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Questionnaire de préparation UAA5

Chapitre 3 - Biotechnologies

Connaître
1. Quels sont les différents outils dont dispose le biologiste moléculaire ?
2. Quel est l’intérêt d’utiliser les bactéries ?
3. Qu’est ce qu’un virus ? Comment se reproduit-il ?
4. Quelles sont les différentes enzymes utilisées en génie génétique ?
5. Qu'est ce qu'une enzyme de restriction ? Quelles sont ses spécificités ? Quel rôle jouent-elles
dans le génie génétique ?
6. Que sont les ADN ligases ?
7. Que sont les transcriptases inverses ?
8. Explique le principe de l’électrophorèse.
9. Comment révèle-t-on la présence d’un fragment d’ADN déterminé ?
10. Qu’est ce qu’une autoradiographie ? Explique le principe.
11. Qu’est ce qu’une sonde moléculaire et à quoi sert-elle ?
12. Pourquoi dénature-t-on l'ADN avant de l'hybrider avec une sonde? Comment intérpréter une
autoradiographie dans laquelle plusieurs bandes sont radioactives ?
13. Qu'est ce que le génie génétique ?
14. Quels sont les avantages de l’utilisation des bactéries pour le clonage ?
15. Explique les étapes de clonage d'un fragment d’ADN (ou d’un gène).
16. Pourquoi met-on un antibiotique dans le milieu de culture ? Quelle précaution a-t-on dû prendre
auparavant ?
17. Différencie plasmide non recombiné et plasmide recombiné.
18. Comment détecte-t-on les clones bactériens ayant intégré le gène d’intérêt ?
19. Pourquoi dit-on que les plasmides sont des vecteurs d'ADN ?
20. Définis plasmide et transgène.
21. Explique l'intégration de gène par un virus.
22. Quel est le principe d’une transgénèse végétale ?
23. Quelles sont les étapes d'une transgénèse végétale ?
24. Montre que la transgénèse implique le support de l'information génétique et que les mécanismes
de son utilisation soient universels.
25. Quels sont les avantages de produire des protéines recombinantes dans des bactéries?
26. Compare le transfert de gène par agrobacterium tumefasciens et la biolistique.
27. Pourquoi sélectionne-t-on les plantes ayant intégré le gène par des antibiotiques ?
28. Qu'est ce qu'un OGM ?
29. Cite 3 applications de la transgénèse.
30. Qu’est ce que la thérapie génique ? Explique les différentes étapes.
31. Différencie thérapie génique somatique et thérapie génique germinale.
Appliquer
Exercice 1 :
La séquence d’un ADN bicaténaire (2 brins), correspondant à un gène, est partiellement reportée ci-
dessous :

brin transcrit : 5' ATACGGGATCCGAGCTCTCGATCGTCTGCAGATATCATATAGGAAAGCC 3'

Soient les enzymes de restriction BamH I, Pst I, Xho I, EcoR V et Mbo I dont les sites reconnus sont
repris dans le tableau ci-dessous :

Enzyme Site de restriction


Bam HI 5' G/GATCC 3'
Pst I 5' CTGCA/G 3'
Xho I 5' C/TCGAG 3'
EcoR V 5’ GAT /ATC 3’
Mbo I 5' /GATC 3'

1) Sur la séquence de l’ADN (ci-dessus), encadre les sites de restriction en indiquant la position des
coupures et le nom de l'enzyme de restriction impliquée.
2) Combien de fragments sont obtenus après digestion du fragment d’ADN par BamH I, EcoR V et Mbo
I (les 3 enzymes sont utilisées en même temps) ? Explique ton raisonnement.

Transférer
Exercice 1 :
La fabrication de l’insuline par transgénèse
Il existe de nombreuses applications à la transgénèse, mais en voici un exemple pour bien comprendre :
L'être humain produit dans son corps une substance, l'insuline, qui lui permet de réguler la quantité de
sucre dans son sang. Pour cela, il dispose d'un gène, qui "explique" à son corps comment faire cette
insuline. Chez certaines personnes, ce gène ne fonctionne pas correctement : ces personnes ne
fabriquent donc pas d'insuline, et deviennent malades : c'est ce que l'on appelle le diabète.
On peut facilement soigner les diabétiques : il suffit de leur faire une piqûre d'insuline. Le problème,
c'est que seule l'insuline fabriquée par les êtres humains marche. Alors comment faire? On ne peut pas
élever des êtres humains pour leur prendre leur insuline afin de soigner les diabétiques, bien sûr...
Avec la transgénèse, c'est assez facile : je cherche, chez l'homme, le gène qui lui permet de fabriquer
de l'insuline, et je le mets dans une bactérie. Ensuite, je n'ai plus qu'à cultiver les nouvelles bactéries
transgéniques ainsi obtenues : grâce au gène humain que je leur ai injecté, ces bactéries sont devenues
capables, exactement comme l'homme, de fabriquer de l'insuline humaine! Il n'y a plus qu'à la
récupérer pour soigner les malades. » (source : Vikidia)

En prenant l’exemple de la fabrication d’insuline humaine par des bactéries, faire le schéma des
différentes étapes de cette transgénèse.
Exercice 2 :
On veut cloner une séquence d'ADN d'un chromosome de souris dans des bactéries. Cette séquence est
encadrée par deux sites de restriction reconnus par l'enzyme Bam HI et l'on dispose de plasmide
bactériens avec un site unique de restriction pour cette même enzyme (document 1).
L'ADN des plasmides contient deux gènes qui confèrent à leur bactérie hôte une résistance à deux
antibiotiques A et B. Le gène de résistance B possède un site de restriction reconnu par Bam HI et est
inactivé lorsqu'il est coupé ; la bactérie devient alors sensible à l'antibiotique.
Pour procéder au clonage de cette séquence, on mélange d'abord dans un tube les plasmides et l'ADN
de souris découpés par Bam HI et de l'ADN ligase (la ligase sert « de colle »). On ajoute ensuite des
bactéries naturellement dépourvues de plasmides et susceptibles d'intégrer les plasmides recombinés.
Quelques temps après, on étale les bactéries sur un milieu de culture additionné de l'antibiotique A.
Chacun des clones obtenus est alors séparé en deux parties : l'une est remise sur du milieu avec de
l'antibiotique A et l'autre sur du milieu avec de l'antibiotique B selon une disposition bien précise et
l'on observe le développement des clones (document 2).

a) en utilisant l'ensemble des données du document 1, montre à l'aide de schémas comment se forme un
plasmide recombiné.
b) Explique pourquoi la procédure représentée sur le document 2 permet de sélectionner les clones
ayant intégré l'ADN de souris. Ta réponse devra répondre aux points suivants :
• Pourquoi on cultive d'abord les bactéries en présence de l'antibiotique A? Quelle information
cela donne-t-il à l'expérimentateur?
• Pourquoi cultive t-on les clones obtenus lors de la première étape sur deux milieux différents
(antibiotique A et antibiotique B)? Pourquoi certains clones poussent-ils sur les deux milieux?
Dans quelle boite l'expérimentateur obtiendra-t-il les bactéries ayant intégré l'ADN de souris?
Réponses
Appliquer

1) brin transcrit : 5' ATACGG/GATCCGAGCTCTC/GATCGTC/TGCAGAT/ATCATATAGGAAAGCC 3'


a) gris : Bam HI jaune : PstI vert : EcoRV souligné : MboI
b) 5' ATACGG/GATCCGAGCTCTC/GATCGTCTGCAGAT/ATCATATAGGAAAGCC 3'

3 sites de restriction donc il y aura 4 fragments d'ADN après digestion simultanée du fragment
d’ADN par BamH I, EcoR V et Mbo

Transférer
1)

2) a) On attend un schéma montrant le plasmide ouvert avec les séquences de bases des bouts collants
(cohésifs), un autre montrant la séquence d'ADN de souris aussi avec des bouts collants (cohésifs) et
un 3e schéma du plasmide refermé avec l'ADN de souris intégré dans le gène B. L'ADN ligase ainsi que
le gène A sont mentionnés.
b) En réalisant la construction, on obtient toutes sortes de plasmides : des plasmides identiques à ceux
de départ (ils se sont ouverts puis refermés), des plasmides ayant intégré le gène de souris, des
plasmides qui ont intégré un autre fragment d'ADN issu de la digestion par BamH1. Les bactéries vont
donc intégrer, au hasard, l'un de ces plasmides ou pas de plasmide du tout.
Il faut donc sélectionner les bactéries ayant intégré le gène de souris désiré.
Comme le plasmide possède un gène de résistance à l'antibiotique A, on cultive les bactéries sur un
milieu contenant l'antibiotique A. Seules celles ayant intégré le plasmide survivront et cela permet
donc de sélectionner les bactéries voulues.
En revanche, le gène d'intéret se place dans le gène de résistance à l'antibiotique B et l'inactive. Si on
cultive les bactéries ayant intégré le plasmide avec le bon gène sur un milieu contenant l'antibiotique B,
elles ne pousseront pas.
Par conséquent, après la 1ère étape, on sépare les bactéries ayant poussé en 2 lots distincts : l'un est
mis en présence de l'antibiotique A sur lequel toutes les bactéries poussent, l'autre est mis en
présence de l'antibiotique B sur lequel les bactéries ayant intégré le bon gène meurent. La différence
entre les deux boites montre à l'expérimentateur où sont les bons clones (càd les points absents de la
boite B)