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ISSN 10142
-90*
manuels
sur le contrôle de la qualité
des •produits alimentaires
gagiss®
fË
manuels
sur le contrôle de la qualité
des produits alimentaires
10. cours de formation
sur l'analyse des mycotoxines
M-82
ISBN 92-5-202947-8
Tous droits réservés. Aucune partie de cette publication ne peut être reproduite,
mise en mémoire dans un système de recherche bibliographique ni transmise sous
quelque forme ou par quelque procédé que ce soit: électronique, mécanique, par
photocopie ou autre, sans autorisation préalable. Adresser une demande motivée
au Directeur de la Division des publications, Organisation des Nations Unies pour
l'alimentation et l'agriculture, Vlale delle Terme dl Caracalla, 00100 Rome, Italie, en
indiquant les passages ou illustrations en cause.
© FAO 1992
AVANT-PROPOS
La plupart de ces cultures sont des céréales et des oléagineux qui sont
extrêmement vulnérables aux champignons et à la production de mycotoxines. Non
seulement les mycotoxines sont dangereuses pour la santé du consommateur, mais
de plus elles altèrent la qualité des produits alimentaires, entrainant
d'énormes pertes économiques pour ces pays.
Le Chef du
Service de la qualité des aliments et des normes alimentaires
Division des Politiques alimentaires et de la nutrition
Organisation des Nations Unies pour l'alimentation et l'agriculture
00100 Rome, Italie
iv -
NOTE SPECIALE
Bien que les informations figurant dans le Manuel aient été préparées
avec le plus grand soin, la FAO décline expressément toute responsabilité à
l'égard des usagers de ces procédures pour les dommages de quelque sorte que
ce soit pouvant résulter de leur application.
Pages
1. Généralités 2
2. Equipement du laboratoire 2
3. Réactifs et matériel de base 2
4. Niveau d'instruction des participants 2
5. Enseignements tirés des cours antérieurs 3
1. Introduction 5
2. Croissance des champignons et production des toxines 7
3. Présence et toxicité des mycotoxines 11
4. Limites et réglementations 13
5. Echantillonnage 20
6. Techniques d'analyse 25
Titrages biologiques 25
Titrages chimiques 27
Extraction 27
Epuration 28
Dernières opérations de séparation,
de détection et de dosage 29
Méthodes chromatographiques 29
a. Chromatographie sur colonne ouverte 30
b. Chromatographie en couche mince 31
c. Chromatographie liquide sous haute pression 39
d. Chromatographie en phase gazeuse 44
Méthodes immunochimiques 44
a. Titrage immunoenzymatique 45
b. Titrage radio-immunologique 50
Conclusion 52
7. Caractéristiques 54
Sensibilité 54
Spécificité 55
Précision 56
Seuil de détection 58
Exactitude 60
8. Assurance de la qualité 61
Principe 64
Réactifs 64
Equipement 65
Mode opératoire 65
Expression des résultats 65
Examen critique 65
V. EXPOSES 103
ANNEXES
Le présent Manuel est conçu pour des cours d'une durée d'environ trois
semaines et il est destiné à former des analystes des pays en développement.
L'accent a été mis sur l'analyse des aflatoxines dans les produits
d'alimentation humaine et animale.
- 2 -
1. Généralités
Pour qu'un cours de formation sur les mycotoxines se déroule dans des
conditions de travail satisfaisantes, il faut veiller à un certain nombre
d'aspects organisationnels. Il est indispensable pour le directeur du cours
de se faire une idée précise des installations au lieu proposé et qu'il soit
avisé du budget disponible pour l'achat de fournitures supplémentaires dès le
stade initial. Si les délais impartis et les ressources le permettent, il est
préférable que le directeur du cours se rende sur place peu •après son
recrutement, éventuellement six mois avant la date prévue pour le cours, afin
d'estimer si les installations conviennent, de prendre note de tous problèmes
éventuels, de suggérer des adaptations, de prendre contact avec les autorités
locales et de commander les fournitures supplémentaires nécessaires. Au lieu
de se rendre sur place en personne, ou en plus, il peut utiliser des
questionnaires pour se faire une idée de la situation à l'endroit proposé pour
le cours de formation (voir annexe I B).
2. Equipement du laboratoire
Bien que ces documents de formation mettent l'accent sur les méthodes
d'analyse des aflatoxines, qui sont relativement faciles à appliquer, il est
impossible de procéder au titrage des aflatoxines sans un minimum de réactifs
et de matériel. Un questionnaire conforme au modèle C (voir annexe I) pourra
se révéler utile pour déterminer si les fournitures essentielles sont
disponibles. La section IV contient des listes détaillées de réactifs et de
matériel pour certaines procédures de laboratoire.
profiter d'un stage de formation de trois semaines, il est bon d'avoir une
certaine expérience de la chimie analytique, et de préférence de l'analyse des
oligo-éléments. Un questionnaire conforme au modèle A (annexe I) pourrait se
révéler utile pour obtenir quelques informations sur les participants.
Divers cours de formation sur les aflatoxines ont été organisés dans des
pays africains et autres entre 1982 et 1988. Les points ci-après reflétant les
enseignements pratiques tirés des cours antérieurs méritent d'être signalés,
car ils pourront guider la programmation de futurs cours de formation sur les
mycotoxines dans les pays en développement.
1. Introduction
Les maladies causées par les mycotoxines sont connues de longue date.
La première mycotoxicose reconnue était probablement l'ergotisme, une maladie
caractérisée par la nécrose et la gangrène et mieux connue au moyen-âge en
Europe sous le nom de "feu sacré"; elle était provoquée par l'absorption de
céréales contaminées par les sclérotes de Claviceps purpurea.
Les deux décennies qui ont suivi la flambée de maladie X du dindon ont
donné naissance à une abondance d'informations sur les aflatoxines et beaucoup
d'autres mycotoxines ont également été isolées et caractérisées. On connaît
aujourd'hui plus de 200 mycotoxines différentes accusant une grande diversité
de structures chimiques. La figure 1 contient des exemples de quelques-unes
de ces structures.
CO OCH3
CH3
0C0CM3
OCOCH3
Sterigmatocystine Ochratoxine A
Tableau 1
3 Qw
1. A. flavus AFLATOXINEB,
2. A. parasiticus
0.80
0 10 20 30 0 10 2 0 30
Température fC)
1. A. clavatus
2. P. expansum PATULINE
3. P. patulum
10 20 30 0 10 20 30
Température (-C)
Encore plus alarmante que les faits concernant les effets aigus des
aflatoxines fut la découverte que l'aflatoxine B, est un hépatocancérogène
très puissant chez le rat (Butler, 1968), et chez toutes les autres espèces
d'animaux de laboratoire soumises aux épreuves (Wogan, 1973). Le tableau 2
récapitule les données concernant la tumorigénicité hépatique de l'aflatoxine
B, chez diverses souches de rats.
Le cancer primitif du foie est l'un des cancers les plus répandus chez
l'homme dans les pays en développement. Les études épidémiologiques menées
dans les années 1970 confirment du point de vue statistique une association
entre l'incidence des carcinomes hépatocellulaires et la consommation
d'aliments contaminés par les aflatoxines. On a estimé pour ces études qu'il
était justifié de comparer l'exposition actuelle aux aflatoxines avec les taux
actuels de cancer, puisque les observations se limitaient à des populations
12 -
Tableau 2
Pour les pays en développement, les aflatoxines sont les mycotoxines les
plus importantes du point de vue de leur présence dans l'environnement, de
leur toxicité et de l'économie nationale. Etant donné les conditions
climatiques favorables à la croissance des champignons et à la production de
toxines dans les aliments et leurs ingrédients, et compte tenu des méthodes
peu satisfaisantes utilisées pour la manutention des produits alimentaires,
il est probable qu'une partie de la population de ces pays soit exposée à un
certain degré d'intoxication par les aflatoxines. Il est beaucoup plus
difficile que dans les pays développés de réduire le risque d'exposition aux
aflatoxines. Pour l'heure, tout au moins, il est presque impossible pour
certains des habitants des pays en développement d'éviter tous les produits
alimentaires contaminés par les aflatoxines.
Outre les dangers que font peser sur la santé les mycotoxines en général
et les aflatoxines en particulier, il faut mentionner l'impact négatif sur
l'économie de ces pays. Dans la plupart d'entre eux, les technologies
applicables pendant et après la récolte et qui empêcheraient la croissance des
moisissures et la production des mycotoxines sont parfois insuffisantes, ou
bien tout simplement inexistantes. Pour de tels pays qui exportent des
produits alimentaires ou autres vers des pays qui ont des programmes efficaces
de contrôle de la contamination et qui mettent en pratique un système de
contrôle de la qualité des denrées alimentaires, les conséquences économiques
peuvent être catastrophiques. D'autre part, la présence de mycotoxines dans
les produits d'alimentation animale peut avoir un effet défavorable sur la
productivité animale. En prenant pour hypothèse une réduction de poids de 3%
chez les poulets de chair en raison d'une faible contamination par les
mycotoxines, Hesseltine (1986) a estimé le montant annuel des pertes à plus
de 140 millions de dollars des Etats-Unis. Ces aspects et d'autres concernant
la réglementation applicable en matière de mycotoxines sont examinés dans la
section 4.
4. Limites et réglementations
- des difficultés pour les pays exportateurs qui recherchent des marchés
pour leurs produits;
Il est clair qu'il n'existe aucune formule simple pour peser ces
facteurs. Toute décision est surtout question de bon sens. Le personnel des
services de santé publique est confronté à un problème complexe: les
mycotoxines, et singulièrement les aflatoxines, doivent être exclues des
produits d'alimentation humaine dans toute la mesure possible, mais puisque
les substances sont présentes dans les aliments sous forme de contaminants
naturels, on ne peut pas empêcher totalement l'homme d'y être exposé. Il
s'ensuit donc qu'il faut tolérer l'exposition de la population à un certain
degré d'aflatoxines. L'adoption de réglementations pour le contrôle des
aflatoxines est un processus en continuelle évolution dans certains pays. La
plupart des pays n'ont pas rendu publiques les informations qui ont servi de
base aux décisions concernant la fixation de tolérances. Il faut citer comme
exception les Etats-Unis d'Amérique où tous les problèmes et toutes les
difficultés ont été exposés dans des publications, de sorte que la raison
d'être des décisions prises est connue (Stoloff, 1980).
Dans les cas où les pays ont fixé des tolérances différentes pour les
aflatoxines selon les produits, on a retenu la tolérance applicable aux
produits d'alimentation humaine "principaux" (s'agissant souvent de produits
à base d'arachides), ce choix ayant pu avoir occasionnellement un caractère
subjectif. Pour les pays qui avaient indiqué une tolérance nulle pour la somme
des aflatoxines Bi, B2, G, et G2, on a considéré automatiquement que la
tolérance était nulle pour l'aflatoxine B,, si ce n'était pas spécifié
séparément.
16
Nombre de pays
U• N =30
12
10 •
10 15 20 25 30 35 40 ¿5 50
Tolérance (ng/kg)
F i g u r e 4 . D i s t r i b u t i o n de f r é q u e n c e des q u a n t i t é s t o l é r é e s
(en v i g u e u r ou p r o p o s é e s ) d ' a f l a t o x i n e B, d a n s les p r o d u i t s
d'alimentation humaine dans divers pays.
Nombre de pays
14
12
N = 35
10
10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tolérance (ng/kg)
F i g u r e 5 . D i s t r i b u t i o n de f r é q u e n c e d e s q u a n t i t é s t o l é r é e s
(en v i g u e u r o u p r o p o s é e s ) de la s o m m e d e s a f l a t o x i n e s
B ^ B j + G ^ G g d a n s les p r o d u i t s d ' a l i m e n t a t i o n h u m a i n e
dans divers pays.
- 17 -
Dans les cas où les pays ont fixé des tolérances différentes pour les
aflatoxines selon les produits, on a retenu la tolérance applicable aux
produits d'alimentation humaine "principaux" (s'agissant souvent de produits
à base d'arachides), ce choix ayant pu avoir occasionnellement un caractère
subjectif. Les tolérances applicables à la somme de l'aflatoxine B, et des
autres aflatoxines ont été considérées comme correspondant aux tolérances
applicables à la somme des aflatoxines B,, B2, G, et G2.
Nombre de pays
I
N =13
Tolérance (ng/kg)
Seules ont été incluses les tolérances pour l'aflatoxine M, dans le lait
de consommation (pas pour des produits spécifiés contenant du lait tels que
les préparations pour nourrissons).
- 18 -
Nombre de pays
12
N = 18
10
10 20 25 30 35 Í.0 ¿5 50
Tolérance (wj/kg)
Seules ont été incluses les tolérances pour l'aflatoxine B, dans les
produits d'alimentation animale pour bovins laitiers (ou pour les produits
d'alimentation animale en général, si aucune précision n'a été fournie).
Nombre de pays
12
N=6
10
10 15 20 25 30 35 ¿0 ¿5 50
Tolérance (ng/kg)
5. Echantillonnage
100
80
c Echantillonnage (21,8 kg)
o
•S 6 0
CO
>
CD
"O
c
2 40
o
it
ai
O
o Sous-échantillonnage (1100 g)
20
Analyse (18,3 g avec répétition)
0 20 40 60 80
Concentration d'aflatoxine ((ig/kg)
Tolérance
Tolérance
Taille de l'échantillon
3.2 kg
9.1 kg
3 4 kg
10 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 100
Concentration d'aflatoxine (p.g/kg) j g / k g )
1.00 r
0.90 Tolérance
o
0.80
3
T3 0 . 7 0
c
O
ra0 . 6 0
Q. Faible
O 0.50
ra
b 0.40
S
S 0.30
ra
-O
o 0.20
CL
0.10
10 20 30 40 50 60 70 80
Concentration d'aflatoxine (p.g/kg)
Tolérance
c
13
T3
C
O Seuil de décision
ra
o. 50 jug/kg
25 / j g / k g
ra 10 > j g / k g
-<D
-O
ra
-O
O
10 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 70 8 0 9 0 100
Concentration d'aflatoxine (ng/kg)
On peut citer comme exemple d'un tel plan d'échantillonnage celui du PAC
(Peanut Administrative Committee - Commission administrative sur les
arachides) qui est appliqué aux Etats-Unis d'Amérique pour l'échantillonnage
des lots importants d'arachides avant qu'ils soient expédiés à l'usine de
traitement (Dickens, 1977). Ce procédé d'échantillonnage comporte des
opérations multiples d'échantillonnage et de titrage effectuées sur des unités
représentatives de 22 kg du lot avec application d'une tolérance de 25 pg/kg
pour la somme des aflatoxines B,, B2, G, et G2.
Bien que l'opération soit parfois coûteuse, il est hors de doute qu'il
faut prélever de très grands échantillons d'arachides pesant plusieurs
kilogrammes pour ramener à un niveau minimal le risque d'une décision erronée
tant pour le consommateur que pour le producteur. Avec ces échantillons de
grande taille, il est nécessaire de procéder à un sous-échantillonnage pour
rendre possible une analyse adéquate. Vu l'éventualité d'une hétérogénéité,
il faut broyer et homogénéiser la totalité de l'échantillon. On a mis au point
à cet effet des instruments spéciaux et des techniques spéciales tels que la
meule de sous-échantillonnage de Dickens -Satterwhite (Dickens, 1969) et
l'appareil vertical de coupe et malaxage de Hobart (Francis, 1979). Ensuite,
ou bien on analyse la totalité du sous-échantillon, ou bien on réduit de
nouveau la taille du sous-échantillon jusqu'à ce qu'on obtienne une prise
d'essai dont la taille se situe généralement entre 20 et 100 g. Il semble
qu'on ait fixé la taille à 50 g pour parvenir à un compromis entre l'économie
de solvant et l'obtention d'un échantillon représentatif. Dans le programme
d'essai de la PAC pour les arachides, on procède à l'extraction de la totalité
du sous-échantillon (1 100 g) au moyen d'un mélange de 1 650 ml de méthanol,
1 350 ml d'eau, 1 000 ml d'hexane et 22 g de chlorure de sodium. Outre qu'ils
soient coûteux, les solvants sont une importante source d'énergie et ils est
difficile de s'en débarrasser après usage sans polluer l'environnement. Aussi
Whitaker (1980) a-t-il proposé une méthode qui consiste à extraire les
aflatoxines au moyen d'un solvant à partir d'un échantillon de 130 g d'une
boue qu'on obtient en mélangeant 1 100 g de graines d'arachides broyées,
1 500 ml d'eau et 22 g de chlorure de sodium dans un malaxeur Waring. Il
semble que la variance parmi les analyses avec cette méthode ne différait pas
sensiblement de la variance constatée entre les analyses effectuées selon le
procédé officiel de la PAC.
6. Techniques d'analyse
Titrages biologiques
Parmi les animaux terrestres, il semble que les plus sensibles aux
mycotoxines soient les canetons et les embryons de poulet. Lors de l'épreuve
biologique initialement mise au point à l'occasion de la flambée de maladie X
du dindon (Carnaghan, 1963), on a utilisé des canetons nouvellement éclos
- 26 -
Les titrages biologiques peuvent être utiles quand il n'est pas possible
de procéder à un titrage chimique. Les titrages biologiques se sont révélés
surtout utiles pour le dépistage des mycotoxines. Cependant, leur emploi pour
la surveillance des produits d'alimentation humaine et animale est de peu
d'importance car ces méthodes manquent généralement de spécificité, de
reproductibilité et de rapidité.
27
Titrages chimiques
Echantillonnage
1
Extraction
1
Epuration de l'extrait
\
Concentration
\
Séparation des composants de l'extrait
J
Détection et dosage
I
Confirmation de l'identité
Extraction
une ampoule à décantation ou absorbés sur un milieu hydrophile qui est placé
au préalable dans une colonne, après quoi l'extraction est effectuée par
élution au solvant. On peut citer comme exemple de cette dernière technique
d'extraction la procédure employée pour doser l'aflatoxine M, dans le lait,
où l'on utilise une colonne de Celite préparée en laboratoire (Schuller,
1973).
Epuration
les p i g m e n t s de g o s s y p o l d a n s des e x t r a i t s de g r a i n e s de c o t o n ( P o n s , 1 9 6 5 )
( W i s e m a n , 1 9 6 7 ) , le c a r b o n a t e de c u i v r e p o u r é l i m i n e r la c h l o r o p h y l l e
( V e l a s c o , 1 9 7 0 ) e t le n i t r a t e d ' a r g e n t p o u r e x t r a i r e la t h é o b r o m i n e d u c a c a o
(Scott, 1969).
L e s t e c h n i q u e s d ' é p u r a t i o n s u s m e n t i o n n é e s s o n t e n f a i t des p r o c é d u r e s
de s é p a r a t i o n p e r m e t t a n t de s é p a r e r l ' u n de l ' a u t r e d e s g r o u p e s de s u b s t a n c e s
p o s s é d a n t c e r t a i n e s p r o p r i é t é s p h y s i c o c h i m i q u e s . Il e s t p o s s i b l e de c e t t e
m a n i è r e d ' é l i m i n e r la m a j e u r e p a r t i e d e s s u b s t a n c e s e x t r a i t e s s i m u l t a n é m e n t .
Le c h o i x de la t e c h n i q u e d ' é p u r a t i o n p o u r r a d é p e n d r e de la m é t h o d e e m p l o y é e
p o u r la d é t e c t i o n e t le d o s a g e , d u s e u i l de d é t e c t i o n r e q u i s , de la r a p i d i t é
de l ' a n a l y s e e t d u d e g r é de r é c u p é r a t i o n .
Les extraits qui ont été épurés sont généralement concentrés par
évaporation du solvant dans un évaporateur rotatif sous pression réduite, ou
à l ' é t u v e , t a n d i s q u e l ' e x t r a i t e s t m a i n t e n u s o u s u n c o u r a n t d ' a z o t e . Le
r é s i d u e s t r e d i s s o u s d a n s u n p e t i t v o l u m e de s o l v a n t , p u i s transféré
quantitativement dans une petite fiole et amené à un v o l u m e spécifié. Selon
la t o x i n e e t l ' é t a p e u l t i m e de s é p a r a t i o n e t de d é t e c t i o n p r é v u e , il p e u t
s ' a v é r e r n é c e s s a i r e de p r o c é d e r à la d é r i v a t i o n de la m y c o t o x i n e à l a q u e l l e
o n s ' i n t é r e s s e a f i n de p o u v o i r la m e s u r e r o u e n o p t i m i s e r le c o m p o r t e m e n t
chromatographique.
D e r n i è r e s o p é r a t i o n s de s é p a r a t i o n , de d é t e c t i o n et de d o s a g e
Méthodes chromatographiques
L e s p r o c é d é s c h r o m a t o g r a p h i q u e s i m p l i q u e n t u n p a r t a g e b a s é s u r la
s o l u b i l i t é d i f f é r e n t i e l l e d ' u n e s u b s t a n c e v i s - à - v i s d ' u n e p h a s e f i x e (le
s u p p o r t c h r o m a t o g r a p h i q u e ) e t d ' u n e p h a s e m o b i l e ( l i q u i d e o u g a z e u s e ) , les
s u b s t a n c e s à s é p a r e r p a s s a n t à t r a v e r s le s u p p o r t c h r o m a t o g r a p h i q u e . L a p h a s e
f i x e r e t a r d e p l u s o u m o i n s le p a s s a g e des s u b s t a n c e s s e l o n l e u r s p r o p r i é t é s
p h y s i c o c h i m i q u e s , de s o r t e q u e la s é p a r a t i o n d e s c o n s t i t u a n t s p e u t ê t r e
r é a l i s é e . P o u r le t i t r a g e des m y c o t o x i n e s , o n p e u t d i s t i n g u e r les t y p e s de
chromatographie suivants:
Les méthodes sur minicolonne sont des méthodes "tout ou rien" qui ne
prennent que peu de temps et ne nécessitent aucun matériel complexe. Aussi
sont-elles utiles pour les épreuves de dépistage à effectuer sur le terrain
par des spécialistes scientifiques et des techniciens dans les pays en
développement. En conséquence, l'Organisation de coopération et de
développement économiques (OCDE) a décrit quelques méthodes sur minicolonne
pour les aflatoxines dans un manuel sur le dépistage rapide des mycotoxines
(OCDE, 1982). En dépit de quelques avantages, les méthodes sur minicolonne ont
certaines limitations: l'interprétation de l'image sur la colonne exige une
certaine expérience et elle peut se révéler particulièrement difficile quand
sont appliqués sur la colonne des extraits "souillés" contenant des composés
fluorescents autres que la toxine recherchée. En pareil cas, on risque
d'obtenir des résultats faussement positifs. Les méthodes sur minicolonne sont
au mieux semi- quantitatives et en général leur seuil de détection est plus
élevé et la sensibilité, le pouvoir de résolution et la sélectivité sont
inférieurs à ce qu'on obtient avec la chromatographie en couche mince et la
chromatographie liquide sous haute pression. On peut s'attendre à ce que le
titrage immuno-enzymatique remplace les méthodes sur minicolonne pour le
dépistage rapide.
31
Laine de verre
Sulfate de calcium
Alumine
Gel de silice
FlorisilR
Sulfate de calcium
Laine de verre —
iSséW
Si l'on ne dispose pas d'un densimètre, ce qui sera souvent le cas dans
les pays en développement, on peut recourir au schéma de taches disposées
perpendiculairement à la diagonale tel que l'avait mis au point à l'origine
Beljaars (1973) pour le dosage de l'aflatoxine B, dans les arachides
(figure 21): on dispose en taches une aliquote d'un extrait de l'échantillon
en A et différentes quantités de l'étalon d'aflatoxine B, en B. La plaque est
soumise à un développement bidimensionnel et la détection et le dosage sont
de nouveau effectués sous rayonnement ultraviolet (figure 22). Avec l'aide de
la rangée d'étalons d'aflatoxine B, soumis à un développement bidimensionnel,
il est possible de localiser l'aflatoxine B, provenant de l'extrait et
d'estimer sa concentration en comparant l'intensité de sa fluorescence avec
- 35 -
celle des différents étalons d'aflatoxine B,. Etant donné que toutes les
taches d'aflatoxine B, sont alignées et assez proches l'une de l'autre, une
telle estimation est plus facile qu'une comparaison visuelle avec des taches
d'étalon développées dans les bandes latérales, comme c'est le cas pour le
schéma de taches densimétrique. Toutefois, cette technique n'est applicable
que si les taches d'étalon apparaissent dans une partie "libre" de la plaque
après le développement bidimensionnel.
Orientation 1
>•
B
•
• m
A B B
A
• • •
A : extrait de l'échantillon . . . • • .
B: étalon d'aflatoxine 0 5 cm
Figure 19. Disposition des taches Figure 20. Séparation d'un extrait
pour la chromatographie en couche de beurre d'arachides soumis à la
mince bidimensionnelle (dosage chromatographie en couche mince
densimétrique). bidimensionnelle avec utilisation
d'un schéma de répartition des
taches densimétrique.
M a l g r é t o u t e s les t e c h n i q u e s d ' é p u r a t i o n a u x q u e l l e s o n a r e c o u r s , il
subsiste des substances qui se comportent pendant la séparation
c h r o m a t o g r a p h i q u e e n c o u c h e m i n c e de la m ê m e f a ç o n q u e la m y c o t o x i n e q u ' o n
c h e r c h e à d o s e r . P o u r r é d u i r e a u m i n i m u m le r i s q u e de r é s u l t a t s f a u s s e m e n t
p o s i t i f s , il f a u t c o n f i r m e r l ' i d e n t i t é de la m y c o t o x i n e d a n s les é c h a n t i l l o n s
p o s i t i f s , surtout quand l'opérateur n'a pas une grande expérience du titrage
d e s m y c o t o x i n e s . L a m é t h o d e la p l u s f i a b l e à c e t t e f i n e s t la s p e c t r o m é t r i e
de m a s s e à h a u t e r é s o l u t i o n . T o u t e f o i s , la s p e c t r o m é t r i e de m a s s e à h a u t e
r é s o l u t i o n a s s o c i é e à la c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e e s t u n e p r o c é d u r e
a s s e z l o n g u e e t la p l u p a r t d e s l a b o r a t o i r e s d a n s les p a y s e n d é v e l o p p e m e n t n e
s e r o n t p a s d o t é s de ce t y p e d ' é q u i p e m e n t c o m p l e x e . Il l e u r f a u d r a d o n c
a p p l i q u e r d e s t e c h n i q u e s p l u s s i m p l e s . S a n s d o u t e les m o y e n s les p l u s s i m p l e s
de c o n f i r m e r la p r é s e n c e de m y c o t o x i n e s s o n t - i l s l ' u t i l i s a t i o n de s y s t è m e s de
solvants supplémentaires ou l'application d'une chromatographie
s u p p l é m e n t a i r e , l ' o p é r a t i o n de c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e é t a n t a l o r s
r é p é t é e a v e c u n é t a l o n i n t e r n e q u i e s t s u r i m p o s é s u r la t a c h e d ' e x t r a i t a v a n t
le développement de la p l a q u e . A p r è s achèvement de l'opération de
c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e , c e t é t a l o n s u r i m p o s é e t la t a c h e " p r é s u m é e "
de t o x i n e p r o v e n a n t de l ' é c h a n t i l l o n d o i v e n t c o ï n c i d e r . U n e a u t r e p o s s i b i l i t é
c o n s i s t e à p u l v é r i s e r u n r é a c t i f s u r la p l a q u e de c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e
m i n c e d é v e l o p p é e , de s o r t e q u e la c o u l e u r (de f l u o r e s c e n c e ) de la t a c h e de
m y c o t o x i n e c h a n g e . C o m m e e x e m p l e de c e t t e d e r n i è r e p o s s i b i l i t é , o n p e u t c i t e r
l ' é p r e u v e de p u l v é r i s a t i o n a v e c u n e s o l u t i o n d i l u é e d ' a c i d e s u l f u r i q u e ( S m i t h ,
1 9 6 2 ) q u i e n t r a î n e u n c h a n g e m e n t de c o u l e u r de la f l u o r e s c e n c e , les t a c h e s
d ' a f l a t o x i n e v i r a n t d u b l e u a u j a u n e . B i e n q u e les é p r e u v e s d é c r i t e s p l u s
h a u t , s i e l l e s d o n n a i e n t u n r é s u l t a t n é g a t i f , e x c l u r a i e n t la p r é s e n c e de la
m y c o t o x i n e r e c h e r c h é e , c e l l e - c i n e s e r a i t t o u t e f o i s p a s c o n f i r m é e e n c a s de
résultat positif.
37
Orientation 1
•
• CD
B
•
B
•
•B
A
• B
•
A: extrait de l'échantillon
B: étalon d'aflatoxine O 5 cm
Figure 21. Disposition des taches Figure 22. Séparation d'un extrait
selon un schéma antidiagonal pour la de beurre d'arachides soumis à la
chromatographic en couche mince chromatographie en couche mince
bidimensionnelle (dosage visuel). bidimensionnelle avec utilisation
du schéma de répartition des taches
antidiagonal.
même plaque et ayant subi la même procédure. D'autres constituants (non soumis
à réaction) sont disposés en diagonale, formant une bissectrice sur la plaque,
du fait que la séparation a été effectuée selon les deux orientations dans des
conditions rigoureusement identiques. La figure 24 illustre le résultat d'une
telle épreuve de confirmation appliquée à un produit d'alimentation animale
contaminé par les aflatoxines B, et G,.
A B
• •
quantité décelable minimale d'aflatoxine B, serait d'environ 0,3 ng, alors que
l'application de la méthode de Manabe aux produits d'alimentation humaine et
animale a révélé que des quantités des quatre afltoxines B,, B2, G, et G2 de
10 à 20 /¿g/kg étaient encore décelables. Par rapport aux autres techniques
utilisées pour accentuer la fluorescence des aflatoxines B, et B2, les seuils
de détection indiqués par Manabe (1978) ne sont pas très impressionnants;
toutefois, cette technique est la plus facile à appliquer. Elle a pour
inconvénient la décomposition possible des aflatoxines B, et G, sur la colonne
par suite de la présence d'acide dans la phase mobile. Il faut veiller à ne
pas employer de trop grandes quantités d'acide et vérifier avec des témoins
s'il se produit une décomposition dans les conditions de séparation optimales.
O 5 10 15 20
>. min.
Figure 25. Chromatogramme (chromatographie liquide sous haute pression de
phase inverse) C18 d'un extrait de produit d'alimentation animale contenant de
la pulpe d'agrumes et contaminé par les aflatoxines B,, B2 , G, et G2 à raison
d'environ 12, 3, 8 et 1 pg/kg respectivement, préparé selon van Egmond
(1987) .
Pic M
0 5 10
Durée de rétention (min.)
Méthodes immunochimiques
l'antigène, par exemple pour les protéines ou les polypeptides d'un poids
moléculaire supérieur à 5000 Dalton. En règle générale, les mycotoxines ont
un poids moléculaire trop faible pour produire directement des anticorps quand
elles sont administrées à des animaux. Ces substances qu'on appelle des
haptènes doivent être conjuguées par covalence avec des protéines avant que
l'immunisation puisse se produire. Les anticorps (immunsérums) sont un groupe
de protéines sériques aussi appelées immunoglobulines. La plupart des
immunoglobulines appartiennent à la classe IgG. Du fait qu'il existe pour ces
immunoglobulines des sites de réaction non seulement pour les anticorps mais
aussi pour les déterminants antigéniques, elles peuvent elles-mêmes servir
d'antigènes quand elles sont injectées dans un organisme animal étranger.
Cette possibilité est exploitée dans certains types de titrages immunologiques
(par exemple le titrage avec immunoadsorbant lié à une enzyme opérant par
immuno cap ture, dont il est question plus loin). Il n'entre pas dans les
limites du présent chapitre d'exposer en détail la conjugaison des haptènes
et la production d'anticorps dirigés contre les mycotoxines. Plus important
est de savoir que des immunsérums dirigés contre certaines des mycotoxines
(des aflatoxines en particulier) ont été produits (Chu, 1983). Certains de ces
immunsérums sont aujourd'hui disponibles dans le commerce, quoique le plus
souvent uniquement dans des nécessaires d'épreuve.
a. Titrage immunoenzymatique
••n — ^
> R ^ ^
KOE + KO
K K t OE :
Produit coloré
K O E + SLJ PP ort
Anticorps spécifique AE
K (fixé à la paroi)
O Antigène
Antigène marqué
par une enzyme (antigène)
K + 0 KO+ OE KO
K K KOE
+ support
Produit coloré
AE'
K Anticorps spécifique
O (fixé à la paroi)
Antigène (antigène)
O E Antigène marqué
par une enzyme
IO + > + ) E ^ l<C>»E
+ support
O Antigène Produit coloré
l O Antigène fixé à la paroi AE
)>-° Anticorps spécifique
Anticorps anti-immunoglobuline
marqué par une enzyme (antigène)
b . Titrage radio-immunologique
100% actif
• • • • • • + I I I
100% actif
I I I SWT
50% actif
f 91 50% actif
•oo««o + II I
ottoo* irâr
33% actif
oootot II I 9f 9
ottooo + 33% actif
•ooo«o "5751r
17% actif
O•OOOO
•ooooo 999
ootooo , 17% actif
oooo«o T II 1
ooo*oo
ooooo*
Complexe Anticorps Antigène contenant
antigène-anticorps la prise d'essai
# Antigène marqué
O Antigène libre
Conclusion
4. Bien qu'étant l'une des plus anciennes méthodes employées pour les
mycotoxines, la chromatographie en couche mince est une technique de
séparation fiable, aisément réalisable et relativement simple,
offrant un large chanmp d'application. C'est la technique de choix
pour les pays en développement. Son application bidimensionnelle
offre une résolution particulièrement bonne, d'où un seuil de
détection assez bas.
Tableau 3
Titrage
biologique Limité Faible Elevé Faible Non
Chromatographie
en couche
mince Large Elevée Faible Faible Non
Chromatographie
liquide sous Partiel-
haute pression Large Elevée Faible Elevé lement
Chromatographie
en phase Partiel-
gazeuse Limité Elevée Faible Elevé lement
Titrage radio-
immunologique Limité * Faible Elevé Oui
* Inconnue actuellement.
- 54 -
7. Caractéristiques
Sensibilité
Cu —-c
Spécificité
Précision
méthode ELISA pour l'aflatoxine B,. Très intéressants sont les résultats d'une
étude rétrospective d'Horwitz (1980, 1981) qui a étudié les données en matière
de précision tirées d'environ 200 études concertées menées sous les auspices
de l'AOAC, dont plusieurs portant sur les aflatoxines. Il a pu en tirer deux
conclusions remarquables qui sont également applicables au titrage des
afltoxines (chromatographie en couche mince): 1) la précision
interlaboratoires (reproductibilité) semble être fonction de la concentration
(figure 33) et semble être indépendante de la nature de la substance à
analyser ou de la technique de mesure adoptée.
Ces conclusions ont une grande importance sur le plan pratique. Elles
signifient qu'à un niveau d'environ 10 ng/kg, niveau de contamination "normal"
pour l'aflatoxine B,, on peut s'attendre à un CV d'environ 20% dans un
laboratoire donné et à un CV interlaboratoires d'environ 32%. En outre, à un
niveau de 0,1 /¿g/kg, niveau de contamination "normal" pour l'aflatoxine M,,
on peut s'attendre à un CV dans un laboratoire donné d'environ 40% et à un
CV interlaboratoires d'environ 64%.
Seuil de détection
*B X,
C, c,
m — dx/dc —• de = dx/m
C L - C0 - (XL - x B )/m
CL = 3s B /m
10SB
3Sb _ ,
i
\ i
\ i
\ i
\ i
\ i
\i
\i
Exactitude
8. Assurance de la qualité
Pour que la fiabilité des résultats d'épreuve puisse être vérifiée selon
au moins deux méthodes indépendantes, il faut que celles-ci aient été
utilisées avec succès dans d'autres situations analogues comportant des
analyses (mêmes concentrations, mêmes interférences). On entend par
"indépendantes" des déterminations reposant sur différentes propriétés
physico-chimiques de la substance analysée, par exemple la chromatographie en
couche mince par opposition à la méthode ELISA. Il est très peu probable que
deux méthodes indépendantes puissent accuser une erreur systématique du même
ordre de grandeur et dans le même sens. Par conséquent, quand les résultats
de différentes analyses concordent, il est à peu près certain qu'ils sont
exacts. Les comparaisons faites dans un même laboratoire selon des méthodes
indépendantes sont un précieux élément dans un programme d'assurance de la
qualité.
62 -
Tableau 4
Méthode Observations
Tableau 5
Description d'une méthode pour mesurer l'activité de l'eau (aw) dans les
produits d'alimentation humaine. Cette épreuve convient pour vérifier la a w
de diverses denrées agricoles, laquelle doit être conforme aux normes fixées
en la matière pour empêcher la croissance des champignons et la production de
mycotoxines.
Définition
Principe
Réactifs
Vaseline
Sels pulvérisés, maille 105-210 ^m, le choix des sels étant fonction
d'étalons représentant les échantillons à soumettre aux épreuves.
Equipement
Mode opératoire
Observer les cristaux pour voir s'ils sont liquéfiés ou non. Quand 50%
ou davantage des cristaux sont liquéfiés, le résultat de l'épreuve est jugé
positif.
Dans le cas d'une épreuve positive, 50% ou plus des cristaux du sel x
sont liquéfiés au bout de 3 à 24 heures selon le type de sel, le type de
produit et la température (voir tableau 6). La a w de l'échantillon peut être
exprimée ainsi:
Examen critique
Tableau 6
Arachides non
décortiquées 0,702 CuCl2.2H20 0,018
Solution de
glycérol 0,776 NaCl 0,020 4
Solution de
glycérol 0,876 KC1 0,020
Solution de
glycérol 0,890 K2Cr04 0,020 12
Saucisse
fermentée 0,960 (NH4)H2P04 0,021 4
b. Mode opératoire
Vérifier que les couches minces soient bien lisses et étalées de façon
égale sur les plaques. conserver au dessiccateur jusqu'au moment de
1'utilisation.
- 68 -
a. Equipement
c = concentration en mmol/L
1 = trajet en mètres.
b. Vérification de la pureté
Tableau 7
Tableau 8
Tableau 9
Aflatoxine PM
B, 312
B2 314
G, 328
G2 330
M, 328
(A x PM x FC)
/¿g d'aflatoxine/ml = , où
1 x S
B, 1980 2100
B2 2090
G, 1710
G2 1820
M, 1882 1995
Tableau 10
le c o n t e n u s o i t à la t e m p é r a t u r e a m b i a n t e . L a s o l u t i o n - m è r e p e u t ê t r e
c o n s e r v é e 4 m o i s si e l l e e s t s t o c k é e d a n s u n r é f r i g é r a t e u r à l ' a b r i de la
l u m i è r e . L a s o l u t i o n é t a l o n p e u t ê t r e c o n s e r v é e a u m o i n s 14 j o u r s si e l l e e s t
s t o c k é e de la m ê m e f a ç o n .
g. P r é p a r a t i o n de l ' é t a l o n de r é f é r e n c e p o u r résolution
P r é p a r e r l ' é t a l o n de r é f é r e n c e p o u r r é s o l u t i o n e n m é l a n g e a n t les
s o l u t i o n s d ' a f l a t o x i n e s B,, B 2 , G, e t G 2 a f i n d ' o b t e n i r d e s c o n c e n t r a t i o n s de
1 , 0 , 4 , 1 e t 0 , 4 yLig/ml r e s p e c t i v e m e n t l o r s de la d i l u t i o n f i n a l e a v e c le
c h l o r o f o r m e o u le b e n z è n e - a c é t o n i t r i l e .
C h r o m a t o g r a p h i c en c o u c h e m i n c e
a. D é p ô t des t a c h e s et développement
P o u r l ' a n a l y s e d e s m y c o t o x i n e s p a r c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e , les
s u b s t a n c e s q u i s o n t a p p l i q u é e s sur la p l a q u e o n t g é n é r a l e m e n t u n v o l u m e
v a r i a n t de 5 à 25 /il. S e l o n l ' e x a c t i t u d e e t la p r é c i s i o n s o u h a i t é e s , o n p e u t
u t i l i s e r d i f f é r e n t s t y p e s d ' a p p l i c a t e u r s , t e l s que des p i p e t t e s c a p i l l a i r e s
q u a l i t a t i v e s , des p i p e t t e s c a p i l l a i r e s q u a n t i t a t i v e s o u d e s s e r i n g u e s de
précision.
S u r la m ê m e p l a q u e de c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e o n a p p l i q u e
d i r e c t e m e n t l ' u n e a p r è s l ' a u t r e des p a r t i e s a l i q u o t e s de l ' é c h a n t i l l o n , de
m ê m e q u e des p a r t i e s a l i q u o t e s de la s o l u t i o n é t a l o n , e n v e i l l a n t à ce q u e les
t a c h e s s o i e n t de t a i l l e r é d u i t e e t u n i f o r m e . De c e t t e f a ç o n , la c o m p a r a i s o n
de l ' é c h a n t i l l o n e t de l ' é t a l o n e s t p o s s i b l e e t j u s t i f i é e , é t a n t d o n n é q u e les
d e u x s o n t s o u m i s a u x m ê m e s c o n d i t i o n s de d é v e l o p p e m e n t e t que les v a r i a t i o n s
é v e n t u e l l e s d ' u n e p l a q u e à l ' a u t r e s o n t é l i m i n é e s . Il e s t de b o n n e p r a t i q u e
d a n s u n l a b o r a t o i r e d ' a p p l i q u e r les é c h a n t i l l o n s e t les é t a l o n s a u s s i v i t e que
p o s s i b l e s o u s u n f a i b l e é c l a i r a g e à i n c a n d e s c e n c e , de p r é f é r e n c e e n a t m o s p h è r e
i n e r t e p o u r é v i t e r la d é c o m p o s i t i o n . A c e t t e m ê m e f i n , il f a u t , a p r è s le d é p ô t
des t â c h e s , c o u v r i r c e l l e s - c i d ' u n e p l a q u e e n v e r r e . P o u r l ' e s t i m a t i o n
v i s u e l l e , il e s t n é c e s s a i r e que l ' i n t e n s i t é des t a c h e s d ' é c h a n t i l l o n s se s i t u e
d a n s la g a m m e des i n t e n s i t é s d ' u n e s é r i e c r o i s s a n t e de t a c h e s d ' é t a l o n s . P a r
c o n s é q u e n t , s i l ' o n a n a l y s e les é c h a n t i l l o n s de c o n c e n t r a t i o n s de m y c o t o x i n e s
i n c o n n u e s , il e s t u t i l e de p r o c é d e r d ' a b o r d à u n e o p é r a t i o n p r é l i m i n a i r e de
c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e p o u r d é t e r m i n e r la t e n e u r a p p r o x i m a t i v e e n
m y c o t o x i n e , a f i n q u ' o n p u i s s e p r é p a r e r u n e d i l u t i o n a p p r o p r i é e p o u r la
c h r o m a t o g r a p h i e q u a n t i t a t i v e e n c o u c h e m i n c e . P o u r le d o s a g e d e n s i m é t r i q u e ,
il f a u t p r o c é d e r à d e s d i l u t i o n s si l ' i n t e n s i t é des t a c h e s d ' é c h a n t i l l o n e t
c e l l e d e s t a c h e s d ' é t a l o n n e s o n t p a s d u m ê m e o r d r e de g r a n d e u r .
b. Interprétation et calcul
S x Y x V
MgAg = , où
X x W
B x Y x S x V
Mg/kg = , où
Z x X x W
D a n s la m é t h o d e ( s i m p l e ) de P r z y b y l s k i , o n o b t i e n t ce r é s u l t a t e n
s u r i m p o s a n t de l ' a c i d e t r i f l u o r o a c é t i q u e d i r e c t e m e n t s u r la t a c h e d ' e x t r a i t
a v a n t le d é v e l o p p e m e n t . A p r è s la r é a c t i o n , la p l a q u e e s t d é v e l o p p é e e t
e x a m i n é e s o u s é c l a i r a g e u l t r a v i o l e t p o u r d é t e r m i n e r la p r é s e n c e de la t a c h e
b l e u e d e f l u o r e s c e n c e de l ' a f l a t o x i n e B 2 a , q u i p e u t ê t r e i d e n t i f i é e à l ' a i d e
d ' u n é t a l o n d ' a f l a t o x i n e B, d é p o s é e n t a c h e s sur la m ê m e p l a q u e e t s o u m i s à
l a m ê m e o p é r a t i o n . C o m m e c o n f i r m a t i o n s u p p l é m e n t a i r e , o n p u l v é r i s e d u H 2 S 0 4 sur
u n e a u t r e p a r t i e de la p l a q u e o ù o n t été d é v e l o p p é e s d e s p a r t i e s a l i q u o t e s
n ' a y a n t p a s r é a g i de l ' e x t r a i t e t de l ' a f l a t o x i n e B, s e r v a n t d ' é t a l o n . L a
p u l v é r i s a t i o n d ' a c i d e H 2 S 0 4 m o d i f i e la f l u o r e s c e n c e de l ' a f l a t o x i n e , q u i v i r e
d u b l e u a u j a u n e , c e t t e é p r e u v e n e f a i t que c o n f i r m e r l ' a b s e n c e d ' a f l a t o x i n e ,
c ' e s t - à - d i r e que les taches qui ne virent pas au jaune ne sont certainement
p a s de l ' a f l a t o x i n e , m a i s de n o m b r e u s e s s u b s t a n c e s a u t r e s que l ' a f l a t o x i n e
p e u v e n t donner une tache jaune avec du H2S04.
N.B.: Ces deux méthodes sont tout aussi satisfaisantes l'une que l'autre pour
c o n f i r m e r l ' i d e n t i t é de l ' a f l a t o x i n e G,.
b. M é t h o d e de l ' A O A C p o u r l ' a f l a t o x i n e B, ( u n i d i m e n s i o n n e l l e )
Mode opératoire
Chloroforme
-acétone
(85+15)
# Echantillon
O Etalon
C Echantillon + étalon
Figure 36
N.B.: Ces modes opératoires sont basés sur la méthode officielle des
Communautés européennes, Journal officiel des Communautés européennes L102,
9-18 (1976), texte modifié par P.L. Schuller et H.P. van Egmond.
b. Principe
c. Réactifs
Acétone
Chloroforme, stabilisé avec 0,5 à 1,0% d'éthanol à 96% (v/v)
n-Hexane
Méthanol
Ether éthylique anhydre, exempt de peroxydes
Mélange de benzène et d'acétonitrile: 98/2 (v/v)
Mélange de chloroforme et de méthanol: 97/3 (v/v)
Gel de silice pour chromatographie sur colonne; granulométrie:
0,05-0,20 mm
Coton hydrophile, préalablement dégraissé au chloroforme, ou laine de
verre
Sulfate de sodium anhydre granuleux
Gaz inerte, par exemple azote
Acide chlorhydrique (1 mol/L)
Solution aqueuse d'acide sulfurique à 50% (v/v)
Diatomite (Kieselguhr, Hyflosupercel), lavée à l'acide
Gel de silice G-HR ou équivalent pour plaques à enduire par l'opérateur
Solution étalon contenant 0,1 /¿g d'aflatoxine B, par ml dans du
chloroforme ou dans le mélange de benzène et d'acétonitrile préparé et
vérifié comme indiqué ci-après
Solvants révélateurs :
d. Equipement
Broyeur-malaxeur
Agitateur, magnétique ou autre
Papiers filtres cannelés, Schleicher et Schüll N° 588 ou équivalent;
diamètre: 24 cm
Tube en verre pour chromatographic (diamètre interne: 22 mm; longueur:
300 mm) avec robinet en Teflon et réservoir de 250 ml
81 -
e. Mode opératoire
Préparation de l'échantillon:
Extraction:
Epuration de la colonne:
S é c h e r d a n s u n c o u r a n t d ' a i r o u de g a z i n e r t e à f a i b l e d é b i t . L e s t a c h e s
obtenues auront un diamètre d'environ 5 m m .
D é v e l o p p e r le c h r o m a t o g r a m m e d a n s l ' o b s c u r i t é a v e c l ' u n d e s s o l v a n t s
r é v é l a t e u r s . (On c h o i s i r a le s o l v a n t a u p r é a l a b l e e n d é p o s a n t 25 /¿I de
la s o l u t i o n é t a l o n q u a l i t a t i v e sur la p l a q u e e t e n v é r i f i a n t q u ' a p r è s
d é v e l o p p e m e n t les a f l a t o x i n e s B, e t B z à f l u o r e s c e n c e b l e u e s o n t
c o m p l è t e m e n t s é p a r é e s . ) L a i s s e r le s o l v a n t s ' é v a p o r e r d a n s l ' o b s c u r i t é ,
p u i s i r r a d i e r a u x u l t r a v i o l e t s e n p l a ç a n t la p l a q u e à 10 cm de la l a m p e .
L e s t a c h e s d ' a f l a t o x i n e B, d é g a g e n t u n e f l u o r e s c e n c e b l e u e .
Dosage :
Estimation visuelle :
M e s u r e r a u f l u o r o d e n s i m è t r e l ' i n t e n s i t é de la f l u o r e s c e n c e d é g a g é e p a r
les t a c h e s d ' a f l a t o x i n e B, à u n e l o n g e u r d ' o n d e s d ' e x c i t a t i o n de 365 n m
e t à u n e l o n g u e u r d ' o n d e s d ' é m i s s i o n de 4 4 3 rim. D é t e r m i n e r la q u a n t i t é
d ' a f l a t o x i n e B, d a n s les t a c h e s d ' e x t r a i t e n c o m p a r a n t l ' i n t e n s i t é de
la f l u o r e s c e n c e d e s t a c h e s d ' e x t r a i t a v e c c e l l e d e s t a c h e s d ' a f l a t o x i n e
B, s e r v a n t d ' é t a l o n . S i l ' i n t e n s i t é de la f l u o r e s c e n c e d é g a g é e p a r les
20 /il d ' e x t r a i t e s t n e t t e m e n t s u p é r i e u r e à c e l l e d e s 4 0 /il de s o l u t i o n
é t a l o n , d i l u e r l ' e x t r a i t 10 o u 100 fois a v e c d u c h l o r o f o r m e o u a v e c le
m é l a n g e de b e n z è n e e t d ' a c é t o n i t r i l e a v a n t de r é p é t e r l ' o p é r a t i o n de
chromatographie en couche mince.
C o n f i r m a t i o n de l ' i d e n t i t é de l ' a f l a t o x i n e B, :
Tracer deux lignes droites sur une plaque parallèlement aux deux côtés
contigus (à 6 cm de chaque bord) pour limiter la migration du solvant.
Déposer des taches des solutions ci-après sur la plaque à l'aide des
pipettes capillaires ou de la microseringue.
Orientation Iï >
Q o
O
H
ro
3
rt
B)
rr
H1
O
3
0 o 0
B
— O
CM
H 12 cm -fl-4 c m 1
2 cm 2 cm
Figure 37
85
a u p o i n t A : u n v o l u m e d ' e x t r a i t de la p r i s e d ' e s s a i , o b t e n u e n
" E p u r a t i o n de la c o l o n n e " , c o n t e n a n t e n v i r o n 2,5 n g d ' a f l a t o x i n e
B,;
a u x p o i n t s B e t C: 25 fil de la s o l u t i o n étalon;
D é v e l o p p e m e n t : ( S u i v r e le d i a g r a m m e de la f i g u r e 37.)
D é v e l o p p e r la p l a q u e s u i v a n t l ' o r i e n t a t i o n I d a n s l ' o b s c u r i t é e n
u t i l i s a n t le s o l v a n t r é v é l a t e u r c h l o r o f o r m e - a c é t o n e 9 / 1 ( v / v ) j u s q u ' à
ce q u ' i l a t t e i g n e la l i g n e l i m i t e .
R e t i r e r la p l a q u e de la c u v e e t la l a i s s e r s é c h e r d a n s l ' o b s c u r i t é à la
t e m p é r a t u r e a m b i a n t e p e n d a n t 5 m i n u t e s . P u l v é r i s e r e n s u i t e de l ' a c i d e
c h l o r h y d r i q u e sur u n e b a n d e de 2,5 cm de l a r g e e n c o u v r a n t les p o i n t s
A e t C (zone i n d i q u é e p a r les h a c h u r e s s u r la f i g u r e 3 7 ) j u s q u ' à ce q u e
c e t t e z o n e d e v i e n n e f o n c é e , e n p r o t é g e a n t le r e s t e de la p l a q u e a v e c u n e
f e u i l l e de v e r r e . L a i s s e r r é a g i r 10 m i n u t e s d a n s l ' o b s c u r i t é e t s é c h e r
d a n s u n c o u r a n t d ' a i r à la t e m p é r a t u r e a m b i a n t e .
D é v e l o p p e r e n s u i t e la p l a q u e s u i v a n t l ' o r i e n t a t i o n II d a n s l ' o b s c u r i t é
en u t i l i s a n t le s o l v a n t r é v é l a t e u r c h l o r o f o r m e - a c é t o n e 9 / 1 ( v / v ) j u s q u ' à
ce q u ' i l a t t e i g n e la l i g n e l i m i t e . R e t i r e r la p l a q u e de la c u v e e t
l a i s s e r s é c h e r à la t e m p é r a t u r e a m b i a n t e .
I n t e r p r é t a t i o n du chromatogramme:
1) A p p a r i t i o n d ' u n e t a c h e f l u o r e s c e n t e b l e u e d ' a f l a t o x i n e B, é m a n a n t
de la s o l u t i o n é t a l o n a p p l i q u é e e n B ( m i g r a t i o n s u i v a n t l ' o r i e n t a t i o n
I).
3) A p p a r i t i o n de t a c h e s c o r r e s p o n d a n t à c e l l e s d é c r i t e s e n (2) é m a n a n t
de l ' e x t r a i t de la p r i s e d ' e s s a i a p p l i q u é e n A . L a p o s i t i o n de c e s
t a c h e s e s t d é f i n i e p r e m i è r e m e n t p a r la d i s t a n c e de m i g r a t i o n de
l ' a f l a t o x i n e B, à p a r t i r d u p o i n t A s u i v a n t l ' o r i e n t a t i o n I
( i d e n t i q u e à la d i s t a n c e p a r c o u r u e p a r l ' é t a l o n a p p l i q u é e n B e t ,
d e u x i è m e m e n t , p a r la d i s t a n c e de m i g r a t i o n à p a r t i r de là e t s u i v a n t
l ' o r i e n t a t i o n II de l ' h é m i a c é t a l de l ' a f l a t o x i n e B, ( i d e n t i q u e à
c e l l e p a r c o u r u e p a r l ' é t a l o n a p p l i q u é e n C . L ' i n t e n s i t é de la
f l u o r e s c e n c e des t a c h e s d ' h é m i a c é t a l é m a n a n t de l ' e x t r a i t d o i t
c o r r e s p o n d r e à c e l l e de l ' é t a l o n a p p l i q u é e n C .
- 86 -
Tracer deux lignes droites sur une plaque parallèlement aux deux côtés
contigus (6 cm de chaque bord) pour limiter la migration du solvant.
Déposer des taches des solutions ci-après sur la plaque à l'aide des
pipettes capillaires ou de la microseringue.
Sécher dans un courant d'air ou de gaz inerte à faible débit. Les taches
obtenues doivent avoir un diamètre d'environ 5 mm.
Orientation II-
T
1
T c
1
±
I
- — o — O
o 1
rsi — 1 o
h
H.
m
3
PC
eu
A'" B'" rf
H-
O O O
A" s
£
O O o B"
A' - B '
O 0
1 1
A
1 B
o — 0 -
E
u 1 1
1 1
I- 12 cm il 1.1-4 cm
2 cm 2 cm
Figure 38
- 87 -
Estimation visuelle:
X x S x V , où
Y x m
- 88 -
Mesure fluorodensimétrique:
S x V . où
Y x m
Principe
Réactifs
Acétone
- 89 -
d. Equipement
e. Mode opératoire
'Orientation IF
T
c
O
/S— O D
I
C — O
H c
O
-IV o
>-t
\ ra
3
\ A
\ oA" B" H-
e \o A' O
a
u B'
\
— f -o o-
1 B
A i
e
u
CM
•13 cm HI — 5 cm-
2 cm
A: extrait de la prise d'essai
B, C, D, E: étalon d'aflatoxine B,
Figure 39
Tracer deux lignes droites sur une plaque parallèlement aux deux côtés
contigus (à 5 et 6 cm de chaque bord, respectivement) pour limiter la
migration du solvant. Déposer des taches des solutions ci-après sur la
plaque à l'aide des pipettes capillaires ou de la microseringue:
Sécher dans un courant d'air ou de gaz inerte à faible débit. Les taches
obtenues doivent avoir un diamètre d'environ 5 mm.
91
Chromatographie supplémentaire:
Tracer deux lignes droites sur une nouvelle plaque parallèlement aux
deux côtés contigus, comme indiqué sur le diagramme de la figure 39, et
appliquer au point A 20 /il de l'extrait de la prise d'essai et, en
surimposition, 20 de la solution étalon. Développer comme indiqué
précédemment. Irradier le chromatogramme à l'ultraviolet et vérifier:
Dosage :
Estimation visuelle :
2) Apparition de taches fluorescentes bleues (positions A' ' ' et A' ' )
émanant de l'aflatoxine B, présumée dans l'extrait (position A') dont
la valeur fy correspond à celle de l'aflatoxine B, servant d'étalon
(position B'). L'identité de l'aflatoxine B, dans l'extrait est
confirmée quand la valeur R< de la tache d'hémiacétal de l'aflatoxine
B, provenant de l'extrait correspond à celle de la tache de l'étalon
(positions A'' et B'', respectivement).
- 93 -
Estimation visuelle:
X x S x V . où
Y x m
Mesure fluorodensimétrique:
S x V . où
Y x m
b. Principe
c. Réactifs
d. Equipement
e. Mode opératoire
Tracer deux droites sur une plaque parallèlement aux deux côtés contigus
(à 3 cm de chaque bord) pour limiter la migration du solvant. Déposer
des taches des solutions ci-après sur la plaque à l'aide de pipettes
capillaires ou de la microseringue.
Sécher dans un courant d'air ou de gaz inerte à faible débit. Les taches
obtenues doivent avoir un diamètre d'environ 5 mm.
95
O r i e n t â t ion II-
r
o 0
M F.
O
1
l\
T c
U
\
\
\
» A' F'
- o - 0 -
h\y' _ \
O B' O -
o
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g i\ (0
U 3
rt
i\
.3\ o C' M
rf
H*
t
U I \ o
D' O
3
n C \
O
£ \
U \
D \
u
rsi
| «- 4.5 cm — fl- 10.5 cm -J 3 cm H
2 cm
F i g u r e 40
Chromatographie supplémentaire:
Tracer deux lignes droites sur une nouvelle plaque parallèlement aux
deux côtés contigus, comme indiqué sur la figure 40, et appliquer au
point A (voir figure 40) 20 /¿I de l'extrait de la prise d'essai obtenu
et, surimposés sur celui-ci, 20 ni de la solution étalon. Développer
comme précédemment. Irradier le chromatogramme à l'ultraviolet et
vérifier que:
Dosage :
Estimation visuelle:
Estimation visuelle:
X x S x V . où
Y x m
a. Délipidation
c. R e p r o d u c t i b i l i t é des résultats
Principe
Réactifs
Eau oxygénée. Contient 1,5 ml de H202 à 30% par litre dans un tampon de
citrate (pH 4,0). Boucher après utilisation et conserver au froid
(4° C).
Equipement
Mode opératoire
Extraction :
Titrage immunoenzymatique:
N.B.: Un seul embout de pipette doit être utilisé pour chacune des
étapes suivantes:
V. EXPOSES
L'homme peut être exposé aux mycotoxines non seulement par ingestion
d'aliments contaminés par la toxine, mais aussi par inhalation ou contact
cutané (7). On peut citer comme exemple d'exposition humaine par inhalation
l'observation faite par Van Nieuwenhuize qui a signalé le développement de
cancers dans divers organes chez des travailleurs qui avaient aspiré pendant
plusieurs années de petites poussières chargées d'aflatoxine dans une huilerie
où l'on broyait des arachides et d'autres oléagineux.
Le facteur appelé activité de l'eau (a^,) mesure l'eau libre qui, dans
les produits alimentaires, est disponible pour la croissance de la moisissure.
Ce terme est expliqué sur la diapositive (11). On utilise le terme d'humidité
relative pour l'atmosphère: l'humidité relative d'équilibre ou pression de
vapeur d'eau relative d'équilibre est en équilibre avec l'humidité de la
substance entreposée. L'activité de l'eau est définie sur la diapositive (12).
Il s'agit du quotient de la tension de vapeur d'eau du produit par la tension
de vapeur de l'eau pure à la même température et tension.
Plus l'eau se trouve sous une forme liée au support, moins il y a d'eau
disponible pour le champignon et plus l'activité a w est faible. Non seulement
la a^ influe sur la croissance des champignons mais, de plus, elle affecte la
production de mycotoxines. Quand la a,, est inférieure à une certaine valeur,
il n'y a pas production de mycotoxines. Cette valeur dépend de la mycotoxine
en cause, de la souche de champignon considérée, du support et de la
température.
qui indique seulement que la présence d'une mycotoxine est possible. On peut
en obtenir la preuve directe en appliquant des méthodes d'analyse pour
déterminer la présence effective d'une ou plusieurs mycotoxines dans la denrée
à inspecter.
Les titrages immunologiques (24) sont des méthodes qui reposent sur des
principes tout à fait différents par rapport aux méthodes chromatographiques.
Les titrages immunologiques en sont encore à leur stade initial d'application
pour le dosage des mycotoxines. Néanmoins, le titrage sur immunoadsorbant lié
à une enzyme (ELISA), en particulier, gagne rapidement du terrain et c'est
pourquoi un exposé distinct (V.3) sera consacré aux techniques ELISA.
Le déplacement des substances séparées peut être exprimé par leur débit,
habituellement représenté par le symbole R^, lequel peut être défini comme
étant (7):
Distance de migration du composé
Distance de migration du solvant
Le solvant pour déposer les taches, qui doit être le même pour l'extrait
et pour l'étalon, doit permettre (16) une solubilité satisfaisante de la
toxine à rechercher, et doit être volatil et donner des taches réduites et
uniformes. Ces conditions revêtent une grande importance pour obtenir des
résultats reproductibles.
On peut citer comme exemple (18) d'un schéma de dépôt des taches pour
chromatographic unidimensionnelle en couche mince celui de la méthode dite de
la Contamination Branch (CB) , qui peut être appliquée pour le dosage de
l'aflatoxine B, dans les arachides, les produits à base d'arachides et le
maïs. On dépose en taches de petites quantités d'extrait de l'échantillon et
de l'aflatoxine B, servant d'étalon sur une plaque de 20 x 20 cm, suivant une
ligne imaginaire située à 4 cm du bord inférieur de la plaque de
chromatographie en couche mince. Sur l'une des taches d'échantillon, on dépose
5 ni de l'étalon d'aflatoxine B, comme étalon interne. On dépose aussi une
tache de 5 ni d'un mélange qualitatif d'étalon d'aflatoxine pour indiquer si
la résolution est adéquate. Il subsiste sur la plaque de chromatographie en
couche mince assez d'espace pour déposer des taches d'autres extraits
d'échantillons permettant d'estimer la teneur en aflatoxine B, d'après la même
série d'étalons. Après évaporation du solvant utilisé pour le dépôt des
taches, on place la plaque dans une cuve de développement contenant un mélange
de chloroforme et d'acétone (9+1) et la plaque est développée jusqu'à ce que
le solvant atteigne la ligne limite (tracée à 16 cm du bord inférieur de la
plaque), la durée de cette opération étant d'environ 40 minutes. Après
séchage, on observe la plaque sous éclairage ultraviolet dans les grandes
longueurs d'ondes afin de permettre la visualisation et le dosage des taches
d'aflatoxine (19). Sur le côté gauche de la plaque est visible le résultat de
la séparation d'un extrait d'arachides crues contaminées par de l'aflatoxine
B, obtenue selon la méthode CB. La séparation du mélange d'étalon d'aflatoxine
permet de conclure que la qualité de séparation de la plaque était suffisante.
A l'aide des étalons d'aflatoxine B,, on peut localiser la tache d'aflatoxine
B, dans l'extrait et en estimer la quantité afin de pouvoir calculer la
concentration initiale de l'échantillon. Il est beaucoup plus difficile de
localiser et de doser l'aflatoxine B, présente dans le beurre de cacahuètes.
Ce produit ayant été grillé, il s'est formé de nombreux constituants qui
peuvent gêner considérablement l'interprétation et le chiffrage du résultat
obtenu avec la chromatographie en couche mince. Afin d'améliorer la séparation
dans ce cas, et ainsi d'abaisser le seuil de détection, il faut recourir à la
chromatographie bidimensionnelle en couche mince.
(21) S é p a r a t i o n d ' u n e x t r a i t de b e u r r e de c a c a h u è t e s s o u m i s à la
chromatographic bidimensionnelle en couche mince avec
utilisation du schéma de répartition des taches
densimétrique
(22) Schéma de répartition des taches antidiagonal pour
chromatographie bidimensionnelle en couche mince
(23) S é p a r a t i o n d ' u n e x t r a i t de b e u r r e de c a c a h u è t e s s o u m i s à la
chromatographie bidimensionnelle en couche mince avec
u t i l i s a t i o n d u s c h é m a de r é p a r t i t i o n d e s t a c h e s a n t i d i a g o n a l
(24) A v a n t a g e s e t i n c o n v é n i e n t s de la c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e
mince unidimensionnelle et bidimensionnelle
(25) Auxiliaires de visualisation pour la détection des
mycotoxines par chromatographie en couche mince
(26) I l l u s t r a t i o n de t a c h e s de s t é r i g m a t o c y s t i n e v i s u a l i s é e s e t
non visualisées avec réactif au A1C13
(27) S c h é m a de l ' é p r e u v e de c o n f i r m a t i o n à l ' a c i d e c h l o r h y d r i q u e
(28) I l l u s t r a t i o n d u r é s u l t a t de l ' é p r e u v e de c o n f i r m a t i o n à
l'acide chlorhydrique appliquée à un produit d'alimentation
p o u r l a p i n s c o n t a m i n é p a r de l ' a f l a t o x i n e B,
(29) L e s d i x é t a p e s f o n d a m e n t a l e s de la c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e
mince
(30) " M i e u x v a u t ê t r e a p p r o x i m a t i v e m e n t e x a c t que se t r o m p e r a v e c
précision!"
3. Techniques ELISA
C e s c o n s t a t a t i o n s o n t p e r m i s de m e t t r e a u p o i n t d e s m é t h o d e s d ' a n a l y s e
immunochimiques dites "titrages immunologiques". Ces titrages exploitent leurs
p r o p r i é t é s de r e c o n n a i s s a n c e m o l é c u l a i r e d e s a n t i c o r p s , t o u t c o m m e u n e s e r r u r e
c o r r e s p o n d à u n e clé ( 2 ) . L a clé q u ' i l f a u t m e s u r e r e s t l ' a n t i g è n e .
A v a n t d ' a p p l i q u e r les m é t h o d e s i m m u n o c h i m i q u e s à la d é t e c t i o n e t a u
dosage d'un constituant (l'antigène), il f a u t p r é p a r e r les réactifs
b i o l o g i q u e s q u i i n t e r v i e n n e n t d a n s c e s m é t h o d e s (les a n t i c o r p s ) c h e z d e s
a n i m a u x s u p é r i e u r s e n l e u r i n o c u l a n t l ' a n t i g è n e , tous les a n t i g è n e s n ' o n t p a s
la c a p a c i t é d ' i n d u i r e la f o r m a t i o n d ' a n t i c o r p s c h e z les a n i m a u x d ' e x p é r i e n c e .
L ' i m m u n o g é n i c i t é d é p e n d d a n s u n c e r t a i n e m e s u r e de la t a i l l e de l ' a n t i g è n e .
L e s p e t i t e s m o l é c u l e s c o m m e les m y c o t o x i n e s ne s o n t p a s i m m u n o g è n e s ; o n les
appelle des haptènes (3), Une fois le haptène fixé à un grand porteur,
s ' a g i s s a n t g é n é r a l e m e n t d ' u n e p r o t é i n e , il d e v i e n t i m m u n o g è n e . P o u r la
p r o d u c t i o n d ' a n t i c o r p s o n u t i l i s e d e s l a p i n s , des s o u r i s , des c o b a y e s , des
118 -
chèvres, des moutons, des poules et des chevaux; l'injection peut être
intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée ou intrapéritonéale. Le sérum
recueilli après l'injection est appelé immunsérum ou antisérum; il contient
un groupe de protéines sériques également appelés immunoglobulines.
Pour le titrage avec mise en compétition (8), on fixe sur une plaque de
microtitrage une quantité connue d'anticorps dirigé contre la mycotoxine
recherchée. Après lavage, on ajoute la solution d'épreuve contenant une
quantité inconnue de la mycotoxine avec une quantité connue de mycotoxine
marquée par une enzyme. La mycotoxine marquée et la mycotoxine libre sont en
compétition pour se fixer sur les sites actifs de l'anticorps enduit sur la
plaque. Après incubation on lave de nouveau la plaque et l'enzyme capturée est
dosée par addition d'un support chromogène. On peut mesurer visuellement ou,
avec plus de précision, au moyen d'un lecteur ELISA la couleur obtenue ou
l'intensité de cette couleur. Dans les deux cas, on peut doser la quantité de
mycotoxine dans la solution d'épreuve en utilisant une série d'étalons de
concentration variable auxquels a été appliquée la même méthode. Souvent, les
solutions d'épreuve sont appliquées avec différentes dilutions si l'on n'a
aucune idée de l'ampleur de la concentration de mycotoxine dans la prise
d'essai. Plus la concentration du produit de la réaction enzymatique est
faible, plus la quantité d'enzyme fixée est faible et plus la concentration
de mycotoxine dans la prise d'essai est élevée. La diapositive suivante (9)
- 120
un composé donné mais demeure "inerte" pour tous les autres composés qui
peuvent aussi être présents dans l'échantillon. Ainsi, avec une méthode
pleinement spécifique, la probabilité de réactions faussement positives est
nulle. Souvent les techniques chromatographiques classiques visant à séparer
les aflatoxines des autres constituants de la matrice ne sont pas pleinement
spécifiques et il faut procéder à des épreuves supplémentaires pour confirmer
la présence d'aflatoxine dans l'échantillon. La méthode la plus fiable à cet
effet est la spectrométrie de masse à haute résolution, mais bien des
laboratoires dans des pays en développement ne seront pas dotés de ce type
d'appareil perfectionné et devront donc appliquer des techniques plus simples.
Parmi les diverses possibilités qui s'offrent pour accroître la spécificité
d'une méthode, la dérivation à effectuer directement sur la plaque de
chromatographie en couche mince ou en aval de la colonne dans le cas de la
chromatographie liquide sous haute pression est l'une des plus utiles.
participants en vue de rechercher par analyse les aflatoxines B,, B2, G, et Gz,
ainsi que des échantillons de lait en poudre pour la détection de l'aflatoxine
M,. Après avoir envoyé les résultats de leur analyse, les participants
reçoivent un rapport succinct décrivant les résultats des analyses
préliminaires effectuées sur des échantillons par trois laboratoires choisis
pour leur maîtrise des titrages d'aflatoxine. A un stade ultérieur, un rapport
complet contenant tous les résultats anonymes est distribué. Ces rapports
permettent aux laboratoires participants de juger de la qualité de leurs
propres résultats. La participation à ce programme de vérification
d'échantillons du CIRC est gratuite et elle est fortement recommandée parce
que le personnel qui travaille dans le domaine du dosage des mycotoxines ne
peut qu'admettre la justesse de ce qu'il a été convenu d'appeler la Loi de
Murphy, à savoir:
Travaux pratiques :
Travaux pratiques:
Jour 9 Même programme que pour le jour 8, mais avec des échantillons
choisis par les participants (produits locaux, problèmes
spécifiques).
Travaux pratiques :
Travaux pratiques:
ANNEXE I
Nom:
Sexe: masculin/féminin
Date de naissance:
Niveau d'instruction:
Fonctions actuelles:
Adresse de l'Institut:
Quels sont les jours ouvrables officiels chaque semaine et quelle est
la durée officielle du travail quotidien?
Acétone?
n-Hexane?
Méthanol?
Acétate d'éthyle?
Toluène?
Acétonitrile?
Chlorure de sodium?
Acide citrique?
Acide phosphorique?
Acide sulfurique?
Acide trifluoroacétique?
Acide acétique?
Acide formique?
Acide chlorhydrique?
- 133 -
Broyeur?
Agitateur magnétique?
Malaxeur Vortex?
ANNEXE II
EXERCICES DE CALCUL
EXERCICE A
UN MICROGRAMME (/¿g) EST EGAL A NANOGRAMMES (ng)
UN MILLIGRAMME (mg) EST EGAL A NANOGRAMMES (ng)
UN GRAMME (g) EST EGAL A KILOGRAMMES (kg)
UN GRAMME (g) EST EGAL A MICROGRAMMES (/¿g)
UN NANOGRAMME (ng) EST EGAL A MICROGRAMMES (/ig)
EXERCICE B
UN MILLIGRAMME (mg) PAR KILOGRAMME (kg) EST EGAL A MICROGRAMMES PAR GRAMME
UN MICROGRAMME (ng) PAR GRAMME (g) EST EGAL A MICROGRAMMES PAR KILOGRAMME
UN NANOGRAMME (ng) PAR GRAMME (g) EST EGAL A MICROGRAMMES PAR KILOGRAMME
UN NANOGRAMME (ng) PAR MICROGRAMME (/ig) EST EGAL A MICROGRAMMES PAR GRAMME
EXERCICE C
UN MILLILITRE (ml) EST EGAL A MICROLITRES (p1)
UN LITRE (1) EST EGAL A MILLILITRES (ml)
UN MICROLITRE (/il) EST EGAL A MILLILITRES (ml)
UN LITRE (1) EST EGAL A MICROLITRES (/il)
EXERCICE D
LA DENSITE RELATIVE DE L'EAU EST DE 1,0
UN MILLILITRE (ml) D'EAU PESE MILLIGRAMMES (mg)
UN MICROLITRE (/il) D'EAU PESE MILLIGRAMMES (mg)
UN MILLILITRE (ml) D'EAU PESE MICROGRAMMES (/ig)
UN MILLILITRE (ml) D'EAU PESE GRAMMES (g)
137
EXERCICE E
LA DENSITE RELATIVE DU CHLOROFORME EST DE 1,49
EXERCICE F
SUPPOSONS QUE NOUS DISPOSONS D'UNE SOLUTION ETALON D'AFLATOXINE B, DE ng/ml
DANS DU CHLOROFORME;
SI NOUS DISPOSONS SUR UNE PLAQUE DE CHROMATOGRAPHIE EN COUCHE MINCE DES TACHES
DE CET ETALON DE RESPECTIVEMENT 5, 10 et 15 fil, COMBIEN DE NANOGRAMMES
D'AFLATOXINE B, ONT ETE DEPOSES SUR LA PLAQUE RESPECTIVEMENT DANS CHAQUE
TACHE?
EXERCICE G
SUPPOSONS QUE VOUS AVEZ PROCEDE A L'EXTRACTION DE 50 g D'ARACHIDES ET QUE
L'EXTRAIT A ETE DE NOUVEAU ANALYSE SELON LA PROCEDURE DES COMMUNAUTES
EUROPEENNES. VOTRE VOLUME FINAL EST DE 2 ml ; VOUS PRELEVEZ SUR CE VOLUME FINAL
Ml QUE VOUS DEPOSEZ EN TACHE SUR LA PLAQUE DE CHROMATOGRAPHIE EN COUCHE
MINCE.
LA TACHE D'AFLATOXINE B, PROVENANT DE VOTRE EXTRAIT ET DEPOSEE SUR LA PLAQUE
DEVELOPPE UNE FLUORESCENCE DE MEME INTENSITE QUE ng D'AFLATOXINE B,.
COMBIEN Y A-T-IL D'AFLATOXINE B, DANS LE VOLUME FINAL DE VOTRE EXTRAIT
D'ECHANTILLON (en ng)?
QUELLE EST LA TENEUR DE VOTRE ECHANTILLON EN AFLATOXINE B, (/ig/kg)?
- 138 -
ANNEXE III
BIBLIOGRAPHIE
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M-82 T0322F/1/11.92/1000
ETUDE FAO: ALIMENTATION ET NUTRITION 14/io
ISSN 10142
-90*
manuels
sur le contrôle de la qualité
des •produits alimentaires
gagiss®
fË
manuels
sur le contrôle de la qualité
des produits alimentaires
10. cours de formation
sur l'analyse des mycotoxines
M-82
ISBN 92-5-202947-8
Tous droits réservés. Aucune partie de cette publication ne peut être reproduite,
mise en mémoire dans un système de recherche bibliographique ni transmise sous
quelque forme ou par quelque procédé que ce soit: électronique, mécanique, par
photocopie ou autre, sans autorisation préalable. Adresser une demande motivée
au Directeur de la Division des publications, Organisation des Nations Unies pour
l'alimentation et l'agriculture, Vlale delle Terme dl Caracalla, 00100 Rome, Italie, en
indiquant les passages ou illustrations en cause.
© FAO 1992
AVANT-PROPOS
La plupart de ces cultures sont des céréales et des oléagineux qui sont
extrêmement vulnérables aux champignons et à la production de mycotoxines. Non
seulement les mycotoxines sont dangereuses pour la santé du consommateur, mais
de plus elles altèrent la qualité des produits alimentaires, entrainant
d'énormes pertes économiques pour ces pays.
Le Chef du
Service de la qualité des aliments et des normes alimentaires
Division des Politiques alimentaires et de la nutrition
Organisation des Nations Unies pour l'alimentation et l'agriculture
00100 Rome, Italie
iv -
NOTE SPECIALE
Bien que les informations figurant dans le Manuel aient été préparées
avec le plus grand soin, la FAO décline expressément toute responsabilité à
l'égard des usagers de ces procédures pour les dommages de quelque sorte que
ce soit pouvant résulter de leur application.
Pages
1. Généralités 2
2. Equipement du laboratoire 2
3. Réactifs et matériel de base 2
4. Niveau d'instruction des participants 2
5. Enseignements tirés des cours antérieurs 3
1. Introduction 5
2. Croissance des champignons et production des toxines 7
3. Présence et toxicité des mycotoxines 11
4. Limites et réglementations 13
5. Echantillonnage 20
6. Techniques d'analyse 25
Titrages biologiques 25
Titrages chimiques 27
Extraction 27
Epuration 28
Dernières opérations de séparation,
de détection et de dosage 29
Méthodes chromatographiques 29
a. Chromatographie sur colonne ouverte 30
b. Chromatographie en couche mince 31
c. Chromatographie liquide sous haute pression 39
d. Chromatographie en phase gazeuse 44
Méthodes immunochimiques 44
a. Titrage immunoenzymatique 45
b. Titrage radio-immunologique 50
Conclusion 52
7. Caractéristiques 54
Sensibilité 54
Spécificité 55
Précision 56
Seuil de détection 58
Exactitude 60
8. Assurance de la qualité 61
Principe 64
Réactifs 64
Equipement 65
Mode opératoire 65
Expression des résultats 65
Examen critique 65
V. EXPOSES 103
ANNEXES
Le présent Manuel est conçu pour des cours d'une durée d'environ trois
semaines et il est destiné à former des analystes des pays en développement.
L'accent a été mis sur l'analyse des aflatoxines dans les produits
d'alimentation humaine et animale.
- 2 -
1. Généralités
Pour qu'un cours de formation sur les mycotoxines se déroule dans des
conditions de travail satisfaisantes, il faut veiller à un certain nombre
d'aspects organisationnels. Il est indispensable pour le directeur du cours
de se faire une idée précise des installations au lieu proposé et qu'il soit
avisé du budget disponible pour l'achat de fournitures supplémentaires dès le
stade initial. Si les délais impartis et les ressources le permettent, il est
préférable que le directeur du cours se rende sur place peu •après son
recrutement, éventuellement six mois avant la date prévue pour le cours, afin
d'estimer si les installations conviennent, de prendre note de tous problèmes
éventuels, de suggérer des adaptations, de prendre contact avec les autorités
locales et de commander les fournitures supplémentaires nécessaires. Au lieu
de se rendre sur place en personne, ou en plus, il peut utiliser des
questionnaires pour se faire une idée de la situation à l'endroit proposé pour
le cours de formation (voir annexe I B).
2. Equipement du laboratoire
Bien que ces documents de formation mettent l'accent sur les méthodes
d'analyse des aflatoxines, qui sont relativement faciles à appliquer, il est
impossible de procéder au titrage des aflatoxines sans un minimum de réactifs
et de matériel. Un questionnaire conforme au modèle C (voir annexe I) pourra
se révéler utile pour déterminer si les fournitures essentielles sont
disponibles. La section IV contient des listes détaillées de réactifs et de
matériel pour certaines procédures de laboratoire.
profiter d'un stage de formation de trois semaines, il est bon d'avoir une
certaine expérience de la chimie analytique, et de préférence de l'analyse des
oligo-éléments. Un questionnaire conforme au modèle A (annexe I) pourrait se
révéler utile pour obtenir quelques informations sur les participants.
Divers cours de formation sur les aflatoxines ont été organisés dans des
pays africains et autres entre 1982 et 1988. Les points ci-après reflétant les
enseignements pratiques tirés des cours antérieurs méritent d'être signalés,
car ils pourront guider la programmation de futurs cours de formation sur les
mycotoxines dans les pays en développement.
1. Introduction
Les maladies causées par les mycotoxines sont connues de longue date.
La première mycotoxicose reconnue était probablement l'ergotisme, une maladie
caractérisée par la nécrose et la gangrène et mieux connue au moyen-âge en
Europe sous le nom de "feu sacré"; elle était provoquée par l'absorption de
céréales contaminées par les sclérotes de Claviceps purpurea.
Les deux décennies qui ont suivi la flambée de maladie X du dindon ont
donné naissance à une abondance d'informations sur les aflatoxines et beaucoup
d'autres mycotoxines ont également été isolées et caractérisées. On connaît
aujourd'hui plus de 200 mycotoxines différentes accusant une grande diversité
de structures chimiques. La figure 1 contient des exemples de quelques-unes
de ces structures.
CO OCH3
CH3
0C0CM3
OCOCH3
Sterigmatocystine Ochratoxine A
Tableau 1
3 Qw
1. A. flavus AFLATOXINEB,
2. A. parasiticus
0.80
0 10 20 30 0 10 2 0 30
Température fC)
1. A. clavatus
2. P. expansum PATULINE
3. P. patulum
10 20 30 0 10 20 30
Température (-C)
Encore plus alarmante que les faits concernant les effets aigus des
aflatoxines fut la découverte que l'aflatoxine B, est un hépatocancérogène
très puissant chez le rat (Butler, 1968), et chez toutes les autres espèces
d'animaux de laboratoire soumises aux épreuves (Wogan, 1973). Le tableau 2
récapitule les données concernant la tumorigénicité hépatique de l'aflatoxine
B, chez diverses souches de rats.
Le cancer primitif du foie est l'un des cancers les plus répandus chez
l'homme dans les pays en développement. Les études épidémiologiques menées
dans les années 1970 confirment du point de vue statistique une association
entre l'incidence des carcinomes hépatocellulaires et la consommation
d'aliments contaminés par les aflatoxines. On a estimé pour ces études qu'il
était justifié de comparer l'exposition actuelle aux aflatoxines avec les taux
actuels de cancer, puisque les observations se limitaient à des populations
12 -
Tableau 2
Pour les pays en développement, les aflatoxines sont les mycotoxines les
plus importantes du point de vue de leur présence dans l'environnement, de
leur toxicité et de l'économie nationale. Etant donné les conditions
climatiques favorables à la croissance des champignons et à la production de
toxines dans les aliments et leurs ingrédients, et compte tenu des méthodes
peu satisfaisantes utilisées pour la manutention des produits alimentaires,
il est probable qu'une partie de la population de ces pays soit exposée à un
certain degré d'intoxication par les aflatoxines. Il est beaucoup plus
difficile que dans les pays développés de réduire le risque d'exposition aux
aflatoxines. Pour l'heure, tout au moins, il est presque impossible pour
certains des habitants des pays en développement d'éviter tous les produits
alimentaires contaminés par les aflatoxines.
Outre les dangers que font peser sur la santé les mycotoxines en général
et les aflatoxines en particulier, il faut mentionner l'impact négatif sur
l'économie de ces pays. Dans la plupart d'entre eux, les technologies
applicables pendant et après la récolte et qui empêcheraient la croissance des
moisissures et la production des mycotoxines sont parfois insuffisantes, ou
bien tout simplement inexistantes. Pour de tels pays qui exportent des
produits alimentaires ou autres vers des pays qui ont des programmes efficaces
de contrôle de la contamination et qui mettent en pratique un système de
contrôle de la qualité des denrées alimentaires, les conséquences économiques
peuvent être catastrophiques. D'autre part, la présence de mycotoxines dans
les produits d'alimentation animale peut avoir un effet défavorable sur la
productivité animale. En prenant pour hypothèse une réduction de poids de 3%
chez les poulets de chair en raison d'une faible contamination par les
mycotoxines, Hesseltine (1986) a estimé le montant annuel des pertes à plus
de 140 millions de dollars des Etats-Unis. Ces aspects et d'autres concernant
la réglementation applicable en matière de mycotoxines sont examinés dans la
section 4.
4. Limites et réglementations
- des difficultés pour les pays exportateurs qui recherchent des marchés
pour leurs produits;
Il est clair qu'il n'existe aucune formule simple pour peser ces
facteurs. Toute décision est surtout question de bon sens. Le personnel des
services de santé publique est confronté à un problème complexe: les
mycotoxines, et singulièrement les aflatoxines, doivent être exclues des
produits d'alimentation humaine dans toute la mesure possible, mais puisque
les substances sont présentes dans les aliments sous forme de contaminants
naturels, on ne peut pas empêcher totalement l'homme d'y être exposé. Il
s'ensuit donc qu'il faut tolérer l'exposition de la population à un certain
degré d'aflatoxines. L'adoption de réglementations pour le contrôle des
aflatoxines est un processus en continuelle évolution dans certains pays. La
plupart des pays n'ont pas rendu publiques les informations qui ont servi de
base aux décisions concernant la fixation de tolérances. Il faut citer comme
exception les Etats-Unis d'Amérique où tous les problèmes et toutes les
difficultés ont été exposés dans des publications, de sorte que la raison
d'être des décisions prises est connue (Stoloff, 1980).
Dans les cas où les pays ont fixé des tolérances différentes pour les
aflatoxines selon les produits, on a retenu la tolérance applicable aux
produits d'alimentation humaine "principaux" (s'agissant souvent de produits
à base d'arachides), ce choix ayant pu avoir occasionnellement un caractère
subjectif. Pour les pays qui avaient indiqué une tolérance nulle pour la somme
des aflatoxines Bi, B2, G, et G2, on a considéré automatiquement que la
tolérance était nulle pour l'aflatoxine B,, si ce n'était pas spécifié
séparément.
16
Nombre de pays
U• N =30
12
10 •
10 15 20 25 30 35 40 ¿5 50
Tolérance (ng/kg)
F i g u r e 4 . D i s t r i b u t i o n de f r é q u e n c e des q u a n t i t é s t o l é r é e s
(en v i g u e u r ou p r o p o s é e s ) d ' a f l a t o x i n e B, d a n s les p r o d u i t s
d'alimentation humaine dans divers pays.
Nombre de pays
14
12
N = 35
10
10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tolérance (ng/kg)
F i g u r e 5 . D i s t r i b u t i o n de f r é q u e n c e d e s q u a n t i t é s t o l é r é e s
(en v i g u e u r o u p r o p o s é e s ) de la s o m m e d e s a f l a t o x i n e s
B ^ B j + G ^ G g d a n s les p r o d u i t s d ' a l i m e n t a t i o n h u m a i n e
dans divers pays.
- 17 -
Dans les cas où les pays ont fixé des tolérances différentes pour les
aflatoxines selon les produits, on a retenu la tolérance applicable aux
produits d'alimentation humaine "principaux" (s'agissant souvent de produits
à base d'arachides), ce choix ayant pu avoir occasionnellement un caractère
subjectif. Les tolérances applicables à la somme de l'aflatoxine B, et des
autres aflatoxines ont été considérées comme correspondant aux tolérances
applicables à la somme des aflatoxines B,, B2, G, et G2.
Nombre de pays
I
N =13
Tolérance (ng/kg)
Seules ont été incluses les tolérances pour l'aflatoxine M, dans le lait
de consommation (pas pour des produits spécifiés contenant du lait tels que
les préparations pour nourrissons).
- 18 -
Nombre de pays
12
N = 18
10
10 20 25 30 35 Í.0 ¿5 50
Tolérance (wj/kg)
Seules ont été incluses les tolérances pour l'aflatoxine B, dans les
produits d'alimentation animale pour bovins laitiers (ou pour les produits
d'alimentation animale en général, si aucune précision n'a été fournie).
Nombre de pays
12
N=6
10
10 15 20 25 30 35 ¿0 ¿5 50
Tolérance (ng/kg)
5. Echantillonnage
100
80
c Echantillonnage (21,8 kg)
o
•S 6 0
CO
>
CD
"O
c
2 40
o
it
ai
O
o Sous-échantillonnage (1100 g)
20
Analyse (18,3 g avec répétition)
0 20 40 60 80
Concentration d'aflatoxine ((ig/kg)
Tolérance
Tolérance
Taille de l'échantillon
3.2 kg
9.1 kg
3 4 kg
10 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 100
Concentration d'aflatoxine (p.g/kg) j g / k g )
1.00 r
0.90 Tolérance
o
0.80
3
T3 0 . 7 0
c
O
ra0 . 6 0
Q. Faible
O 0.50
ra
b 0.40
S
S 0.30
ra
-O
o 0.20
CL
0.10
10 20 30 40 50 60 70 80
Concentration d'aflatoxine (p.g/kg)
Tolérance
c
13
T3
C
O Seuil de décision
ra
o. 50 jug/kg
25 / j g / k g
ra 10 > j g / k g
-<D
-O
ra
-O
O
10 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 70 8 0 9 0 100
Concentration d'aflatoxine (ng/kg)
On peut citer comme exemple d'un tel plan d'échantillonnage celui du PAC
(Peanut Administrative Committee - Commission administrative sur les
arachides) qui est appliqué aux Etats-Unis d'Amérique pour l'échantillonnage
des lots importants d'arachides avant qu'ils soient expédiés à l'usine de
traitement (Dickens, 1977). Ce procédé d'échantillonnage comporte des
opérations multiples d'échantillonnage et de titrage effectuées sur des unités
représentatives de 22 kg du lot avec application d'une tolérance de 25 pg/kg
pour la somme des aflatoxines B,, B2, G, et G2.
Bien que l'opération soit parfois coûteuse, il est hors de doute qu'il
faut prélever de très grands échantillons d'arachides pesant plusieurs
kilogrammes pour ramener à un niveau minimal le risque d'une décision erronée
tant pour le consommateur que pour le producteur. Avec ces échantillons de
grande taille, il est nécessaire de procéder à un sous-échantillonnage pour
rendre possible une analyse adéquate. Vu l'éventualité d'une hétérogénéité,
il faut broyer et homogénéiser la totalité de l'échantillon. On a mis au point
à cet effet des instruments spéciaux et des techniques spéciales tels que la
meule de sous-échantillonnage de Dickens -Satterwhite (Dickens, 1969) et
l'appareil vertical de coupe et malaxage de Hobart (Francis, 1979). Ensuite,
ou bien on analyse la totalité du sous-échantillon, ou bien on réduit de
nouveau la taille du sous-échantillon jusqu'à ce qu'on obtienne une prise
d'essai dont la taille se situe généralement entre 20 et 100 g. Il semble
qu'on ait fixé la taille à 50 g pour parvenir à un compromis entre l'économie
de solvant et l'obtention d'un échantillon représentatif. Dans le programme
d'essai de la PAC pour les arachides, on procède à l'extraction de la totalité
du sous-échantillon (1 100 g) au moyen d'un mélange de 1 650 ml de méthanol,
1 350 ml d'eau, 1 000 ml d'hexane et 22 g de chlorure de sodium. Outre qu'ils
soient coûteux, les solvants sont une importante source d'énergie et ils est
difficile de s'en débarrasser après usage sans polluer l'environnement. Aussi
Whitaker (1980) a-t-il proposé une méthode qui consiste à extraire les
aflatoxines au moyen d'un solvant à partir d'un échantillon de 130 g d'une
boue qu'on obtient en mélangeant 1 100 g de graines d'arachides broyées,
1 500 ml d'eau et 22 g de chlorure de sodium dans un malaxeur Waring. Il
semble que la variance parmi les analyses avec cette méthode ne différait pas
sensiblement de la variance constatée entre les analyses effectuées selon le
procédé officiel de la PAC.
6. Techniques d'analyse
Titrages biologiques
Parmi les animaux terrestres, il semble que les plus sensibles aux
mycotoxines soient les canetons et les embryons de poulet. Lors de l'épreuve
biologique initialement mise au point à l'occasion de la flambée de maladie X
du dindon (Carnaghan, 1963), on a utilisé des canetons nouvellement éclos
- 26 -
Les titrages biologiques peuvent être utiles quand il n'est pas possible
de procéder à un titrage chimique. Les titrages biologiques se sont révélés
surtout utiles pour le dépistage des mycotoxines. Cependant, leur emploi pour
la surveillance des produits d'alimentation humaine et animale est de peu
d'importance car ces méthodes manquent généralement de spécificité, de
reproductibilité et de rapidité.
27
Titrages chimiques
Echantillonnage
1
Extraction
1
Epuration de l'extrait
\
Concentration
\
Séparation des composants de l'extrait
J
Détection et dosage
I
Confirmation de l'identité
Extraction
une ampoule à décantation ou absorbés sur un milieu hydrophile qui est placé
au préalable dans une colonne, après quoi l'extraction est effectuée par
élution au solvant. On peut citer comme exemple de cette dernière technique
d'extraction la procédure employée pour doser l'aflatoxine M, dans le lait,
où l'on utilise une colonne de Celite préparée en laboratoire (Schuller,
1973).
Epuration
les p i g m e n t s de g o s s y p o l d a n s des e x t r a i t s de g r a i n e s de c o t o n ( P o n s , 1 9 6 5 )
( W i s e m a n , 1 9 6 7 ) , le c a r b o n a t e de c u i v r e p o u r é l i m i n e r la c h l o r o p h y l l e
( V e l a s c o , 1 9 7 0 ) e t le n i t r a t e d ' a r g e n t p o u r e x t r a i r e la t h é o b r o m i n e d u c a c a o
(Scott, 1969).
L e s t e c h n i q u e s d ' é p u r a t i o n s u s m e n t i o n n é e s s o n t e n f a i t des p r o c é d u r e s
de s é p a r a t i o n p e r m e t t a n t de s é p a r e r l ' u n de l ' a u t r e d e s g r o u p e s de s u b s t a n c e s
p o s s é d a n t c e r t a i n e s p r o p r i é t é s p h y s i c o c h i m i q u e s . Il e s t p o s s i b l e de c e t t e
m a n i è r e d ' é l i m i n e r la m a j e u r e p a r t i e d e s s u b s t a n c e s e x t r a i t e s s i m u l t a n é m e n t .
Le c h o i x de la t e c h n i q u e d ' é p u r a t i o n p o u r r a d é p e n d r e de la m é t h o d e e m p l o y é e
p o u r la d é t e c t i o n e t le d o s a g e , d u s e u i l de d é t e c t i o n r e q u i s , de la r a p i d i t é
de l ' a n a l y s e e t d u d e g r é de r é c u p é r a t i o n .
Les extraits qui ont été épurés sont généralement concentrés par
évaporation du solvant dans un évaporateur rotatif sous pression réduite, ou
à l ' é t u v e , t a n d i s q u e l ' e x t r a i t e s t m a i n t e n u s o u s u n c o u r a n t d ' a z o t e . Le
r é s i d u e s t r e d i s s o u s d a n s u n p e t i t v o l u m e de s o l v a n t , p u i s transféré
quantitativement dans une petite fiole et amené à un v o l u m e spécifié. Selon
la t o x i n e e t l ' é t a p e u l t i m e de s é p a r a t i o n e t de d é t e c t i o n p r é v u e , il p e u t
s ' a v é r e r n é c e s s a i r e de p r o c é d e r à la d é r i v a t i o n de la m y c o t o x i n e à l a q u e l l e
o n s ' i n t é r e s s e a f i n de p o u v o i r la m e s u r e r o u e n o p t i m i s e r le c o m p o r t e m e n t
chromatographique.
D e r n i è r e s o p é r a t i o n s de s é p a r a t i o n , de d é t e c t i o n et de d o s a g e
Méthodes chromatographiques
L e s p r o c é d é s c h r o m a t o g r a p h i q u e s i m p l i q u e n t u n p a r t a g e b a s é s u r la
s o l u b i l i t é d i f f é r e n t i e l l e d ' u n e s u b s t a n c e v i s - à - v i s d ' u n e p h a s e f i x e (le
s u p p o r t c h r o m a t o g r a p h i q u e ) e t d ' u n e p h a s e m o b i l e ( l i q u i d e o u g a z e u s e ) , les
s u b s t a n c e s à s é p a r e r p a s s a n t à t r a v e r s le s u p p o r t c h r o m a t o g r a p h i q u e . L a p h a s e
f i x e r e t a r d e p l u s o u m o i n s le p a s s a g e des s u b s t a n c e s s e l o n l e u r s p r o p r i é t é s
p h y s i c o c h i m i q u e s , de s o r t e q u e la s é p a r a t i o n d e s c o n s t i t u a n t s p e u t ê t r e
r é a l i s é e . P o u r le t i t r a g e des m y c o t o x i n e s , o n p e u t d i s t i n g u e r les t y p e s de
chromatographie suivants:
Les méthodes sur minicolonne sont des méthodes "tout ou rien" qui ne
prennent que peu de temps et ne nécessitent aucun matériel complexe. Aussi
sont-elles utiles pour les épreuves de dépistage à effectuer sur le terrain
par des spécialistes scientifiques et des techniciens dans les pays en
développement. En conséquence, l'Organisation de coopération et de
développement économiques (OCDE) a décrit quelques méthodes sur minicolonne
pour les aflatoxines dans un manuel sur le dépistage rapide des mycotoxines
(OCDE, 1982). En dépit de quelques avantages, les méthodes sur minicolonne ont
certaines limitations: l'interprétation de l'image sur la colonne exige une
certaine expérience et elle peut se révéler particulièrement difficile quand
sont appliqués sur la colonne des extraits "souillés" contenant des composés
fluorescents autres que la toxine recherchée. En pareil cas, on risque
d'obtenir des résultats faussement positifs. Les méthodes sur minicolonne sont
au mieux semi- quantitatives et en général leur seuil de détection est plus
élevé et la sensibilité, le pouvoir de résolution et la sélectivité sont
inférieurs à ce qu'on obtient avec la chromatographie en couche mince et la
chromatographie liquide sous haute pression. On peut s'attendre à ce que le
titrage immuno-enzymatique remplace les méthodes sur minicolonne pour le
dépistage rapide.
31
Laine de verre
Sulfate de calcium
Alumine
Gel de silice
FlorisilR
Sulfate de calcium
Laine de verre —
iSséW
Si l'on ne dispose pas d'un densimètre, ce qui sera souvent le cas dans
les pays en développement, on peut recourir au schéma de taches disposées
perpendiculairement à la diagonale tel que l'avait mis au point à l'origine
Beljaars (1973) pour le dosage de l'aflatoxine B, dans les arachides
(figure 21): on dispose en taches une aliquote d'un extrait de l'échantillon
en A et différentes quantités de l'étalon d'aflatoxine B, en B. La plaque est
soumise à un développement bidimensionnel et la détection et le dosage sont
de nouveau effectués sous rayonnement ultraviolet (figure 22). Avec l'aide de
la rangée d'étalons d'aflatoxine B, soumis à un développement bidimensionnel,
il est possible de localiser l'aflatoxine B, provenant de l'extrait et
d'estimer sa concentration en comparant l'intensité de sa fluorescence avec
- 35 -
celle des différents étalons d'aflatoxine B,. Etant donné que toutes les
taches d'aflatoxine B, sont alignées et assez proches l'une de l'autre, une
telle estimation est plus facile qu'une comparaison visuelle avec des taches
d'étalon développées dans les bandes latérales, comme c'est le cas pour le
schéma de taches densimétrique. Toutefois, cette technique n'est applicable
que si les taches d'étalon apparaissent dans une partie "libre" de la plaque
après le développement bidimensionnel.
Orientation 1
>•
B
•
• m
A B B
A
• • •
A : extrait de l'échantillon . . . • • .
B: étalon d'aflatoxine 0 5 cm
Figure 19. Disposition des taches Figure 20. Séparation d'un extrait
pour la chromatographie en couche de beurre d'arachides soumis à la
mince bidimensionnelle (dosage chromatographie en couche mince
densimétrique). bidimensionnelle avec utilisation
d'un schéma de répartition des
taches densimétrique.
M a l g r é t o u t e s les t e c h n i q u e s d ' é p u r a t i o n a u x q u e l l e s o n a r e c o u r s , il
subsiste des substances qui se comportent pendant la séparation
c h r o m a t o g r a p h i q u e e n c o u c h e m i n c e de la m ê m e f a ç o n q u e la m y c o t o x i n e q u ' o n
c h e r c h e à d o s e r . P o u r r é d u i r e a u m i n i m u m le r i s q u e de r é s u l t a t s f a u s s e m e n t
p o s i t i f s , il f a u t c o n f i r m e r l ' i d e n t i t é de la m y c o t o x i n e d a n s les é c h a n t i l l o n s
p o s i t i f s , surtout quand l'opérateur n'a pas une grande expérience du titrage
d e s m y c o t o x i n e s . L a m é t h o d e la p l u s f i a b l e à c e t t e f i n e s t la s p e c t r o m é t r i e
de m a s s e à h a u t e r é s o l u t i o n . T o u t e f o i s , la s p e c t r o m é t r i e de m a s s e à h a u t e
r é s o l u t i o n a s s o c i é e à la c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e e s t u n e p r o c é d u r e
a s s e z l o n g u e e t la p l u p a r t d e s l a b o r a t o i r e s d a n s les p a y s e n d é v e l o p p e m e n t n e
s e r o n t p a s d o t é s de ce t y p e d ' é q u i p e m e n t c o m p l e x e . Il l e u r f a u d r a d o n c
a p p l i q u e r d e s t e c h n i q u e s p l u s s i m p l e s . S a n s d o u t e les m o y e n s les p l u s s i m p l e s
de c o n f i r m e r la p r é s e n c e de m y c o t o x i n e s s o n t - i l s l ' u t i l i s a t i o n de s y s t è m e s de
solvants supplémentaires ou l'application d'une chromatographie
s u p p l é m e n t a i r e , l ' o p é r a t i o n de c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e é t a n t a l o r s
r é p é t é e a v e c u n é t a l o n i n t e r n e q u i e s t s u r i m p o s é s u r la t a c h e d ' e x t r a i t a v a n t
le développement de la p l a q u e . A p r è s achèvement de l'opération de
c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e , c e t é t a l o n s u r i m p o s é e t la t a c h e " p r é s u m é e "
de t o x i n e p r o v e n a n t de l ' é c h a n t i l l o n d o i v e n t c o ï n c i d e r . U n e a u t r e p o s s i b i l i t é
c o n s i s t e à p u l v é r i s e r u n r é a c t i f s u r la p l a q u e de c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e
m i n c e d é v e l o p p é e , de s o r t e q u e la c o u l e u r (de f l u o r e s c e n c e ) de la t a c h e de
m y c o t o x i n e c h a n g e . C o m m e e x e m p l e de c e t t e d e r n i è r e p o s s i b i l i t é , o n p e u t c i t e r
l ' é p r e u v e de p u l v é r i s a t i o n a v e c u n e s o l u t i o n d i l u é e d ' a c i d e s u l f u r i q u e ( S m i t h ,
1 9 6 2 ) q u i e n t r a î n e u n c h a n g e m e n t de c o u l e u r de la f l u o r e s c e n c e , les t a c h e s
d ' a f l a t o x i n e v i r a n t d u b l e u a u j a u n e . B i e n q u e les é p r e u v e s d é c r i t e s p l u s
h a u t , s i e l l e s d o n n a i e n t u n r é s u l t a t n é g a t i f , e x c l u r a i e n t la p r é s e n c e de la
m y c o t o x i n e r e c h e r c h é e , c e l l e - c i n e s e r a i t t o u t e f o i s p a s c o n f i r m é e e n c a s de
résultat positif.
37
Orientation 1
•
• CD
B
•
B
•
•B
A
• B
•
A: extrait de l'échantillon
B: étalon d'aflatoxine O 5 cm
Figure 21. Disposition des taches Figure 22. Séparation d'un extrait
selon un schéma antidiagonal pour la de beurre d'arachides soumis à la
chromatographic en couche mince chromatographie en couche mince
bidimensionnelle (dosage visuel). bidimensionnelle avec utilisation
du schéma de répartition des taches
antidiagonal.
même plaque et ayant subi la même procédure. D'autres constituants (non soumis
à réaction) sont disposés en diagonale, formant une bissectrice sur la plaque,
du fait que la séparation a été effectuée selon les deux orientations dans des
conditions rigoureusement identiques. La figure 24 illustre le résultat d'une
telle épreuve de confirmation appliquée à un produit d'alimentation animale
contaminé par les aflatoxines B, et G,.
A B
• •
quantité décelable minimale d'aflatoxine B, serait d'environ 0,3 ng, alors que
l'application de la méthode de Manabe aux produits d'alimentation humaine et
animale a révélé que des quantités des quatre afltoxines B,, B2, G, et G2 de
10 à 20 /¿g/kg étaient encore décelables. Par rapport aux autres techniques
utilisées pour accentuer la fluorescence des aflatoxines B, et B2, les seuils
de détection indiqués par Manabe (1978) ne sont pas très impressionnants;
toutefois, cette technique est la plus facile à appliquer. Elle a pour
inconvénient la décomposition possible des aflatoxines B, et G, sur la colonne
par suite de la présence d'acide dans la phase mobile. Il faut veiller à ne
pas employer de trop grandes quantités d'acide et vérifier avec des témoins
s'il se produit une décomposition dans les conditions de séparation optimales.
O 5 10 15 20
>. min.
Figure 25. Chromatogramme (chromatographie liquide sous haute pression de
phase inverse) C18 d'un extrait de produit d'alimentation animale contenant de
la pulpe d'agrumes et contaminé par les aflatoxines B,, B2 , G, et G2 à raison
d'environ 12, 3, 8 et 1 pg/kg respectivement, préparé selon van Egmond
(1987) .
Pic M
0 5 10
Durée de rétention (min.)
Méthodes immunochimiques
l'antigène, par exemple pour les protéines ou les polypeptides d'un poids
moléculaire supérieur à 5000 Dalton. En règle générale, les mycotoxines ont
un poids moléculaire trop faible pour produire directement des anticorps quand
elles sont administrées à des animaux. Ces substances qu'on appelle des
haptènes doivent être conjuguées par covalence avec des protéines avant que
l'immunisation puisse se produire. Les anticorps (immunsérums) sont un groupe
de protéines sériques aussi appelées immunoglobulines. La plupart des
immunoglobulines appartiennent à la classe IgG. Du fait qu'il existe pour ces
immunoglobulines des sites de réaction non seulement pour les anticorps mais
aussi pour les déterminants antigéniques, elles peuvent elles-mêmes servir
d'antigènes quand elles sont injectées dans un organisme animal étranger.
Cette possibilité est exploitée dans certains types de titrages immunologiques
(par exemple le titrage avec immunoadsorbant lié à une enzyme opérant par
immuno cap ture, dont il est question plus loin). Il n'entre pas dans les
limites du présent chapitre d'exposer en détail la conjugaison des haptènes
et la production d'anticorps dirigés contre les mycotoxines. Plus important
est de savoir que des immunsérums dirigés contre certaines des mycotoxines
(des aflatoxines en particulier) ont été produits (Chu, 1983). Certains de ces
immunsérums sont aujourd'hui disponibles dans le commerce, quoique le plus
souvent uniquement dans des nécessaires d'épreuve.
a. Titrage immunoenzymatique
••n — ^
> R ^ ^
KOE + KO
K K t OE :
Produit coloré
K O E + SLJ PP ort
Anticorps spécifique AE
K (fixé à la paroi)
O Antigène
Antigène marqué
par une enzyme (antigène)
K + 0 KO+ OE KO
K K KOE
+ support
Produit coloré
AE'
K Anticorps spécifique
O (fixé à la paroi)
Antigène (antigène)
O E Antigène marqué
par une enzyme
IO + > + ) E ^ l<C>»E
+ support
O Antigène Produit coloré
l O Antigène fixé à la paroi AE
)>-° Anticorps spécifique
Anticorps anti-immunoglobuline
marqué par une enzyme (antigène)
b . Titrage radio-immunologique
100% actif
• • • • • • + I I I
100% actif
I I I SWT
50% actif
f 91 50% actif
•oo««o + II I
ottoo* irâr
33% actif
oootot II I 9f 9
ottooo + 33% actif
•ooo«o "5751r
17% actif
O•OOOO
•ooooo 999
ootooo , 17% actif
oooo«o T II 1
ooo*oo
ooooo*
Complexe Anticorps Antigène contenant
antigène-anticorps la prise d'essai
# Antigène marqué
O Antigène libre
Conclusion
4. Bien qu'étant l'une des plus anciennes méthodes employées pour les
mycotoxines, la chromatographie en couche mince est une technique de
séparation fiable, aisément réalisable et relativement simple,
offrant un large chanmp d'application. C'est la technique de choix
pour les pays en développement. Son application bidimensionnelle
offre une résolution particulièrement bonne, d'où un seuil de
détection assez bas.
Tableau 3
Titrage
biologique Limité Faible Elevé Faible Non
Chromatographie
en couche
mince Large Elevée Faible Faible Non
Chromatographie
liquide sous Partiel-
haute pression Large Elevée Faible Elevé lement
Chromatographie
en phase Partiel-
gazeuse Limité Elevée Faible Elevé lement
Titrage radio-
immunologique Limité * Faible Elevé Oui
* Inconnue actuellement.
- 54 -
7. Caractéristiques
Sensibilité
Cu —-c
Spécificité
Précision
méthode ELISA pour l'aflatoxine B,. Très intéressants sont les résultats d'une
étude rétrospective d'Horwitz (1980, 1981) qui a étudié les données en matière
de précision tirées d'environ 200 études concertées menées sous les auspices
de l'AOAC, dont plusieurs portant sur les aflatoxines. Il a pu en tirer deux
conclusions remarquables qui sont également applicables au titrage des
afltoxines (chromatographie en couche mince): 1) la précision
interlaboratoires (reproductibilité) semble être fonction de la concentration
(figure 33) et semble être indépendante de la nature de la substance à
analyser ou de la technique de mesure adoptée.
Ces conclusions ont une grande importance sur le plan pratique. Elles
signifient qu'à un niveau d'environ 10 ng/kg, niveau de contamination "normal"
pour l'aflatoxine B,, on peut s'attendre à un CV d'environ 20% dans un
laboratoire donné et à un CV interlaboratoires d'environ 32%. En outre, à un
niveau de 0,1 /¿g/kg, niveau de contamination "normal" pour l'aflatoxine M,,
on peut s'attendre à un CV dans un laboratoire donné d'environ 40% et à un
CV interlaboratoires d'environ 64%.
Seuil de détection
*B X,
C, c,
m — dx/dc —• de = dx/m
C L - C0 - (XL - x B )/m
CL = 3s B /m
10SB
3Sb _ ,
i
\ i
\ i
\ i
\ i
\ i
\i
\i
Exactitude
8. Assurance de la qualité
Pour que la fiabilité des résultats d'épreuve puisse être vérifiée selon
au moins deux méthodes indépendantes, il faut que celles-ci aient été
utilisées avec succès dans d'autres situations analogues comportant des
analyses (mêmes concentrations, mêmes interférences). On entend par
"indépendantes" des déterminations reposant sur différentes propriétés
physico-chimiques de la substance analysée, par exemple la chromatographie en
couche mince par opposition à la méthode ELISA. Il est très peu probable que
deux méthodes indépendantes puissent accuser une erreur systématique du même
ordre de grandeur et dans le même sens. Par conséquent, quand les résultats
de différentes analyses concordent, il est à peu près certain qu'ils sont
exacts. Les comparaisons faites dans un même laboratoire selon des méthodes
indépendantes sont un précieux élément dans un programme d'assurance de la
qualité.
62 -
Tableau 4
Méthode Observations
Tableau 5
Description d'une méthode pour mesurer l'activité de l'eau (aw) dans les
produits d'alimentation humaine. Cette épreuve convient pour vérifier la a w
de diverses denrées agricoles, laquelle doit être conforme aux normes fixées
en la matière pour empêcher la croissance des champignons et la production de
mycotoxines.
Définition
Principe
Réactifs
Vaseline
Sels pulvérisés, maille 105-210 ^m, le choix des sels étant fonction
d'étalons représentant les échantillons à soumettre aux épreuves.
Equipement
Mode opératoire
Observer les cristaux pour voir s'ils sont liquéfiés ou non. Quand 50%
ou davantage des cristaux sont liquéfiés, le résultat de l'épreuve est jugé
positif.
Dans le cas d'une épreuve positive, 50% ou plus des cristaux du sel x
sont liquéfiés au bout de 3 à 24 heures selon le type de sel, le type de
produit et la température (voir tableau 6). La a w de l'échantillon peut être
exprimée ainsi:
Examen critique
Tableau 6
Arachides non
décortiquées 0,702 CuCl2.2H20 0,018
Solution de
glycérol 0,776 NaCl 0,020 4
Solution de
glycérol 0,876 KC1 0,020
Solution de
glycérol 0,890 K2Cr04 0,020 12
Saucisse
fermentée 0,960 (NH4)H2P04 0,021 4
b. Mode opératoire
Vérifier que les couches minces soient bien lisses et étalées de façon
égale sur les plaques. conserver au dessiccateur jusqu'au moment de
1'utilisation.
- 68 -
a. Equipement
c = concentration en mmol/L
1 = trajet en mètres.
b. Vérification de la pureté
Tableau 7
Tableau 8
Tableau 9
Aflatoxine PM
B, 312
B2 314
G, 328
G2 330
M, 328
(A x PM x FC)
/¿g d'aflatoxine/ml = , où
1 x S
B, 1980 2100
B2 2090
G, 1710
G2 1820
M, 1882 1995
Tableau 10
le c o n t e n u s o i t à la t e m p é r a t u r e a m b i a n t e . L a s o l u t i o n - m è r e p e u t ê t r e
c o n s e r v é e 4 m o i s si e l l e e s t s t o c k é e d a n s u n r é f r i g é r a t e u r à l ' a b r i de la
l u m i è r e . L a s o l u t i o n é t a l o n p e u t ê t r e c o n s e r v é e a u m o i n s 14 j o u r s si e l l e e s t
s t o c k é e de la m ê m e f a ç o n .
g. P r é p a r a t i o n de l ' é t a l o n de r é f é r e n c e p o u r résolution
P r é p a r e r l ' é t a l o n de r é f é r e n c e p o u r r é s o l u t i o n e n m é l a n g e a n t les
s o l u t i o n s d ' a f l a t o x i n e s B,, B 2 , G, e t G 2 a f i n d ' o b t e n i r d e s c o n c e n t r a t i o n s de
1 , 0 , 4 , 1 e t 0 , 4 yLig/ml r e s p e c t i v e m e n t l o r s de la d i l u t i o n f i n a l e a v e c le
c h l o r o f o r m e o u le b e n z è n e - a c é t o n i t r i l e .
C h r o m a t o g r a p h i c en c o u c h e m i n c e
a. D é p ô t des t a c h e s et développement
P o u r l ' a n a l y s e d e s m y c o t o x i n e s p a r c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e , les
s u b s t a n c e s q u i s o n t a p p l i q u é e s sur la p l a q u e o n t g é n é r a l e m e n t u n v o l u m e
v a r i a n t de 5 à 25 /il. S e l o n l ' e x a c t i t u d e e t la p r é c i s i o n s o u h a i t é e s , o n p e u t
u t i l i s e r d i f f é r e n t s t y p e s d ' a p p l i c a t e u r s , t e l s que des p i p e t t e s c a p i l l a i r e s
q u a l i t a t i v e s , des p i p e t t e s c a p i l l a i r e s q u a n t i t a t i v e s o u d e s s e r i n g u e s de
précision.
S u r la m ê m e p l a q u e de c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e o n a p p l i q u e
d i r e c t e m e n t l ' u n e a p r è s l ' a u t r e des p a r t i e s a l i q u o t e s de l ' é c h a n t i l l o n , de
m ê m e q u e des p a r t i e s a l i q u o t e s de la s o l u t i o n é t a l o n , e n v e i l l a n t à ce q u e les
t a c h e s s o i e n t de t a i l l e r é d u i t e e t u n i f o r m e . De c e t t e f a ç o n , la c o m p a r a i s o n
de l ' é c h a n t i l l o n e t de l ' é t a l o n e s t p o s s i b l e e t j u s t i f i é e , é t a n t d o n n é q u e les
d e u x s o n t s o u m i s a u x m ê m e s c o n d i t i o n s de d é v e l o p p e m e n t e t que les v a r i a t i o n s
é v e n t u e l l e s d ' u n e p l a q u e à l ' a u t r e s o n t é l i m i n é e s . Il e s t de b o n n e p r a t i q u e
d a n s u n l a b o r a t o i r e d ' a p p l i q u e r les é c h a n t i l l o n s e t les é t a l o n s a u s s i v i t e que
p o s s i b l e s o u s u n f a i b l e é c l a i r a g e à i n c a n d e s c e n c e , de p r é f é r e n c e e n a t m o s p h è r e
i n e r t e p o u r é v i t e r la d é c o m p o s i t i o n . A c e t t e m ê m e f i n , il f a u t , a p r è s le d é p ô t
des t â c h e s , c o u v r i r c e l l e s - c i d ' u n e p l a q u e e n v e r r e . P o u r l ' e s t i m a t i o n
v i s u e l l e , il e s t n é c e s s a i r e que l ' i n t e n s i t é des t a c h e s d ' é c h a n t i l l o n s se s i t u e
d a n s la g a m m e des i n t e n s i t é s d ' u n e s é r i e c r o i s s a n t e de t a c h e s d ' é t a l o n s . P a r
c o n s é q u e n t , s i l ' o n a n a l y s e les é c h a n t i l l o n s de c o n c e n t r a t i o n s de m y c o t o x i n e s
i n c o n n u e s , il e s t u t i l e de p r o c é d e r d ' a b o r d à u n e o p é r a t i o n p r é l i m i n a i r e de
c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e m i n c e p o u r d é t e r m i n e r la t e n e u r a p p r o x i m a t i v e e n
m y c o t o x i n e , a f i n q u ' o n p u i s s e p r é p a r e r u n e d i l u t i o n a p p r o p r i é e p o u r la
c h r o m a t o g r a p h i e q u a n t i t a t i v e e n c o u c h e m i n c e . P o u r le d o s a g e d e n s i m é t r i q u e ,
il f a u t p r o c é d e r à d e s d i l u t i o n s si l ' i n t e n s i t é des t a c h e s d ' é c h a n t i l l o n e t
c e l l e d e s t a c h e s d ' é t a l o n n e s o n t p a s d u m ê m e o r d r e de g r a n d e u r .
b. Interprétation et calcul
S x Y x V
MgAg = , où
X x W
B x Y x S x V
Mg/kg = , où
Z x X x W
D a n s la m é t h o d e ( s i m p l e ) de P r z y b y l s k i , o n o b t i e n t ce r é s u l t a t e n
s u r i m p o s a n t de l ' a c i d e t r i f l u o r o a c é t i q u e d i r e c t e m e n t s u r la t a c h e d ' e x t r a i t
a v a n t le d é v e l o p p e m e n t . A p r è s la r é a c t i o n , la p l a q u e e s t d é v e l o p p é e e t
e x a m i n é e s o u s é c l a i r a g e u l t r a v i o l e t p o u r d é t e r m i n e r la p r é s e n c e de la t a c h e
b l e u e d e f l u o r e s c e n c e de l ' a f l a t o x i n e B 2 a , q u i p e u t ê t r e i d e n t i f i é e à l ' a i d e
d ' u n é t a l o n d ' a f l a t o x i n e B, d é p o s é e n t a c h e s sur la m ê m e p l a q u e e t s o u m i s à
l a m ê m e o p é r a t i o n . C o m m e c o n f i r m a t i o n s u p p l é m e n t a i r e , o n p u l v é r i s e d u H 2 S 0 4 sur
u n e a u t r e p a r t i e de la p l a q u e o ù o n t été d é v e l o p p é e s d e s p a r t i e s a l i q u o t e s
n ' a y a n t p a s r é a g i de l ' e x t r a i t e t de l ' a f l a t o x i n e B, s e r v a n t d ' é t a l o n . L a
p u l v é r i s a t i o n d ' a c i d e H 2 S 0 4 m o d i f i e la f l u o r e s c e n c e de l ' a f l a t o x i n e , q u i v i r e
d u b l e u a u j a u n e , c e t t e é p r e u v e n e f a i t que c o n f i r m e r l ' a b s e n c e d ' a f l a t o x i n e ,
c ' e s t - à - d i r e que les taches qui ne virent pas au jaune ne sont certainement
p a s de l ' a f l a t o x i n e , m a i s de n o m b r e u s e s s u b s t a n c e s a u t r e s que l ' a f l a t o x i n e
p e u v e n t donner une tache jaune avec du H2S04.
N.B.: Ces deux méthodes sont tout aussi satisfaisantes l'une que l'autre pour
c o n f i r m e r l ' i d e n t i t é de l ' a f l a t o x i n e G,.
b. M é t h o d e de l ' A O A C p o u r l ' a f l a t o x i n e B, ( u n i d i m e n s i o n n e l l e )
Mode opératoire
Chloroforme
-acétone
(85+15)
# Echantillon
O Etalon
C Echantillon + étalon
Figure 36
N.B.: Ces modes opératoires sont basés sur la méthode officielle des
Communautés européennes, Journal officiel des Communautés européennes L102,
9-18 (1976), texte modifié par P.L. Schuller et H.P. van Egmond.
b. Principe
c. Réactifs
Acétone
Chloroforme, stabilisé avec 0,5 à 1,0% d'éthanol à 96% (v/v)
n-Hexane
Méthanol
Ether éthylique anhydre, exempt de peroxydes
Mélange de benzène et d'acétonitrile: 98/2 (v/v)
Mélange de chloroforme et de méthanol: 97/3 (v/v)
Gel de silice pour chromatographie sur colonne; granulométrie:
0,05-0,20 mm
Coton hydrophile, préalablement dégraissé au chloroforme, ou laine de
verre
Sulfate de sodium anhydre granuleux
Gaz inerte, par exemple azote
Acide chlorhydrique (1 mol/L)
Solution aqueuse d'acide sulfurique à 50% (v/v)
Diatomite (Kieselguhr, Hyflosupercel), lavée à l'acide
Gel de silice G-HR ou équivalent pour plaques à enduire par l'opérateur
Solution étalon contenant 0,1 /¿g d'aflatoxine B, par ml dans du
chloroforme ou dans le mélange de benzène et d'acétonitrile préparé et
vérifié comme indiqué ci-après
Solvants révélateurs :
d. Equipement
Broyeur-malaxeur
Agitateur, magnétique ou autre
Papiers filtres cannelés, Schleicher et Schüll N° 588 ou équivalent;
diamètre: 24 cm
Tube en verre pour chromatographic (diamètre interne: 22 mm; longueur:
300 mm) avec robinet en Teflon et réservoir de 250 ml
81 -
e. Mode opératoire
Préparation de l'échantillon:
Extraction:
Epuration de la colonne:
S é c h e r d a n s u n c o u r a n t d ' a i r o u de g a z i n e r t e à f a i b l e d é b i t . L e s t a c h e s
obtenues auront un diamètre d'environ 5 m m .
D é v e l o p p e r le c h r o m a t o g r a m m e d a n s l ' o b s c u r i t é a v e c l ' u n d e s s o l v a n t s
r é v é l a t e u r s . (On c h o i s i r a le s o l v a n t a u p r é a l a b l e e n d é p o s a n t 25 /¿I de
la s o l u t i o n é t a l o n q u a l i t a t i v e sur la p l a q u e e t e n v é r i f i a n t q u ' a p r è s
d é v e l o p p e m e n t les a f l a t o x i n e s B, e t B z à f l u o r e s c e n c e b l e u e s o n t
c o m p l è t e m e n t s é p a r é e s . ) L a i s s e r le s o l v a n t s ' é v a p o r e r d a n s l ' o b s c u r i t é ,
p u i s i r r a d i e r a u x u l t r a v i o l e t s e n p l a ç a n t la p l a q u e à 10 cm de la l a m p e .
L e s t a c h e s d ' a f l a t o x i n e B, d é g a g e n t u n e f l u o r e s c e n c e b l e u e .
Dosage :
Estimation visuelle :
M e s u r e r a u f l u o r o d e n s i m è t r e l ' i n t e n s i t é de la f l u o r e s c e n c e d é g a g é e p a r
les t a c h e s d ' a f l a t o x i n e B, à u n e l o n g e u r d ' o n d e s d ' e x c i t a t i o n de 365 n m
e t à u n e l o n g u e u r d ' o n d e s d ' é m i s s i o n de 4 4 3 rim. D é t e r m i n e r la q u a n t i t é
d ' a f l a t o x i n e B, d a n s les t a c h e s d ' e x t r a i t e n c o m p a r a n t l ' i n t e n s i t é de
la f l u o r e s c e n c e d e s t a c h e s d ' e x t r a i t a v e c c e l l e d e s t a c h e s d ' a f l a t o x i n e
B, s e r v a n t d ' é t a l o n . S i l ' i n t e n s i t é de la f l u o r e s c e n c e d é g a g é e p a r les
20 /il d ' e x t r a i t e s t n e t t e m e n t s u p é r i e u r e à c e l l e d e s 4 0 /il de s o l u t i o n
é t a l o n , d i l u e r l ' e x t r a i t 10 o u 100 fois a v e c d u c h l o r o f o r m e o u a v e c le
m é l a n g e de b e n z è n e e t d ' a c é t o n i t r i l e a v a n t de r é p é t e r l ' o p é r a t i o n de
chromatographie en couche mince.
C o n f i r m a t i o n de l ' i d e n t i t é de l ' a f l a t o x i n e B, :
Tracer deux lignes droites sur une plaque parallèlement aux deux côtés
contigus (à 6 cm de chaque bord) pour limiter la migration du solvant.
Déposer des taches des solutions ci-après sur la plaque à l'aide des
pipettes capillaires ou de la microseringue.
Orientation Iï >
Q o
O
H
ro
3
rt
B)
rr
H1
O
3
0 o 0
B
— O
CM
H 12 cm -fl-4 c m 1
2 cm 2 cm
Figure 37
85
a u p o i n t A : u n v o l u m e d ' e x t r a i t de la p r i s e d ' e s s a i , o b t e n u e n
" E p u r a t i o n de la c o l o n n e " , c o n t e n a n t e n v i r o n 2,5 n g d ' a f l a t o x i n e
B,;
a u x p o i n t s B e t C: 25 fil de la s o l u t i o n étalon;
D é v e l o p p e m e n t : ( S u i v r e le d i a g r a m m e de la f i g u r e 37.)
D é v e l o p p e r la p l a q u e s u i v a n t l ' o r i e n t a t i o n I d a n s l ' o b s c u r i t é e n
u t i l i s a n t le s o l v a n t r é v é l a t e u r c h l o r o f o r m e - a c é t o n e 9 / 1 ( v / v ) j u s q u ' à
ce q u ' i l a t t e i g n e la l i g n e l i m i t e .
R e t i r e r la p l a q u e de la c u v e e t la l a i s s e r s é c h e r d a n s l ' o b s c u r i t é à la
t e m p é r a t u r e a m b i a n t e p e n d a n t 5 m i n u t e s . P u l v é r i s e r e n s u i t e de l ' a c i d e
c h l o r h y d r i q u e sur u n e b a n d e de 2,5 cm de l a r g e e n c o u v r a n t les p o i n t s
A e t C (zone i n d i q u é e p a r les h a c h u r e s s u r la f i g u r e 3 7 ) j u s q u ' à ce q u e
c e t t e z o n e d e v i e n n e f o n c é e , e n p r o t é g e a n t le r e s t e de la p l a q u e a v e c u n e
f e u i l l e de v e r r e . L a i s s e r r é a g i r 10 m i n u t e s d a n s l ' o b s c u r i t é e t s é c h e r
d a n s u n c o u r a n t d ' a i r à la t e m p é r a t u r e a m b i a n t e .
D é v e l o p p e r e n s u i t e la p l a q u e s u i v a n t l ' o r i e n t a t i o n II d a n s l ' o b s c u r i t é
en u t i l i s a n t le s o l v a n t r é v é l a t e u r c h l o r o f o r m e - a c é t o n e 9 / 1 ( v / v ) j u s q u ' à
ce q u ' i l a t t e i g n e la l i g n e l i m i t e . R e t i r e r la p l a q u e de la c u v e e t
l a i s s e r s é c h e r à la t e m p é r a t u r e a m b i a n t e .
I n t e r p r é t a t i o n du chromatogramme:
1) A p p a r i t i o n d ' u n e t a c h e f l u o r e s c e n t e b l e u e d ' a f l a t o x i n e B, é m a n a n t
de la s o l u t i o n é t a l o n a p p l i q u é e e n B ( m i g r a t i o n s u i v a n t l ' o r i e n t a t i o n
I).
3) A p p a r i t i o n de t a c h e s c o r r e s p o n d a n t à c e l l e s d é c r i t e s e n (2) é m a n a n t
de l ' e x t r a i t de la p r i s e d ' e s s a i a p p l i q u é e n A . L a p o s i t i o n de c e s
t a c h e s e s t d é f i n i e p r e m i è r e m e n t p a r la d i s t a n c e de m i g r a t i o n de
l ' a f l a t o x i n e B, à p a r t i r d u p o i n t A s u i v a n t l ' o r i e n t a t i o n I
( i d e n t i q u e à la d i s t a n c e p a r c o u r u e p a r l ' é t a l o n a p p l i q u é e n B e t ,
d e u x i è m e m e n t , p a r la d i s t a n c e de m i g r a t i o n à p a r t i r de là e t s u i v a n t
l ' o r i e n t a t i o n II de l ' h é m i a c é t a l de l ' a f l a t o x i n e B, ( i d e n t i q u e à
c e l l e p a r c o u r u e p a r l ' é t a l o n a p p l i q u é e n C . L ' i n t e n s i t é de la
f l u o r e s c e n c e des t a c h e s d ' h é m i a c é t a l é m a n a n t de l ' e x t r a i t d o i t
c o r r e s p o n d r e à c e l l e de l ' é t a l o n a p p l i q u é e n C .
- 86 -
Tracer deux lignes droites sur une plaque parallèlement aux deux côtés
contigus (6 cm de chaque bord) pour limiter la migration du solvant.
Déposer des taches des solutions ci-après sur la plaque à l'aide des
pipettes capillaires ou de la microseringue.
Sécher dans un courant d'air ou de gaz inerte à faible débit. Les taches
obtenues doivent avoir un diamètre d'environ 5 mm.
Orientation II-
T
1
T c
1
±
I
- — o — O
o 1
rsi — 1 o
h
H.
m
3
PC
eu
A'" B'" rf
H-
O O O
A" s
£
O O o B"
A' - B '
O 0
1 1
A
1 B
o — 0 -
E
u 1 1
1 1
I- 12 cm il 1.1-4 cm
2 cm 2 cm
Figure 38
- 87 -
Estimation visuelle:
X x S x V , où
Y x m
- 88 -
Mesure fluorodensimétrique:
S x V . où
Y x m
Principe
Réactifs
Acétone
- 89 -
d. Equipement
e. Mode opératoire
'Orientation IF
T
c
O
/S— O D
I
C — O
H c
O
-IV o
>-t
\ ra
3
\ A
\ oA" B" H-
e \o A' O
a
u B'
\
— f -o o-
1 B
A i
e
u
CM
•13 cm HI — 5 cm-
2 cm
A: extrait de la prise d'essai
B, C, D, E: étalon d'aflatoxine B,
Figure 39
Tracer deux lignes droites sur une plaque parallèlement aux deux côtés
contigus (à 5 et 6 cm de chaque bord, respectivement) pour limiter la
migration du solvant. Déposer des taches des solutions ci-après sur la
plaque à l'aide des pipettes capillaires ou de la microseringue:
Sécher dans un courant d'air ou de gaz inerte à faible débit. Les taches
obtenues doivent avoir un diamètre d'environ 5 mm.
91
Chromatographie supplémentaire:
Tracer deux lignes droites sur une nouvelle plaque parallèlement aux
deux côtés contigus, comme indiqué sur le diagramme de la figure 39, et
appliquer au point A 20 /il de l'extrait de la prise d'essai et, en
surimposition, 20 de la solution étalon. Développer comme indiqué
précédemment. Irradier le chromatogramme à l'ultraviolet et vérifier:
Dosage :
Estimation visuelle :
2) Apparition de taches fluorescentes bleues (positions A' ' ' et A' ' )
émanant de l'aflatoxine B, présumée dans l'extrait (position A') dont
la valeur fy correspond à celle de l'aflatoxine B, servant d'étalon
(position B'). L'identité de l'aflatoxine B, dans l'extrait est
confirmée quand la valeur R< de la tache d'hémiacétal de l'aflatoxine
B, provenant de l'extrait correspond à celle de la tache de l'étalon
(positions A'' et B'', respectivement).
- 93 -
Estimation visuelle:
X x S x V . où
Y x m
Mesure fluorodensimétrique:
S x V . où
Y x m
b. Principe
c. Réactifs
d. Equipement
e. Mode opératoire
Tracer deux droites sur une plaque parallèlement aux deux côtés contigus
(à 3 cm de chaque bord) pour limiter la migration du solvant. Déposer
des taches des solutions ci-après sur la plaque à l'aide de pipettes
capillaires ou de la microseringue.
Sécher dans un courant d'air ou de gaz inerte à faible débit. Les taches
obtenues doivent avoir un diamètre d'environ 5 mm.
95
O r i e n t â t ion II-
r
o 0
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| «- 4.5 cm — fl- 10.5 cm -J 3 cm H
2 cm
F i g u r e 40
Chromatographie supplémentaire:
Tracer deux lignes droites sur une nouvelle plaque parallèlement aux
deux côtés contigus, comme indiqué sur la figure 40, et appliquer au
point A (voir figure 40) 20 /¿I de l'extrait de la prise d'essai obtenu
et, surimposés sur celui-ci, 20 ni de la solution étalon. Développer
comme précédemment. Irradier le chromatogramme à l'ultraviolet et
vérifier que:
Dosage :
Estimation visuelle:
Estimation visuelle:
X x S x V . où
Y x m
a. Délipidation
c. R e p r o d u c t i b i l i t é des résultats
Principe
Réactifs
Eau oxygénée. Contient 1,5 ml de H202 à 30% par litre dans un tampon de
citrate (pH 4,0). Boucher après utilisation et conserver au froid
(4° C).
Equipement
Mode opératoire
Extraction :
Titrage immunoenzymatique:
N.B.: Un seul embout de pipette doit être utilisé pour chacune des
étapes suivantes:
V. EXPOSES
L'homme peut être exposé aux mycotoxines non seulement par ingestion
d'aliments contaminés par la toxine, mais aussi par inhalation ou contact
cutané (7). On peut citer comme exemple d'exposition humaine par inhalation
l'observation faite par Van Nieuwenhuize qui a signalé le développement de
cancers dans divers organes chez des travailleurs qui avaient aspiré pendant
plusieurs années de petites poussières chargées d'aflatoxine dans une huilerie
où l'on broyait des arachides et d'autres oléagineux.
Le facteur appelé activité de l'eau (a^,) mesure l'eau libre qui, dans
les produits alimentaires, est disponible pour la croissance de la moisissure.
Ce terme est expliqué sur la diapositive (11). On utilise le terme d'humidité
relative pour l'atmosphère: l'humidité relative d'équilibre ou pression de
vapeur d'eau relative d'équilibre est en équilibre avec l'humidité de la
substance entreposée. L'activité de l'eau est définie sur la diapositive (12).
Il s'agit du quotient de la tension de vapeur d'eau du produit par la tension
de vapeur de l'eau pure à la même température et tension.
Plus l'eau se trouve sous une forme liée au support, moins il y a d'eau
disponible pour le champignon et plus l'activité a w est faible. Non seulement
la a^ influe sur la croissance des champignons mais, de plus, elle affecte la
production de mycotoxines. Quand la a,, est inférieure à une certaine valeur,
il n'y a pas production de mycotoxines. Cette valeur dépend de la mycotoxine
en cause, de la souche de champignon considérée, du support et de la
température.
qui indique seulement que la présence d'une mycotoxine est possible. On peut
en obtenir la preuve directe en appliquant des méthodes d'analyse pour
déterminer la présence effective d'une ou plusieurs mycotoxines dans la denrée
à inspecter.
Les titrages immunologiques (24) sont des méthodes qui reposent sur des
principes tout à fait différents par rapport aux méthodes chromatographiques.
Les titrages immunologiques en sont encore à leur stade initial d'application
pour le dosage des mycotoxines. Néanmoins, le titrage sur immunoadsorbant lié
à une enzyme (ELISA), en particulier, gagne rapidement du terrain et c'est
pourquoi un exposé distinct (V.3) sera consacré aux techniques ELISA.
Le déplacement des substances séparées peut être exprimé par leur débit,
habituellement représenté par le symbole R^, lequel peut être défini comme
étant (7):
Distance de migration du composé
Distance de migration du solvant
Le solvant pour déposer les taches, qui doit être le même pour l'extrait
et pour l'étalon, doit permettre (16) une solubilité satisfaisante de la
toxine à rechercher, et doit être volatil et donner des taches réduites et
uniformes. Ces conditions revêtent une grande importance pour obtenir des
résultats reproductibles.
On peut citer comme exemple (18) d'un schéma de dépôt des taches pour
chromatographic unidimensionnelle en couche mince celui de la méthode dite de
la Contamination Branch (CB) , qui peut être appliquée pour le dosage de
l'aflatoxine B, dans les arachides, les produits à base d'arachides et le
maïs. On dépose en taches de petites quantités d'extrait de l'échantillon et
de l'aflatoxine B, servant d'étalon sur une plaque de 20 x 20 cm, suivant une
ligne imaginaire située à 4 cm du bord inférieur de la plaque de
chromatographie en couche mince. Sur l'une des taches d'échantillon, on dépose
5 ni de l'étalon d'aflatoxine B, comme étalon interne. On dépose aussi une
tache de 5 ni d'un mélange qualitatif d'étalon d'aflatoxine pour indiquer si
la résolution est adéquate. Il subsiste sur la plaque de chromatographie en
couche mince assez d'espace pour déposer des taches d'autres extraits
d'échantillons permettant d'estimer la teneur en aflatoxine B, d'après la même
série d'étalons. Après évaporation du solvant utilisé pour le dépôt des
taches, on place la plaque dans une cuve de développement contenant un mélange
de chloroforme et d'acétone (9+1) et la plaque est développée jusqu'à ce que
le solvant atteigne la ligne limite (tracée à 16 cm du bord inférieur de la
plaque), la durée de cette opération étant d'environ 40 minutes. Après
séchage, on observe la plaque sous éclairage ultraviolet dans les grandes
longueurs d'ondes afin de permettre la visualisation et le dosage des taches
d'aflatoxine (19). Sur le côté gauche de la plaque est visible le résultat de
la séparation d'un extrait d'arachides crues contaminées par de l'aflatoxine
B, obtenue selon la méthode CB. La séparation du mélange d'étalon d'aflatoxine
permet de conclure que la qualité de séparation de la plaque était suffisante.
A l'aide des étalons d'aflatoxine B,, on peut localiser la tache d'aflatoxine
B, dans l'extrait et en estimer la quantité afin de pouvoir calculer la
concentration initiale de l'échantillon. Il est beaucoup plus difficile de
localiser et de doser l'aflatoxine B, présente dans le beurre de cacahuètes.
Ce produit ayant été grillé, il s'est formé de nombreux constituants qui
peuvent gêner considérablement l'interprétation et le chiffrage du résultat
obtenu avec la chromatographie en couche mince. Afin d'améliorer la séparation
dans ce cas, et ainsi d'abaisser le seuil de détection, il faut recourir à la
chromatographie bidimensionnelle en couche mince.
(21) S é p a r a t i o n d ' u n e x t r a i t de b e u r r e de c a c a h u è t e s s o u m i s à la
chromatographic bidimensionnelle en couche mince avec
utilisation du schéma de répartition des taches
densimétrique
(22) Schéma de répartition des taches antidiagonal pour
chromatographie bidimensionnelle en couche mince
(23) S é p a r a t i o n d ' u n e x t r a i t de b e u r r e de c a c a h u è t e s s o u m i s à la
chromatographie bidimensionnelle en couche mince avec
u t i l i s a t i o n d u s c h é m a de r é p a r t i t i o n d e s t a c h e s a n t i d i a g o n a l
(24) A v a n t a g e s e t i n c o n v é n i e n t s de la c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e
mince unidimensionnelle et bidimensionnelle
(25) Auxiliaires de visualisation pour la détection des
mycotoxines par chromatographie en couche mince
(26) I l l u s t r a t i o n de t a c h e s de s t é r i g m a t o c y s t i n e v i s u a l i s é e s e t
non visualisées avec réactif au A1C13
(27) S c h é m a de l ' é p r e u v e de c o n f i r m a t i o n à l ' a c i d e c h l o r h y d r i q u e
(28) I l l u s t r a t i o n d u r é s u l t a t de l ' é p r e u v e de c o n f i r m a t i o n à
l'acide chlorhydrique appliquée à un produit d'alimentation
p o u r l a p i n s c o n t a m i n é p a r de l ' a f l a t o x i n e B,
(29) L e s d i x é t a p e s f o n d a m e n t a l e s de la c h r o m a t o g r a p h i e e n c o u c h e
mince
(30) " M i e u x v a u t ê t r e a p p r o x i m a t i v e m e n t e x a c t que se t r o m p e r a v e c
précision!"
3. Techniques ELISA
C e s c o n s t a t a t i o n s o n t p e r m i s de m e t t r e a u p o i n t d e s m é t h o d e s d ' a n a l y s e
immunochimiques dites "titrages immunologiques". Ces titrages exploitent leurs
p r o p r i é t é s de r e c o n n a i s s a n c e m o l é c u l a i r e d e s a n t i c o r p s , t o u t c o m m e u n e s e r r u r e
c o r r e s p o n d à u n e clé ( 2 ) . L a clé q u ' i l f a u t m e s u r e r e s t l ' a n t i g è n e .
A v a n t d ' a p p l i q u e r les m é t h o d e s i m m u n o c h i m i q u e s à la d é t e c t i o n e t a u
dosage d'un constituant (l'antigène), il f a u t p r é p a r e r les réactifs
b i o l o g i q u e s q u i i n t e r v i e n n e n t d a n s c e s m é t h o d e s (les a n t i c o r p s ) c h e z d e s
a n i m a u x s u p é r i e u r s e n l e u r i n o c u l a n t l ' a n t i g è n e , tous les a n t i g è n e s n ' o n t p a s
la c a p a c i t é d ' i n d u i r e la f o r m a t i o n d ' a n t i c o r p s c h e z les a n i m a u x d ' e x p é r i e n c e .
L ' i m m u n o g é n i c i t é d é p e n d d a n s u n c e r t a i n e m e s u r e de la t a i l l e de l ' a n t i g è n e .
L e s p e t i t e s m o l é c u l e s c o m m e les m y c o t o x i n e s ne s o n t p a s i m m u n o g è n e s ; o n les
appelle des haptènes (3), Une fois le haptène fixé à un grand porteur,
s ' a g i s s a n t g é n é r a l e m e n t d ' u n e p r o t é i n e , il d e v i e n t i m m u n o g è n e . P o u r la
p r o d u c t i o n d ' a n t i c o r p s o n u t i l i s e d e s l a p i n s , des s o u r i s , des c o b a y e s , des
118 -
chèvres, des moutons, des poules et des chevaux; l'injection peut être
intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée ou intrapéritonéale. Le sérum
recueilli après l'injection est appelé immunsérum ou antisérum; il contient
un groupe de protéines sériques également appelés immunoglobulines.
Pour le titrage avec mise en compétition (8), on fixe sur une plaque de
microtitrage une quantité connue d'anticorps dirigé contre la mycotoxine
recherchée. Après lavage, on ajoute la solution d'épreuve contenant une
quantité inconnue de la mycotoxine avec une quantité connue de mycotoxine
marquée par une enzyme. La mycotoxine marquée et la mycotoxine libre sont en
compétition pour se fixer sur les sites actifs de l'anticorps enduit sur la
plaque. Après incubation on lave de nouveau la plaque et l'enzyme capturée est
dosée par addition d'un support chromogène. On peut mesurer visuellement ou,
avec plus de précision, au moyen d'un lecteur ELISA la couleur obtenue ou
l'intensité de cette couleur. Dans les deux cas, on peut doser la quantité de
mycotoxine dans la solution d'épreuve en utilisant une série d'étalons de
concentration variable auxquels a été appliquée la même méthode. Souvent, les
solutions d'épreuve sont appliquées avec différentes dilutions si l'on n'a
aucune idée de l'ampleur de la concentration de mycotoxine dans la prise
d'essai. Plus la concentration du produit de la réaction enzymatique est
faible, plus la quantité d'enzyme fixée est faible et plus la concentration
de mycotoxine dans la prise d'essai est élevée. La diapositive suivante (9)
- 120
un composé donné mais demeure "inerte" pour tous les autres composés qui
peuvent aussi être présents dans l'échantillon. Ainsi, avec une méthode
pleinement spécifique, la probabilité de réactions faussement positives est
nulle. Souvent les techniques chromatographiques classiques visant à séparer
les aflatoxines des autres constituants de la matrice ne sont pas pleinement
spécifiques et il faut procéder à des épreuves supplémentaires pour confirmer
la présence d'aflatoxine dans l'échantillon. La méthode la plus fiable à cet
effet est la spectrométrie de masse à haute résolution, mais bien des
laboratoires dans des pays en développement ne seront pas dotés de ce type
d'appareil perfectionné et devront donc appliquer des techniques plus simples.
Parmi les diverses possibilités qui s'offrent pour accroître la spécificité
d'une méthode, la dérivation à effectuer directement sur la plaque de
chromatographie en couche mince ou en aval de la colonne dans le cas de la
chromatographie liquide sous haute pression est l'une des plus utiles.
participants en vue de rechercher par analyse les aflatoxines B,, B2, G, et Gz,
ainsi que des échantillons de lait en poudre pour la détection de l'aflatoxine
M,. Après avoir envoyé les résultats de leur analyse, les participants
reçoivent un rapport succinct décrivant les résultats des analyses
préliminaires effectuées sur des échantillons par trois laboratoires choisis
pour leur maîtrise des titrages d'aflatoxine. A un stade ultérieur, un rapport
complet contenant tous les résultats anonymes est distribué. Ces rapports
permettent aux laboratoires participants de juger de la qualité de leurs
propres résultats. La participation à ce programme de vérification
d'échantillons du CIRC est gratuite et elle est fortement recommandée parce
que le personnel qui travaille dans le domaine du dosage des mycotoxines ne
peut qu'admettre la justesse de ce qu'il a été convenu d'appeler la Loi de
Murphy, à savoir:
Travaux pratiques :
Travaux pratiques:
Jour 9 Même programme que pour le jour 8, mais avec des échantillons
choisis par les participants (produits locaux, problèmes
spécifiques).
Travaux pratiques :
Travaux pratiques:
ANNEXE I
Nom:
Sexe: masculin/féminin
Date de naissance:
Niveau d'instruction:
Fonctions actuelles:
Adresse de l'Institut:
Quels sont les jours ouvrables officiels chaque semaine et quelle est
la durée officielle du travail quotidien?
Acétone?
n-Hexane?
Méthanol?
Acétate d'éthyle?
Toluène?
Acétonitrile?
Chlorure de sodium?
Acide citrique?
Acide phosphorique?
Acide sulfurique?
Acide trifluoroacétique?
Acide acétique?
Acide formique?
Acide chlorhydrique?
- 133 -
Broyeur?
Agitateur magnétique?
Malaxeur Vortex?
ANNEXE II
EXERCICES DE CALCUL
EXERCICE A
UN MICROGRAMME (/¿g) EST EGAL A NANOGRAMMES (ng)
UN MILLIGRAMME (mg) EST EGAL A NANOGRAMMES (ng)
UN GRAMME (g) EST EGAL A KILOGRAMMES (kg)
UN GRAMME (g) EST EGAL A MICROGRAMMES (/¿g)
UN NANOGRAMME (ng) EST EGAL A MICROGRAMMES (/ig)
EXERCICE B
UN MILLIGRAMME (mg) PAR KILOGRAMME (kg) EST EGAL A MICROGRAMMES PAR GRAMME
UN MICROGRAMME (ng) PAR GRAMME (g) EST EGAL A MICROGRAMMES PAR KILOGRAMME
UN NANOGRAMME (ng) PAR GRAMME (g) EST EGAL A MICROGRAMMES PAR KILOGRAMME
UN NANOGRAMME (ng) PAR MICROGRAMME (/ig) EST EGAL A MICROGRAMMES PAR GRAMME
EXERCICE C
UN MILLILITRE (ml) EST EGAL A MICROLITRES (p1)
UN LITRE (1) EST EGAL A MILLILITRES (ml)
UN MICROLITRE (/il) EST EGAL A MILLILITRES (ml)
UN LITRE (1) EST EGAL A MICROLITRES (/il)
EXERCICE D
LA DENSITE RELATIVE DE L'EAU EST DE 1,0
UN MILLILITRE (ml) D'EAU PESE MILLIGRAMMES (mg)
UN MICROLITRE (/il) D'EAU PESE MILLIGRAMMES (mg)
UN MILLILITRE (ml) D'EAU PESE MICROGRAMMES (/ig)
UN MILLILITRE (ml) D'EAU PESE GRAMMES (g)
137
EXERCICE E
LA DENSITE RELATIVE DU CHLOROFORME EST DE 1,49
EXERCICE F
SUPPOSONS QUE NOUS DISPOSONS D'UNE SOLUTION ETALON D'AFLATOXINE B, DE ng/ml
DANS DU CHLOROFORME;
SI NOUS DISPOSONS SUR UNE PLAQUE DE CHROMATOGRAPHIE EN COUCHE MINCE DES TACHES
DE CET ETALON DE RESPECTIVEMENT 5, 10 et 15 fil, COMBIEN DE NANOGRAMMES
D'AFLATOXINE B, ONT ETE DEPOSES SUR LA PLAQUE RESPECTIVEMENT DANS CHAQUE
TACHE?
EXERCICE G
SUPPOSONS QUE VOUS AVEZ PROCEDE A L'EXTRACTION DE 50 g D'ARACHIDES ET QUE
L'EXTRAIT A ETE DE NOUVEAU ANALYSE SELON LA PROCEDURE DES COMMUNAUTES
EUROPEENNES. VOTRE VOLUME FINAL EST DE 2 ml ; VOUS PRELEVEZ SUR CE VOLUME FINAL
Ml QUE VOUS DEPOSEZ EN TACHE SUR LA PLAQUE DE CHROMATOGRAPHIE EN COUCHE
MINCE.
LA TACHE D'AFLATOXINE B, PROVENANT DE VOTRE EXTRAIT ET DEPOSEE SUR LA PLAQUE
DEVELOPPE UNE FLUORESCENCE DE MEME INTENSITE QUE ng D'AFLATOXINE B,.
COMBIEN Y A-T-IL D'AFLATOXINE B, DANS LE VOLUME FINAL DE VOTRE EXTRAIT
D'ECHANTILLON (en ng)?
QUELLE EST LA TENEUR DE VOTRE ECHANTILLON EN AFLATOXINE B, (/ig/kg)?
- 138 -
ANNEXE III
BIBLIOGRAPHIE
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M-82 T0322F/1/11.92/1000