLig/ml r e s p e c t i v e m e n t l o r s de la d i l u t i o n f i n a l e a v e c le
c h l o r o f o r m e o u le b e n z è n e - a c é t o n i t r i l e .

C h r o m a t o g r a p h i c en c o u c h e m i n c e

a. D é p ô t des t a c h e s et développement

P o u r l ' a n a l y s e d e s m y c o t o x i n e s p a r c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e , les
s u b s t a n c e s q u i s o n t a p p l i q u é e s sur la p l a q u e o n t g é n é r a l e m e n t u n v o l u m e
v a r i a n t de 5 à 25 /il. S e l o n l ' e x a c t i t u d e e t la p r é c i s i o n s o u h a i t é e s , o n p e u t
u t i l i s e r d i f f é r e n t s t y p e s d ' a p p l i c a t e u r s , t e l s que des p i p e t t e s c a p i l l a i r e s
q u a l i t a t i v e s , des p i p e t t e s c a p i l l a i r e s q u a n t i t a t i v e s o u d e s s e r i n g u e s de
précision.

S u r la m ê m e p l a q u e de c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e o n a p p l i q u e
d i r e c t e m e n t l ' u n e a p r è s l ' a u t r e des p a r t i e s a l i q u o t e s de l ' é c h a n t i l l o n , de
m ê m e q u e des p a r t i e s a l i q u o t e s de la s o l u t i o n é t a l o n , e n v e i l l a n t à ce q u e les
t a c h e s s o i e n t de t a i l l e r é d u i t e e t u n i f o r m e . De c e t t e f a ç o n , la c o m p a r a i s o n
de l ' é c h a n t i l l o n e t de l ' é t a l o n e s t p o s s i b l e e t j u s t i f i é e , é t a n t d o n n é q u e les
d e u x s o n t s o u m i s a u x m ê m e s c o n d i t i o n s de d é v e l o p p e m e n t e t que les v a r i a t i o n s
é v e n t u e l l e s d ' u n e p l a q u e à l ' a u t r e s o n t é l i m i n é e s . Il e s t de b o n n e p r a t i q u e
d a n s u n l a b o r a t o i r e d ' a p p l i q u e r les é c h a n t i l l o n s e t les é t a l o n s a u s s i v i t e que
p o s s i b l e s o u s u n f a i b l e é c l a i r a g e à i n c a n d e s c e n c e , de p r é f é r e n c e e n a t m o s p h è r e
i n e r t e p o u r é v i t e r la d é c o m p o s i t i o n . A c e t t e m ê m e f i n , il f a u t , a p r è s le d é p ô t
des t â c h e s , c o u v r i r c e l l e s - c i d ' u n e p l a q u e e n v e r r e . P o u r l ' e s t i m a t i o n
v i s u e l l e , il e s t n é c e s s a i r e que l ' i n t e n s i t é des t a c h e s d ' é c h a n t i l l o n s se s i t u e
d a n s la g a m m e des i n t e n s i t é s d ' u n e s é r i e c r o i s s a n t e de t a c h e s d ' é t a l o n s . P a r
c o n s é q u e n t , s i l ' o n a n a l y s e les é c h a n t i l l o n s de c o n c e n t r a t i o n s de m y c o t o x i n e s
i n c o n n u e s , il e s t u t i l e de p r o c é d e r d ' a b o r d à u n e o p é r a t i o n p r é l i m i n a i r e de
c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e p o u r d é t e r m i n e r la t e n e u r a p p r o x i m a t i v e e n
m y c o t o x i n e , a f i n q u ' o n p u i s s e p r é p a r e r u n e d i l u t i o n a p p r o p r i é e p o u r la
c h r o m a t o g r a p h i e q u a n t i t a t i v e e n c o u c h e m i n c e . P o u r le d o s a g e d e n s i m é t r i q u e ,
il f a u t p r o c é d e r à d e s d i l u t i o n s si l ' i n t e n s i t é des t a c h e s d ' é c h a n t i l l o n e t
c e l l e d e s t a c h e s d ' é t a l o n n e s o n t p a s d u m ê m e o r d r e de g r a n d e u r .

Les plaques doivent être développées dans l'obscurité ou en lumière


t a m i s é e c a r l ' e x p o s i t i o n des m y c o t o x i n e s sur des s u r f a c e s a d s o r b a n t e s a u x
r a y o n s u l t r a v i o l e t s p e u t e n t r a i n e r la d é c o m p o s i t i o n , s u r t o u t e n p r é s e n c e de
s o l v a n t s . De m ê m e , les p l a q u e s de c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e d o i v e n t ê t r e
recouvertes d'une plaque en verre propre après 1'évaporation du solvant et
s t o c k é e s d a n s l ' o b s c u r i t é e n a t t e n d a n t la v i s u a l i s a t i o n o u le d o s a g e . L e s
taches développées ne doivent être exposées à l'éclairage ultraviolet que
p e n d a n t la d u r é e m i n i m a l e n é c e s s a i r e à la v i s u a l i s a t i o n . A f i n d ' o b t e n i r d e s
c o n d i t i o n s de d é v e l o p p e m e n t a u s s i u n i f o r m e s que p o s s i b l e , il e s t c o n s e i l l é de
p l a c e r s i m u l t a n é m e n t d e u x p l a q u e s d a n s la m ê m e c u v e , les s u r f a c e s o ù s o n t
f i x é e s les s u b s t a n c e s é t a n t f a c e à f a c e .
- 74 -

b. Interprétation et calcul

La manière de déceler une mycotoxine dépend de ses propriétés physico-


chimiques. Les aflatoxines absorbent fortement l'éclairage ultraviolet et
émettent l'énergie de l'ultraviolet absorbé sous forme de fluorescence. Cette
heureuse caractéristique permet à la personne effectuant l'analyse de déceler
ces constituants. Pour les autres mycotoxines, il faut utiliser des réactifs
de visualisation, par exemple en pulvérisant un réactif sur la plaque ou en
exposant celle-ci à de la vapeur de réactif.

Après visualisation, il faut interpréter le chromatogramme afin de


déterminer si la mycotoxine recherchée est présente ou non dans l'échantillon.
La tache de mycotoxine provenant de l'extrait peut être localisée à l'aide des
étalons développés simultanément. La tache de toxine présumée doit coïncider
avec l'étalon de référence pour ce qui est de la valeur R^ et de la teinte
(couleur). Il est conseillé de procéder à une opération supplémentaire de
chromatographie si l'interprétation du chromatogramme est gênée par la
présence d'autres taches ayant les mêmes valeurs R^ que la tache de toxine
présumée, ou bien si l'on éprouve des doutes quant à l'identité d'une tache
de toxine "présumée". Pour cette chromatographie supplémentaire, on répète,
l'opération de chromatographie en couche mince, cette fois avec un étalon
interne surimposé sur la tache d'extrait avant développement de la plaque.
Après l'opération de chromatographie en couche mince, cet étalon surimposé et
la tache de toxine "présumée" provenant de l'échantillon doivent coïncider.

N.B.: Avec la chromatographie bidimensionnelle en couche mince, la position


effective de la tache de mycotoxine provenant de l'extrait d'échantillon après
développement suivant la seconde orientation peut accuser une valeur R,
quelque peu supérieure à celle de l'étalon correspondant dans la voie
latérale. Cela est généralement dû à la présence dans le gel de silice de
résidus des composants du premier solvant de développement (méthanol, eau),
ces résidus ne sont pas présents dans la voie latérale en raison de la ligne
limite du solvant. Il peut donc en résulter une légère divergence des
valeurs R,.

Le dosage peut être effectué par des moyens visuels ou densimétriques,


selon l'équipement du laboratoire. Pour l'estimation visuelle, on compare
l'intensité des taches de toxine provenant de l'échantillon avec celle des
étalons et l'on détermine quelles sont les taches d'étalon qui correspondent
à la tache d'échantillon. Au besoin, on peut procéder à une interpolation.
Pour calculer la concentration de mycotoxine dans l'échantillon, on applique
la formule suivante :

S x Y x V
MgAg = , où
X x W

S = /il de mycotoxine étalon égale à l'inconnue


Y = concentration de mycotoxine étalon en /ig/ml
V = /il de dilution finale de l'extrait d'échantillon
X = /il d'extrait d'échantillon donnant une intensité de tache égale à S
W = masse de l'échantillon, représentée par l'extrait final en g.
75 -

Pour le dosage densimétrique, on examine l'intensité des taches


d'échantillon et d'étalon conformément aux instructions du fabricant et l'on
compare les pics sur la sortie d'imprimante. Avec la chromatographie
bidimensionnelle en couche mince, on examine habituellement les taches
d'étalon développées selon la seconde orientation. La concentration de
mycotoxine dans l'échantillon est calculée d'après la formule suivante:

B x Y x S x V
Mg/kg = , où
Z x X x W

B = superficie moyenne du pic de mycotoxine provenant de l'échantillon


Y = concentration de mycotoxine étalon en /¿g/ml
S = ni de mycotoxine étalon égale à l'inconnue
V = /il de dilution finale de l'extrait d'échantillon
Z = superficie moyenne du pic de mycotoxine provenant de l'étalon
X = /j.1 d'extrait d'échantillon déposé en taches

W = masse de l'échantillon, représentée par l'extrait final en g.

Confirmation de 1 ' identité


a. Principes généraux

Malgré toutes les techniques d'épuration utilisées, il subsiste des


substances qui se comportent comme la mycotoxine recherchée par séparation
selon la méthode de chromatographie en couche mince. Pour réduire au minimum
le risque de résultats faussement positifs, il faut confirmer l'identité de
la mycotoxine dans les échantillons positifs. La méthode la plus fiable à
cette fin est la spectroscopie de masse à haute résolution. Toutefois, la
spectroscopie de masse à haute résolution utilisée en association avec la
chromatographie en couche mince est une opération d'assez longue durée et tous
les laboratoires ne disposent pas de ce type d'appareil de haute technicité.
Il faut donc accorder la préférence à des techniques chimiques simples. Ces
techniques n'offrent pas la même certitude absolue que la spectroscopie de
masse à haute résolution, mais elles évitent la plupart des résultats
faussement positifs.

Les épreuves de confirmation des mycotoxines reposent généralement sur


la dérivation de la mycotoxine considérée dans un produit de réaction doté
d'un comportement et/ou d'une couleur chromatographiques spécifiques. La
mycotoxine servant d'étalon et l'échantillon suspect sont tous deux soumis à
la même réaction de dérivation. Par conséquent, dans les échantillons
positifs, on devrait voir apparaître un dérivé de la mycotoxine identique à
celui de la mycotoxine servant d'étalon. Les réactions de confirmation peuvent
être effectuées dans des éprouvettes ou, de préférence, directement sur une
plaque de chromatographie en couche mince, ce qui permet de tirer profit des
avantages de cette technique. Comme exemples de cette dernière possibilité,
on peut citer les méthodes de confirmation de l'aflatoxine B, mises au point
à l'origine par Przybylski (1975) et par Verhülsdonk (1977), aujourd'hui
adoptées comme méthodes officielles, respectivement par l'AOAC et par les
Communautés européennes. Dans les deux méthodes, l'aflatoxine B, est dérivée
en milieu acide sur une plaque de chromatographie en couche mince pour obtenir
son hémiacétal, l'aflatoxine B2a, qui produit une fluorescence bleue à un R,
plus faible que l'aflatoxine B,.
- 76 -

D a n s la m é t h o d e ( s i m p l e ) de P r z y b y l s k i , o n o b t i e n t ce r é s u l t a t e n
s u r i m p o s a n t de l ' a c i d e t r i f l u o r o a c é t i q u e d i r e c t e m e n t s u r la t a c h e d ' e x t r a i t
a v a n t le d é v e l o p p e m e n t . A p r è s la r é a c t i o n , la p l a q u e e s t d é v e l o p p é e e t
e x a m i n é e s o u s é c l a i r a g e u l t r a v i o l e t p o u r d é t e r m i n e r la p r é s e n c e de la t a c h e
b l e u e d e f l u o r e s c e n c e de l ' a f l a t o x i n e B 2 a , q u i p e u t ê t r e i d e n t i f i é e à l ' a i d e
d ' u n é t a l o n d ' a f l a t o x i n e B, d é p o s é e n t a c h e s sur la m ê m e p l a q u e e t s o u m i s à
l a m ê m e o p é r a t i o n . C o m m e c o n f i r m a t i o n s u p p l é m e n t a i r e , o n p u l v é r i s e d u H 2 S 0 4 sur
u n e a u t r e p a r t i e de la p l a q u e o ù o n t été d é v e l o p p é e s d e s p a r t i e s a l i q u o t e s
n ' a y a n t p a s r é a g i de l ' e x t r a i t e t de l ' a f l a t o x i n e B, s e r v a n t d ' é t a l o n . L a
p u l v é r i s a t i o n d ' a c i d e H 2 S 0 4 m o d i f i e la f l u o r e s c e n c e de l ' a f l a t o x i n e , q u i v i r e
d u b l e u a u j a u n e , c e t t e é p r e u v e n e f a i t que c o n f i r m e r l ' a b s e n c e d ' a f l a t o x i n e ,
c ' e s t - à - d i r e que les taches qui ne virent pas au jaune ne sont certainement
p a s de l ' a f l a t o x i n e , m a i s de n o m b r e u s e s s u b s t a n c e s a u t r e s que l ' a f l a t o x i n e
p e u v e n t donner une tache jaune avec du H2S04.

D a n s le c a s d ' e x t r a i t s f o r t e m e n t " s o u i l l é s " , il p e u t s ' a v é r e r d i f f i c i l e


d e d i s t i n g u e r l ' h é m i a c é t a l de l ' a f l a t o x i n e B, ( c ' e s t - à - d i r e la B 2 a ) e n r a i s o n
d'une forte fluorescence de fond. La technique bi-dimensionnelle de
V e r h ü l s d o n k s e r a a l o r s la m é t h o d e de c h o i x , c o m p o r t a n t la succession
s é p a r a t i o n - r é a c t i o n - s é p a r a t i o n . O n p u l v é r i s e de l ' a c i d e c h l o r h y d r i q u e a p r è s
la p r e m i è r e s é p a r a t i o n e t la r é a c t i o n a l i e u . P u i s o n p r o c è d e à u n e d e u x i è m e
s é p a r a t i o n d a n s l a s e c o n d e d i m e n s i o n d a n s des c o n d i t i o n s r i g o u r e u s e m e n t
i d e n t i q u e s , a p r è s q u o i la t a c h e de f l u o r e s c e n c e b l e u e i s o l é e de l ' a f l a t o x i n e
B 2 a e s t v i s i b l e , p o u v a n t ê t r e i d e n t i f i é e à l ' a i d e de l ' é t a l o n d ' a f l a t o x i n e B,
d é p o s é e n t a c h e s s u r la m ê m e p l a q u e e t a y a n t s u b i la m ê m e o p é r a t i o n . D ' a u t r e s
c o n s t i t u a n t s (sans r é a c t i o n ) s o n t d i s p o s é s e n d i a g o n a l e s u i v a n t la b i s s e c t r i c e
d e la p l a q u e , la s é p a r a t i o n a y a n t é t é e f f e c t u é e s e l o n les d e u x o r i e n t a t i o n s
dans des conditions rigoureusement identiques.

N.B.: Ces deux méthodes sont tout aussi satisfaisantes l'une que l'autre pour
c o n f i r m e r l ' i d e n t i t é de l ' a f l a t o x i n e G,.

b. M é t h o d e de l ' A O A C p o u r l ' a f l a t o x i n e B, ( u n i d i m e n s i o n n e l l e )

Matériel et produits chimiques :

Plaques de chromatographie en couche mince préparées selon la


d e s c r i p t i o n q u i p r é c è d e o u u t i l i s a t i o n de p l a q u e s c o m p o r t a n t d é j à u n e c o u c h e
é p a i s s e de 0 , 2 5 m m de g e l de s i l i c e ( M e r c k , g e l D C - K i e s e l 60 ( D a r m s t a d t , R F A ) ;
M a c h e r y & N a g e l , MN-G-HR (Düren, RFA); ou équivalent).

Acide trifluoroacétique. Conserver au réfrigérateur dans un flacon à


bouchon étanche.
M i c r o s e r i n g u e de 10 /il o u c a p i l l a i r e s q u a n t i t a t i f s e n v e r r e .
C a p i l l a i r e s q u a l i t a t i f s e n v e r r e de 1 f i l .
P l a q u e e n v e r r e p r o p r e d ' e n v i r o n 10 x 20 c m .
Soufflerie d'air chaud.
S o l v a n t r é v é l a t e u r : m é l a n g e de c h l o r o f o r m e e t d ' a c é t o n e (85 + 1 5 ) .
Chambre de développement rectangulaire avec bord en verre et bouchon à
l'émeri ou équivalent.
L a m p e u l t r a v i o l e t à g r a n d e s o n d e s (360 n m ) (à u t i l i s e r a v e c des l u n e t t e s
a b s o r b a n t les ultraviolets) ou chambre ChromatoVue (Ultra-Violet
P r o d u c t s , I n c . ) o u é q u i v a l e n t . L ' i n t e n s i t é de l ' i r r a d i a t i o n doit
p e r m e t t r e de d i s t i n g u e r n e t t e m e n t sur u n e p l a q u e de c h r o m a t o g r a p h i e e n
c o u c h e m i n c e à 10 c m de la l a m p e u n e t a c h e de 1 n g d ' a f l a t o x i n e B,.
- 77 -

Mode opératoire

(Voir figure 36) . Diviser une plaque de chromatographie en couche mince


en deux parties égales en traçant dessus un trait épais. Recouvrir l'une des
parties avec la plaque en verre.

Sur la partie non couverte, déposer deux taches aliquotes de l'extrait


d'échantillon préparé pour la chromatographie en couche mince contenant de 0, 5
à 5 ng d'aflatoxine B,. Déposer deux aliquotes de l'aflatoxine B, servant
d'étalon (approximativement la même quantité que dans l'échantillon)
respectivement sur l'une de ces taches d'échantillon et en un autre endroit.

Chloroforme
-acétone
(85+15)

# Echantillon
O Etalon

C Echantillon + étalon
Figure 36

Surimposer 1 /J.1 d'acide trifluoroacétique sur chacune des trois taches


et laisser réagir pendant 5 minutes. Souffler ensuite de l'air chaud sur la
plaque pendant au moins 10 minutes (la température de l'air à la surface de
la plaque doit être d'environ 40° C) . Découvrir la deuxième partie de la
plaque et répéter l'opération décrite plus haut. Ne pas ajouter d'acide
trifluoroacétique.
- 78 -

Placer une quantité suffisante du solvant révélateur dans la cuve de


développement et introduire la plaque dans la cuve. Placer une auge ou trois
petits béchers contenant de l'eau devant la plaque. Ne pas équilibrer. Après
le développement, examiner la plaque sous éclairage ultraviolet grandes ondes.
L'aflatoxine B, n'ayant pas réagi apparaît près du haut de la plaque dans la
partie où il n'y a pas d'acide trifluoroacétique. Les dérivés à fluorescence
bleue (aflatoxine B2a) provenant de l'aflatoxine B, servant d'étalon et de
l'extrait où l'on a surimposé de l'étalon d'aflatoxine B, apparaissent avec
un fy d'environ 0,25 dans la partie où l'on a pulvérisé de l'acide
trifluoroacétique. La présence d'aflatoxine B2a dans le canal de l'extrait
d'échantillon ayant réagi est une preuve de l'identité de l'aflatoxine B,
dans l'extrait d'échantillon.

3. Méthodes de chromatographie en couche mince pour le dosage de


l'aflatoxine B, dans les produits d'alimentation humaine et animale

N.B.: Ces modes opératoires sont basés sur la méthode officielle des
Communautés européennes, Journal officiel des Communautés européennes L102,
9-18 (1976), texte modifié par P.L. Schuller et H.P. van Egmond.

Mode opératoire pour la chromatographie unidimensionnelle en couche


mince

a. But et champ d'application

Cette méthode permet de déterminer la teneur en aflatoxine B, des


produits simples d'alimentation animale suivants: tourteaux et farines
préparés à partir d'arachides, de coprah, de graines de lin, de soja, de
sésame, de babassou, de manioc et d'huile de germe de maïs, ainsi que de
céréales et de produits céréaliers, de maïs, de farine de pois, de fécule de
pomme de terre et d'amidon. Bien que ce ne soit pas spécifié dans le texte
officiel du mode opératoire prescrit par les Communautés européennes, cette
méthode convient aussi à l'analyse de divers produits d'alimentation humaine
pour y rechercher l'aflatoxine B,.

Le seuil de détection inférieur est d'environ 0,01 mg/kg (10 ppb).

Si le dosage est entravé par la présence de substances gênantes, il


faut répéter l'analyse en utilisant la chromatographie bidimensionnelle en
couche mince.

b. Principe

La prise d'essai est soumise à une extraction au chloroforme. L'extrait


est filtré et une partie aliquote est prélevée et purifiée sur gel de silice
par chromatographie sur colonne. L'éluat est évaporé et le résidu est
redissous dans un volume spécifique de chloroforme ou d'un mélange de benzène
et d'acétonitrile. Une partie aliquote de cette solution est soumise à une
opération de chromatographie en couche mince. Le dosage de l'aflatoxine B,
s'effectue par irradiation du chromatogramme aux ultraviolets, soit
visuellement, soit au fluorodensimètre, par comparaison avec des quantités
connues de l'aflatoxine B, servant d'étalon. L'identité de l'aflatoxine B,
extraite du produit d'alimentation animale est confirmée par la formation de
l'hémiacétal de l'aflatoxine B, sur la plaque de chromatographie en couche
mince.
- 79

c. Réactifs

(N.B.: Tous les réactifs doivent être de qualité "réactif analytique".)

Acétone
Chloroforme, stabilisé avec 0,5 à 1,0% d'éthanol à 96% (v/v)
n-Hexane
Méthanol
Ether éthylique anhydre, exempt de peroxydes
Mélange de benzène et d'acétonitrile: 98/2 (v/v)
Mélange de chloroforme et de méthanol: 97/3 (v/v)
Gel de silice pour chromatographie sur colonne; granulométrie:
0,05-0,20 mm
Coton hydrophile, préalablement dégraissé au chloroforme, ou laine de
verre
Sulfate de sodium anhydre granuleux
Gaz inerte, par exemple azote
Acide chlorhydrique (1 mol/L)
Solution aqueuse d'acide sulfurique à 50% (v/v)
Diatomite (Kieselguhr, Hyflosupercel), lavée à l'acide
Gel de silice G-HR ou équivalent pour plaques à enduire par l'opérateur
Solution étalon contenant 0,1 /¿g d'aflatoxine B, par ml dans du
chloroforme ou dans le mélange de benzène et d'acétonitrile préparé et
vérifié comme indiqué ci-après

Préparation de la solution étalon et dosage de la concentration:

Préparer une solution étalon d'aflatoxine B, dans du chloroforme ou


dans le mélange de benzène et d'acétonitrile avec une concentration de
8 à 10 /xg/ml. Enregistrer le spectre d'absorption entre 330 et 370 nm
à l'aide du spectrophotomètre.

Mesurer le pouvoir absorbant (A) à 363 nm dans le cas de la solution


au chloroforme et à 348 nm quand la solution est un mélange de benzène
et d'acétonitrile.

Calculer la concentration en microgrammes d'aflatoxine B, par ml de


solution à partir des formules ci-après:

312 x A x 1000 pour la solution au chloroforme;


20600

312 x A x 1000 pour la solution comportant un mélange de


19800 benzène et d'acétonitrile.
80 -

Diluer la solution d'étalon comme il convient à l'abri de la lumière


du jour pour obtenir une concentration d'aflatoxine B, de 0,1 /jg/ml.
Conservée au réfrigérateur à 4° C, cette solution reste stable pendant
deux semaines.

Vérification de la pureté chromatographique de la solution étalon:

Déposer sur une plaque 5 /j.1 de la solution étalon d'aflatoxine B,


contenant de 8 à 10 ¿¿g/ml. Développer le chromatogramme comme indiqué
à la page 82. Sous éclairage ultraviolet, le chromatogramme ne révélera
qu'une seule tache et aucune fluorescence ne sera perceptible dans la
zone de dépôt initiale.

Solution étalon pour épreuve qualitative contenant environ 0,1 /¿g


d'aflatoxine B, et B2 par ml dans du chlorofome ou dans" le mélange de
benzène et d'acétonitrile. ces concentrations sont données à titre
indicatif. On pourra les ajuster pour obtenir la même intensité de
fluorescence pour les deux aflatoxine.

Solvants révélateurs :

Mélange de chloroforme et d'acétone: 9/1 (v/v), cuve non saturée;


Mélange d'éther éthylique et de méthanol et d'eau: 96/3/1 (v/v/v), cuve
non saturée;
Mélange d'éther éthylique et de méthanol et d'eau: 94/4,5/1,5 (v/v/v),
cuve non saturée;
Mélange de chloroforme et de méthanol: 95/6 (v/v), cuve saturée;
Mélange de chloroforme et de méthanol: 97/3 (v/v), cuve saturée.
Acide trifluoroacétique (stocker au réfrigérateur dans un flacon à
fermeture hermétique);
Propanol-2.

Solvants révélateurs pour épreuve de confirmation:

Mélange de chloroforme et d'acétone et méthanol: 90/10/2 (v/v/v), cuve


non saturée;
Mélange de chloroforme et d'acétone et propanol-2: 85/12,5/2,5 (v/v/v),
cuve non saturée;

Solution aqueuse à 5% (v/v) d'hypochlorite de sodium (NaOCl).

d. Equipement

Broyeur-malaxeur
Agitateur, magnétique ou autre
Papiers filtres cannelés, Schleicher et Schüll N° 588 ou équivalent;
diamètre: 24 cm
Tube en verre pour chromatographic (diamètre interne: 22 mm; longueur:
300 mm) avec robinet en Teflon et réservoir de 250 ml
81 -

Evaporateur rotatif sous vide avec ballon de 500 ml


Fiole conique de 500 ml avec bouchon à l'émeri
Matériel de chromatographie en couche mince
Plaques en verre pour chromatographie en couche mince, 200 x 200 mm,
préparées comme suit (les quantités indiquées sont suffisantes pour
recouvrir 5 plaques): déposer 30 g de gel de silice G-HR dans une fiole
conique. Ajouter 60 ml d'eau, boucher et agiter pendant une minute.
Etaler la suspension sur les plaques de manière à obtenir une couche
uniforme de 0,25 mm d'épaisseur. Laisser sécher à l'air, puis stocker
dans un dessiccateur contenant du gel de silice. Au moment de
l'utilisation, activer les plaques en les plaçant pendant une heure dans
un four à 110° C.

Les plaques à antigène préfixé conviennent si elles donnent des


résultats analogues à ceux qu'on obtient avec les plaques préparées
selon la méthode indiquée ci-dessus.

Lampe ultraviolet grandes ondes (360 nm). L'intensité de l'irradiation


permettra de distinguer nettement une tache de 1,0 ng d'aflatoxine B,
sur une plaque de chromatographie en couche mince à 10 cm de la lampe.

ATTENTION - L'ECLAIRAGE ULTRAVIOLET EST DANGEREUX POUR LES YEUX. IL EST


IMPERATIF DE PORTER DES LUNETTES DE PROTECTION.

Tubes graduées de 10 ml avec bouchons en verre ou en polyéthylène


Spectrophotomètre ultraviolet
Fluorodensimètre (facultatif)
Capillaires de 1 ou 2 /il ou de préférence microseringue (0-50 \x 1)
Pulvérisateur pour chromatographie en couche mince (à faible volume
(5-20 ml)).

e. Mode opératoire

Préparation de l'échantillon:

Broyer l'échantillon de telle sorte qu'il traverse parfaitement un


tamis à mailles de 1 mm (conformément à la recommandation de l'ISO
R 565).

Extraction:

Placer dans une fiole conique 50 g d'échantillon broyé et homogénéisé.


Ajouter 25 g de diatomite, 25 ml d'eau et 250 ml de chloroforme. Boucher
la fiole, agiter ou remuer pendant 30 minutes en utilisant l'appareil
et filtrer à travers un papier filtre cannelé. Mettre au rebut les 10
premiers millilitres du filtrat, puis en recueillir au moins 50 ml.

Epuration de la colonne:

Introduire à l'extrémité inférieure du tube de chromatographie un


bouchon de coton hydrophile ou de laine de verre, remplir le tube aux
deux tiers avec du chloroforme et ajouter 5 g de sulfate de sodium.
- 82 -

Vérifier que la surface de la couche de sulfate de sodium soit bien


plane, puis ajouter 10 g de gel de silice en fractions réduites. Remuer
soigneusement après chaque addition pour éliminer les bulles d'air.
Laisser reposer 15 minutes, puis ajouter soigneusement 15 g de sulfate
de sodium. Ouvrir le robinet, laisser le liquide s'écouler jusqu'à ce
qu'il soit juste au-dessus de la surface de la couche de sulfate de
sodium. Fermer le robinet.

Mélanger 50 ml de l'extrait recueilli dans 100 ml de n-hexane et


transférer quantitativement le mélange dans la colonne. Ouvrir le
robinet, laisser le liquide s'écouler jusqu'à ce qu'il soit juste au-
dessus de la surface de la couche de sulfate de sodium. Fermer le
robinet. Mettre ce liquide au rebut. Ajouter ensuite 100 ml d'éther
éthylique et laisser de nouveau le liquide s'écouler jusqu'à ce qu'il
soit juste au-dessus de la surface de la couche de sulfate de sodium.
Pendant ces opérations, vérifier que le débit soit de 8 à 12 ml par
minute et que la colonne ne soit pas asséchée. Mettre au rebut le
liquide qui s'échappe. Eluer ensuite avec 150 ml du mélange de
chloroforme et de méthanol et recueillir la totalité de l'éluat dans
le ballon de 1'évaporateur rotatif.

Evaporer l'éluat jusqu'à ce qu'il soit presque totalement sec à une


température ne dépassant pas 50° C et de préférence sous un jet de gaz
inerte sous pression réduite avec 1'évaporateur rotatif. Transférer
quantitativement le résidu en utilisant le chloroforme ou le mélange de
benzène et d'acétonitrile dans un tube gradué de 10 ml. Concentrer la
solution sous un jet de gaz inerte, puis ajuster le volume à 2,0 ml avec
le chloroforme ou le mélange de benzène et d'acétonitrile.

N.B.: L'aflatoxine B, est une substance hautement cancérogène et il faut


donc la manipuler avec de grandes précautions. Ne pas transférer de
l'aflatoxine sèche pour la pesée ou à d'autres fins, à moins de disposer
de moyens (par exemple un caisson stérile) empêchant la diffusion de
l'aflatoxine aux alentours par suite d'une charge électrostatique sur
les particules. Rincer toute la verrerie exposée à l'aflatoxine
soigneusement au chloroforme, puis avec la solution d'eau de Javel;
laver ensuite à fond. Nettoyer l'aflatoxine répandue par accident avec
la solution d'eau de Javel. Pour plus de détails sur les méthodes de
décontamination, voir la publication du CIRC N° 37 "Décontamination au
laboratoire et destruction des aflatoxines B,, B2, G, et G2 dans les
déchets de laboratoire", publiée sous la direction de M. Castegnaro et
col., Lyon, 1980.

Chromatographie en couche mince:

Déposer en taches sur une plaque de chromatographie en couche mince,


à 2 cm du bord inférieur et à intervalles de 2 cm, les volumes indiqués
ci-après de la solution étalon et de l'extrait de la prise d'essai en
utilisant des pipettes capillaires ou la microseringue.

10, 15, 20, 30 et 40 ¿¿1 de la solution étalon d'aflatoxine B, ;


10 ni de l'extrait obtenu et, surimposés au même endroit, 20 ¡j.1 de
la solution étalon;
10 et 20 /il de l'extrait obtenu ci-dessus.
- 83 -

S é c h e r d a n s u n c o u r a n t d ' a i r o u de g a z i n e r t e à f a i b l e d é b i t . L e s t a c h e s
obtenues auront un diamètre d'environ 5 m m .

D é v e l o p p e r le c h r o m a t o g r a m m e d a n s l ' o b s c u r i t é a v e c l ' u n d e s s o l v a n t s
r é v é l a t e u r s . (On c h o i s i r a le s o l v a n t a u p r é a l a b l e e n d é p o s a n t 25 /¿I de
la s o l u t i o n é t a l o n q u a l i t a t i v e sur la p l a q u e e t e n v é r i f i a n t q u ' a p r è s
d é v e l o p p e m e n t les a f l a t o x i n e s B, e t B z à f l u o r e s c e n c e b l e u e s o n t
c o m p l è t e m e n t s é p a r é e s . ) L a i s s e r le s o l v a n t s ' é v a p o r e r d a n s l ' o b s c u r i t é ,
p u i s i r r a d i e r a u x u l t r a v i o l e t s e n p l a ç a n t la p l a q u e à 10 cm de la l a m p e .
L e s t a c h e s d ' a f l a t o x i n e B, d é g a g e n t u n e f l u o r e s c e n c e b l e u e .

Dosage :

Estimer visuellement ou doser au fluorodensimètre comme indiqué ci-


après.

Estimation visuelle :

E s t i m e r la q u a n t i t é d ' a f l a t o x i n e B, d a n s l ' e x t r a i t e n comparant


l ' i n t e n s i t é de f l u o r e s c e n c e des t a c h e s de l ' e x t r a i t a v e c c e l l e d e s
t a c h e s de s o l u t i o n é t a l o n . A u b e s o i n , p r o c é d e r p a r i n t e r p o l a t i o n . L a
f l u o r e s c e n c e o b t e n u e p a r s u r i m p o s i t i o n de l ' e x t r a i t sur la s o l u t i o n
é t a l o n s e r a p l u s i n t e n s e que c e l l e d e s 10 ¿¿1 d ' e x t r a i t e t s e r a p e r ç u e
c o m m e u n e s e u l e t a c h e v i s i b l e . Si l ' i n t e n s i t é de la f l u o r e s c e n c e d é g a g é e
p a r les 10 /il d ' e x t r a i t e s t s u p é r i e u r e à c e l l e d e s 4 0 /il de s o l u t i o n
é t a l o n , d i l u e r l ' e x t r a i t 10 o u 100 f o i s a v e c d u c h l o r o f o r m e o u a v e c le
m é l a n g e de b e n z è n e e t d ' a c é t o n i t r i l e a v a n t de r é p é t e r l ' o p é r a t i o n de
chromatographie en couche mince.

Mesure par fluorodensimétrie:

M e s u r e r a u f l u o r o d e n s i m è t r e l ' i n t e n s i t é de la f l u o r e s c e n c e d é g a g é e p a r
les t a c h e s d ' a f l a t o x i n e B, à u n e l o n g e u r d ' o n d e s d ' e x c i t a t i o n de 365 n m
e t à u n e l o n g u e u r d ' o n d e s d ' é m i s s i o n de 4 4 3 rim. D é t e r m i n e r la q u a n t i t é
d ' a f l a t o x i n e B, d a n s les t a c h e s d ' e x t r a i t e n c o m p a r a n t l ' i n t e n s i t é de
la f l u o r e s c e n c e d e s t a c h e s d ' e x t r a i t a v e c c e l l e d e s t a c h e s d ' a f l a t o x i n e
B, s e r v a n t d ' é t a l o n . S i l ' i n t e n s i t é de la f l u o r e s c e n c e d é g a g é e p a r les
20 /il d ' e x t r a i t e s t n e t t e m e n t s u p é r i e u r e à c e l l e d e s 4 0 /il de s o l u t i o n
é t a l o n , d i l u e r l ' e x t r a i t 10 o u 100 fois a v e c d u c h l o r o f o r m e o u a v e c le
m é l a n g e de b e n z è n e e t d ' a c é t o n i t r i l e a v a n t de r é p é t e r l ' o p é r a t i o n de
chromatographie en couche mince.

C o n f i r m a t i o n de l ' i d e n t i t é de l ' a f l a t o x i n e B, :

C o n f i r m e r l ' i d e n t i t é de l ' a f l a t o x i n e B, d a n s l ' e x t r a i t a u m o y e n de


l ' é p r e u v e de p r é s o m p t i o n à l ' a c i d e s u l f u r i q u e e t , s i c e t t e é p r e u v e
d o n n e u n r é s u l t a t p o s i t i f , a u m o y e n d e s é p r e u v e s de c o n f i r m a t i o n ci-
a p r è s e n u t i l i s a n t la c h r o m a t o g r a p h i e b i d i m e n s i o n n e l l e e n c o u c h e m i n c e .
S i l ' é p r e u v e de p r é s o m p t i o n à l ' a c i d e s u l f u r i q u e d o n n e u n r é s u l t a t
n é g a t i f , il n ' e s t p a s n é c e s s a i r e de p r o c é d e r à la c o n f i r m a t i o n e f f e c t i v e
p u i s q u e , d a n s ce c a s , il n ' y a p a s d ' a f l a t o x i n e B,.
- 84 -

Epreuve de présomption à l'acide sulfurique:

Pulvériser de l'acide sulfurique sur le chromatogramme. La fluorescence


des taches d'aflatoxine B, doit virer du bleu au jaune sous le
rayonnement ultraviolet.

Chromatographic bidimensionnelle comportant la formation de l'hémiacétal


de l'aflatoxine B, d'aflatoxine B?a) avec utilisation d'acide
chlorhydrique: (La préférence doit être accordée à cette méthode si l'on
dispose de plaques à antigène préfixé et d'un coffret de pulvérisation
à succion.)

Application des solutions; (Suivre le diagramme de la figure 37.)

Tracer deux lignes droites sur une plaque parallèlement aux deux côtés
contigus (à 6 cm de chaque bord) pour limiter la migration du solvant.
Déposer des taches des solutions ci-après sur la plaque à l'aide des
pipettes capillaires ou de la microseringue.

Orientation Iï >

Q o

O
H
ro
3
rt
B)
rr
H1
O
3

0 o 0

B
— O

CM

H 12 cm -fl-4 c m 1
2 cm 2 cm

A: extrait de la prise d'essai


B et C: étalon d'aflatoxine B.

Figure 37
85

a u p o i n t A : u n v o l u m e d ' e x t r a i t de la p r i s e d ' e s s a i , o b t e n u e n
" E p u r a t i o n de la c o l o n n e " , c o n t e n a n t e n v i r o n 2,5 n g d ' a f l a t o x i n e
B,;

a u x p o i n t s B e t C: 25 fil de la s o l u t i o n étalon;

S é c h e r d a n s u n c o u r a n t d ' a i r o u d e s gaz i n e r t e à faible débit. Les


taches auront un diamètre d'environ 5 mm.

D é v e l o p p e m e n t : ( S u i v r e le d i a g r a m m e de la f i g u r e 37.)

D é v e l o p p e r la p l a q u e s u i v a n t l ' o r i e n t a t i o n I d a n s l ' o b s c u r i t é e n
u t i l i s a n t le s o l v a n t r é v é l a t e u r c h l o r o f o r m e - a c é t o n e 9 / 1 ( v / v ) j u s q u ' à
ce q u ' i l a t t e i g n e la l i g n e l i m i t e .

R e t i r e r la p l a q u e de la c u v e e t la l a i s s e r s é c h e r d a n s l ' o b s c u r i t é à la
t e m p é r a t u r e a m b i a n t e p e n d a n t 5 m i n u t e s . P u l v é r i s e r e n s u i t e de l ' a c i d e
c h l o r h y d r i q u e sur u n e b a n d e de 2,5 cm de l a r g e e n c o u v r a n t les p o i n t s
A e t C (zone i n d i q u é e p a r les h a c h u r e s s u r la f i g u r e 3 7 ) j u s q u ' à ce q u e
c e t t e z o n e d e v i e n n e f o n c é e , e n p r o t é g e a n t le r e s t e de la p l a q u e a v e c u n e
f e u i l l e de v e r r e . L a i s s e r r é a g i r 10 m i n u t e s d a n s l ' o b s c u r i t é e t s é c h e r
d a n s u n c o u r a n t d ' a i r à la t e m p é r a t u r e a m b i a n t e .

D é v e l o p p e r e n s u i t e la p l a q u e s u i v a n t l ' o r i e n t a t i o n II d a n s l ' o b s c u r i t é
en u t i l i s a n t le s o l v a n t r é v é l a t e u r c h l o r o f o r m e - a c é t o n e 9 / 1 ( v / v ) j u s q u ' à
ce q u ' i l a t t e i g n e la l i g n e l i m i t e . R e t i r e r la p l a q u e de la c u v e e t
l a i s s e r s é c h e r à la t e m p é r a t u r e a m b i a n t e .

I n t e r p r é t a t i o n du chromatogramme:

E x a m i n e r le c h r o m a t o g r a m m e sous rayonnement ultraviolet et vérifier


les p o i n t s s u i v a n t s :

1) A p p a r i t i o n d ' u n e t a c h e f l u o r e s c e n t e b l e u e d ' a f l a t o x i n e B, é m a n a n t
de la s o l u t i o n é t a l o n a p p l i q u é e e n B ( m i g r a t i o n s u i v a n t l ' o r i e n t a t i o n
I).

2) A p p a r i t i o n d ' u n e t a c h e f l u o r e s c e n t e b l e u e d ' a f l a t o x i n e B, n ' a y a n t


p a s r é a g i (avec l ' a c i d e c h l o r h y d r i q u e ) e t d ' u n e t a c h e de f l u o r e s c e n c e
b l e u e , p l u s i n t e n s e , de l ' h é m i a c é t a l de l ' a f l a t o x i n e B, à u n e v a l e u r
R^ p l u s f a i b l e , les d e u x é m a n a n t de la s o l u t i o n é t a l o n a p p l i q u é e e n
C (migration suivant l'orientation II).

3) A p p a r i t i o n de t a c h e s c o r r e s p o n d a n t à c e l l e s d é c r i t e s e n (2) é m a n a n t
de l ' e x t r a i t de la p r i s e d ' e s s a i a p p l i q u é e n A . L a p o s i t i o n de c e s
t a c h e s e s t d é f i n i e p r e m i è r e m e n t p a r la d i s t a n c e de m i g r a t i o n de
l ' a f l a t o x i n e B, à p a r t i r d u p o i n t A s u i v a n t l ' o r i e n t a t i o n I
( i d e n t i q u e à la d i s t a n c e p a r c o u r u e p a r l ' é t a l o n a p p l i q u é e n B e t ,
d e u x i è m e m e n t , p a r la d i s t a n c e de m i g r a t i o n à p a r t i r de là e t s u i v a n t
l ' o r i e n t a t i o n II de l ' h é m i a c é t a l de l ' a f l a t o x i n e B, ( i d e n t i q u e à
c e l l e p a r c o u r u e p a r l ' é t a l o n a p p l i q u é e n C . L ' i n t e n s i t é de la
f l u o r e s c e n c e des t a c h e s d ' h é m i a c é t a l é m a n a n t de l ' e x t r a i t d o i t
c o r r e s p o n d r e à c e l l e de l ' é t a l o n a p p l i q u é e n C .
- 86 -

Chromatographie bidimensionnelle comportant la formation de l'hémiacétal


de l'aflatoxine B1 (1'aflatoxine B?a) avec utilisation d'acide
fluoroacétique:

Application des solutions: (Suivre le diagramme de la figure 38.)

Tracer deux lignes droites sur une plaque parallèlement aux deux côtés
contigus (6 cm de chaque bord) pour limiter la migration du solvant.
Déposer des taches des solutions ci-après sur la plaque à l'aide des
pipettes capillaires ou de la microseringue.

au point A, un volume de l'extrait de la prise d'essai obtenu en


"Epuration de la colonne" (page 81) contenant environ 2,5 ng
d'alfatoxine B, ;

aux points B et C, 20 /il de la solution étalon.

Sécher dans un courant d'air ou de gaz inerte à faible débit. Les taches
obtenues doivent avoir un diamètre d'environ 5 mm.

Développement : (Suivre le diagramme de la figure 38.)

Orientation II-

T
1
T c
1
±

I
- — o — O
o 1
rsi — 1 o
h
H.
m
3
PC
eu
A'" B'" rf
H-
O O O
A" s
£
O O o B"
A' - B '
O 0

1 1
A
1 B
o — 0 -
E
u 1 1
1 1
I- 12 cm il 1.1-4 cm
2 cm 2 cm

A: extrait de la prise d'essai


B et C: étalon d'aflatoxine B,

Figure 38
- 87 -

Développer la plaque suivant l'orientation I dans l ' o b s c u r i t é , en


u t i l i s a n t le solvant révélateur éther-méthanol-eau 94/4,5/1,5 (v/v/v)
jusqu'à ce qu'il atteigne la ligne limite. Retirer la plaque de la cuve
et la laisser sécher dans l'obscurité à la température ambiante p e n d a n t
15 m i n u t e s .

Développer ensuite la plaque suivant l'orientation II dans l ' o b s c u r i t é ,


en u t i l i s a n t le solvant révélateur chloroforme-acétone 9/1 (v/v) j u s q u ' à
ce qu'il atteigne la ligne limite. Retirer la plaque de la cuve et la
laisser sécher dans l'obscurité à la température a m b i a n t e .

Examiner le chromatogramme sous rayonnement u l t r a v i o l e t et m a r q u e r au


m o y e n d'un crayon à mine douce l'emplacement de la tache de solution
étalon au p o i n t B ' (voir figure 38) et de la tache présumée d'aflatoxine
B, (A') p r o v e n a n t de l'extrait. A u m o y e n d'un capillaire en v e r r e ,
déposer une tache de 1 à 2 ¿¿1 d'acide trifluoroacétique sur les taches
A ' et B ' . Sécher dans u n courant d'air à la température a m b i a n t e .

Développer de nouveau la plaque suivant l'orientation I (voir figure 38)


dans l'obscurité, en utilisant l'un des solvants révélateurs mentionnés
p r é c é d e m m e n t jusqu'à ce que ce dernier atteigne encore la ligne l i m i t e .
Retirer la plaque de la cuve et la laisser sécher dans l'obscurité à la
température ambiante pendant 15 m i n u t e s .

Interprétation du chromatogramme: (Suivre le diagramme de la figure 38.)

Examiner le chromatogramme sous rayonnement u l t r a v i o l e t et vérifier


les points suivants:

a) A p p a r i t i o n d'une faible tache fluorescente b l e u e , de dérivé


d'aflatoxine B, n o n identifié (position B ' ' ' ) , et d'une tache de
l'hémiacétal de l'aflatoxine B, développant une fluorescence b l e u e
plus intense (position B ' '), l'une et l'autre émanant de l'aflatoxine
B, servant d'étalon (position B').

b ) A p p a r i t i o n de taches fluorescentes bleues (positions A ' '' et A ' ' )


émanant de l'aflatoxine B, présumée dans l'extrait (position A ' ) ,
dont la v a l e u r R^ correspond à celles ayant pour origine l'aflatoxine
B, servant d'étalon (position B ' ) .

L'identité de l'aflatoxine B, dans l'extrait est confirmée quand la


v a l e u r R f de la tache d'hémiacétal de l'aflatoxine B, de l'extrait
correspond à celle de la tache de l'aflatoxine servant d'étalon
(positions A ' ' et B ' ' , r e s p e c t i v e m e n t ) .

f. Calcul des résultats

Estimation visuelle:

La formule suivante donne le contenu en /¿g d'aflatoxine B, par kg


d'échantillon (ppb):

X x S x V , où
Y x m
- 88 -

X et Y sont respectivement le volume en /il de la solution étalon


d'aflatoxine B, et le volume en /il de l'extrait développant une
fluorescence de même intensité;

S = concentration en /ig d'aflatoxine B, par ml de solution étalon;

V = volume final de l'extrait en /il, compte tenu de toute dilution


éventuellement nécessaire;

m = masse en grammes de la prise d'essai correspondant au volume


d'extrait soumis à une épuration sur colonne.

Mesure fluorodensimétrique:

La formule suivante donne le contenu en /ig d'aflatoxine B, par kg


d'échantillon:

S x V . où
Y x m

V = volume en /il d'extrait déposé sur la plaque (10 /il ou 20 /il);

S = masse en nanogrammes d'aflatoxine B, dans la tache d'extrait


(proportionnelle à la valeur de Y), déduite des mesures ;

V = volume final de l'extrait en /il, compte tenu de toute dilution


éventuellement nécessaire;

m = masse en grammes de la prise d'essai correspondant au volume


d'extrait soumis à une épuration sur colonne.

Chromatographic bidimensionnelle en couche mince (dépôt de taches pour


densimétrie)

But et champ d'application

Cette méthode permet de déterminer la teneur en aflatoxine B, des


produits d'alimentation humaine et des produits composés pour
alimentation animale, des produits d'alimentation animale simples
n'entrant pas dans le champ d'application de la méthode "Mode opératoire
pour la chromatographie unidimensionnelle en couche mince", page 78, et
des produits d'alimentation animale simples mentionnés dans le champ
d'application de la méthode, mais où la présence de substances gênantes
entrave le dosage de l'aflatoxine B,. Cette méthode n'est pas applicable
aux produits d'alimentation animale contenant de la pulpe d'agrumes. Le
seuil de détection est d'environ 0,01 mg/kg (10 ppb).

Principe

(N.B.: Comme pour la méthode à page 78.)

Réactifs

(N.B.: Tous les réactifs doivent être de qualité "réactif analytique".)

Acétone
- 89 -

Chloroforme, stabilisé avec de 0,5 à 1,0% d'éthanol a 96% (v/v)


n-Hexane
Méthanol
Ether éthylique anhydre exempt de peroxydes
Mélange de benzène et d'acétonitrile: 98/2 (v/v)
Mélange de chloroforme et de méthanol: 97/3 (v/v)
gel de silice pour chromatographie sur colonne; granulométrie: de 0,05
à 0,20 mm
Coton hydrophile préalablement dégraissé au chloroforme, ou laine de
verre
Sulfate de sodium anhydre granuleux
Gaz inerte, par exemple azote
Acide chlorhydrique (1 mol/L)
Diatomite (Kieselguhr, Hyflosupercel), lavée à l'acide
Gel de silice G-HR ou équivalent pour plaques à enduire par l'opérateur
Solvants révélateurs:
Mélange d'éther éthylique et de méthanol et d'eau: 94/4,5/1,5 (v/v/v),
cuve saturée;
Mélange de chloroforme et d'acétone: 9/1 (v/v), cuve non saturée;
Solution étalon contenant 0,1 /¿g d'aflatoxine B, par ml dans du
chloroforme ou dans le mélange de benzène et d'acétonitrile, préparée
et vérifiée comme indiqué ci-après;
Préparation de la solution étalon et détermination de la concentration:
procéder comme indiqué à la page 79;

Vérification de la pureté chromatographique de la solution étalon :

Procéder comme indiqué à la page 80.


Acide trifluoroacétique (conserver au réfrigérateur dans un flacon
parfaitement hermétique).
Propanol-2

Solvants révélateurs pour l'épreuve de confirmation:


Mélange de chloroforme et d'acétone et méthanol: 90/10/2 (v/v/v), cuve
non saturée;
Mélange de chloroforme et d'acétone et propanol-2: 85/12,5/2,5 (v/v/v),
cuve non saturée;

Hypochlorite de sodium (NaOCl), solution aqueuse à 5% (v/v).

d. Equipement

(N.B.: Comme pour la méthode indiqué à la page 80).


- 90 -

e. Mode opératoire

Préparation de l'échantillon d'épreuve: procéder comme indiqué à la


page 81.
Chromatographie bidimensionnelle en couche mince:
Application des solutions (suivre le diagramme de la figure 39).

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•13 cm HI — 5 cm-
2 cm
A: extrait de la prise d'essai
B, C, D, E: étalon d'aflatoxine B,

Figure 39

Tracer deux lignes droites sur une plaque parallèlement aux deux côtés
contigus (à 5 et 6 cm de chaque bord, respectivement) pour limiter la
migration du solvant. Déposer des taches des solutions ci-après sur la
plaque à l'aide des pipettes capillaires ou de la microseringue:

au point A, 20 ¿il de l'extrait de la prise d'essai;


au point B, 20 /il de la solution étalon;
au point C, 10 /¿I de la solution étalon;
au point D, 20 /il de la solution étalon;
au point E, 40 /il de la solution étalon.

Sécher dans un courant d'air ou de gaz inerte à faible débit. Les taches
obtenues doivent avoir un diamètre d'environ 5 mm.
91

Développement:; (Suivre le diagramme de la figure 39).

Développer la plaque suivant l'orientation I dans l'obscurité en


utilisant le solvant révélateur jusqu'à ce qu'il atteigne la ligne
limite. Retirer la plaque de la cuve et la laisser sécher dans
l'obscurité à la température ambiante pendant 15 minutes.

Développer ensuite la plaque suivant l'orientation II dans l'obscurité


en utilisant le second solvant révélateur éther-méthanol-eau 94/4,5/1,5
(v/v/v) jusqu'à ce qu'il atteigne la ligne limite. Retirer la plaque de
la cuve et la laisser sécher dans l'obscurité à la température ambiante.

Interprétation du chromatogramme: (Suivre le diagramme de la figure 39.)

Irradier le chromatogramme à l'ultraviolet en plaçant la plaque à 10 cm


d'une lampe à ultraviolets. Repérer la position des taches fluorescentes
bleues B', C', D' et E' de l'aflatoxine B, provenant de la solution
étalon. Projeter deux lignes imaginaires traversant ces taches à angle
droit par rapport à l'orientation du développement. L'intersection P de
ces lignes est l'endroit où l'on peut s'attendre à trouver la tache
d'aflatoxine B., provenant de l'extrait de la prise d'essai appliquée en
A. Toutefois, il se peut que l'emplacement réel de la tache d'aflatoxine
B, soit un point A': à l'intersection de deux droites imaginaires
formant un angle d'environ 100° entre elles et traversant respectivement
les taches B' et C'. Doser la quantité d'aflatoxine B, dans l'extrait
de la prise d'essai, comme indiqué ci-après.

Chromatographie supplémentaire:

Tracer deux lignes droites sur une nouvelle plaque parallèlement aux
deux côtés contigus, comme indiqué sur le diagramme de la figure 39, et
appliquer au point A 20 /il de l'extrait de la prise d'essai et, en
surimposition, 20 de la solution étalon. Développer comme indiqué
précédemment. Irradier le chromatogramme à l'ultraviolet et vérifier:

que les taches d'aflatoxine B, de l'extrait et de la solution étalon


soient surimposées;

que la fluorescence de cette tache soit plus intense que celle de


la tache d'aflatoxine B, se trouvant en A' sur la première plaque.

Dosage :

Estimer visuellement ou doser par fluorodensimètre comme indiqué ci-


après .

Estimation visuelle :

Estimer la quantité d'aflatoxine B, dans l'extrait en comparant


l'intensité de la fluorescence de la tache d'extrait (A') avec celle des
taches C' , D' et E' de la solution étalon. Au besoin, procéder par
interpolation. Si la fluorescence émanant des 20 /¿I d'extrait est plus
intense que celle des 40 /J.1 de solution étalon, diluer l'extrait 10 ou
100 fois avec du chloroforme ou avec le mélange de benzène et
d'acétonitrile avant de répéter l'opération de chromatographie en couche
mince.
92 -

Mesure par fluorodensimétrie:

Mesurer au fluoroderisimètre l'intensité de la fluorescence dégagée par


les taches d'aflatoxine B, à une longueur d'ondes d'excitation de 365 nm
et à une longueur d'ondes d'émission de 443 nm. Déterminer la quantité
d'aflatoxine B, dans la tache d'extrait (A') en comparant l'intensité
de la fluorescence de la tache d'extrait avec celle des taches C , D'
et E' de la solution étalon. Si la fluorescence développée par les 20 ¿¿1
d'extrait est plus intense que celle des 40 ni de solution étalon,
diluer l'extrait 10 ou 100 fois avec du chloroforme ou avec le mélange
de benzène et d'acétonitrile avant de répéter l'opération de
chromatographie en couche mince.

Confirmation de l'identité de l'aflatoxine B, :

Par commodité, la préférence est accordée à la première méthode ci-


après, parce que la plaque utilisée pour le dosage convient directement
aux fins de confirmation. Si l'on ne dispose pas d'acide
trifluoroacétique, il faut appliquer la seconde méthode. Toutefois, il
est alors impératif de disposer de plaques à antigènes préfixé et d'un
coffret de pulvérisation avec succion.

Chromatographie bidimensionnelle comportant la formation de l'hémiacétal


de l'aflatoxine B, (l'aflatoxine B2a) avec utilisation d'acide
trifluoroacétique.

Examiner le chromatogramme sous rayonnement ultraviolet et marquer au


moyen d'un crayon à mine douce l'emplacement de la tache (B') (voir
figure 39) provenant de la solution étalon et appliquée au point B, et
de la tache (A') provenant de l'extrait de la prise d'essai et appliquée
au point A. A l'aide d'un capillaire en verre, déposer de 1 à 2 /il
d'acide trif luoroacétique sur les taches A' et B'. Sécher dans un
courant d'air à la température ambiante.

Développer de nouveau la plaque suivant l'orientation I (voir figure 39)


dans l'obscurité en utilisant un des solvants révélateurs jusqu'à ce que
ce dernier atteigne encore la ligne limite. Retirer la plaque de la cuve
et la laisser sécher dans l'obscurité à la température ambiante pendant
15 minutes.

Interprétation du chromatogramme: (Suivre le diagramme de la figure 39.)

Examiner le chromatogramme sous rayonnement ultraviolet et vérifier les


points suivants:

1) Apparition d'une faible tache fluorescente bleue de dérivé non


identifié d'aflatoxine B, (position B' ' ') et d'une tache fluorescente
bleue plus intense d'hémiacétal de l'aflatoxine B, (position B''),
les deux provenant de l'aflatoxine B, servant d'étalon (position B').

2) Apparition de taches fluorescentes bleues (positions A' ' ' et A' ' )
émanant de l'aflatoxine B, présumée dans l'extrait (position A') dont
la valeur fy correspond à celle de l'aflatoxine B, servant d'étalon
(position B'). L'identité de l'aflatoxine B, dans l'extrait est
confirmée quand la valeur R< de la tache d'hémiacétal de l'aflatoxine
B, provenant de l'extrait correspond à celle de la tache de l'étalon
(positions A'' et B'', respectivement).
- 93 -

Chromatographic bidimensionnelle comportant la formation de l'hémiacétal


de l'aflatoxine B, (aflatoxine B2a) avec utilisation d'acide
chlorhydrique: procéder comme indiqué à la page 82. Voir figure 37.

Calcul des résultats

Estimation visuelle:

La formule suivante donne le contenu en /¿g d'aflatoxine B, par kg


d'échantillon (ppb):

X x S x V . où
Y x m

X et Y représentent respectivement le volume en /il de la solution étalon


d'aflatoxine B, et de l'extrait développant une fluorescence de même
intensité ;

S = concentration en /¿g d'aflatoxine B, par ml de solution étalon;

V = volume final de l'extrait en /il, compte tenu de toute dilution


éventuellement nécessaire;

m = masse en grammes de la prise d'essai correspondant au volume


d'extrait soumis a une épuration sur colonne.

Mesure fluorodensimétrique:

La formule suivante donne le contenu en /ig d'aflatoxine B, par kg


d'échantillon:

S x V . où
Y x m

V = volume en /il de l'extrait déposé en taches sur la plaque (20 /il);

S = masse en nanogrammes d'aflatoxine B, dans la tache d'extrait


proportionnelle à la valeur de Y, déduite d'après les mesures;

V = volume final de l'extrait en /il, compte tenu de toute dilution


éventuellement nécessaire;

m = masse en grammes de la prise d'essai correspondant au volume


d'extrait soumis à une épuration sur colonne.

Chromatographie bidimensionnelle en couche mince (dépôt antidiagonal des


taches)

But et champ d'application

Cette méthode permet de déterminer (visuellement) la quantité


d'aflatoxine B, dans les produits d'alimentation humaine et dans les
produits d'alimentation animale simples ou composés, à l'exclusion de
ceux qui contiennent de la pulpe d'agrumes.
- 94 -

b. Principe

La prise d'essai est soumise à une extraction au chloroforme. L'extrait


est filtré et une partie aliquote est prélevée et épurée par
chromatographie sur colonne sur gel de silice. L'éluat est évaporé et
le résidu redissous dans un volume spécifique de chloroforme ou d'un
mélange de benzène et d'acétonitrile. On soumet une partie aliquote de
cette solution à une opération de chromatographie bidimensionnelle en
couche mince en utilisant la technique de l'application antidiagonale
des taches afin de faciliter la comparaison visuelle de la tache
d'échantillon et de la tache d'aflatoxine B, servant d'étalon. On
détermine visuellement la quantité d'aflatoxine B, sous rayonnement
ultraviolet du chromatogramme en comparant avec des quantités connues
de l'aflatoxine B, servant d'étalon. L'identité de l'aflatoxine B,
extraite du produit d'alimentation animale est confirmée par formation
de l'hémiacétal de l'aflatoxine b, sur la plaque de chromatographie en
couche mince.

c. Réactifs

(N.B.: Comme indiqué à la page 88) .

d. Equipement

(N.B.: Comme indiqué à la page 80).

e. Mode opératoire

Préparation de l'échantillon d'épreuve:


Procéder comme indiqué à la page 81.
Chromatographie bidimensionnelle en couche mince avec utilisation de la
technique d'application antidiagonale des taches.
Application des solutions (suivre le diagramme de la figure 40).

Tracer deux droites sur une plaque parallèlement aux deux côtés contigus
(à 3 cm de chaque bord) pour limiter la migration du solvant. Déposer
des taches des solutions ci-après sur la plaque à l'aide de pipettes
capillaires ou de la microseringue.

au point A, 20 /il de l'extrait de la prise d'essai;


au point B, 10 /il de la solution étalon;
au point C, 20 /il de la solution étalon;
au point D, 40 /il de la solution étalon;
au point E et F, 20 /il de la solution étalon.

Sécher dans un courant d'air ou de gaz inerte à faible débit. Les taches
obtenues doivent avoir un diamètre d'environ 5 mm.
95

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2 cm

A: extrait de la prise d'essai

B, C, D, E et F: aflatoxine B, servant d'étalon

F i g u r e 40

Développement : (Suivre le diagramme de la figure 40.)


Développer la plaque suivant l'orientation I dans l'obscurité en
utilisant le premier solvant révélateur éther-méthanol-eau 94/4,5/1,5
(v/v/v) jusqu'à ce qu'il atteigne la ligne limite. Retirer la plaque de
la cuve et la laisser sécher dans l'obscurité à la température ambiante
pendant 15 minutes.

Développer ensuite la plaque suivant l'orientation II dans l'obscurité


en utilisant le second solvant révélateur chloroforme-acétone 9/1 (v/v)
jusqu'à ce qu'il atteigne la ligne limite. Retirer la plaque de la cuve
et la laisser sécher dans l'obscurité à la température ambiante.

Interprétation du chromatogramme : (Suivre le diagramme de la figure 40.)

Irradier le chromatogramme aux rayons ultraviolets en plaçant la plaque


à 10 cm de la lampe à ultraviolets. Repérer la position des taches
fluorescentes bleues B', C', D', E' et F'. Projeter deux lignes
imaginaires passant respectivement à travers les taches E' et F' et
perpendiculairement à l'orientation du développement. L'intersection P
de ces lignes est l'endroit où l'on peut s'attendre à trouver la tache
- 96

d'aflatoxine B, provenant de l'extrait de la prise d'essai appliquée en


A. Toutefois, il se peut que l'emplacement effectif de la tache
d'aflatoxine B, soit un point A' à l'intersection d'une droite
imaginaire perpendiculaire à l'orientation du premier développement à
travers la tache E' à partir de la position de départ E et d'une autre
droite imaginaire passant par les positions B', C et D' des taches
d'étalon.

L'aflatoxine B, est présente dans la prise d'essai si l'on peut


visualiser quatre taches développant une fluorescence bleue sur une
ligne imaginaire passant par les taches d'aflatoxine B, ayant pour
origine la prise d'essai appliquée en A et l'étalon d'aflatoxine B,
appliqué en B, C et D. Doser la quantité d'aflatoxine B1 dans l'extrait
de la prise d'essai.

Chromatographie supplémentaire:

Tracer deux lignes droites sur une nouvelle plaque parallèlement aux
deux côtés contigus, comme indiqué sur la figure 40, et appliquer au
point A (voir figure 40) 20 /¿I de l'extrait de la prise d'essai obtenu
et, surimposés sur celui-ci, 20 ni de la solution étalon. Développer
comme précédemment. Irradier le chromatogramme à l'ultraviolet et
vérifier que:

les taches d'aflatoxine B, provenant de l'extrait et de la solution


étalon soient surimposées;

la fluorescence de cette tache soit plus intense que celle de la


tache d'aflatoxine B, en A' sur la première plaque.

Dosage :

Estimation visuelle:

Estimer la quantité d'aflatoxine B, dans l'extrait en comparant


l'intensité de la fluorescence développée par la tache d'extrait avec
celle des trois taches d'aflatoxine B, servant d'étalon situées en B',
C' et D' . Au besoin, procéder par interpolation. Si la fluorescence
développée par les 20 fil d'extrait est plus intense que celle des 40 /il
de solution étalon, diluer l'extrait 10 ou 100 fois avec du chloroforme
ou avec le mélange de benzène et d'acétonitrile avant de répéter
l'opération de chromatographie en couche mince.

Confirmation de l'identité de l'aflatoxine B, :

Confirmer l'identité de l'aflatoxine B, dans l'extrait en effectuant


l'épreuve de présomption à l'acide sulfurique et, si celle-ci donne un
résultat positif, procéder aux épreuves de confirmation par
chromatographie bidimensionnelle en couche mince. Si l'épreuve de
présomption à l'acide sulfurique donne un résultat négatif, il n'est pas
nécessaire de procéder à la confirmation effective puisque, en pareil
cas, il n'y a pas d'aflatoxine B,. La préférence doit être donnée à la
seconde méthode de confirmation si l'on dispose de plaques à antigène
préfixé et d'un coffret de pulvérisation à succion.
- 97 -

Epreuve de présomption à l'acide sulfurique:

Pulvériser de l'acide sulfurique sur le chromatogramme. La fluorescence


des taches d'aflatoxine B, doit virer du bleu au jaune sous rayonnement
ultraviolet.

Chromatographie bidimensionnelle comportant la formation de l'hémiacétal


de l'aflatoxine B, (1'aflatoxine B 2 a) avec utilisation d'acide
chlorhydrique.

Procéder comme indiqué à la page 84. Voir figure 37.

Chromatographie bidimensionnelle comportant la formation de l'hémiacétal


de l'aflatoxine B, (l'aflatoxine B 2 a) avec utilisation d'acide
trifluoroacétique.

Procéder comme indiqué à la page 86. Voir figure 38.

f. Calcul des résultats

Estimation visuelle:

La formule suivante donne le contenu en /¿g d'aflatoxine B, par kg


d'échantillon (ppb):

X x S x V . où
Y x m

X et Y représentent respectivement le volume en /i 1 de la solution étalon


d'aflatoxine B, et le volume en ¿¿1 de l'extrait développant une
fluorescence de même intensité;

S = concentration en /ig d'aflatoxine B, par ml de solution étalon;

V = volume final de l'extrait en /il, compte tenu de toute dilution


éventuellement nécessaire;

m «= masse en grammes de la prise d'essai correspondant au volume


d'extrait soumis a une épuration sur colonne.

Observations concernant les opérations de chromatographie en couche


mince

a. Délipidation

Les échantillons contenant plus de 5% de graisses seront délipidés au


pétrole léger (bp 40 à 60° C) avant la préparation initiale.

En pareil cas, les résultats d'analyse seront exprimés en fonction de


la masse de l'échantillon non dégraissé.

b. Répétabilité des résultats

L'écart entre les résultats de deux estimations parallèles effectuées


sur l'échantillon par le même opérateur ne doit pas dépasser:
- 98 -

25% p a r rapport au résultat le plus élevé pour la teneur en


a f l a t o x i n e B, depuis 10 /¿g/kg jusqu'à 20 /¿g/kg;

5 /¿g/kg pour les teneurs supérieures à 20 /¿g/kg et jusqu'à 50 /tg/kg;

10% p a r rapport à la valeur la plus élevée pour les teneurs


s u p é r i e u r e s à 50 /¿g/kg.

c. R e p r o d u c t i b i l i t é des résultats

La r e p r o d u c t i b i l i t é des r é s u l t a t s , c'est-à-dire la v a r i a t i o n entre les


r é s u l t a t s obtenus par au moins deux laboratoires avec le même
é c h a n t i l l o n , a été estimée comme suit:

± 50% de la v a l e u r m o y e n n e pour les valeurs moyennes d'aflatoxine B, se


s i t u a n t entre 10 et 20 /¿g/kg;

± 10% /¿g/kg de la v a l e u r moyenne pour les valeurs moyennes supérieures


à 20 /¿g/kg mais ne dépassant pas 50 /¿g/kg;

± 20% des v a l e u r s m o y e n n e s supérieures à 50 /ig/kg.

d. A p p l i c a t i o n de l'épreuve de confirmation à l'acide trifluoracétique

C h o i x des solvants révélateurs: (Voir le diagramme de la figure 38.)

Il est souhaitable d'avoir une valeur R^ d'aflatoxine B, de 0,5 au


m a x i m u m suivant l'orientation I pour disposer d'un espace suffisant pour
le troisième développement après la réaction à l'acide
t r i f l u o r o a c é t i q u e . La v a l e u r R, dépend du type de gel de silice u t i l i s é .
Si la v a l e u r Rf est supérieure à 0 , 5 , il est recommandé de réduire la
teneur du solvant révélateur en m é t h a n o l et e a u . De m ê m e , la v a l e u r R,
de l ' h é m i a c é t a l de l'aflatoxine B, varie selon le type de gel de silice
u t i l i s é . A f i n d'obtenir une distance de m i g r a t i o n o p t i m a l e , on peut
a j u s t e r la v a l e u r R, de l'hémiacétal de l'aflatoxine B, en m o d i f i a n t le
p o u r c e n t a g e de m é t h a n o l dans le solvant r é v é l a t e u r . Une distance de
m i g r a t i o n de l'hémiacétal de l'aflatoxine B, de 2 cm est jugée o p t i m a l e .

I n t e r p r é t a t i o n du chromatogramme: (Voir le diagramme de la figure 38.)

Q u a n d on analyse des échantillons faiblement c o n t a m i n é s , il est possible


q u ' o n ne puisse pas trouver le dérivé n o n identifié d'aflatoxine B,
(position A ' ' ' ) . De p l u s , ce dérivé n o n identifié d'aflatoxine B,
coïncide souvent avec des substances de fond dégageant de la
f l u o r e s c e n c e . T o u t e f o i s , l'hémiacétal de l'aflatoxine B, est n e t t e m e n t
d i s t i n c t et la confirmation repose essentiellement sur la p r é s e n c e de
cette tache.

4. T i t r a g e avec immunoadsorbant lié à u n e enzyme pour le dosage de


l ' a f l a t o x i n e B, dans les produits d'alimentation h u m a i n e et animale
R
M o d e o p é r a t o i r e basé sur la méthode A g r i - S c r e e n pour la détection de
l ' a f l a t o x i n e B,, N e o g e n C o r p o r a t i o n , Lansing MI 4 8 9 1 2 , Etats-Unis
d ' A m é r i q u e . Texte modifié par H . P . v a n Egmond.
- 99

Ce mode opératoire correspond à l'un des divers nécessaires d'épreuve


ELISA disponibles dans le commerce qui ont été mis au point pour le
dosage des aflatoxines dans les denrées agricoles. Le fait qu'il soit
inclus dans le présent manuel n'implique aucune approbation ni
recommandation de l'épreuve Agri-Screen par l'Organisation des Nations
Unies pour l'alimentation et l'agriculture à l'exclusion d'autres
méthodes d'épreuve ELISA qui pourraient également convenir pour le
dosage de l'aflatoxine B,.

But et champ d'application

Cette méthode permet le dosage semi-quantitatif de l'aflatoxine B, dans


les produits d'alimentation humaine et animale à des niveaux d'environ
20 pg/kg. Au moment de la rédaction du présent ouvrage (1987), on ne
connaissait pas encore l'éventail complet des produits auxquels cette
méthode est applicable. De même, les seuils de détection ne pouvaient
pas être précisés.

Principe

L'aflatoxine B, est conjuguée à une enzyme. Ce conjugué est utilisé


comme antigène connu (enzyme-conjugué). Des anticorps spécifiques de
l'aflatoxine B, sont fixés sur des cupules de microtitrage en matière
plastique. L'aflatoxine B, est extraite de l'échantillon à l'aide d'un
solvant. L'extrait est mélangé en parties égales avec l'aflatoxine B,
conjuguée à une enzyme et ce mélange est placé dans les cupules de
microtitrage enduits d'anticorps. L'aflatoxine B, contaminante provenant
de l'échantillon, si elle est présente, et l'aflatoxine B, conjuguée à
une enzyme sont en compétition pour se fixer sur les sites de liaison
de l'anticorps. L'aflatoxine B,, provenant de l'échantillon ou conjuguée
à une enzyme, qui est restée libre est évacuée par lavage. On ajoute
dans chaque cupule un support enzymatique solubilisé qui, s'il y a
présence d'une enzyme liée, est catalysé, virant d'une solution incolore
à une solution bleue. La couleur perd de son intensité à mesure
qu'augmente la quantité d'aflatoxine B, dans l'échantillon. Après
quelques minutes, on peut évaluer visuellement le changement de
coloration. En ajoutant le réactif fixant l'enzyme de couleur rouge, on
crée un spectre chromatique où une couleur se situant entre le mauve et
le rose ou le rouge indique des niveaux d'aflatoxine supérieurs à
20 ¿xg/kg, tandis qu'une couleur se situant entre le bleu et le bleu
foncé indique que la teneur de l'échantillon en aflatoxine est
inférieure à 20 ¿ug/kg.

Réactifs

Le nécessaire Agri-ScreenR contient tous les réactifs à l'exception du


méthanol.

Aflatoxine B, conjuguée à une enzyme. Conjugué enzymatique lyophilisé


spécifique de l'aflatoxine B, ou équivalent. Ne pas utiliser au-delà de
la date d'expiration.

Solution d'hydratation conjuguée à une enzyme. Eau distillée.


100 -

Support solide enduit d'anticorps. Barrettes de microtitrage à 12


cupules enduites d'anticorps ou équivalent. Ne pas utiliser au-delà de
la date d'expiration.

Support enzymatique contenant de la tétraméthylbenzidine dans un tampon


de citrate (pH 4,0). Boucher après utilisation et conserver au froid
(4° C).

Eau oxygénée. Contient 1,5 ml de H202 à 30% par litre dans un tampon de
citrate (pH 4,0). Boucher après utilisation et conserver au froid
(4° C).

Solution de fixation de la couleur. Contient 3,5 mg de HF, 10,5 g de


citrate de sodium, 6 ml de NaOH (NaOH = 1 mol/L) et 400 mg de Na4EDTA
par litre d'eau distillée. Boucher après utilisation et conserver au
froid.

Etalons d'aflatoxine B, dans une solution de méthanol (3,8).


Concentrations correspondant à 0, 5, 10, 20, 50 et 100 ¿¿g/kg
d'échantillon d'épreuve.

Solution de méthanol, méthanol de qualité réactif et eau: 55/45 (v/v).

Equipement

Le nécessaire Agri-ScreenR contient des cupules et des tubes de mélange.

Papier-filtre, Whatman N° 1 ou équivalent.

Pipettes. Pipetteur étalonné ou automatique à embouts à usage unique


capable de verser des quantités exactes de 0,1 à 1,0 ml Eppendorf ou
équivalent.

Eprouvettes à capsule vissée, contenance 50 ml.

Tubes de mélange. Verre ou matière plastique, 12 mm x 75 mm avec


couvercle.

Cupules de mélange. Barrette de microtitrage à 12 cupules ou équivalent.


Une cupule de mélange pour chaque étalon ou échantillon à soumettre à
1'épreuve.

Mélangeur Vortex. Capable d'agiter vigoureusement les tubes de mélange.


Mélangeur S/P (Scientific Products, Inc.) ou équivalent.

Mode opératoire

Préparation de l'échantillon d'épreuve:

Broyer l'échantillon de laboratoire de telle sorte qu'il traverse


parfaitement un tamis à mailles de 1 mm.

Extraction :

Peser 5 g d'échantillon d'épreuve et les placer dans une éprouvette à


capsule vissée. Ajouter 25 ml de solution de méthanol et agiter
vigoureusement pendant au moins une minute. Passer à travers un papier-
- 101 -

filtre dans une éprouvette de 50 ml ou équivalent. Tous les échantillons


à soumettre à l'épreuve doivent être préparés simultanément.

Préparation de la solution conjuguée à une enzyme :

Ajouter 2 ml de la solution d'hydratation conjuguée à une enzyme à


l'aflatoxine B, conjuguée à une enzyme. Bien mélanger afin de dissoudre
parfaitement. Ne pas agiter suffisamment pour produire de l'écume dans
le flacon. ATTENTION: La solution doit être à la température ambiante
avant utilisation et elle doit être utilisée dans les 30 minutes qui
suivent sa préparation.

Préparation de la solution de support enzymatique:

Transférer dans un tube de mélange 1 ml de support enzymatique et 1 ml


d'eau oxygénée. Boucher le tube et l'agiter vigoureusement. ATTENTION:
La solution doit être utilisée dans l'heure qui suit sa préparation.

Titrage immunoenzymatique:

N.B.: Il faut utiliser un embout de pipette distinct pour chacune des


étapes ci-après. Toujours verser dans les cupules au moyen de la pipette
dans le même ordre.

Mettre en place les cupules de mélange. Ne pas utiliser les cupules de


microtitrage où est fixé l'anticorps. Placer à la pipette dans chaque
cupule 0,1 ml de solution d'aflatoxine B, conjuguée à une enzyme.
Utiliser une cupule pour chaque échantillon à soumettre à l'essai et une
cupule pour chaque témoin. On peut utiliser avec chaque barrette jusqu'à
six cupules d'aflatoxine B, servant de témoin. Ajouter 0,1 ml
d'aflatoxine B, provenant de la solution étalon et du filtrat
d'échantillon dans les cupules distinctes et mélanger parfaitement en
réaspirant le liquide dans la pipette. Changer de pipette ou d'embout
pour chaque échantillon et témoin.

Mettre en place les cupules où est fixé l'anticorps. Transférer 0,1 ml


de la solution de chaque cupule de mélange à la cupule enduite
d'anticorps correspondante. Changer de pipette ou d'embout pour chaque
transfert. Laisser reposer à la température ambiante (22-25° C) pendant
10 minutes.

Agiter les cupules enduites d'anticorps pour en faire tomber la solution


dans un bac à déchets contenant une solution de décontamination (voir
Notes concernant la sécurité). Eviter que la solution de décontamination
ne pénètre dans les cupules. Laver les cupules dix fois en les
remplissant d'eau distillée, puis en les agitant pour évacuer la
solution de lavage. Après le lavage final, disposer les cupules à
l'envers sur un buvard et tapoter pour éliminer l'eau en excédent.

N.B.: Un seul embout de pipette doit être utilisé pour chacune des
étapes suivantes:

Ajouter immédiatement 0,1 ml de la solution servant de support


enzymatique dans chaque cupule où est fixé l'anticorps et laisser
reposer à la température ambiante pendant 5 minutes. Agiter doucement
la cupule plusieurs fois pendant le titrage en la maintenant sur la
paillasse et en tapotant le côté.
- 102 -

Ajouter 0,1 ml de solution de fixation de la couleur dans chaque cupule


d'anticorps et comparer la couleur qui se développe dans les cupules
témoins avec celle des cupules d'échantillon. Présenter les barrettes
sur un fond blanc pour effectuer la comparaison.

Interprétation des résultats

Comparer la couleur de chaque cupule d'échantillon avec les témoins dans


la même barrette. Noter la concentration de l'échantillon d'après
l'étalon dont il se rapproche le plus. L'étalon d'aflatoxine B, de
20 ¿¿g/kg est habituellement de couleur mauve. Si la couleur d'un
échantillon est plus bleue que celle de l'étalon d'aflatoxine B, de
20 /¿g/kg, cet échantillon contient moins de 20 /¿g/kg d'aflatoxine B,.
Si la couleur d'un échantillon est plus rose ou rouge que celle de
l'étalon de 20 /¿g/kg, cet échantillon contient plus de 20 /¿g/kg. Selon
l'opérateur, la couleur de l'étalon peut varier du mauve au lavande ou
bien l'étalon peut être légèrement rose, mais l'interprétation de
l'échantillon sera la même.

Notes concernant la sécurité

Laisser tremper tout le matériel de laboratoire, les embouts de pipettes


et les constituants du nécessaire d'épreuve dans une solution d'eau de
Javel à 10% avant de les mettre au rebut (l'eau de Javel contient
généralement 5,25% d'hypochlorite de sodium).
103 -

V. EXPOSES

1. Les mycotoxines: Introduction

Les mycotoxines sont de métabolites secondaires des champignons qui


peuvent développer des propriétés toxiques, cancérogènes, mutagènes,
tératogènes et oestrogènes. Le terme "mycotoxine" est tiré des mots grecs
mykes (champignon) et toksikon (poison) (1) . Les syndromes de toxicité
résultant de l'absorption de mycotoxines par l'homme ou les animaux sont
appelés "mycotoxicoses". Bien que certains champignons, tels que Claviceps
purpurea qui produit l'ergot, étaient connus depuis des siècles pour leur
toxicité prononcée et aiguë, c'est seulement après la découverte des
aflatoxines au Royaume-Uni en 1960 que la recherche a révélé qu'un grand
nombre d'autres espèces de champignons pouvaient former d'autres métabolites
secondaires toxiques tout aussi importants. Trois hypothèses ont été émises
quant à la fonction possible des métabolites secondaires (2) . Selon la
première, la formation de métabolites secondaires maintient la moisissure en
activité quand le support est épuisé; selon la deuxième, la formation de
métabolites empêche l'accumulation de composés anormaux, éventuellement
nocifs; selon la troisième hypothèse, le métabolisme secondaire a une utilité
sélective dans les systèmes écologiques: il se pourrait que les mycotoxines
soient produites comme mécanisme d'autodéfense contre d'autres organismes,
étant donné que certaines mycotoxines sont toxiques pour les animaux
supérieurs, les insectes et les micro - organismes. Il a été démontré que la
culture pure en laboratoire aboutit souvent à la disparition de l'activité qui
engendre la mycotoxine, ce qui pourrait s'expliquer par l'absence d'ennemis
naturels. Toutefois, selon toute probabilité ce phénomène est dû à la mutation
ou à la sélection de souches ne produisant que difficilement des toxines, cela
en raison du milieu de culture. En fait, il est douteux que la moisissure ait
besoin de produire des mycotoxines puisque des espèces aussi bien toxiques que
non toxiques pourraient être présentes dans la nature jusqu'à un certain
point.

Les mycotoxicoses sont connues de longue date. La première mycotoxicose


reconnue était probablement l'ergotisme, une maladie caractérisée par la
nécrose et la gangrène et mieux connue en Europe au Moyen-âge sous
l'appellation de "feu sacré"; elle était provoquée par l'absorption de
céréales contaminées par les sclérotes de Claviceps purpurea. Bien que les
mycotoxines fussent connues depuis longtemps, les mycotoxicoses ont été les
maladies délaissées jusqu'au début des années 1960 (3). Il y eut à cette
époque un brusque changement d'attitude par suite de la flambée de maladie X
du dindon en Grande-Bretagne. Plus de 100 000 dindons sont morts en quelques
mois. L'apparition de la maladie X du dindon a déclenché une campagne
pluridisciplinaire pour étudier la cause du problème. Ces efforts furent
couronnés de succès et l'origine de la maladie se révéla être un facteur
toxique présent dans la farine d'arachides brésilienne qui avait servi de
source de protéines pour l'alimentation des volailles atteintes. Le facteur
toxique semblait être produit par deux champignons, parasiticus et A.
flavus. d'où le nom d'aflatoxine qui lui fut donné, abréviation de
l'appellation du second champignon mentionné (4). L'étude plus poussée du
facteur toxique a révélé que la substance pouvait être séparée en quatre
taches distinctes par chromatographie (5) . Ces cinq composés ont reçu
l'appellation de aflatoxines B,, B2, G, et G2, selon la couleur de leur
104 -

fluorescence (B correspondant à "bleu", et G à "green", c'est-à-dire "vert"


en anglais) et leur mobilité chromatographique relative. On a constaté par la
suite que le groupe des aflatoxines comprend au moins 17 composés étroitement
apparentés, dont certains peuvent être présents dans des produits animaux par
suite du transfert de mycotoxines se trouvant dans les produits d'ali'mentation
ingérés par les bovins. Les aflatoxines sont très dangereuses pour l'homme et
les animaux, non seulement en raison de leur toxicité aiguë à doses élevées,
mais surtout à cause de leurs propriétés cangérogènes très prononcées. Les
enquêtes épidémiologiques ont révélé que l'incidence des tumeurs du foie était
plus élevée chez les sujets qui absorbent régulièrement des aliments
contaminés par les aflatoxines.

Au cours des deux décennies qui ont suivi la flambée de maladie X du


dindon, on a pu réunir une masse d'informations sur les aflatoxines et il est
apparu en outre qu'un grand nombre d'espèces de champignons pouvaient former
des mycotoxines. On connaît à l'heure actuelle plus de 200 mycotoxines
différentes avec des structures chimiques très diverses. La diapositive (6)
montre à titre d'exemple quelques-unes de ces structures. L'aflatoxine B, est
la mycotoxine la pus notoire, ayant une portion de difuranne caractéristique
et un anneau de lactone. On soupçonne que les deux parties de la molécule
jouent un rôle dans sa cancérogénicité. L'ochratoxine A est une autre
mycotoxine bien connue dont la structure moléculaire comporte une liaison
peptidique et un atome de chlore. Ce dernier semble assez particulier pour des
produits naturels. L'ochratoxine A provoque des lésions rénales. Il existe en
Europe plusieurs régions où l'on observe chez l'homme et les animaux la
néphropathie, maladie rénale qui peut être associée à l'absorption
d'ochratoxine A dans la nourriture. La patuline a une molécule relativement
petite et elle est dotée d'un anneau de lactone comme l'aflatoxine B, et
1 'ochratoxine A. La patuline a servi d'antibiotique dans le passé; de nos
jours, elle est considérée comme une mycotoxine qui peut être produite sur les
fruits et qui entraîne des hémorragies et un oedème chez les animaux
d'expérience. L'acide lysergique est un constituant des alcaloïdes qui
provoquaient l'ergotisme au Moyen-âge comme nous l'avons vu. La dernière
structure est celle d'une mycotoxine plus compliquée, la toxine T-2, qui
comporte un groupe époxy, caractéristique des trichothécènes, produites par
certaines souches de Fusarium. Dans les pays d'Afrique, les aflatoxines sont
probablement les mycotoxines les plus importantes.

L'homme peut être exposé aux mycotoxines non seulement par ingestion
d'aliments contaminés par la toxine, mais aussi par inhalation ou contact
cutané (7). On peut citer comme exemple d'exposition humaine par inhalation
l'observation faite par Van Nieuwenhuize qui a signalé le développement de
cancers dans divers organes chez des travailleurs qui avaient aspiré pendant
plusieurs années de petites poussières chargées d'aflatoxine dans une huilerie
où l'on broyait des arachides et d'autres oléagineux.

Cependant, la voie la plus importante est l'exposition par contamination


des aliments. Les matières premières des aliments et les produits alimentaires
peuvent être contaminés par des spores de conidies et par des fragments de
mycélium présents dans l'environnement. La contamination peut se développer
à différents stades de la production: pendant la croissance et le mûrissement
des plantes cultivées, pendant le traitement des produits semi-complets et
dans les produits de consommation. La présence d'espèces potentiellement
toxinogènes sur des produits alimentaires ne signifie pas toujours que ces
105 -

derniers contiennent des mycotoxines, parce que les conditions écologiques


favorables à la croissance des champignons ne sont pas nécessairement les
mêmes que pour la production des toxines, comme nous allons le voir sur l'une
des prochaines diapositives.

A l'inverse, la présence de mycotoxines ne signifie pas toujours que les


produits en question soient moisis. Le traitement thermique des produits
contaminés (par exemple le fait de griller les arachides ou la fabrication de
fourrage comprimé) permet de réduire de façon draconienne la teneur en
moisissures, alors que nombre de mycotoxines sont thermostables. De plus, les
mycotoxines peuvent être transférées des produits d'alimentation animale aux
produits alimentaires d'origine animale tels que la viande, le lait et les
oeufs. Ces produits animaux peuvent dès lors contenir des mycotoxines sans
être moisis. Les scientifiques se sont beaucoup penchés sur la contamination
des produits laitiers car on a découvert que l'aflatoxine B,, la plus notoire
des mycotoxines, était transformée par la vache laitière en son métabolite
hydroxylé M, (8), qui apparait dans le lait. Des expériences faites sur la
vache ont montré que de 1 à 4% de l'aflatoxine B, ingérée pouvaient être
récupérés dans le lait sous forme d'aflatoxine M,. On ignore si l'aflatoxine
M, a des propriétés cancérogènes. Quelques études de cancérogénicité portant
sur la truite arc-en-ciel et, plus récemment, sur le rat ont révélé que
l'aflatoxine M, est beaucoup moins cancérogène que l'aflatoxine B,. Toutefois,
aucune étude poussée sur la cancérogénicité de l'aflatoxine M, n'a été
publiée, probablement en raison de l'absence de substance suffisamment pure.
Vu sa forte toxicité et l'incertitude qui persiste quant à une éventuelle
cancérogénicité, la présence de ce composé est jugée indésirable dans les
produits alimentaires. Aussi plusieurs pays ont-ils promulgué une législation
visant à empêcher la contamination du lait et des produits laitiers par
l'aflatoxine M,.

Pour les pays en développement, la contamination directe des denrées


agricoles par les mycotoxines est plus importante que la contamination
indirecte par transfert.

Les moisissures ne se développent que dans des conditions favorables.


Les champignons ont besoin de divers nutriments pour se procurer l'énergie
nécessaire et pour former des macromolécules telles que les protéines et
l'ADN. Beaucoup de produits d'alimentation humaine et animale contiennent les
nutriments nécessaires et peuvent donc servir de support. Un grand nombre de
métabolites se forment lors de la décomposition des glucides, quelques-uns
pouvant s'accumuler dans certaines conditions, par exemple l'éthanol et les
acides organiques. Pendant la croissance, et surtout à la fin de celle-ci, on
observe la synthèse de certains métabolites qui ne sont manifestement pas
nécessaires à la moisissure pour sa croissance et son apport énergétique.
Certains de ces métabolites secondaires sont toxiques pour les micro-
organismes et on les appelle antibiotiques. D'autres sont (également) toxiques
pour les animaux supérieurs et on les appelle mycotoxines.

Outre la présence de nutriments, les facteurs les plus importants pour


la croissance et la production de mycotoxines sont la température (9) et
l'activité de l'eau. La température optimale (10) pour la croissance est de
25-30° C pour la plupart des Penicillia et de 30-40° C pour les Aspergilli.
températures qui régnent souvent dans les pays en développement. Les espèces
de Fusarium peuvent être considérées comme psychrophiles, parce que leur
température optimale est assez basse (8-15° C) et que ces espèces sont
présentes dans les régions à climat tempéré.
106 -

Le facteur appelé activité de l'eau (a^,) mesure l'eau libre qui, dans
les produits alimentaires, est disponible pour la croissance de la moisissure.
Ce terme est expliqué sur la diapositive (11). On utilise le terme d'humidité
relative pour l'atmosphère: l'humidité relative d'équilibre ou pression de
vapeur d'eau relative d'équilibre est en équilibre avec l'humidité de la
substance entreposée. L'activité de l'eau est définie sur la diapositive (12).
Il s'agit du quotient de la tension de vapeur d'eau du produit par la tension
de vapeur de l'eau pure à la même température et tension.

Plus l'eau se trouve sous une forme liée au support, moins il y a d'eau
disponible pour le champignon et plus l'activité a w est faible. Non seulement
la a^ influe sur la croissance des champignons mais, de plus, elle affecte la
production de mycotoxines. Quand la a,, est inférieure à une certaine valeur,
il n'y a pas production de mycotoxines. Cette valeur dépend de la mycotoxine
en cause, de la souche de champignon considérée, du support et de la
température.

La diapositive (13) montre l'éventail de a w pour la croissance


d'Aspergillus flavus et la production d'aflatoxine sur de la gélose de
saccharose d'extrait de malt à diverses températures. Le taux de croissance
fongique est représenté par les colonnes ouvertes, tandis- que la quantité
d'aflatoxine B, produits est représentée par les colonnes blanches. La a w pour
la production d'aflatoxine varie de 0,87 à 1,00 et la température de 12 à
37° C. Par ailleurs, la a w optimale pour la production de toxine, soit 0,99,
est supérieure à celle nécessaire pour la croissance, qui est de 0,95. Les
valeurs minimales de a w pour la croissance fongique et pour la production de
toxine peuvent différer selon le support et le Comité sur l'hygiène
alimentaire de la Commission du Codex Alimentarius a proposé comme norme une
a w de 0,70 pour les arachides afin d'éviter leur contamination par les
aflatoxines.

Un système assez complexe est normalement nécessaire pour mesurer la a w


d'un support. Cependant, Northolt a mis au point pour estimer la a w des
produits d'alimentation humaine une technique simple appelée épreuve de
liquéfaction des cristaux de sel. Cette épreuve repose sur le fait que les
cristaux de sel ont la propriété d'attirer la vapeur d'eau et de se liquéfier
si la pression de vapeur d'eau dans l'atmosphère dépasse celle de la solution
saturée de sel. On dépose de 40 à 80 g de l'échantillon, par exemple des
arachides, dans un flacon (14) qui est ensuite fermé et équilibré pendant au
moins deux heures. On ouvre ensuite brièvement le flacon (15) et l'on
pulvérise sur la surface interne du couvercle une couche très mince de
vaseline. Quelques dizaines de cristaux appropriés (en l'occurrence du
CuCl2.2H20) sont étalés sur la vaseline à l'aide d'une spatule. On ferme le
flacon et on l'équilibre pendant environ quatre heures. On observe ensuite les
cristaux pour voir s'ils sont liquéfiés ou non (16). Quand 50% au moins des
cristaux son liquéfiés, l'épreuve est considérée comme ayant donné un résultat
positif, ce qui signifie que la a w de l'échantillon est supérieure à la a w
spécifique du sel. Dans cet exemple, on a utilisé des cristaux de CUC12.2H20,
qui ont une a^, spécifique de 0,70. Cela signifie que la a w des arachides est
supérieure à 0,70 et, par conséquent, l'échantillon illustré sur la
diapositive n'est pas conforme à la norme Codex proposée pour les arachides.
L'épreuve de liquéfaction des cristaux de sel peut être facilement effectuée
sur le terrain et l'on obtient le résultat en quelques heures. L'épreuve de
liquéfaction des cristaux de sel est une épreuve physique indirecte de terrain
- 107

qui indique seulement que la présence d'une mycotoxine est possible. On peut
en obtenir la preuve directe en appliquant des méthodes d'analyse pour
déterminer la présence effective d'une ou plusieurs mycotoxines dans la denrée
à inspecter.

Deux approches sont possibles pour la détection et le dosage des


mycotoxines: les méthodes biologiques et les méthodes chimiques. Les méthodes
biologiques peuvent être utiles pour le dépistage de mycotoxines connues ou
inconnues. On peut indiquer à titre d'exemple qu'elles ont joué un rôle
important lors de la découverte des aflatoxines. Toutefois, le titrage
biologique manque généralement de spécificité et de reproductibilité et il
faut accorder la préférence aux titrages chimiques pour le dosage des
mycotoxines: les étapes fondamentales sont exposées sur la diapositive
suivante (17).

L'échantillonnage fait partie intégrante de l'analyse. Il a pour objet


d'obtenir un échantillon de laboratoire (prise d'essai) représentatif du lot
sur lequel il est prélevé. La décision d'accepter ou de rejeter un lot sera
fondée sur les résultats de l'analyse de l'échantillon. L'échantillonnage peut
poser un très grand problème, par exemple si la toxine n'est pas distribuée
de façon homogène dans le lot à inspecter. Des sacs d'arachides (18) peuvent
comprendre quelques arachides contenant de l'aflatoxine réparties de façon
inégale parmi celles qui sont saines. La diapositive suivante (19) illustre
les résultats de l'analyse de dix sous - échantillons prélevés sur un lot. On
a constaté que la concentration moyenne d'aflatoxine B, était de 36 /¿g/kg,
alors que les résultats variaient de 0 à 165 /¿g/kg. Cet exemple illustre
clairement les difficultés auxquelles on est confronté lorsqu'il s'agit
d'approuver ou de rejeter un lot sur la base des résultats de quelques
analyses. Les statisticiens ne sont pas encore parvenus à un accord sur la
méthode d'échantillonnage qu'il convient d'appliquer pour obtenir la meilleure
estimation possible de la teneur effective en toxine. Malgré ces problèmes,
des méthodes d'échantillonnage ont été élaborées pour certaines denrées
agricoles. On peut citer comme exemple la méthode d'échantillonnage pour les
produits d'alimentation animale qui est officiellement utilisée dans la
Communauté européenne (20).

L'analyse effective de la prise d'essai (habituellement de 20 à 100 g)


débute par l'isolement du constituant recherché. En général, les mycotoxines
sont extraites au moyen d'un solvant organique tel que le chloroforme, le
dichlorométhane, 1'acétonitrile, l'acétate d'éthyle, l'acétone ou le méthanol
(21) . Ces solvants peuvent être utilisés en association avec de faibles
quantités d'eau et d'acides. Les mycotoxines n'étant normalement présentes
qu'en très faibles quantités, une forte concentration de l'extrait est
nécessaire pour permettre le dépistage final. La présence fréquente de lipides
et d'autres constituants entrave toute concentration adéquate et la détection
finale. En pareil cas, il faut épurer les échantillons avant la concentration.
Plusieurs étapes d'épuration chromatographique sur colonne sont possibles avec
des substances telles que le gel de silice, l'oxyde d'aluminium, les
polyamides, le FlorisilR et le SephadexR (22). La substance la plus
fréquemment utilisée est le gel de silice. Le choix définitf du support dans
la colonne dépend des substances à éliminer (constituants de la matrice) et
du constituant recherché, qui est la mycotoxine à doser. Après addition de
l'extrait dans la colonne d'épuration, les impuretés sont habituellement
éliminées par lavage au moyen de solvants dans lesquels les toxines sont
108 -

insolubles ou moins solubles que les impuretés. On modifie ensuite la


composition du solvant de telle sorte que les toxines soient éluées d'une
manière sélective à partir de la colonne, puis l'éluat est recueilli, avec
certaines méthodes, on procède à une extraction liquide-liquide dans des
ampoules de décantation, par exemple du pentane avec du méthanol et de l'eau.
La plupart des toxines n'étant pas lipophiles, les graisses peuvent être
éliminées de la sorte sans la toxine.

Toutes ces techniques d'épuration sont en fait des méthodes de


séparation grâce auxquelles des groupes de substances ayant chacune un
comportement physicochimique différent sont séparés les uns des autres. Il
devient ainsi possible d'éliminer sans la toxine la majeure partie des autre
substances dans l'extrait. Les extraits qui ont été épurés sont généralement
concentrés par évaporation du solvant au moyen d'un évaporateur rotatif ou par
utilisation d'une étuve. Après la concentration on obtient un extrait final
qui est de nouveau soumis à l'étape du dosage. En dépit de l'épuration,
l'extrait final peut contenir d'autres substances extraites simultanément qui
risquent d'entraver le dosage de la mycotoxine. Il existe plusieurs moyens de
séparer la mycotoxine recherchée de ces autres constituants de la matrice. On
a le plus souvent recours aux méthodes chromatographiques, qui sont des
techniques de séparation physique (23). Pour les pays en développement, la
chromatographie unidimensionnelle et bidimensionnelle en couche mince doit
être considérée comme la technique chromatographique la plus importante pour
le dosage des mycotoxines et un exposé distinct (V.2) sera donc consacré à ces
techniques.

Les titrages immunologiques (24) sont des méthodes qui reposent sur des
principes tout à fait différents par rapport aux méthodes chromatographiques.
Les titrages immunologiques en sont encore à leur stade initial d'application
pour le dosage des mycotoxines. Néanmoins, le titrage sur immunoadsorbant lié
à une enzyme (ELISA), en particulier, gagne rapidement du terrain et c'est
pourquoi un exposé distinct (V.3) sera consacré aux techniques ELISA.

Diapositive (1) Explication du terme "mycotoxine"


(2) Fonctions possibles des mycotoxines
(3) Mycotoxicoses: maladies délaissées
(4) La toxine de flavos: l'aflatoxine
(5) Taches d'aflatoxine sur une plaque de chromatographie en
couche mince
(6) Structure de quelques mycotoxines importantes
(7) Voies d'exposition aux mycotoxines
(8) Structure chimique des aflatoxines B, et M,
(9) Facteurs principaux pour la croissance fongique et la
production de toxine
(10) Températures optimales pour la croissance de Pénicillium.
Aspergillus et Fusarium
(11) Différents paramètres en rapport avec la vapeur d'eau
(12) Définition de la aw
(13) Eventail de a w et de températures pour la croissance de A.
flavus et la production d'aflatoxine
(14) Epreuve de liquéfaction des cristaux de sel: étape 1
(15) Epreuve de liquéfaction des cristaux de sel: étape 2
(16) Epreuve de liquéfaction des cristaux de sel: étape 3
(17) Etapes fondamentales des méthodes d'analyse
109

(18) Stockage de sacs d'arachides au Nigéria


(19) Distribution non homogène d'aflatoxine dans les arachides
d'un lot
(20) Méthode d'échantillonnage pour les produits d'alimentation
animale selon la directive de la Communauté européenne
(21) Solvants utilisés pour l'extraction des mycotoxines
(22) Substances d'épuration pour la chromatographie sur colonne
(23) Méthodes de séparation chromatographiques
(24) Méthodes de séparation immunochimiques

2. Techniques de chromatographie en couche mince

"La chromatographie met en oeuvre le principe séculaire: diviser pour


régner. Les substances sont soumises à division, ce qui permet à l'homme de
régner sur les éléments. Il faut régner pour le plus grand bien de l'humanité,
bien qu'elle ait été découverte il y a 75 ans, la chromatographie ne cesse de
se développer et elle demeure à jamais jeune et féconde".

Ces paroles du Dr. Chmutov, Président du Conseil scientifique de


l'Académie des Sciences de l'URSS, s'adressaient à la fin des années 1970 aux
titulaires de la médaille d'or "Tswett" à l'occasion du 75e anniversaire de
la découverte de la chromatographie par Tswett. A n'en pas douter, cette
médaille commémorative est la plus haute distinction qui puisse être accordée
pour des réalisations remarquables dans le domaine du développement de la
chromatographie. Tswett était un botaniste russe qui réussit à séparer les
carotènes et plusieurs xanthophylles présents dans les extraits organiques de
feuilles vertes en faisant passer la solution organique par une colonne
d'adsorbant solide tel que le carbonate de calcium. Plusieurs pigments
végétaux devinrent ainsi visibles, d'où le nom de "chromatographie" donné au
procédé, calqué sur les mots grecs khroma et graphein qui signifient "couleur"
et "écrire". Dans sa thèse de doctorat (1), Tswett décrivait le procédé d'une
manière plus détaillée. Il reconnaissait dans ce procédé un phénomène
d'adsorption. Les pigments le moins fortement adsorbés étaient lavés
rapidement à travers la colonne, tandis que les pigments fortement adsorbés
étaient immobilisés par leur adsorption si bien que leur vitesse de migration
à travers la colonne était considérablement réduite.

Outre la "chromatographie d'adsorption", où la séparation repose sur les


différentes affinités d'adsorption des constituants de l'échantillon vers la
surface d'un solide actif, on peut recenser les types suivants de
chromatographie (2): la chromatographie de partage, la chromatographie sur
échangeurs d'ions, le tamisage moléculaire (chromatographie d'exclusion), la
chromatographie d'ions appariés et la chromatographie d'affinité. Parmi
celles-ci, seules la chromatographie d'adsorption et la chromatographie de
partage revêtent de l'importance pour l'analyse visant à déceler les
mycotoxines. Comme les autres mécanismes de séparation ne présentent qu'une
importance mineure, nous n'y reviendrons pas ici. Très rares sont les exemples
de chromatographie d'adsorption pure (par exemple pour les travaux portant sur
les médicaments à base de charbon) et de chromatographie de partage pure (par
exemple la chromatographie sur papier). La plupart du temps, le phénomène sur
lequel repose la séparation est une association de chromatographie
d'adsorption et de chromatographie de partage. Ce type de chromatographie peut
être subdivisé comme suit (3):
110 -

a. La chromatographie en phase liquide à pesanteur (dont la


chromatographic sur colonne de Tswett fut la première application);

b. La chromatographie liquide sous haute pression (technique récente où


l'on utilise des pressions d'admission élevées et des micro-
supports) ;

c. La chromatographie en couche mince, dont les caractéristiques et


l'application possible pour le dosage des mycotoxines seront
examinées ci-après.

La chromatographie en couche mince est elle aussi une technique de


séparation assez "récente". Bien que les principes de la chromatographie en
couche mince aient été décrits avant la Deuxième Guerre mondiale par Izmailow
(1938) , cette technique a été surtout appliquée dans les années 1960 lorsque
E. Stahl a "redécouvert" la chromatographie en couche mince. Son plus grand
mérite a été de normaliser les adsorbants disponibles à l'époque. On peut
définir la chromatographie en couche mince (4) comme étant "la séparation de
faibles quantités de mélanges en différentes zones sur une couche mince
d'adsorbant". La couche mince (phase fixe) est fixée sur une plaque, par
exemple du verre ou du métal, principalement par étalement d'une suspension
d'adsorbant à laquelle a été ajouté un liant. Après avoir séché et conditionné
cette plaque de couche mince, on y applique un faible volume d'extrait de
l'échantillon à séparer et la plaque est ensuite placée, généralement dans une
position verticale, dans un coffret de séparation (souvent appelé la cuve)
partiellement rempli de la phase mobile, appelée solvant révélateur. Ce
solvant révélateur traverse la couche mince sous l'effet des forces
capillaires. Selon leurs caractéristiques physicochimiques, les constituants
de l'extrait se déplacent plus ou moins par rapport à la phase mobile et les
fractions séparées apparaissent sous forme de taches derrière le front de la
phase mobile sur la couche. Si la séparation est effectuée suivant une seule
orientation, on dit de la chromatographie en couche mince qu'elle est
unidimensionnelle (5). Si cette séparation n'est pas satisfaisante, on peut
procéder à un second développement suivant une orientation perpendiculaire à
la première en utilisant un autre type de solvant révélateur (6). On dit dans
ce cas que la chromatographie en couche mince est bidimensionnelle.

Le déplacement des substances séparées peut être exprimé par leur débit,
habituellement représenté par le symbole R^, lequel peut être défini comme
étant (7):
Distance de migration du composé
Distance de migration du solvant

le rapport entre la distance de migration du composé et la distance de


migration du solvant.

Le Rf est toujours inférieur à l'unité et, par convention, il est


habituellement indiqué avec deux décimales. Pour un ensemble solvant/adsorbant
donné, le R^ est caractéristique et reproductible pour chaque composé. Les
paramètres que sont l'adsorbant (phase fixe), le solvant (phase mobile) et le
composé qui doit être chromatographié constituent les trois éléments
fondamentaux d'une système chromatographique. Les variations de la phase fixe
et/ou de la phase mobile entraînent une modification du R, des solutions et
offrent donc la possibilité de séparer le produit dissous considéré (c'est-
à-dire la mycotoxine qu'il faut titrer) des autres constituants, ce qui rend
possibles la détection et le dosage.
- Ill

On peut utiliser tout un éventail d'adsorbants pour la chromatographie


en couche mince. Pour la détection des mycotoxines, on utilise le plus souvent
des plaques de chromatographie en couche mince à gel de silice car ce type
d'adsorbant est celui qui offre généralement la meilleure possibilité de
séparer la toxine recherchée des autres constituants de la matrice. On peut
préparer au laboratoire les plaques de chromatographie en couche mince à gel
de silice en utilisant le matériel approprié (8) . On peut aussi se les
procurer auprès de diverses entreprises commerciales sous forme de plaques où
les antigènes sont préfixés. Les caractéristiques des plaques à antigène
préfixé et des plaques enduites par l'opérateur peuvent différer d'une marque
à l'autre, voire d'un lot à l'autre, d'où un comportement différent lors de
la séparation, comme on le voit sur la diapositive (9) où un mélange
d'af latoxines B,, B2, G! et G2 a été séparé sur trois types de plaques
différents.

Les plaques préenduites et les plaques à enduire présentent différents


avantages. Les plaques enduites par l'opérateur (10) permettent à ce dernier
de choisir librement l'adsorbant et les additifs (par exemple du sulfate de
calcium pour fixer le gel de silice à la plaque de verre, du EDTA comme
chélateur, des agents de régulation du pH comme l'acide oxalique). On peut
faire varier l'épaisseur de la couche mince sur les plaques enduites par
l'opérateur en ajustant la sortie de l'étaleur. Enfin, les plaques enduites
par l'opérateur sont moins coûteuses que les plaques à antigène préfixé. En
revanche, les plaques à antigène préfixé (11) possèdent généralement une
couche plus uniforme et plus rigide et permettent un certain choix pour le
support, par exemple du verre, de la matière plastique ou de l'aluminium.
Elles sont prêtes à l'emploi et peuvent être stockées d'une manière très
simple dans leur conditionnement d'origine, même si on laisse les boites
ouvertes pendant une durée prolongée. Par contre, les plaques enduites par
l'opérateur nécessitent un séchage et une mise en activité à environ 110° C,
après quoi elles doivent être conservées dans un dessiccateur jusqu'au moment
de l'emploi. Pour assurer un stockage satisfaisant (12), il existe des
supports de séchage spéciaux conçus de manière à pouvoir être disposés dans
un dessiccateur, les plaques pouvant être introduites horizontalement sans
endommager la couche mince. On peut stocker les plaques après leur
développement dans des boites simples en bois qui les protègent de la lumière,
des influences atmosphériques et de tout dégât mécanique.

La chromatographie en couche mince peut être utilisée non seulement pour


séparer les substances et les identifier d'après leur R^, mais aussi pour
doser la substance à analyser qui est présente dans le mélange.

L'exactitude des résultats obtenus avec la chromatographie quantitative


en couche mince dépend dans une large mesure de la précision avec laquelle la
substance peut être appliquée sur les plaques. Pour l'analyse des mycotoxines
par chromatographie en couche mince, la substance qui est appliquée sur la
plaque a généralement un volume de l'ordre de 5 à 25 /il. Selon le degré
d'exactitude (pour mesurer l'erreur systématique) et de précision (pour
mesurer l'erreur accidentelle) souhaité (13), on utilise différents types
d'étaleurs (14). Pour la vérification, on se contentera de pipettes
capillaires qualitatives à usage unique. Pour les travaux quantitatifs, on
utilise des pipettes capillaires quantitatives à usage unique ou des seringues
de précision, qui sont plus exactes et plus précises. Qui plus est, ces
dernières permettent l'application par intermittence de volumes plus
- 112 -

importantes sous atmosphère inerte, étant utilisées en association avec un


verseur à répétition intégré dans un dispositif pour déposer les taches (15) .
On peut confectionner ce dispositif soi-même ou l'obtenir dans le commerce.

Le solvant pour déposer les taches, qui doit être le même pour l'extrait
et pour l'étalon, doit permettre (16) une solubilité satisfaisante de la
toxine à rechercher, et doit être volatil et donner des taches réduites et
uniformes. Ces conditions revêtent une grande importance pour obtenir des
résultats reproductibles.

Les plaques de chromatographie en couche mince existent en différents


formats (17). On peut résoudre la plupart des problèmes de séparation en
utilisant une plaque carrée de 20 x 20 cm; toutefois, l'utilisation de plaques
de 10 x 10 cm donnera souvent de bons résultats et même les plaques de
7 x 7 cm découpées par l'opérateur sont utiles, surtout pour un dépistage
rapide. En outre, les plaques de dimensions plus réduites offrent la
possibilité de les développer non seulement dans des coffrets spécialement
conçus à cet effet, mais aussi dans de simples béchers ou par séries de dix
à la fois sur sun support dit multiplaques, ce qui réduit considérablement la
durée totale requise pour une série d'opérations de chromatographie en couche
mince.

Le système de solvant utilisé doit évidemment permettre une séparation


satisfaisante des constituants du mélange à titrer. Il se compose généralement
d'au moins deux solvants de polarité différente, parce que l'emploi d'un
mélange donne habituellement une meilleure séparation que l'utilisation d'un
solvant unique. Pour être certain d'obtenir des résultats reproductibles, il
convient d'employer des solvants de qualité analytique. En règle générale,
pour la chromatographie en couche mince sur plaques à gel de silice, une
augmentation de la polarité du solvant révélateur aboutit à un accroissement
du Rf. On estime que le R, optimal des composés intéressants se situe entre
0,25 et 0,75. On peut influer sur la séparation entre les différents
constituants du mélange à titrer en modifiant le rapport des divers solvants
du système ou en ajoutant ou supprimant tel ou tel solvant.

D'autres facteurs peuvent aussi revêtir de l'importance, par exemple le


modèle et la taille su coffret de séparation utilisé et le degré de saturation
de ce coffret par les vapeurs de solvant. La saturation d'une cuve par la
vapeur de solvant aboutit à des valeurs de R^ plus faibles et souvent plus
cohérentes, parce que l'ampleur de la migration des substances dépend du débit
du solvant révélateur. Dans les cuves saturées de vapeur, ce débit du solvant
est beaucoup plus faible et beaucoup plus égal sur toute la plaque. Sur le
plan pratique, cela a pour avantage que la durée des opérations est abrégée.
La manière la plus simple de saturer une cuve consiste à la doubler
intérieurement d'une manière totale avec du papier-filtre et à remplir la cuve
de solvant révélateur, afin de saturer le papier de solvant.

Le dépôt des taches d'échantillon et d'étalon est normalement effectué


selon un schéma prescrit dans le cadre de la méthode d'analyse. Ce schéma de
dépôt des taches peut être applicable à la chromatographie unidimensionnelle
en couche mince ou, dans le cas d'un extrait "souillé", à la chromatographie
bidimensionnelle en couche mince.
113 -

On peut citer comme exemple (18) d'un schéma de dépôt des taches pour
chromatographic unidimensionnelle en couche mince celui de la méthode dite de
la Contamination Branch (CB) , qui peut être appliquée pour le dosage de
l'aflatoxine B, dans les arachides, les produits à base d'arachides et le
maïs. On dépose en taches de petites quantités d'extrait de l'échantillon et
de l'aflatoxine B, servant d'étalon sur une plaque de 20 x 20 cm, suivant une
ligne imaginaire située à 4 cm du bord inférieur de la plaque de
chromatographie en couche mince. Sur l'une des taches d'échantillon, on dépose
5 ni de l'étalon d'aflatoxine B, comme étalon interne. On dépose aussi une
tache de 5 ni d'un mélange qualitatif d'étalon d'aflatoxine pour indiquer si
la résolution est adéquate. Il subsiste sur la plaque de chromatographie en
couche mince assez d'espace pour déposer des taches d'autres extraits
d'échantillons permettant d'estimer la teneur en aflatoxine B, d'après la même
série d'étalons. Après évaporation du solvant utilisé pour le dépôt des
taches, on place la plaque dans une cuve de développement contenant un mélange
de chloroforme et d'acétone (9+1) et la plaque est développée jusqu'à ce que
le solvant atteigne la ligne limite (tracée à 16 cm du bord inférieur de la
plaque), la durée de cette opération étant d'environ 40 minutes. Après
séchage, on observe la plaque sous éclairage ultraviolet dans les grandes
longueurs d'ondes afin de permettre la visualisation et le dosage des taches
d'aflatoxine (19). Sur le côté gauche de la plaque est visible le résultat de
la séparation d'un extrait d'arachides crues contaminées par de l'aflatoxine
B, obtenue selon la méthode CB. La séparation du mélange d'étalon d'aflatoxine
permet de conclure que la qualité de séparation de la plaque était suffisante.
A l'aide des étalons d'aflatoxine B,, on peut localiser la tache d'aflatoxine
B, dans l'extrait et en estimer la quantité afin de pouvoir calculer la
concentration initiale de l'échantillon. Il est beaucoup plus difficile de
localiser et de doser l'aflatoxine B, présente dans le beurre de cacahuètes.
Ce produit ayant été grillé, il s'est formé de nombreux constituants qui
peuvent gêner considérablement l'interprétation et le chiffrage du résultat
obtenu avec la chromatographie en couche mince. Afin d'améliorer la séparation
dans ce cas, et ainsi d'abaisser le seuil de détection, il faut recourir à la
chromatographie bidimensionnelle en couche mince.

Le schéma de dépôt des taches pour les étalons et pour l'échantillon


doit être adapté à la méthode de dosage, c'est-à-dire par densimétrie ou par
estimation visuelle. Si l'on utilise un densimètre, on applique le schéma de
dépôt des taches densimétrique. Pour 1'estimation visuelle, on accorde souvent
la préférence au schéma antidiagonal.

Avec le schéma de dépôt des taches densimétriques (20), on dépose une


partie aliquote de l'échantillon (extrait de beurre de cacahuètes) en A et des
quantités connues de l'aflatoxine B, servant d'étalon en B. La plaque est
ensuite développée suivant la première orientation et, après séchage, on la
fait pivoter de 90° et on la développe suivant la seconde orientation. La
détection et le dosage sont effectués sous éclairage ultraviolet (21) avec
l'aide des étalons d'aflatoxine B, développés simultanément; la tache
d'aflatoxine B, de l'échantillon, nettement séparée, peut être repérée. Un
densimètre ou un intégrateur de chromatographie en couche mince permet de
comparer l'intensité de la fluorescence des taches d'aflatoxine B, de
l'échantillon et de l'étalon et l'on peut ainsi calculer la concentration
d'aflatoxine B, dans l'échantillon initial.
- 114 -

Si l'on ne dispose pas d'un densimètre, il faut donner la préférence au


schéma de dépôt des taches antidiagonal (22) . On dépose une partie aliquote
de l'échantillon (beurre de cacahuètes) en A et différentes quantités de
l'aflatoxine servant d'étalon au point B. La plaque est développée suivant
deux dimensions et la détection et le dosage sont de nouveau effectués sous
éclairage ultraviolet (23). A l'aide de la rangée d'étalons d'aflatoxine B,
soumis à un développement bidimensionnel, on peut repérer l'aflatoxine B, de
l'extrait et en estimer la concentration en comparant l'intensité de sa
fluorescence avec celle des différents étalons d'aflatoxine B,. Etant donné
que toutes les taches d'aflatoxine B, sont alignées et assez proches l'une de
l'autre, une telle estimation est plus aisée que la comparaison visuelle avec
les taches d'étalon développées sur les côtés, comme c'est le cas avec le
schéma de dépôt des taches densimétrique.

Ce sont la qualité de l'extrait final et le seuil de détection souhaité


(24) qui détermineront s'il y a lieu de choisir la chromatographie en couche
mince unidimensionnelle ou la chromatographie en couche mince
bidimensionnelle. La variante unidimensionnelle a pour avantage la rapidité,
la simplicité et l'économie, mais la résolution obtenue est généralement assez
limitée et une épuration poussée peut se révéler nécessaire. En revanche, la
chromatographie bidimensionnelle en couche mince nécessite beaucoup plus de
temps et d'équipement et elle est moins facile à appliquer, mais la résolution
est très nettement meilleure sans qu'il soit nécessaire de procéder à une
épuration plus poussée. Il faut examiner les avantages et les inconvénients
des deux variantes de la chromatographie en couche mince au regard des
exigences de tel ou tel problème d'analyse.

Ce sont les propriétés physicochimiques de la mycotoxine en cause qui


déterminent le mode de détection. Les aflatoxines absorbent fortement les
rayons ultraviolets et émettent l'énergie de ces derniers sous forme de
fluorescence. Fort heureusement, cette caractéristique permet à l'opérateur
de déceler ces constituants, comme le montre le chromatogramme en couche mince
d'arachides et de beurre de cacahuètes. Malheureusement, une méthode aussi
simple ne permet pas de déceler toutes les mycotoxines. Beaucoup d'entre elles
ne deviennent pas fluorescentes sous éclairage ultraviolet; certaines révèlent
l'absorption des rayons ultraviolets ou de la lumière visible, alors que
d'autres ne le font pas (25). Dans ce dernier cas, on peut parfois les rendre
visibles par dérivation, par exemple en pulvérisant un réactif sur une plaque
ou en exposant la plaque à de la vapeur de réactif.

On peut citer comme exemple d'une technique de pulvérisation celle qui


est couramment utilisée pour la visualisation de la stérigmatocystine, une
toxine parfois présente dans les céréales et dans le fromage. On peut voir
deux plaques de chromatographie en couche mince (26) avec des taches de
stérigmatocystine développées de concentration croissante. Sur la plaque de
chromatographie en couche mince située à droite, on a pulvérisé une solution
de A1C13 dans l'éthanol. Les deux plaques ont été exposées aux rayons
ultraviolets, mais seules les taches sur la plaque comportant la solution de
A I C I 3 sont visibles sous forme de fluorescence jaune. L'emploi de ce réactif
de pulvérisation améliore 100 fois le seuil de détection.

Malgré toutes les techniques d'épuration utilisées, il subsiste des


substances qui se comportent de la même façon que la mycotoxine dont
l'estimation est effectuée par séparation au moyen de la chromatographie en
115 -

couche mince. Afin de réduire au minimum l'éventualité de résultats faussement


positifs, il faut confirmer l'identité de la mycotoxine dans les échantillons
positifs. La méthode la plus fiable à cette fin est la spectroscopie de masse
à haute résolution. Cependant, la spectroscopie de masse en association avec
la chromatographie en couche mince est une opération d'assez longue durée et
tous les laboratoires ne sont pas équipés de ce type d'appareillage de haute
technicité. Par conséquent, il faut recourir à des techniques chimiques
simples. Ces techniques n'offrent pas la même certitude absolue que la
spectroscopie de masse, mais elles excluent la presque totalité des résultats
faussement positifs. Il est parfois possible d'effectuer ces épreuves de
confirmation directement sur des plaques de chromatographie en couche mince,
en tirant ainsi parti des avantages de cette méthode.

On peut citer comme exemple d'une telle épreuve pour la confirmation de


la présence d'aflatoxine B, dans des extraits de produits d'alimentation
humaine et animale l'épreuve de séparation-réaction-séparation à l'acide
chlorhydrique mise au point par Verhülsdonk. Cette épreuve peut même
s'appliquer à des extraits très "souillés" tels que les produits
d'alimentation pour lapins. Des tâches de l'échantillon et de l'étalon sont
déposées sur une plaque de chromatographie en couche mince (27) de la même
façon que pour la chromatographie bidimensionnelle. La séparation est d'abord
effectuée suivant une orientation, après quoi on pulvérise de l'acide
chlorhydrique sur la zone hachurée. Ensuite, la séparation est effectuée
suivant la seconde orientation, exactement dans les mêmes conditions. La
réaction de l'acide chlorhydrique à l'aflatoxine B,, qui a déjà été séparée
lors de la première opération, aboutit à la formation d'un hémiacétal de
l'aflatoxine B,, qui a un R, spécifique plus faible que celui de l'aflatoxine
B,. Le fait est confirmé après chomatographie suivant la seconde orientation.
Les autres constituants doivent être situés suivant une diagonale divisant la
plaque en deux parties puisque la séparation a été effectuée suivant les deux
orientations dans des conditions rigoureusement identiques. La diapositive
(28) illustre le résultat d'une telle épreuve de confirmation dans le cas d'un
produit d'alimentation pour lapins.

Les facteurs d'importance dans la chromatographie en couche mince


peuvent se résumer en dix points fondamentaux (29). L'analyste doit tout
d'abord définir son problème: quelle est la toxine qui l'intéresse, quelle est
la matrice en cause, quel doit être le seuil de détection? Une fois le
problème défini, il faut choisir sur la liste des adsorbants susceptibles
d'être utilisés. Pour les mycotoxines, l'adsorbant de choix sera normalement
le Si02. Le format de la plaque dépendra des exigences de l'analyste en
matière de séparation, de précision et de rapidité de la méthode. Le choix du
solvant révélateur sera dicté par les caractéristiques physicochimiques de la
toxine recherchée. Normalement, une séparation satisfaisante devrait être
réalisée quand le R, de la solution se situe entre 0,25 et 0,75. L'échantillon
et l'étalon peuvent être appliqués sur la plaque au moyen de pipettes
capillaires ou de seringues. Les premières sont à usage unique; les secondes
sont plus précises, mais elles doivent être nettoyées parfaitement pour éviter
toute contamination croisée. Les taches doivent être aussi petites que
possible et de dimensions égales. La normalisation des conditions de
développement est une condition préalable indispensable pour obtenir des
résultats reproductibles. La visualisation des taches de toxines dépend de
leurs caractéristiques physicochimiques. Certaines toxines absorbent la
lumière visible ou les rayons ultraviolets, d'autres développent une
- 116 -

fluorescence après irradiation aux ultraviolets, une pulvérisation ou


vaporisation de réactifs étant parfois nécessaire. L'identification se fait
à l'aide d'étalons développés simultanément et l'estimation peut être
effectuée visuellement ou par densimétrie. Si un échantillon est jugé positif,
il faut procéder à une épreuve pour en confirmer l'identité, de préférence en
effectuant une réaction dont le produit aura des caractéristiques spécifiques
sur le plan de la chromatographie en couche mince.

Il convient enfin d'adresser un avertissement à ceux qui ont recours au


densimètre pour mesurer l'intensité des taches sur les plaques de
chromatographie en couche mince. Bien que de tels intégrateurs de
chromatographie en couche mince offrent des possibilités attrayantes et des
avantages non négligeables, facilitent l'opération et conduisent à une
estimation plus précise, il ne faut pas perdre de vue que la moindre erreur
de manipulation avec un tel appareil ou la moindre petite défectuosité dans
ce dernier peuvent aboutir à des chiffres qui n'auront aucune validité.
Quoique pratiques, les densimètres ne sont pas indispensables. Il est de bonne
pratique dans les laboratoires de commencer toujours l'évaluation d'une plaque
par une estimation visuelle. La formule suivante a été utilisée dans d'autres
contextes, mais elle est tout aussi valable dans le cas présent (30): "Mieux
vaut être approximativement exact que se tromper avec précision!".

Diapositive (1) Reproduction de la première page de la thèse de Tswett


(2) Les mécanismes en chromatographie
(3) La subdivision de la chromatographie d'adsorption
(4) Définition de la chromatographie en couche mince
(5) Illustration de la séparation unidimensionnelle des
colorants
(6) Illustration de la séparation bidimensionnelle des colorants
(7) Définition de la valeur R
(8) Matériel nécessaire pour préparer soi-même des plaques de
chromatographie en couche mince
(9) Séparation d'un mélange d'étalon d'aflatoxine sur plusieurs
types de plaques de chromatographie en couche mince à Si02
(10) Avantages des plaques enduites par l'opérateur
(11) Avantages des plaques où l'antigène est préfixé
(12) Support de plaque pour chromatographie en couche mince et
coffret de stockage des plaques de chromatographie en couche
mince
(13) Description de l'exactitude et de la précision
(14) Divers types d'applicateurs de taches pour chromatographie
en couche mince
(15) Illustration d'un dispositif de répartition des taches
fabriqué par l'opérateur
(16) Exigences pour les solvants utilisés pour déposer les taches
(17) Illustration des formats de plaques habituels avec leurs
coffrets de développement respectifs
(18) Schéma de répartition des taches avec la méthode CB
(19) Séparation des extraits d'arachides crues et de beurre de
cacahuètes selon la méthode CB
(20) Répartition des taches pour la chromatographie
bidimensionnelle en couche mince (dosage densimétrique)
- 117 -

(21) S é p a r a t i o n d ' u n e x t r a i t de b e u r r e de c a c a h u è t e s s o u m i s à la
chromatographic bidimensionnelle en couche mince avec
utilisation du schéma de répartition des taches
densimétrique
(22) Schéma de répartition des taches antidiagonal pour
chromatographie bidimensionnelle en couche mince
(23) S é p a r a t i o n d ' u n e x t r a i t de b e u r r e de c a c a h u è t e s s o u m i s à la
chromatographie bidimensionnelle en couche mince avec
u t i l i s a t i o n d u s c h é m a de r é p a r t i t i o n d e s t a c h e s a n t i d i a g o n a l
(24) A v a n t a g e s e t i n c o n v é n i e n t s de la c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e
mince unidimensionnelle et bidimensionnelle
(25) Auxiliaires de visualisation pour la détection des
mycotoxines par chromatographie en couche mince
(26) I l l u s t r a t i o n de t a c h e s de s t é r i g m a t o c y s t i n e v i s u a l i s é e s e t
non visualisées avec réactif au A1C13
(27) S c h é m a de l ' é p r e u v e de c o n f i r m a t i o n à l ' a c i d e c h l o r h y d r i q u e
(28) I l l u s t r a t i o n d u r é s u l t a t de l ' é p r e u v e de c o n f i r m a t i o n à
l'acide chlorhydrique appliquée à un produit d'alimentation
p o u r l a p i n s c o n t a m i n é p a r de l ' a f l a t o x i n e B,
(29) L e s d i x é t a p e s f o n d a m e n t a l e s de la c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e
mince
(30) " M i e u x v a u t ê t r e a p p r o x i m a t i v e m e n t e x a c t que se t r o m p e r a v e c
précision!"

3. Techniques ELISA

D é j à d a n s l ' A n t i q u i t é l ' h o m m e é t a i t f a s c i n é p a r la p r o t e c t i o n q u ' i l


p o u v a i t o b t e n i r c o n t r e t e l l e ou t e l l e m a l a d i e a p r è s a v o i r s u b i c e l l e - c i . Ce
n ' e s t q u e v e r s 1 9 0 0 q u ' o n a d é c o u v e r t que des f a c t e u r s de p r o t e c t i o n
a p p a r a i s s a i e n t d a n s le s a n g e n r é p o n s e à l ' i n v a s i o n p a r d e s m i c r o - o r g a n i s m e s
o u p a r c e r t a i n e s s u b s t a n c e s . L e s e n v a h i s s e u r s c a p a b l e s de d é c l e n c h e r u n e
r é a c t i o n s p é c i f i q u e c o n t r e e u x - m ê m e s é t a i e n t a p p e l é s " a n t i g è n e s " , les f a c t e u r s
de p r o t e c t i o n p r o d u i t s é t a n t a p p e l é s " a n t i c o r p s " ( 1 ) . P a r la s u i t e , il e s t
a p p a r u c l a i r e m e n t q u e les a n t i c o r p s s o n t des p r o t é i n e s p r o d u i t e s in v i v o (les
i m m u n o g l o b u l i n e s ) q u i se f i x e n t d ' u n e m a n i è r e s é l e c t i v e a u x a n t i g è n e s
c o r r e s p o n d a n t s . O n a d é c o u v e r t que c e s r é a c t i o n s i m m u n o l o g i q u e s a v a i e n t u n
f o n d e m e n t c h i m i q u e e t q u ' e l l e s p o u v a i e n t a v o i r l i e u n o n s e u l e m e n t in v i v o ,
m a i s a u s s i in v i t r o .

C e s c o n s t a t a t i o n s o n t p e r m i s de m e t t r e a u p o i n t d e s m é t h o d e s d ' a n a l y s e
immunochimiques dites "titrages immunologiques". Ces titrages exploitent leurs
p r o p r i é t é s de r e c o n n a i s s a n c e m o l é c u l a i r e d e s a n t i c o r p s , t o u t c o m m e u n e s e r r u r e
c o r r e s p o n d à u n e clé ( 2 ) . L a clé q u ' i l f a u t m e s u r e r e s t l ' a n t i g è n e .

A v a n t d ' a p p l i q u e r les m é t h o d e s i m m u n o c h i m i q u e s à la d é t e c t i o n e t a u
dosage d'un constituant (l'antigène), il f a u t p r é p a r e r les réactifs
b i o l o g i q u e s q u i i n t e r v i e n n e n t d a n s c e s m é t h o d e s (les a n t i c o r p s ) c h e z d e s
a n i m a u x s u p é r i e u r s e n l e u r i n o c u l a n t l ' a n t i g è n e , tous les a n t i g è n e s n ' o n t p a s
la c a p a c i t é d ' i n d u i r e la f o r m a t i o n d ' a n t i c o r p s c h e z les a n i m a u x d ' e x p é r i e n c e .
L ' i m m u n o g é n i c i t é d é p e n d d a n s u n c e r t a i n e m e s u r e de la t a i l l e de l ' a n t i g è n e .
L e s p e t i t e s m o l é c u l e s c o m m e les m y c o t o x i n e s ne s o n t p a s i m m u n o g è n e s ; o n les
appelle des haptènes (3), Une fois le haptène fixé à un grand porteur,
s ' a g i s s a n t g é n é r a l e m e n t d ' u n e p r o t é i n e , il d e v i e n t i m m u n o g è n e . P o u r la
p r o d u c t i o n d ' a n t i c o r p s o n u t i l i s e d e s l a p i n s , des s o u r i s , des c o b a y e s , des
118 -

chèvres, des moutons, des poules et des chevaux; l'injection peut être
intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée ou intrapéritonéale. Le sérum
recueilli après l'injection est appelé immunsérum ou antisérum; il contient
un groupe de protéines sériques également appelés immunoglobulines.

Au départ, les techniques immunoanalytiques reposaient sur l'interaction


des antigènes et des anticorps en solution, aboutissant à la précipitation du
complexe antigène-anticorps. Cette précipitation permet de déterminer la
concentration d'antigène ou d'anticorps. Ces méthodes de précipitation
conviennent pour mesurer les concentrations d'antigène de l'ordre du ^g-mg/ml.
Cependant, quand la substance à analyser est présente dans des concentrations
plus faibles, comme c'est souvent le cas avec les mycotoxines, d'autres
méthodes plus sensibles sont nécessaires pour mesurer la formation du
complexe. En pareil cas, l'antigène ou l'anticorps est marqué aux fins du
dosage. En règle générale, il s'agit de ces méthodes-là lorsqu'on emploie les
termes de "méthodes immunochimiques" ou "titrages immunologiques" .

Les titrages immunologiques modernes tirent parti de deux phénomènes


importants: la spécificité potentielle des anticorps de réagir vis-à-vis d'un
antigène donné et la possibilité, par marquage avec des indicateurs,
d'amplifier considérablement l'aptitude à déceler le complexe antigène-
anticorps. Ces indicateurs (4) peuvent être, entre autres, des enzymes, des
radio-isotopes ou des marqueurs fluorescents ou luminescents. Après leur
introduction, à la fin des années 1950, les titrages immunologiques sont
devenus des outils d'analyse importants en biochimie clinique. Le démarrage
fut beaucoup plus lent pour l'analyse des produits alimentaires, le premier
titrage immunologique de mycotoxines ayant été décrit en 1976. Ce retard
s'explique en partie par le fait que les mycotoxines sont des haptènes , ce qui
signifie qu'elles ne sont pas immunogènes et qu'elles doivent être conjuguées
avec une protéine porteuse avant que l'immunisation puisse se produire pour
obtenir un immunsérum. Ces conjugaisons peuvent être complexes parce que la
molécule de la plupart des mycotoxines ne comporte pas un groupe réactif
susceptible de réaliser la fixation à la protéine porteuse. Cette absence de
réactif adéquat empêcha tout développement rapide jusqu'aux années 1980,
époque où l'on mit au point plusieurs méthodes pour la préparation de
conjugués de mycotoxines et, plus particulièrement, de conjugués
d'aflatoxines. Il n'y a pas lieu ici d'exposer en détail la conjugaison des
haptènes et la production d'anticorps dirigés contre les mycotoxines. Il
importe davantage de savoir qu'on dispose depuis peu d'immunsérums dirigés
contre certaines des mycotoxines et de mycotoxines marquées par un indicateur,
quoique le plus souvent dans le cadre d'un nécessaire d'épreuve. La plupart
de ces substances ont été mises au point pour le dosage des aflatoxines.

Jusqu'à présent (1987) dans le domaine de la recherche sur les


mycotoxines l'emploi des titrages immunologiques s'est limité au titrage
radio-immunologique et au titrage immunoenzymatique. Dans ces deux méthodes
de titrage, la liaison réversible entre antigène et anticorps joue un rôle
déterminant, comme c'est le cas pour toutes les méthodes immunochimiques. On
peut mesurer la formation du complexe antigène-anticorps en mettant en
compétition un antigène marqué par un isotope radioactif ou une enzyme.
L'application du titrage radio-immunologique présente quelques inconvénients,
par exemple une durée d'activité limitée des radio-isotopes, des problèmes
d'élimination des déchets radioactifs ou d'obtention des autorisations
nécessaires, et la nécessité de disposer d'un coûteux compteur à
- 119

scintillation. Ce sont probablement ces inconvénients qui expliquent pourquoi


il n'existe que très peu de titrages radio -immunologiques pour les
mycotoxines. Cette technique convient beaucoup moins bien aux pays en
développement que le titrage immunoenzymatique, lequel est applicable presque
partout. Par conséquent, nous ne reviendrons plus ici sur le titrage radio-
immunologique, la préférence étant accordée au titrage immunoenzymatique.

Avec le titrage immunoenzymatique, on peut mesurer indirectement la


formation du complexe antigène-anticorps en mettant en compétition un antigène
marqué par une enzyme et l'antigène à doser. La quantité d'enzyme reflète
l'importance du complexe antigène-anticorps. Elle peut être mesurée au moyen
d'un support chromogène. A l'heure actuelle, la plupart des titrages
immunoenzymatiques utilisés pour le dosage des mycotoxines sont du type
titrage avec immunoadsorbant lié à une enzyme (ELISA). Avec la méthode ELISA,
on immobilise sur un support solide soit l'anticorps, soit l'antigène
conjugué. Souvent des plaques ou barrettes de microtitrage (5) servent de
support solide. Elles sont transparentes et fabriquées en polystyrène ou en
chlorure de polyvinyle. Les plaques comportent 96 cupules et les barrettes 8
ou 12. Ces plaques et barrettes de microtitrage présentent plusieurs avantages
par rapport à des tubes distincts (6). Elles sont plus faciles à manipuler,
le lavage et la lecture sont plus aisés, et elles conviennent à des grandes
séries d'analyses. L'anticorps ou l'antigène conjugué à une protéine peuvent
être fixés d'une manière assez uniforme et reproductible sur les cupules des
plaques ou barrettes de microtitrage. On peut réaliser cette fixation
simplement en laissant une solution aqueuse tamponnée 'avec l'anticorps ou
l'antigène conjugué dans les cupules pendant une durée variant de quelques
heures à une journée, après fixation, la solution est évacuée des cupules et
la plaque est lavée plusieurs fois à l'eau. Après séchage, les plaques
enduites peuvent être conservées plusieurs mois. Des plaques et barrettes
enduites chez le fabricant sont habituellement fournies avec les nécessaires
ELISA disponibles dans le commerce.

L'application de la méthode ELISA pour la détection des mycotoxines


comporte plusieurs variantes (7) : le titrage avec mise en compétition, le
titrage avec saturation séquentielle, qui est une variante du précédent, le
titrage par immunocapture, appelé aussi titrage immunométrique.

Pour le titrage avec mise en compétition (8), on fixe sur une plaque de
microtitrage une quantité connue d'anticorps dirigé contre la mycotoxine
recherchée. Après lavage, on ajoute la solution d'épreuve contenant une
quantité inconnue de la mycotoxine avec une quantité connue de mycotoxine
marquée par une enzyme. La mycotoxine marquée et la mycotoxine libre sont en
compétition pour se fixer sur les sites actifs de l'anticorps enduit sur la
plaque. Après incubation on lave de nouveau la plaque et l'enzyme capturée est
dosée par addition d'un support chromogène. On peut mesurer visuellement ou,
avec plus de précision, au moyen d'un lecteur ELISA la couleur obtenue ou
l'intensité de cette couleur. Dans les deux cas, on peut doser la quantité de
mycotoxine dans la solution d'épreuve en utilisant une série d'étalons de
concentration variable auxquels a été appliquée la même méthode. Souvent, les
solutions d'épreuve sont appliquées avec différentes dilutions si l'on n'a
aucune idée de l'ampleur de la concentration de mycotoxine dans la prise
d'essai. Plus la concentration du produit de la réaction enzymatique est
faible, plus la quantité d'enzyme fixée est faible et plus la concentration
de mycotoxine dans la prise d'essai est élevée. La diapositive suivante (9)
- 120

montre les résultats d'une épreuve où l'on mesure l'intensité de la coloration


et d'une épreuve où l'on détermine la couleur elle-même. Cette dernière
épreuve est utilisée avec la méthode Agriscreen, qui comporte un nécessaire
vendu dans le commerce pour le dosage de l'aflatoxine B, dans les produits
d'alimentation humaine et animale.

Le titrage avec saturation séquentielle (10) est une variante du titrage


avec mise en compétition. On fixe sur une plaque de microtitrage une quantité
connue de l'anticorps dirigé contre la mycotoxine recherchée. Après lavage,
on ajoute la solution d'épreuve contenant une quantité inconnue de la
mycotoxine. La mycotoxine à doser réagit avec une partie des anticorps fixés
sur la plaque. Ensuite, on procède au titrage des anticorps non liés au moyen
d'une mycotoxine marquée par une enzyme. Les opérations qui suivent sont les
mêmes que pour le titrage avec mise en compétition et le dosage est effectué
de la même façon.

Avec le titrage par immunocapture (11) on fixe sur la plaque de


microtitrage la mycotoxine, et non pas l'anticorps comme cela se fait pour le
titrage avec mise en compétition et le titrage avec saturation séquentielle.
Pour que la fixation soit possible, il faut que la mycotoxine ait d'abord été
conjuguée avec une protéine. On ajoute dans les cupules de la plaque de
microtitrage enduites de mycotoxine la solution d'épreuve contenant une
quantité inconnue de mycotoxine et une quantité fixe d'anticorps. L'anticorps
qui n'a pas réagi avec la mycotoxine de la solution d'épreuve est capturé par
la surface interne des cupules enduite de mycotoxine. Cet anticorps capturé
est habituellement une immunoglobuline de lapin. Après incubation et lavage,
on laisse incuber la plaque avec un second anticorps (anti-lapin) dirigé
contre l'anticorps de lapin et marqué par une enzyme. On obtient ainsi une
sorte de cascade: l'anticorps marqué par une enzyme a réagi à l'anticorps
anti-mycotoxine, lequel à son tour s'est fixé à la mycotoxine enduite sur la
cupule. On procède au dosage de l'enzyme capturée en ajoutant un support
chromogène. Plus la concentration du produit de la réaction enzymatique est
faible, plus la concentration de mycotoxine dans la prise d'essai est élevée.
De même que pour le titrage avec mise en compétition et le titrage avec
saturation séquentielle, on utilise une courbe type pour doser la mycotoxine
dans la solution d'épreuve. Le titrage ELISA par immunocapture ne nécessite
pas une mycotoxine marquée par une enzyme, et des anticorps anti-lapin liés
à une enzyme sont disponibles dans le commerce, ce qui représente un avantage.
Toutefois, un conjugué mycotoxine-protéine est nécessaire pour pouvoir
réaliser la fixation aux cupules de la plaque de microtitrage.

Outre les nécessaires ELISA, qui comportent des plaques ou barrettes de


microtitrage, on peut utiliser d'autres supports solides pour fixer
l'anticorps. Il convient de citer comme progrès récent l'épreuve "Quick Card",
un nécessaire vendu dans le commerce qui fait appel à des cartes en matière
plastique de la taille d'une carte de crédit (12). Pour l'épreuve Quick Card,
une quantité connue d'anticorps anti-aflatoxine est fixée sur chacune des deux
parties de la carte. Cette fixation se fait en fait à l'usine, la carte étant
ainsi prête à l'emploi. On ajoute une goutte de solution étalon exempte
d'aflatoxine sur la partie gauche et une goutte de solution d'épreuve sur la
partie droite. Ensuite, on ajoute de l'aflatoxine marquée par une enzyme sur
les deux parties de la carte, puis la solution servant de support. Avec des
quantités croissantes d'aflatoxine, la couleur d'un côté apparaîtra plus
claire. Réciproquement, s'il n'y a pas d'aflatoxine, une tache d'un gris-
- 121 -

bleu intense se développera de ce côté (13). La solution étalon exempte


d'aflatoxine donnera une tache d'un gris-bleu foncé. L'épreuve "Quick Card"
est conçue pour déceler des quantités d'aflatoxines B,, B2, G, et M, d'environ
5 ou 10 jig/kg, ce qui est pratique du point de vue de la plupart des
tolérances officielles actuellement en vigueur pour les aflatoxines dans les
produits d'alimentation humaine. Cette épreuve donne des résultats rapides et
ne nécessite aucun équipement ni aucune expérience technique.

En règle générale, les méthodes d'extraction et d'épuration nécessaires


pour procéder au titrage immunoenzymatique sont plus simples que pour la
chromatographie. L'extraction se produit habituellement avec un solvant
aqueux, par exemple un mélange méthanol-eau, mais des solvants organiques
comme le chloroforme sont souvent plus efficaces. Parfois, on procède à une
simple étape de délipidation à l'hexane et une épuration de la colonne n'est
habituellement pas nécessaire. A la différence de nombre des extraits préparés
pour les méthodes chromatographiques, les extraits finals utilisés pour le
titrage immunoenzymatique sont des solutions aqueuses tamponnées parce qu'un
milieu aqueux est nécessaire pour que puisse se former le complexe antigène-
anticorps .

La simplicité des méthodes ELISA et le grand nombre d'échantillons


pouvant être traités en une journée, d'où un coût relativement bas par
analyse, ont rendu ces techniques très précieuses pour une vérification rapide
sur le terrain. Toutefois, il semble que les résultats soient beaucoup plus
variables avec la méthode ELISA qu'avec la chromatographie en couche mince,
encore qu'on ne dispose pas, jusqu'à présent, de données suffisantes issues
d'études concertées et comparatives pour pouvoir estimer parfaitement les
avantages des méthodes ELISA. Un autre problème potentiel est la spécificité
et la sélectivité des méthodes ELISA. Beaucoup de mycotoxines ont une
structure chimique étroitement apparentée. Par conséquent, il existe la
possibilité que des réactions croisées puissent se produire entre des
anticorps dirigés contre une certaine mycotoxine et d'autres toxines du même
groupe également présentes. Il semble que cela ait lieu avec certains des
nécessaires vendus dans le commerce pour le dosage des aflatoxines,
l'anticorps accusant une certaine réactivité croisée avec d'autres
aflatoxines. Cela signifie qu'un résultat positif ne fournit pas d'information
sélective quant à la concentration des différentes aflatoxines, à la
différence de la chromatographie en couche mince qui permet de distinguer
entre les aflatoxines B,, B2, G, et G2 présentes à l'état naturel.

Aux fins de la lutte contre les mycotoxines en Afrique, il semble qu'une


démarche utile et efficace consisterait à associer la méthode ELISA et la
chromatographie en couche mince de manière à utiliser la première pour une
vérification rapide et la seconde pour le dosage analytique des échantillons
positifs.

Diapositive (1) Explication des antigènes et anticorps


(2) Principe clé-serrure pour la réaction antigène-anticorps
(3) Définition du haptène
(4) Marqueurs utilisés pour les titrages immunologiques
(5) Instruments utilisés avec la méthode ELISA
(6) Avantages des plaques de microtitrage par rapport à des
tubes séparés
122 -

(7) Variantes de la méthode ELISA pour la recherche des


mycotoxines
(8) Principe de la méthode ELISA avec mise en compétition
(9) Résultats de la méthode ELISA avec mise en compétition
(10) Principe de la méthode ELISA avec saturation séquentielle
(11) Principe de la méthode ELISA avec titrage par immunocapture
(12) Illustration de l'épreuve "Quick Card"
(13) Résultats de l'épreuve "Quick Card"

4. Caractéristiques des méthodes

La chimie analytique est une science à orientation pratique dans


laquelle des opérations de mesure permettent de rassembler des informations
sur la composition qualitative ou quantitative de diverses substances. Une
méthode analytique est l'adaptation d'une technique en vue d'un certain but
de mensuration. Les méthodes d'analyse ont des caractéristiques scientifiques
et pratiques. Les caractéristiques scientifiques les plus importantes qui
déterminent la fiabilité des données d'analyse sont la précision,
l'exactitude, le seuil de détection, la sensibilité et la spécificité. Les
caractéristiques pratiques sont l'applicabilité, le coût de l'opération, la
durée requise, l'équipement nécessaire et le niveau de formation voulu, ces
caractéristiques déterminent l'utilité de la méthode. Ce sont les buts visés
par l'analyste qui déterminent s'il doit accorder plus d'attention à la
fiabilité d'une méthode ou à son utilité. Aux fins de la recherche et de la
conformité avec la réglementation, il est peut-être important de connaître le
mieux possible la valeur réelle, les aspects pratiques ne venant qu'au second
plan. On peut aussi concevoir des situations où l'élégance scientifique doit
être sacrifiée au profit des avantages pratiques, par exemple quand des
épreuves rapides "tout ou rien" sont nécessaires sur le terrain pour permettre
de décider rapidement si l'on peut accepter un lot ou s'il faut le rejeter.

Il ressort clairement de la littérature que les caractéristiques de la


méthode scientifique suscitent bien des malentendus et des usages incorrects.
C'est pourquoi il convient de bien définir ces termes.

La sensibilité est la pente de la courbe d'étalonnage analytique, en


d'autres termes le changement de signal analytique par unité de concentration
modifiée. C'est la valeur m que nous devons connaître pour doser la substance
analysée en fonction d'un certain signal analytique. La sensibilité vis-à-
vis de la substance analysée dans l'extrait de l'échantillon final peut ne pas
être nécessairement égale à la sensibilité vis-à-vis de la substance analysée
telle qu'elle est présente dans une solution étalon simple. Des effets
imputables à la matrice peuvent donner lieu à un étalonnage incorrect de
l'étape de la méthode d'analyse correspondant au dosage et, partant, à des
estimations de la substance analysée qui seront soit trop élevées, soit trop
faibles. En chimie analytique, on confond très souvent le terme de
"sensibilité" avec celui de "seuil de détection", lequel a une autre
signification comme nous le verrons pus loin.

La spécificité est une caractéristique qui provoque probablement moins


de confusion: on entend par spécificité l'aptitude d'une méthode à déceler ou
à mesurer la substance recherchée par rapport à d'autres substances analogues
ou à des composés gênants. On dit d'une méthode d'analyse qu'elle est
"pleinement spécifique" quand elle donne un signal analytique uniquement pour
123

un composé donné mais demeure "inerte" pour tous les autres composés qui
peuvent aussi être présents dans l'échantillon. Ainsi, avec une méthode
pleinement spécifique, la probabilité de réactions faussement positives est
nulle. Souvent les techniques chromatographiques classiques visant à séparer
les aflatoxines des autres constituants de la matrice ne sont pas pleinement
spécifiques et il faut procéder à des épreuves supplémentaires pour confirmer
la présence d'aflatoxine dans l'échantillon. La méthode la plus fiable à cet
effet est la spectrométrie de masse à haute résolution, mais bien des
laboratoires dans des pays en développement ne seront pas dotés de ce type
d'appareil perfectionné et devront donc appliquer des techniques plus simples.
Parmi les diverses possibilités qui s'offrent pour accroître la spécificité
d'une méthode, la dérivation à effectuer directement sur la plaque de
chromatographie en couche mince ou en aval de la colonne dans le cas de la
chromatographie liquide sous haute pression est l'une des plus utiles.

Outre ces caractéristiques fonctionnelles, il existe quelques


caractéristiques statistiques telles que la précision et le seuil de
détection. ainsi qu'une caractéristique opérationnelle, 1'exactitude. On
confond souvent précision et exactitude, alors que ces deux termes ont en fait
chacun une signification très particulière. La précision concerne la
dispersion inévitable des résultats obtenus lorsqu'on répète une méthode
d'analyse soit dans un même laboratoire, soit dans des laboratoires
différents, alors que l'exactitude est fonction de l'écart systématique par
rapport à la valeur réelle. Ces significations peuvent être illustrées à
l'aide de la diapositive suivante: Un tireur doit tirer un certain nombre de
coups de feu avec un vieux fusil en essayant d'atteindre la cible. On voit en
haut à gauche le premier résultat de son essai. Le tir a tendance à être trop
bas, ce qui indique une erreur systématique et, par conséquent, un manque
d'exactitude. En outre, on constate une dispersion non négligeable et nous
pouvons donc en conclure que le tir manque de précision. Nous décidons de
donner au tireur un autre fusil et de répéter l'exercice. Nous constatons de
nouveau la même dispersion, ce qui traduit, une fois de plus, un manque de
précision, mais nous ne voyons aucun signe d'erreur systématique, de sorte
qu'avec le nouveau fusil le tireur a obtenu des résultats exacts. La partie
suivante de l'illustration indique le résultat obtenu par un autre tireur
utilisant le même nouveau fusil et nous constatons que la dispersion est
faible, si bien que la précision est bonne, et que l'exactitude est
satisfaisante elle aussi. Enfin, le bon tireur tire avec l'ancien fusil: les
points d'impact sont groupés, de sorte que la précision est bonne; toutefois,
on constante clairement une erreur systématique, donc l'exactitude n'est pas
bonne. En fait, la raison, en 1'occurence, était une torsion du canon du fusil
ancien.

La précision d'une méthode est habituellement exprimée par l'écart-


type de cette méthode ou par l'écart-type relatif, dit coefficient de
variation. La précision peut être imputée à un erreur de méthode à l'intérieur
du laboratoire, laquelle est exprimée par r indiquant la répétabilité, ou bien
elle peut être imputée à un erreur entre laboratoires, laquelle est exprimée
par R indiquant la reproductibilité. La répétabilité r peut être définie comme
étant la valeur au-dessous de laquelle on peut s'attendre à ce que la
différence absolue entre deux résultats d'épreuve obtenus avec la même méthode
sur une substance identique dans les mêmes conditions se situe dans les
limites d'une probabilité spécifiée. En l'absence d'autres indications, la
probabilité est de 95%. Mathématiquement, la répétabilité r = 2,83 s, où
- 124 -

s = l'écart-type des résultats de l'épreuve. De façon analogue, la


reproductibilité R peut être définie comme étant la valeur au-dessous de
laquelle on peut s'attendre à ce que la différence absolue entre deux
résultats d'épreuve obtenus avec la même méthode sur une substance identique,
mais dans des conditions différentes (opérateurs, appareils et laboratoires
différents et/ou durées différentes), se situe dans les limites d'une
probabilité spécifiée. Là encore, en l'absence d'autres indications, la
probabilité est de 95%. Mathématiquement, la reproductibilité R = 2,83 s, où
s = l'écart-type des résultats de l'épreuve.

La répétabilité et la reproductibilité des méthodes d'analyse sont des


caractéristiques importantes qui permettent de vérifier si la technique
expérimentale d'un laboratoire est conforme à la normale, ou de comparer les
résultats d'épreuves obtenus à l'intérieur d'un laboratoire donnée ou par
différents laboratoires. Elles indiquent si les différences observées entre
les résultats d'épreuves sont importantes ou bien si elles s'inscrivent
simplement dans le cadre des fluctuations normales.

Il faut s'informer de la précision d'une méthode en soumettant celle-


ci à des épreuves lors d'une étude interlaboratoires. Pour ce qui est des
titrages classiques d'aflatoxine, on peut obtenir une idée assez exacte de la
précision de ces méthodes. Horwitz a constaté que les titrages d'aflatoxine
accusent des caractéristiques de reproductibilité conformes au tableau
général, à savoir que la précision interlaboratoires semble être fonction de
la concentration, étant indépendante de la nature de la substance analysée ou
de la technique de mesure utilisée. En général, cette précision peut être
représentée par l'équation suivante: C.V. (%) = 2<1"0,5l09 c), où c est la
concentration exprimée en puissances de 10. Dans la pratique, cela signifie
qu'avec un niveau d'environ 10 /¿g/kg un C.V. interlaboratoires est supérieur
à 30% et qu'avec un niveau de 0,1 /¿g/kg ce C.V. interlaboratoires a dépassé
65%.

En outre, Horwitz a observé que le rapport répétabilité/reproductibilité


se situe le plus souvent entre 0,5 et 0,7. Un rapport de moins de 0,5 indique
qu'il s'agit d'une méthode très personnelle; les analystes peuvent très bien
vérifier leur propre travail, mais ils ne peuvent pas vérifier celui de
collègues dans d'autres laboratoires, ce qui signifie que les instructions
doivent être revues ou qu'il faut vérifier les normes de référence appliquées.
Un rapport de plus de 0,7 peut indiquer que les répétitions d'opérations
faites par un analyste individuel sont de si mauvaise qualité qu'elles
éliminent la composante interlaboratoires.

La caractéristique suivante qui mérite qu'on lui accorde une certaine


attention est le seuil de détection d'une méthode. Là encore, il s'agit d'une
caractéristique qui n'est pas définie de la même façon par tous les analystes.
Selon la définition de l'UICPA, on entend par seuil de détection d'une méthode
le niveau de concentration le plus faible qui puisse être déterminé comme
étant statistiquement différent d'un dosage à blanc. L'UICPA précise que le
seuil de détection c L correspond à la mesure xB la plus faible qui puisse être
effectuée avec un degré raisonnable de certitude pour une méthode d'analyse
donnée. Mathématiquement xL = x B + ksB où xB est une estimation de la valeur
moyenne des résultats à blanc et où sB est l'écart-type des résultats à blanc,
k est un facteur numérique choisi en fonction de la limite de confiance
souhaitée. L'UICPA a choisi k = 3, ce qui signifie dans la pratique qu'il
125 -

existe une certitude de 90% qu'un signal mesuré à xL provient du composé


recherché; nous appelons seuil de détection la concentration correspondante
cL. La diapositive suivante indique la relation entre le seuil de détection
et la sensibilité m: plus la sensibilité est élevée et plus le seuil de
détection est bas. Il ne faut pas perdre de vue qu'à proximité du seuil de
détection tous les dosages d'une substance sont assez imprécis. Aussi la
American Chemical Society a-t-elle fixé comme autre critère une distance
correspondant à 10 fois l'écart-type du dosage à blanc par rapport à xB. Les
échantillons qui sont mesurés comme ayant un signal x, où x correspond à plus
de 10 fois l'écart-type du dosage à blanc, sont considérés comme étant dans
la zone de dosage, ce qui signifie que les concentrations sont suffisamment
élevées pour permettre un dosage raisonnable. On appelle zone de détection la
fourchette se situant entre trois fois et 10 fois l'écart-type du dosage à
blanc.

Malheureusement, les données signalées dans la littérature pour le seuil


de détection et de dosage semblent avoir été établies d'une manière très
subjective, ne correspondant que rarement à cette approche. Certains auteurs
font correspondre le seuil de détection qu'ils signalent à la quantité la plus
faible d'aflatoxine tout juste visible sur une plaque de chromatographie en
couche mince; d'autres font correspondre leur seuil de détection uniquement
à des étalons ou à des matrices qui ne produisent aucun "bruit de fond"
important. On peut citer comme autres complications les différences
d'intensité des divers types de lampes à ultraviolet et les différences de
sensibilité des divers types de détecteurs utilisés pour la chromatographie
liquide sous haute pression.

La dernière caractéristique à examiner est 1'exactitude. Cet écart


systématique est habituellement exprimé en pourcentages de récupération. Avec
les titrages d'aflatoxine classiques, des taux de récupération de 70 à 80%
sont courants. Le grand problème en matière de récupération est que les
données sont tirées d'épreuves où l'on utilise des échantillons enrichis. Nous
devons présumer que la fraction récupérée d'aflatoxine présente naturellement
dans l'échantillon est égale à celle d'aflatoxine ajoutée. En fait, nous
ignorons si toute l'aflatoxine naturellement présente se prête ou non à une
extraction au moyen de nos solvants initiaux. Ces problèmes peuvent être
surmontés en partie par l'emploi de substances de référence homologuées dans
lesquelles les alfatoxines sont présentes d'une manière naturelle. Cela permet
au moins de calculer l'exactitude de la méthode étudiée à l'aide d'une "valeur
réelle" ayant fait l'objet d'une homologation. Toutefois, ces substances de
référence homologuées pour le dosage des aflatoxines en sont encore au stade
du développement, sauf celles pour le lait en poudre ayant une teneur
homologuée en aflatoxine M,, qui sont disponibles depuis 1986 par
l'intermédiaire du Bureau de référence de la Communauté européenne.

La nécessité de substances de référence pour les mycotoxines s'impose


d'elle-même lorsqu'on considère les résultats des études interlaboratoires
portant sur les mycotoxines. Les programmes de vérification d'échantillons
organisés pour les mycotoxines par le Centre international de recherche sur
le cancer ont montré qu'une grande variabilité des résultats doit être
considérée comme la norme plutôt que l'exception et cela n'est guère
réconfortant pour ceux qui doivent payer pour les dosages ou tabler sur ceux-
ci pour des décisions importantes. Dans le cadre du programme du CIRC, des
échantillons de produits agricoles sont envoyés à de nombreux pays
- 126 -

participants en vue de rechercher par analyse les aflatoxines B,, B2, G, et Gz,
ainsi que des échantillons de lait en poudre pour la détection de l'aflatoxine
M,. Après avoir envoyé les résultats de leur analyse, les participants
reçoivent un rapport succinct décrivant les résultats des analyses
préliminaires effectuées sur des échantillons par trois laboratoires choisis
pour leur maîtrise des titrages d'aflatoxine. A un stade ultérieur, un rapport
complet contenant tous les résultats anonymes est distribué. Ces rapports
permettent aux laboratoires participants de juger de la qualité de leurs
propres résultats. La participation à ce programme de vérification
d'échantillons du CIRC est gratuite et elle est fortement recommandée parce
que le personnel qui travaille dans le domaine du dosage des mycotoxines ne
peut qu'admettre la justesse de ce qu'il a été convenu d'appeler la Loi de
Murphy, à savoir:

Rien n'est aussi facile qu'il apparaît.


Tout nécessite plus de temps que prévu
et si quelque chose doit aller mal cela se produira
au pire moment possible.
- 127

VI. PROGRAMME D'ETUDES PROPOSE POUR UN STAGE DE FORMATION


DE TROIS SEMAINES

Ce projet est assez approximatif, étant fondé sur l'expérience acquise


précédemment (voir II.5); il peut être adapté à la situation locale, aux
préférences du directeur de stage et aux derniers perfectionnements de la
méthodologie concernant les mycotoxines. Au besoin, la durée du stage pourrait
être quelque peu réduite par une diminution du nombre des exercices à
répétition.

Jour 1 - Les participants et le directeur de stage se présentent.


Explication du but poursuivi et planifiction approximative des
activités.
Cours magistral V.l: Les mycotoxines: introduction.

Travaux pratiques :

Préparation et manipulation des solutions étalons d'aflatoxine.


Chromatographie en couche mince des étalons d'aflatoxine ,
inspection aux rayons ultraviolets.
Devoirs individuels A-C (voir annexe II).

Jour 2 - Cours magistral V.2: Techniques de chromatographie en couche mince.

Travaux pratiques:

Préparation des plaques de chromatographie en couche mince.


Préparation des solvants révélateurs pour la chromatographie en
couche mince.
Chromatographie en couche mince des aflatoxines B,, B2, G, et G2
préfixées sur plaque ou fixées sur les plaques par l'opérateur.
Identification, valeurs Rf, intensité des taches.
Epreuve de confirmation au H2S04.
Devoirs individuels D-F (voir annexe II).

Jour 3 Travaux pratiques:

Chromatographie en couche mince unidimensionnelle et


bidimensionnelle des extraits (préparatifs effectués par le
directeur de stage).
Interprétation visuelle des plaques développées.
Surimposition des taches étalons sur les taches d'extrait aux fins
de confirmation.
Estimation de la teneur en aflatoxine B, sur la plaque de
chromatographie en couche mince.
Epreuve de confirmation au H2S04.

Jour 4 Travaux pratiques:

Chromatographie en couche mince unidimensionnelle et


bidimensionnelle d'extraits de produits agricoles (extraits
préparés par le directeur de stage).
Interprétation visuelle des plaques développées.
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Estimation des quantités d'aflatoxines B,, B2, G, et G2 sur les


plaques de chromatographie en couche mince.
Calcul de la teneur des échantillons initiaux en aflatoxines B,,
Bz, G, et G2.
Transfert quantitatif des extraits de fiole à flacon.
Nettoyage de la verrerie contaminée.
Préparation des papiers filtres pliés.

Jour 5 Non programmé, laissé libre pour répétition de l'enseignement


théorique ou des exercices des jours 1 à 4, ou pour rattraper un
retard imprévu.

Jour 6 Travaux pratiques: